Лебедева О.В. - Применение хромогенных сред для

Применение
хромогенных сред
для бактериологического
анализа мочи
Лебедева Оксана – к.м.н. доцент
зав.бактериологической лабораторией
ФГБУЗ Северный медицинский клинический центр
им. Н.А. Семашко ФМБА России (г. Архангельск)
Хромогенные среды
- принцип действия основан на выявлении
высокоспецифичных ферментов у искомых
микроорганизмов.
- предназначены для быстрого (в течение 24 часов)
обнаружения в исследуемом материале целого
ряда микроорганизмов, имеющих этиологическое
значение.
Виды хромогенных сред

1. среды для селективного выделения и прямой
идентификации микроорганизмов
клинических образцах

 уропатогены
 грибы рода Кандида
 сальмонеллы
 золотистый стафилококк
 стрептококк гр. В
 кишечная палочка О157
санитарной микробиологии
 кампилобактерии
 энтеробактер саказаки
 БГКП в пищевых продуктах и воде
 КОС в пищевых продуктах
 бациллу цереус
 листерии
2. среды для скрининга на полирезистентные
микроорганизмы




метициллинрезистентные золотистые стафилококки;
энтерококки с приобретенной устойчивостью к
ванкомицину;
энтеробактерии, продуцирующие БЛРС;
карбапенем-резистентные энтеробактерии).
Цель исследования
-
провести сравнительный анализ применения
хромогенных сред для обнаружения и подсчета
уропатогенных бактерий

UTI (Sifin, Германия)
Chromogenic urine agar II (Biolife, Италия)
Chromogenic urine agar III (clear) (Biolife, Италия).


Среды рекомендованы для обнаружения уропатогенных
бактерий по характеру окраски, определяемой взаимодействием
родо и видоспецифичных ферментов бактерий с хромогенным
субстратом
Характеристика основных
субстратов хромогенных сред
Фермент
Микроорганизм
β-галактозидаза
Escherichia coli
β-глюкозидаза
Enterococcus spp.
Триптофан
дезаминаза
Protey spp.
Цвет
Розовый
Сине-зеленый
Светлокоричневый
Материалы и методы






В апреле-июне 2013 года на базе лаборатории клинической
микробиологии ФГБУЗ СМКЦ им. Н.А. Семашко ФМБА
России использовались указанные хромогенные агары для
посева мочи параллельно с традиционным методом посева.
Отбор и доставка биоматериала для исследования
производились согласно МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и
транспортирования биоматериалов в микробиологические
лаборатории».
Осуществлялся посев средней порции утренней мочи с
последующей инкубацией в течение 18-24 часов при
температуре 370С.
Предварительная идентификация выделенных культур
проводилась согласно инструкции фирмы-производителя
Окончательная с помощью классических бактериологических
методов, а также с использованием тест-систем Erba
Lachema, Чехия.
Было исследовано в параллелях 156 проб мочи и
проанализировано 624 посева.
характеристика хромогенных
агаров
Характеристика
UTI
Chromogenic Chromogenic
urine agar II urine agar III
Навеска на 1л. (г)
39,0
49,4
34,6
Хромогенный
субстрат, г/л
Триптофан (г)
0,7
11,6
1,8
1,0
2,0
2,0
-
+
+
7,3
7,0
6,8
Прозрачный
светложелтый
10-14 дней
Молочнобелый
Прозрачный
светложелтый
2 суток
Флуоресцентная
детекция
pH
Цвет готовой среды
Срок хранения
5 суток
Этиологическая структура
46,8% - выявлена бактериурия в диагностических титрах
20,6% - обнаружены ассоциации из 2 культур
4,6
4,6
2,3
2,3
6,8
6,8
37,8
9,1
19,4
E. coli
Enterobacter spp.
Serratia spp.
Enterococcus spp.
Staphylococcus spp.
Proteus spp.
Streptococcus spp.
Klebsiella spp.
Прочие
Результаты
Всхожесть и количественный
подсчет был идентичным на
всех апробируемых
хромогенных агарах.
!
Хотя при массивном росте
микроорганизмов (более 107
КОЕ/мл) оценка цветового
показателя на хромогенах
была затруднена.
E. сoli

Согласно инструкциям фирмпроизводителей:


цвет фуксина (UTI агар, Германия)
розовый (Chromogenic urine agar II и
III, Италия).
Все выделенные штаммы E. сoli
были окрашены от светлосиреневого до темно-сиреневого
цвета.
 3 штамма лактозонегативных E. сoli
– образовывали бесцветные колонии
с розово—сиреневым центром на
средах Biolife, Италия.

группа KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia)

Бактерии синтезируют оба фермента (β-галактозидазу и
βглюкозидазу) и образуют крупные колонии с окраской
различных оттенков от сине-зеленых до насыщенно синих
цветов.

Некоторые штаммы Enterobacter cloacae не имеет фермента
β-глюкозидазу, поэтому они образуют колонии внешне очень
похожие на колонии E. сoli.

Для исключения ошибки в предварительной идентификации
необходим тест на индол.
Proteus spp., Morganella spp. и
Providencia spp.



Содержание в среде аминокислоты триптофана помогает
выявить триптофандезаминазную активность
Все выделенные культуры формировали крупные, часто
слизистые колонии светло-коричневого цвета или
бесцветные с коричневым краем.
Пигмент диффундировал в прилегающую питательную среду.
Enterococcus spp., Streptococcus
agalactiae и Streptococcus гр. Д


в ходе роста синтезировали β-глюкозидазу и формировали
мелкие колонии сине-зеленого цвета.
Характерная яркая окраска позволяла выявить данные
группы микроорганизмов при микст инфекциях даже в
небольших титрах до 103 КОЕ/мл, что практически
невозможно при традиционном методе посева.
Staphylococcus spp.


формировали медленно
растущие мелкие колонии
белого цвета.
На среде UTI (Sifin,
Германия) отмечался
замедленный рост колоний,
в 27% случаев после 24
часовой инкубации.
неферментирующие
грамнегативные бактерии



Колонии характеризовались
крупными размерами, белой
или кремовой окраской.
На вторые сутки у колоний
синегнойной палочки
наблюдалось появление
зеленого пигмента с
диффузией в агар.
Acinetobacter spp.
формировал полупрозразные
колонии с белесоватым
оттенком.
Candida albicans

колонии мелкие,
белые, но более
выпуклые, чем у
стафилококков.
Интерпретация результатов
посева на хромогенный агар
Сиреневые
или
бесцветные
с сиреневым
центром
2,0-3,0 мм
Г- палочки
Индол
Escherichia
coli
Цвет колоний
Белые или бесцветные
Коричневые
или
Сине-зеленые (бирюзовые) бесцветные с
коричневым
краем
Диаметр колоний
0,5-1,0 мм 2,0-3,0 мм
2,0-3,0 мм
1,0-2,0 мм
2,0-3,0 мм
Микроскопия
Г+ кокки
Г- палочки
Г- палочки
Г+ кокки
Г- палочки
Дополнительные тесты
PYR тест
Требует
Индол
Фенилаланин
окончательной
идентификации
Предварительная идентификация
Enterococc Klebsiella,
Proteus,
Staphylo
coccus spp.
us spp.,
Enterobacter,
Morganella,
Providencia
Streptococ Citrobacter,
Serratia
cus
agalactiae
Окончательная идентификация
Pseudomona
s
Acinetobacter
spp
Результаты:
+



-



Принципиальных различий в цветовой окраске на
исследуемых хромогенных средах не выявлено
Однако при всей сопоставимости результатов, в
практическом плане, на наш взгляд, наиболее выгодна для
оценки цвета колоний среда Chromogenic urine agar II
(Италия)
Использование хромогенных сред позволяет уменьшить
количество тестов для окончательной идентификации
выделенных штаммов и тем самым снижает трудозатраты
при большом объеме работы.
К сожалению, на данных средах нельзя определять
гемолитические свойства микроорганизмов,
недостаточно сведений о характере роста
неферментирующих бактерий, что необходимо учитывать при
внутрибольничных инфекциях и хронических вялотекущих
процессах.
Также хромогенные среды Biolife (Италия) имеют
ограниченный срок хранения, что возможно нерентабельно в
условиях небольшой лаборатории при незначительном
Рекомендации:

при работе с хромогенными агарами в лаборатории
необходим предварительный посев музейных штаммов
микроорганизмов для отработки и сверки цветовой окраски
колоний

продление сроков инкубирования до 48 часов при
сомнительных результатах

во всех случаях сомнительных цветовых реакций
рекомендуется микроскопия по Граму
Выводы:

Таким образом, применение
апробированных хромогенных сред
целесообразно при инфекциях
мочевыводящих путей, включая микст
инфекции для выделения и
предварительной идентификации
основных уропатогенов.
Спасибо
за
внимание!