эффекты сочетанного действия внеклеточных компонентов

Биология
УДК 576.314:633.11:631.488
В.И. ЛЕВЧЕНКО, А.И. СОКОЛИК
ЭФФЕКТЫ СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ
КОМПОНЕНТОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ-ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
КОРНЕВЫХ ГНИЛЕЙ
НА КОРНЕВЫЕ КЛЕТКИ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ
Experimental work presents the result of electrophysiological study of processes taking place at the plasma membrane of wheat
root cells during action of extracellular components of Gramineae common root rot causing phytopathogenic fungi. It was shown
that, depending on the concentration of extracellular metabolites of phytopathogenic fungi, two qualitatively different reactions may
take place. High extracellular components concentrations demonstrate general toxic effect and lead to the inhibition of primary active
transport at plasma membrane. Strongly diluted filtrates were found to induce quick irreversible action, similar to described for
activation of strong defense reaction of plant cells, a hypersensitive response.
Функции плазматической мембраны живых клеток являются жизнеопределяющими: их нарушения при стрессовых воздействиях, включая биотические, индуцируют ответные реакции либо приводят к гибели клеток. Электрофизиологические методы позволяют производить прямую регистрацию
47
Вестник БГУ. Сер. 2. 2012. № 1
динамики функционального состояния плазматической мембраны в различных условиях [1]. Однако
в применении к вопросам физиологии больного растения эти методы использовались редко, а накопленный на сегодняшний день экспериментальный материал отрывочен и малочислен [2, 3]. В связи
с этим большое число вопросов, связанных с участием мембран в формировании картины фитопатогенеза, сегодня остаются неясными.
В электрофизиологических исследованиях взаимодействия растительных клеток с патогенами
предметом изучения чаще всего является либо токсическое действие патогенов или их метаболитов
на функциональность плазматической мембраны [2, 5, 6], либо внимание акцентируется на кратковременных обратимых событиях на мембране, являющихся этапом активного «распознавания» растительными клетками присутствия патогена в их окружении и имеющих отношение к внутриклеточной передаче сигнала о потенциальной атаке патогенов [6–8]. Как правило, в обоих случаях используются очищенные препараты токсинов, литических ферментов или отдельных элиситорных
компонентов, принадлежащих фитопатогенным организмам. В таком случае, помимо достоверного
описания оказываемого мембранотропного эффекта, исключается возможность исследования сочетанного действия различных факторов патогенности и авирулентности, т. е. той картины, которая
разворачивается на плазматической мембране клетки при патогенезе в реальных условиях.
Целью данной работы являлось экспериментальное описание событий, происходящих на плазматической мембране корневых клеток культурного злакового растения – пшеницы (Triticum aestivum)
при контакте с внеклеточными компонентами, секретируемыми актуальными для Беларуси фитопатогенными грибами-возбудителями корневых гнилей зерновых Fusarium culmorum и Bipolaris
sorokiniana.
Материал и методика
Фитопатогенные грибы Fusarium culmorum (W.G. Smith) Saccardo и Bipolaris sorokiniana (Sacc.)
Shoemaker (телеоморфа Cochliobolus sativus) были получены из РУП НИИ защиты растений НАН Беларуси. Патогены выращивались в жидкой питательной среде, включавшей (в ммоль·л–1) NaNO3 – 23;
KCl – 7; KH2PO4 – 7; MgSO4 – 4; FeSO4 – 0,7 и 87 ммоль·л–1 сахарозы при непрерывном перемешивании в течение 14 сут. По завершении культивирования патогенов культуральную жидкость отфильтровывали от мицелиальной массы и хранили в замороженном виде при –20 °С.
Семена пшеницы сорта Ростань подвергали стерилизации в 10 % растворе Domestos и проращивали на слое дистиллированной воды в закрытых чашках Петри в течение 2 сут. Для проведения экспериментов выбирали полноценные проростки с тремя корешками, длина центрального корешка
составляла от 15 до 30 мм. Проростки переносили в изготовленную из оргстекла экспериментальную
камеру с поперечными перегородками и укладывали центральным корешком в горизонтальные прорези перегородок так, чтобы с торца корешок был доступен для введения микроэлектрода. После
укладки проростка в местах контакта с прорезями камеры корешок фиксировали маленькими каплями
растопленного агара (0,15 %) и сразу же камеру заполняли контрольным раствором. Экспериментальные регистрации начинали не ранее чем через 3 ч после укладки проростка.
В качестве контрольного раствора использовали среду для выращивания патогенных грибов, разбавленную дистиллированной водой. Так, разбавленные в 5 / 10 / 50 раз контрольные растворы содержали (в моль·л–1): NaNO3 4,6 / 2,3 / 0,46; KCl и KH2PO4 – по 1,4 / 0,7 / 0,14; MgSO4 0,8 / 0,4 / 0,08,
FeSO4 0,14 / 0,07 / 0,014 и 17,4 / 8,7 / 1,74 ммоль·л–1 сахарозы. Значение pH каждого рабочего (культуральная жидкость определенного разведения) и контрольного растворов доводили до значения 7,0
при помощи TRIS. Экспериментальные регистрации производили при непрерывной перфузии раствора через рабочую камеру с проростком со скоростью 2 мл·мин–1 (до 4 объемов камеры в минуту).
Для проведения электрофизиологических регистраций использовали микроэлектродный усилитель GeneClamp 500B (Axon Instruments, США) с выносным предусилителем HS-2A (Axon Instruments). Микроэлектроды изготавливали из боросиликатных капилляров 1B100F-4 (World Precision
Instruments, США), снабженных внутренним филаментом. Вытяжку микроэлектродов производили на
вертикальной микрокузнице P-30 (Sutter Instrument, США). Сопротивление микроэлектрода, заполненного 0,3 моль/л раствором KCl, составляло 30÷50 МОм. В качестве электрода сравнения использовали хлорированный серебряный электрод, погруженный в камеру с раствором. Манипуляции
с микроэлектродом производили на инвертированном микроскопе Axiovert 40 CFL (Zeiss, ФРГ) при
помощи механических микроманипуляторов (#17979, Sutter Instrument).
Электрофизиологические данные (кинетика изменений мембранного потенциала) регистрировали
при помощи самописца, оцифровывали с помощью ЦАП/АЦП интерфейса Digidata 1322A (Axon
48
Биология
Instruments). Оцифровку производили с частотой дискретизации 50 Гц, перед оцифровкой сигнал отфильтровывали встроенным фильтром нижних частот на частоте 10 Гц.
Результаты и их обсуждение
После введения микроэлектрода внутрь клетки мембранный потенциал медленно стабилизировался,
и в течение 60÷90 мин достигал стабильного значения. Уровень мембранного потенциала в клетках
эпидермиса и кортекса корней проростков пшеницы оставался стабильным на протяжении нескольких часов регистрации и в зависимости от выбранного разведения контрольного раствора составлял
величину от –100 до –190 мВ (уровень потенциала цитоплазмы относительно потенциала апопласта).
После установления стабильного уровня мембранного потенциала производили экспериментальные воздействия фильтратами культуральных жидкостей фитопатогенных грибов в различных разбавлениях. В качестве основного разведения, обеспечивающего, с одной стороны, получение значимых и воспроизводимых реакций мембранного потенциала корневых клеток пшеницы, а с другой –
значения концентраций ионов в наружном растворе, близкие к естественным, было выбрано 1:5.
Типичный временной ход реакции мембранного потенциала клеток корневого кортекса пшеницы
в ответ на действие культуральных фильтратов фитопатогенных грибов F. culmorum и B. sorokiniana
в разведении 1:5 представлен на рис. 1. Культуральные жидкости обоих грибов вызывали деполяризацию плазматической
мембраны корневых клеток, которая начиналась с задержкой,
отражающей, по-видимому, время, необходимое для диффузии компонентов культуральных фильтратов к сайтам их
действия.
Видно, что деполяризация, вызываемая культуральной
жидкостью F. culmorum (в разбавлении 1:5), была более сильной (21,5 ± 2,18 мВ) и быстрой (0,96 мВ·мин–1), достигавшей
максимума спустя 30÷35 мин. Мембранный ответ на культуральный фильтрат гриба B. sorokiniana развивался значительно медленнее (0,37 мВ·мин–1), достигал максимума спустя
45÷50 мин и был меньшим по амплитуде (15,1 ± 0,6 мВ).
В обоих случаях реакция мембранного потенциала была
Рис. 1. Деполяризация мембраны клеток
перманентной, т. е. по достижении максимума деполяризации
кортекса пшеницы культуральными
потенциал оставался на новом уровне в течение всего периода
жидкостями патогенных грибов
F. culmorum (а) и B. sorokiniana (б)
присутствия стимула (вплоть до 1 ч), и также обратимой, т. е.
в разбавлении 1:5. (Период воздействия КЖ
при отмыве уровень мембранного потенциала возвращался
обозначен черными полосами под кривыми)
к исходному (см. рис. 1).
Известно, что во многих случаях, когда механизм действия стимула связан с функционированием
специализированных рецепторов, сопряженных с работой цитоплазматических сигнальных цепей,
повторная стимуляция приводит к уменьшению амплитуды последующих ответов за определенный
промежуток времени, называемый рефракторным периодом. В нашем случае повторное добавление
КЖ F. culmorum к проросткам пшеницы (вслед за достижением максимума деполяризации и полного
последующего отмыва с восстановлением мембранного потенциала к контрольному уровню) тем не
менее вызывало ответы плазматической мембраны клеток кортекса схожей амплитуды и временной
кинетики до трех раз подряд (данные не приведены). Однако в некоторых случаях в ответ на третье
добавление КЖ имела место качественно иная реакция мембранного потенциала: сразу вслед за повторным добавлением КЖ F. culmorum наблюдалась небольшая (5÷10 мВ) кратковременная гиперполяризация мембраны, сопровождающаяся последующей сильной деполяризацией (рис. 2).
Рис. 2. Второй тип реакции мембранного потенциала корневых клеток пшеницы в ответ на добавление КЖ F. culmorum.
(Период воздействия КЖ отображен черной полосой под кривой)
49
Вестник БГУ. Сер. 2. 2012. № 1
Отличительной чертой ответов подобного типа являлась большая скорость (не менее 3 мВ·мин–1) и
амплитуда деполяризации (более 80 мВ), а также их необратимость, т. е. после отмыва КЖ мембрана
могла оставаться в деполяризованном состоянии до 3 ч. Ответы мембранного потенциала этого типа
на действии КЖ F. culmorum проявлялись с вероятностью около 20 % (2 клетки из 10). Отметим, что
конечный уровень мембранного потенциала в таких случаях находился на уровне, значительно более
деполяризованном, чем К+-равновесный потенциал мембраны.
При анализе концентрационной зависимости эффекта деполяризации при действии КЖ
F. culmorum оказалось, что большее разведение (1:50) увеличивает вероятность генерации клетками
корневого кортекса ответов большой амплитуды (ответы II типа). Из трех протестированных проростков подобные ответы при первом добавлении КЖ продемонстрировали клетки корневого кортекса
двух и при повторном добавлении – одного проростка. Таким образом, в этих случаях меньшая концентрация метаболитов в рабочем растворе при большем разбавлении КЖ приводила к более сильной
мембранной реакции.
Для выяснения природы изменений активности ионтранспортных систем, происходящих на плазматической мембране при действии фильтратов КЖ, были предприняты эксперименты с применением ингибиторного анализа. Карбонилцианид-β-[3-фторметокси]фенилгидразон (FCCP), известный
блокатор активного транспорта в растительных клетках, деполяризовал мембрану до уровня К+диффузионного потенциала, что в нашем случае в зависимости от концентрации К+ составляло величину –70÷–110 мВ. На фоне FCCP добавление фильтратов КЖ патогенных грибов не вызывало никакой реакции со стороны мембранного потенциала (рис. 3). Этот факт позволяет сделать вывод о том,
что механизм действия секретируемых компонентов патогенных грибов выражается в ингибировании
Н+-АТФазы плазматической мембраны.
Рис. 3. Отсутствие деполяризующего эффекта при действии фильтрата КЖ F. culmorum
на фоне ингибитора активного транспорта FCCP.
(Вслед за первым добавлением КЖ (черная полоса), демонстрирующим нормальный деполяризационный ответ,
повторное добавление на фоне FCCP (серая полоса) не вызывает эффекта)
Таким образом, эксперименты показали, что бесспоровые культуральные фильтраты патогенных
грибов-возбудителей корневых гнилей злаковых культур B. sorokiniana и F. culmorum вызывают
характерные мембранотропные реакции в клетках корневого кортекса пшеницы. Направление эффекта – деполяризация мембраны (т. е. уменьшение величины трансмембранного потенциала) согласуется
с описанными в литературе эффектами, зарегистрированными при действии отдельных внеклеточных
компонентов фитопатогенных грибов. Так, среди токсинов, секретируемых грибами рода Fusarium,
по крайней мере два – фузариевая кислота [4, 9] и беауверицин [5] – вызывали сильный мембранотропный эффект в растительных клетках. Мембранотропные эффекты для немногочисленных идентифицированных токсических веществ, секретируемых грибом B. sorokiniana, на сегодняшний день
не охарактеризованы.
Наблюдаемая деполяризация плазматической мембраны клеток корневого кортекса также хорошо
согласуется с результатами макроскопических наблюдений на уровне целых растений. Так, кондуктометрическими методами было установлено, что фильтраты КЖ патогенных грибов-возбудителей
корневых гнилей вызывают утечку электролитов из корней злаков, причем наблюдаемые эффекты
могут коррелировать как с устойчивостью растений к патогену, так и с агрессивностью штаммов [6].
Как уже говорилось, мембранотропные эффекты могут вызывать не только токсические соединения, но и элиситорные компоненты фитопатогенных грибов, такие как хитин [7], β-глюканы [9], некоторые белки и олигопептиды [8]. Возникающие под действием элиситоров эффекты, как правило,
являются кратковременными. Достоверные, но недостаточно изученные мембранотропные эффекты
50
Биология
могут появиться в результате использования ферментов патогенных грибов, включая целлюлазы и
пектатлиазы [11]. Вызываемые ими эффекты имеют пикообразную кинетику, что позволило характеризовать их как элиситоры в плане активного распознавания растением. Так, клетки корневых волосков люцерны реагировали также на денатурированные литические ферменты, лишенные каталитической активности [11], а вопрос целлюлозосвязывающего домена вызвал значительный интерес. Некоторые авторы полагают, что подобные домены могут служить эволюционно древними сигнальными
детерминантами, сигнализирующими о наличии патогенов и (или) повреждений [12].
Таким образом, учитывая простую кинетику наблюдаемых эффектов, можно предположить, что
они вызваны токсическим действием секретируемых компонентов патогенных грибов-возбудителей
корневых гнилей. Отсутствие деполяризации мембраны при действии фильтратов КЖ на фоне FCCP
однозначно указывает на то, что эффект опосредован ингибированием активного компонента мембранного транспорта – H+-АТФазы. Следует отметить, что на ингибирование протонной помпы как
на механизм токсического действия метаболитов фитопатогенных организмов указывается во многих
работах, в том числе с использованием токсинов, производимых грибами рода Fusarium [5, 6]. Отсутствие же сведений об эффектах, оказываемых ими на другие типы каналов (калиевые, кальциевые,
анионные), связано в первую очередь с методическими трудностями непосредственной их регистрации в клетках высших растений.
Возможное объяснение ответов большой амплитуды при действии сильно разбавленных фильтратов КЖ гриба F. culmorum – смешение эффектов, вызываемых различными компонентами фильтрата
КЖ. С одной стороны, известно, что элиситорные компоненты действуют в очень малых количествах, с другой стороны, также известно, что токсические компоненты могут оказывать ингибирующий
эффект на очень широкий спектр клеточных реакций. В подобной ситуации мы фактически можем
наблюдать картину, когда сильное разведение КЖ приводит к элиминации действия ее токсических
компонентов, в то время как элиситорные компоненты могут находиться в ней в количествах, все еще
достаточных для инициации сигнальных событий, проявление которых на мембране блокируется
токсическими компонентами при небольшом разбавлении КЖ.
Возможным механизмом наблюдаемой значительной деполяризации, превышающей уровень
К+-равновесного потенциала, может являться активация анионных каналов плазматической мембраны. Такая активация в качестве одного из необходимых компонентов сигнальной цепи, ведущей к активации механизмов запрограммированной клеточной смерти, недавно была продемонстрирована на
суспензионных культуральных клетках арабидопсиса при действии распространенного загрязнителя –
озона [13]. Хорошо известно, что один из вариантов запрограммированной клеточной смерти, так
называемая реакция гиперчувствительности, является весьма распространенным механизмом, обеспечивающим эффективную защиту растений при патогенной атаке [14]. Дальнейшее исследование
электрофизиологической и сигнальной составляющих этого интересного и важного клеточного события, слабо пока еще изученного с точки зрения физиологии, включая поиск химических соединений,
приводящих к его активации, остается крайне интересной и важной задачей.
1. V o l k o v A . G . (ed.). Plant Electrophysiology: Theory and Methods. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2006.
2. T a t t a r T . A . // Annual Reviews of Phytopathology. 1976. Vol. 14. Р. 309.
3. Д ь я к о в Ю . Т ., О з е р е ц к о в с к а я О . Л . , Д ж а в а х и я В . Г . , Б а г и р о в а С . Ф . Общая и молекулярная фитопатология: Учеб. пособие. М., 2001.
4. P a v l o v k i n J . , M i s t r í k I . , P r o k o p M . // Plant, Soil and Environment. 2004. Vol. 50. Р. 397.
5. P a v l o v k i n J . , M i s t r í k o v á I . , L u x o v á M . et al. // Plant, Soil and Environment. 2006. Vol. 52. Р. 492.
6. W i s n i e w s k a H . , W a k u l i n s k i W . , C h e l k o w s k i J . // J. of Phytopathology. 1998. Vol. 146. Р. 563.
7. K i k u y a m a M . , K u c h i t s u K . , S h i b u y a N . // Plant Cell Physiology. 1997. Vol. 38. Р. 902.
8. P u g i n A . , F r a c h i s s e J . - M . , T a v e r n i e r E . et al. // The Plant Cell. 1997. Vol. 9. Р. 2077.
9. M i t h ö f e r A . , E b e l J . , F e l l e H . H . // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2005. Vol. 18. Р. 983.
10. D ' a l t o n A . , E t h e r t o n B . // Plant Physiology. 1984. Vol. 74. Р. 39.
11. C a r d e n D . E . , F e l l e H . H . // Planta. 2003. Vol. 216. Р. 993.
12. G a u l i n E . , D r a m e N . , L a f i t t e C . et al. // The Plant Cell. 2006. Vol. 18. Р. 1766.
13. K a d o n o T . , T r a n D . , E r r a k h i R . et al. // PLoS ONE. 2010. Vol. 5. Р. e13373.
14. M u r L . A . J . , K e n t o n P . , L l o y d A . J . et al. // J. of Experimental Botany. 2008. Vol. 59. № 3. Р. 50.
Поступила в редакцию 06.10.11.
Виктор Иванович Левченко – кандидат биологических наук, научный сотрудник НИЛ физиологии и биотехнологии
растений.
Анатолий Иосифович Соколик – кандидат биологических наук, доцент, заведующий НИЛ физиологии и биотехнологии растений.
51