ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИХ
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» М.А. Климова, А.Т. Епринцев ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ Учебно-методическое пособие для вузов (Практикум) Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2008 Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 5 мая 2008 г., протокол № 9 Рецензент доктор биологических наук, профессор О.С. Корнеева Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета. Рекомендуется для студентов биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета всех форм обучения. Для специальности: 020201 – Биология 2 СОДЕРЖАНИЕ Тема 1. Основные принципы выделения и очистки ферментов 4 Работа 1. Измерение скорости ферментативной реакции 4 Работа 2. Разрушение клеток и экстракция 7 Работа 3. Фракционирование солями 9 Работа 4. Обессоливание с помощью сефадекса G-25 11 Работа 5. Применение ДЭАЭ-целлюлозы для разделения белков 12 Работа 6. Определение молекулярной массы нативного фермента с помощью гель-хроматографического метода Тема 2. Электрофорез белков 14 16 Работа 1. Нативный ступенчатый электрофорез 17 Работа 2. Электрофорез белков с ДДС по Лэммли 20 Работа 3. Универсальное окрашивание белков в ПААГ 21 Работа 4. Специфическое проявление белков в ПААГ 23 Тема 3. Исследование каталитических свойств ферментов Работа 1. Определение константы Михаэлиса Работа 2. Определение зависимости скорости реакции от температуры 25 25 26 Работа 3. Определение зависимости скорости реакции от рН 27 Работа 4. Исследование влияния ингибиторов 28 Приложение 1 31 Приложение 2 32 Приложение 3 33 Список литературы 34 ТЕМА 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ Белки – это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. В клетке Еscherichia coli содержится около 3000 различных белков, а в организме человека насчитывается более 100 000 разнообразных белков. Исследования строения и функций белков предполагают наличие высокоочищенных препаратов. Получение же белка в гомогенном состоянии – достаточно сложная задача. Как правило, биологический материал, являющийся источником выделения, содержит большое число белков, их комплексов друг с другом и другими биополимерами. Близкие свойства компонентов этой смеси требуют при выделении индивидуальных белков использования разнообразных методов и различных их сочетаний. Трудности получения чистого белка связаны также с лабильностью белков и опасностью их денатурации, что сужает круг возможных методов выделения. Работа 1. Измерение скорости ферментативной реакции 1. Общие правила работы с ферментами. Ферменты – вещества, имеющие лабильную структуру и, как правило, легко подвергающиеся инактивации. Поэтому при работе с ферментами необходимо соблюдать ряд предосторожностей. • При определении активности фермента на разных стадиях очистки необходимо соблюдать одни и те же условия. По возможности следует подбирать условия, при которых фермент достаточно стабилен. рН среды и температура должны поддерживаться в пределах зоны стабильности фермента. Обычно ферментативные реакции проводят при температуре, лежащей в пределах 25–40 °С. Температура 25 °С соответствует стандартной, которой обычно придерживаются в большинстве случаев при определении ферментативной активности. • Обычно выделение и очистку ферментов проводят в холодной комнате при температуре 0–4 °С. • Часто на различных стадиях выделения и очистки ферментов необходимо интенсивное перемешивание ферментного раствора. Однако многие ферменты подвергается денатурации на поверхности раздела. Поэтому 4 следует избегать сильного вспенивания при перемешивании. Для избегания возникновения пены ферментный раствор следует переливать из одного сосуда в другой осторожно, по стенке. • Часто даже при наиболее благоприятных условиях наблюдается медленная инактивация фермента со временем. В связи с этим рекомендуется проводить очистку фермента как можно быстрее. • В состав ферментных растворов нередко вводят стабилизаторы. Стабилизации ферментов, как правило, способствует добавление глицерина, альбумина. Наличие в ферментных растворах восстановителей (тиолов, аскорбиновой кислоты) защищает ферменты от окисления. ЭДТА, глутатион, цистеин препятствуют инактивации ферментов под действием ионов тяжелых металлов, которые в следовых количествах могут содержаться в дистиллированной воде. 2. Измерение скорости ферментативной реакции. Наиболее существенную часть в методике исследования ферментов составляет измерение скорости ферментативной реакции. По скорости реакции принято определять количество присутствующего фермента. Скорость реакции характеризуется ферментативной единицей (Е). За Е любого фермента принимается то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при 25 °С в оптимальных условиях действия фермента. Температура 25 °С является стандартной в физической химии. Удельная активность выражается в ферментативных единицах на мг белка. Для того чтобы точно измерить скорость реакции, нужно проводить определение ферментативной активности в самом начале реакции, т. е. тогда, когда еще имеется избыток субстрата, минимальное количество продуктов реакции, и фермент находится в активной форме. 3. Методы количественного определения ферментативной активности бывают флуоресцентные, манометрические, поляриметрические, электродные, вискозиметрические, спектрофотометрические (в настоящее время для определения активности ферментов применяются наиболее широко). Эта группа методов основана на способности многих субстратов и продуктов ферментативных реакций поглощать свет в определенных участках спектра. Положение максимума поглощения определяется наличием в химическом соединении определенных групп, например, линейных или циклических систем с сопряженными двойными связями. Спектрофотометри5 ческие методы отличаются высокой чувствительностью, малыми затратами времени, реактивов и ферментного препарата). Оборудование и реактивы. Раствор крахмала (0,2%), 0,1%-й раствор йода в 0,2%-м растворе йодида калия, раствор слюны – рот ополаскивают 2–3 раза водой, отмеряют цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают ею рот в течение 3–5 мин в несколько приемов, собранную жидкость фильтруют через вату и фильтрат используют в качестве источника фермента. Среда спектрофотометрирования: 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 7.5, 1.5 мМ оксалоацетат (М.в. 132 г/л), 0.15 мМ НАДН Na2 (М.в. 709.4 г/л). Среда спектрофотометрирования 2: 100мМ трис-HCl буфер, рН 9.0, 4 мМ малат (М.в. 134.1 г/л), 1 мМ НАД+ (М.в. 663.4 г/л). Спектрофотометр, набор варипипеток, кюветы, буфер, экстракт фермента, среды спектрофотометрирования, дистиллированная вода и др. Ход работы. 1. Действие амилазы: амилаза (КФ 3.2.1.1.) является ферментом, который катализирует гидролиз α-глюкозидной связи α-1,4-крахмала и гликогена до промежуточных продуктов – декстринов. Крахмал обладает способностью образовывать с йодом соединение синего цвета, амилодекстрин – фиолетового, эритродекстрин – красно-бурого, ахродекстрин – желтого. В две пробирки вносят по 5 мл крахмального клейстера, в одну из них добавляют 0,5 мл раствора слюны, содержащей амилазу, хорошо перемешивают и оставляют стоять. Через 15 мин в обе пробирки прибавляют по 5 капель раствора йода. В пробирке с амилазой слюны раствор через некоторое время становится бесцветным, в пробирке без амилазы раствор остается сине-фиолетовым. 2. Измерение активности малатдегидрогеназы. Малатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.37.) катализирует превращение малата в оксалоацетат и наоборот в присутствии НАД+ или НАДН в качестве кофермента. Для определения скорости восстановления оксалоацетата МДГ в кювету внести 3 мл среды спектрофотометрирования 1 и начать реакцию добавлением 0.01 мл раствора МДГ. Для исследования реакций окисления малата использовать среду спектрофотометрирования 2. Метод измерения активности основан на учете изменения оптической плотности (уменьшение или увеличение) при использовании НАДН или НАД+ при 340 нм. 6 Активность фермента рассчитать по формуле: ΔE ⋅ ε ⋅ Vобщ E = , t ⋅ Vвн где Е – общая активность фермента, мкмоль/мин; ∆Е – скорость ферментативной реакции; ε – коэффициент экстинкции (для МДГ равен 0.482); t – время измерения скорости ферментативной реакции, мин; Vобщ – общий объем вытяжки, мл; Vвн – объем внесения пробы в кювету, мл. Работа 2. Разрушение клеток и экстракция В природе ферменты находятся в виде смесей и комплексов с разнообразными веществами, в том числе с белками. В большинстве случаев примеси других веществ мешают глубокому изучению исследуемого фермента, оказывая на ферментативную активность косвенное влияние путем воздействия на фермент, субстрат или продукты реакции. Существуют различные методы экстракции (гомогенизаторы, химические, энзиматические, биологические). Животные ткани различаются по своей прочности: легко разрушаются эритроциты, а в кровеносных сосудах, напротив, содержится жесткий коллагеносодержащий материал. Успешным является замораживание ткани в жидком азоте и измельчение ее в замороженном состоянии. Ряд белков можно извлечь из тканей после обработки их ацетоном или другими органическими растворителями. Растительные клетки труднее разрушаются, так как содержат целлюлозную оболочку. Некоторые бактерии легко разрушаются под действием осмотического шока, а более устойчивые с толстой клеточной стенкой требуют механического воздействия, например, ультразвуком. Таким образом, способы разрушения клеток можно разделить на следующие группы: 1. Мягкое воздействие, которое включает лизис клеток с помощью осмотического шока, разрушение под действием ферментов (лизоцима и др.), химическую солюбилизацию (например, экстракция дрожжей толуолом, при которой частично растворяется клеточная стенка), гомогенизацию вручную (клетки продавливают через зазор). 7 2. Воздействие средней силы, при котором используют лопастной гомогенизатор или растирание с абразивом (песком, стеклянными шариками). 3. Сильное воздействие с помощью пресса, ультразвука или шаровой мельницы. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей исследуемого белка. Для растворимого белка используют буферные растворы. Обычно объем раствора в 2–3 раза превышает объем ткани. Оборудование и реактивы. Трис-ЭДТА буфер (ТЕ): 50 мМ трис-НСl, рН 8,0 и 10мМ ЭДТА (М.в. 292,0); свежеприготовленный раствор лизоцима в ТЕ-буфере, 10 мг/мл. Ход работы. 1. Лизис клеток с применением ферментов. Разрушение клеточных стенок с применением детергентов и ферментов проводят с небольшими порциями биомассы. Как правило, время лизиса не превышает 15–30 мин. Для лизирования клетки E. сoli суспендируют в ТЕ-буфере из расчета 3 мл буфера на 1 г сырой биомассы и нагревают до 37 оС. Добавляют 1 мл раствора лизоцима на каждые 5 мл суспензии или эквивалентное количество сухого лизоцима и инкубируют 10–20 мин при 37 оС. 2. Лизис клеток с помощью детергентов. Это наиболее мягкий и быстрый способ разрушения клеток по сравнению с другими методами. Перед лизисом клетки промывают несколько раз забуференным солевым раствором (например, 10 мМ трис-HCl буфером, рН 7.5, с 150 мМ NaCl). После последнего центрифугирования биомассу суспендируют до плотности 107–108 кл/мл, или 3–4 мг сухих клеток на 1 мл в том же буфере, с добавлением 0,1–0,3 % Тритона Х-100. Содержимое перемешивают и инкубируют на льду от 10 до 90 мин. Для стабилизации белков в экстракт добавляют 0,2 объема 50 % глиицерола. Вместо тритона Х-100 могут быть использованы и другие неионные детергенты. 3. Гомогенизация. Этот способ можно использовать для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой, для животных и некоторых растительных клеток. Порции биомассы, суспендированные в буферном растворе (3–5 объемов), переносят в ручной гомогенизатор и пропускают через него биомассу 10–20 раз. При использовании механических гомогенизаторов с блендерами время обработки обычно не превышает 1–2 мин интервалами по 20 с с промежуточным охлаждением биомассы на льду. 4. Обработка клеток ультразвуком. Измельчение клеточных суспензий в ультразвуковом дезинтеграторе широко применяется, особенно для раз8 рушения бактериальных клеток. Однако в данном случае необходимо подобрать режим ультразвуковой обработки, не вызывающий инактивации фермента. Разрушение клеток ультразвуком происходит в результате микроколебаний суспензии, помещенной в стеклянный стакан с излучателем ультразвуковых волн. Ультразвук создает высокую степень вибрации суспензии, вследствие чего происходит механический разрыв клеток. Следует контролировать уровень пенообразования и перемешивать при обработке, поскольку интенсивное пенообразование вызывает денатурацию белков в образующихся тонких пленках на разделе фаз жидкость/газ. Для разрушения бактерий чаще всего используют излучатель на 22 кГц. При выбранном значении облучают суспензию клеток (1 г сырой биомассы и 5 мл среды разрушения) последовательно 6–10 раз с интервалами в 30 с при промежуточном охлаждении излучателя и суспензии в воде со льдом. Полученные клетки затем осаждают на скоростной центрифуге (примерно 20 тыс. g в течение 10–15 мин при 4 оС). Работа 3. Фракционирование солями Метод фракционирования солями очень широко используется при очистке ферментов. Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в растворе. Постепенно повышая концентрацию, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого фермента в одной из них. Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Наиболее часто для фракционирования белковых смесей употребляют сульфат аммония. Он хорошо растворим в воде, что позволяет получать четкое разделение белковых фракций. Растворимость его мало зависит от температуры, и он, как правило, не оказывает вредного воздействия на ферменты. Сульфат аммония добавляют к ферментному раствору отдельными порциями, при перемешивании. Тщательное перемешивание и дробное до9 бавление предотвращает местное повышение концентрации соли выше требуемой, что могло бы привести к загрязнению выделяемой фракции. На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура. При проведении высаливания концентрацию сульфата аммония выражают не в абсолютных величинах, а в «процентах насыщения» или «долях от полного насыщения». При этом за 100 % (или за 1.0) принимают максимально возможную (насыщающую) концентрацию сульфата аммония при комнатной температуре. Для достижения 100 % насыщения при комнатной температуре на каждый литр раствора необходимо прибавить 760 г сульфата аммония. Исходя из этого соотношения, рассчитывают количество соли, которое необходимо прибавить к определенному объему раствора белка, чтобы достичь определенной степени насыщения. Труднее произвести соответствующие расчеты при дробном высаливании, когда необходимо прибавлять сульфат аммония к раствору, уже содержащему некоторое количество соли. В таких случаях используют для расчетов специальную таблицу (см. приложение 1), горизонтальные строки которой соответствуют определенной степени насыщения исходных растворов, а вертикальные столбцы – той степени насыщения, которую необходимо достичь на данной стадии высаливания. Оборудование и реактивы. Магнитная мешалка, центрифуга, супернатант. Ход работы. Для очистки МДГ из бесклеточного экстракта объемом 5 мл высаливать фракцию насыщения 35–80 %. I стадия: 35 % (NH4)2SO4 (см. приложение 1); 19.7 г (NH4)2SO4 – 100 мл исходного раствора (супернатант) х г – 5 мл. Таким образом взвесить 0.985 г (NH4)2SO4 и прибавлять к раствору постепенно, небольшими порциями, при обязательном перемешивании. В ходе высаливания следить за изменениями рН; в случае подкисления провести нейтрализацию разбавленным раствором NH4OH. Каждую последующую порцию прибавляют после полного растворения предыдущей. Соблюдение этих приемов имеет важное значение, поскольку при местном повышении концентрации соли на данной стадии могут выпасть в осадок белки, высаливаемые при более высокой ионной силе. После растворения 10 последней порции соли раствор перемешивать еще 15–30 мин, а затем центрифугировать при 4 тыс.–10 тыс. g в течение 20–30 мин. На следующей стадии использовать полученный супернатант. II стадия: 80 % (NH4)2SO4 (см. приложение 1); 29.5 г – 100 мл исходного раствора; у г – 4 мл супернатанта. Взвесить 1.1 г (NH4)2SO4 и повторить процедуру, как на стадии 1. После центрифугирования осадок перерастворить в небольшом объеме 50 мМ трис-НCl буфера (рН 7.5) и измерить в нем спектрофотометрически активность МДГ. Далее освобождают фермент от избытка сульфата аммония путем обессоливания. Работа 4. Обессоливание с помощью сефадекса G-25 Белки чаще всего разделяют методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как разные белки достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их заряду (ионообменная хроматография), размеру (хроматография гель-фильтрацией), или способности связываться с различными химическими группами (аффинная хроматография). Низкомолекулярные соединения удаляют с помощью гель-фильтрации через сефадекс G-25. Сефадекс – гель, состоящий из полисахаридных цепочек декстрана, сшитых поперечными связями. Цифра сефадекса характеризует пористость. Так, G-10, G-15, G-25 мелкопористые (с небольшим размером пор, т. е. с большим количеством поперечных связей); G-150, G-200 – крупнопористые (с малым количеством поперечных связей). Оборудование и реактивы. Приготовление обессоливающей колонки: около 3 г сухого сефадекса G-25 суспендировать в 50 мМ трис-НСl буфере, рН 7.5, где он должен предварительно набухать в течение 3 часов, либо прокипятить на водяной бане в течение 1 ч. Далее заполнить суспензией колонку, и промывать бу11 фером до тех пор, пока кислотность вытекающей из колонки жидкости не станет постоянной (рН 7.5). Ход работы. Для освобождения от низкомолекулярных примесей, ферментную вытяжку пропустить через колонку (1,5×10 см) с сефадексом G-25. Объем наносимого образца не должен превышать 4 мл. После нанесения пробы колонку заполнить буферным раствором и начать элюирование трис-HCl буфером, рН 7.5. При этом белковый раствор освобождается от низкомолекулярных примесей, пигментов, и происходит смена буфера, если для экстракции белков использовался иной буфер. Элюат собирать фракциями по 2 мл, измерить активность фермента, продолжить очистку наиболее активной фракции. По окончании фракционирования колонку промыть водой, трис-HCl буфером до постоянного значения рН и вновь использовать для очистки. Работа 5. Применение ДЭАЭ-целлюлозы для разделения белков В основе ионообменной хроматографии лежат реакции ионного обмена между белками и различными ионообменниками. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы (см. приложение 3). ДЭAЭ-целлюлоза КМ-целлюлоза 12 При взаимодействии белков с ионообменниками в ходе адсорбции образуются множественные электростатические связи между функциональными группами на поверхности адсорбционной матрицы и группами белковых молекул, несущими противоположный заряд. Прочность связывания каждого белка на матрице зависит от ряда факторов и, в первую очередь, от величины заряда белка, зависящей от рН и ионной силы раствора. При пропускании через колонку определенного элюирующего раствора происходит хроматографическое разделение белков в зависимости от степени их взаимодействия с ионообменником. Разрыв связей достигается путем изменения рН или ионной силы протекающего раствора. Оборудование и реактивы. Хроматографическая колонка с рабочим объемом 20–30 мл, причем соотношение длины и диаметра колонки может варьировать от 20 до 4, магнитная мешалка, коллектор фракций, центрифуга, химическая посуда, ДЭАЭ-целлюлоза, 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7.5. Приготовление ионообменной колонки (иониты промышленного изготовления после набухания фракционируют по размеру частиц и подвергают «циклизации» – переводу их из одной формы в другую): около 6 г целлюлозы суспендировать в 50-кратном объеме дистиллированной воды, перемешать и оставить набухать на ночь. Слой жидкости над ионообменником декантировать, снова залить дистиллированной водой, перемешать и через 2–2.5 ч верхний слой жидкости декантировать вместе с неосевшими мелкими частицами. К оставшемуся осадку прилить 15-кратный объем 0.5 М HCl и через 15–30 мин (время обработки анионообменника кислотой не должно быть большим) отмыть водой до рН 5.0. На следующем этапе сорбент обработкой 15-кратным объемом 0.5 М NaOH в течение 30 мин переводят в ОН- форму. Затем осадок на 5 мин заливают свежей порцией щелочи, фильтруют через колонку Бюхнера и отмывают дистиллированной водой до рН 7.0. После этого ионит уравновешивают 15-кратным объемом 50 мМ трис-HCl буфером, рН 7.5 и оставляют его на ночь, после чего заполняют колонку, следя за значением рН. В процессе подобной обработки стабилизируется структура ионита и функциональные группы становятся более доступными. Одновременно ионит освобождается от примесей. Ход работы. Раствор фермента после стадии очистки через сефадекс G-25 нанести на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (объем раствора белка может значительно 13 варьировать, но его концентрация не должна превышать 5 мг/мл). Колонку промывают буфером для удаления не сорбируемых в данных условиях белков до тех пор, пока в элюате не останется белка. Затем начинают элюцию белка с колонки раствором KCl с линейным градиентом концентрации (0–0.5М) в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5. В смеситель вносят 150 мл буфера, а в питающий сосуд – 150 мл 0.5 М KCl в буфере. Скорость элюции 1–1.5 мл/мин, время разделения около 4 часов. Элюат собирают фракциями по 2 мл и измеряют в них активность фермента. По окончании фракционирования анионообменник необходимо регенерировать. Для этого к использованному сорбенту добавляют 30-кратный объем 0.2–0.5 н. раствора NaOH, перемешивают до получения однородной суспензии и фильтруют на воронке Бюхнера. Обработку щелочью проводят дважды. После этого ионит отмыть водой до нейтральной реакции фильтрата. Регенерированный анионообменник уравновесить буферным раствором. Хранить в солевой форме, добавляя антисептики: 0.02%-й азид натрия, мертиолоат или хлороформ. Работа 6. Определение молекулярной массы нативного фермента с применением гель-хроматографического метода Гель-хроматография – метод разделения веществ на основе их молекулярной массы. Принцип метода основан на том, что для большого числа глобулярных белков имеется линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и объемом элюирования с колонки, заполненной гелем с определенной величиной пор. Поэтому для определения молекулярной массы глобулярного белка достаточно определить объем его элюции с предварительно откалиброванной колонки. Калибровку колонки проводят, пропуская через нее белки с известной молекулярной массой и определяя объем элюции для каждого из них. Массу исследуемого белка также можно рассчитать по формулам: lg Mr = 6,0404 – 0,8032(Ve/Vсв) для сефадекса G-150, lg Mr = 6,698 – 0,987(Ve/Vсв) для сефадекса G-200, где Vсв – свободный объем колонки, определяемый эмпирически с помощью голубого декстрана; 14 Ve – элюционный объем, равный объему элюата, собранного с момента внесения вещества на колонку до момента его элюции с колонки, включая фракцию с максимальным его содержанием. Чем выше молекулярная масса белка, тем ниже его элюционный объем. Поэтому сначала будут выходить белки с большей молекулярной массой, затем с более низкой и т. д. Оборудование и реактивы. Натрий-фосфатный буфер, рН 6.5, сефадекс G-200, голубой декстран (Mr около 2 000 000 Да), белки с определенной молекулярной массой (Да): яичный альбумин (45 000), бычий сывороточный альбумин (68 000), рибонуклеаза из поджелудочной железы (12 700), цитохром с (13 000). Приготовление хроматографической колонки: сухой сефадекс G-200 суспендируют в 100–200-кратном объеме буфера и оставляют набухать в течение 72 ч при комнатной температуре, или же в течение 5 ч на кипящей водяной бане (см. прил. 2). В колонку (отношение длины к диаметру должно равняться 10 : 1, 20 : 1) вносят относительно густую суспензию полностью набухшего геля. Для предотвращения образования пузырьков воздуха в слое геля в колонке суспензию сефадекса перед заполнением колонки можно деаэрировать с помощью водоструйного насоса в колбе Бунзена или вносить его в колонку при температуре, значительно превышающей комнатную (50–60 оС). Для получения хороших результатов разделения и четких пиков колонка должна быть заполнена равномерно, а верхняя и нижняя поверхности сефадекса строго горизонтальны. Сефадексу в колонке дают отстояться, затем с целью уравновешивания и достижения постоянной высоты столба геля колонку промывают 3–5 объемами буферного растовра. Чтобы избежать необратимой деформации частиц геля, максимальное гидростатическое давление при работе с сефадексами не должно превышать допустимого предела – 50, 35, 15 и 10 см водного столба соответственно для сефадексов типа G-75, G-100, G-150, G-200. Ход работы. За 2–3 часа перед работой колонку с сефадексом следует перенести в холодильник. Исследуемую белковую смесь растворяют в буферном растворе и вносят в колонку. В аналитической работе объем наносимого образца должен занимать не более 1–2 % объема колонки. Перед использованием колонки определяют ее свободный объем (Vсв.). Для этого через колонку пропускают 1 мл (1 мг/мл) раствора голубого декстрана (линейный водорастворимый полиглюкан с молекулярной массой 15 около 2 млн, несущий ковалентно присоединенные хромофорные группы) в соответствующем буфере. Наиболее яркую фракцию определяют либо визуально, либо спектрофотометрически при 630 нм. После определения свободного объема через колонку последовательно пропускают растворы соответствующих белков-маркеров (по 3–4 мг в объеме 0.5–1 мл). Белки удобно наносить последовательно в порядке уменьшения их молекулярной массы с интервалом, зависящим от размера колонки. Во время нанесения белков колонку перекрыть. Элюат, вытекающий из колонки со скоростью 15–20 мл/ч, собирают небольшими порциями (1–2 мл). Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при 280 нм. Оптическую плотность растворов, содержащих рибонуклеазу, определяют при 230 нм, цитохром с – при 412 нм. Строят профиль элюции отдельных белковых фракций. Для этого вычерчивают график, на горизонтальной оси которого откладывают номера фракций или объем прошедшей через колонку жидкости, а на вертикальной оси – величины оптической плотности фракций. Затем строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы белков-маркеров и объемом элюирования с колонки. После построения калибровочного графика на колонку наносят исследуемый белок и, определив объем элюции, находят по графику его молекулярную массу. Хранить сефадекс можно в набухшем состоянии (в холодильнике), добавив к нему 0.02%-й азид натрия. Для перевода сефадекса в первоначальное состояние его перемешивают несколько минут с 2-кратным объемом 50%-го этанола и фильтруют на воронке Бюхнера. Затем перемешивают 30 мин с 2-кратным объемом неразведенного этанола и опять фильтруют. Обработку неразведенным спиртом повторяют несколько раз. Осадок высушивают в термостате при 60–80 °С. ТЕМА 2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ Электрофорез занимает центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молеку16 лярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности. Работа 1. Нативный ступенчатый электрофорез Диск-электрофорез широко применяется в настоящее время для проверки гомогенности ферментных препаратов. Этот метод достаточно быстрый, характеризуется высокой разрешающей способностью и воспроизводимостью, требует небольших количеств исследуемого материала. Используется он и для других целей, например, для идентификации изоферментов, определения молекулярной массы белков и их субъединиц и т. д. Диск-электрофорез – метод, сочетающий в себе разделение макромолекул по их общему электрическому заряду, по величине молекулярной массы и по форме. Использование двухслойного носителя с различным размером пор и пары буферов, отличающихся между собой по составу и по значению рН, обеспечивает концентрирование веществ в узкой стартовой зоне. Это является существенным для четкого разделения компонентов смеси. Процедура: ПААГ – синтетический продукт, выполняющий функции молекулярного сита, он химически стабилен и инертен. Прозрачен, лабилен, устойчив к изменениям рН и температуры и не растворим в большинстве растворителей. Получают его путем сополимеризации акриламида (CH2=CH-CO-NH2) и сшивающего агента метиленбисакриламида. Подбирая соответствующую концентрацию акриламида, получают гель с нужным размером пор. При работе с глобулярными белками рекомендуют пользоваться соотношением между средней величиной молекулярной массы разделяемых белков (Мr) и концентрацией (с) акриламида, которую нужно взять для полимеризации: с, % Мr < 10 000 > 30 10 000–30 000 15–30 30 000–100 000 7,5–15 >100 000 < 7,5 В качестве катализаторов при получении ПААГ используются персульфат аммония и тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). 17 Физический принцип метода. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала. Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом связываться с белками, а скорость его продвижения по гелю должна быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно отрываться от белков, чтобы его прохождению до конца пластины или трубки соответствовало использование большей части находящегося в них геля для фракционирования белков. В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки заряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых белков в комплексе с ДДС-Na (см. ниже) используют отрицательно заряженные красители. Наибольшее распространение получил бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфенольных остатка. 18 Для характеристики электрофоретической подвижности белков в данных условиях электрофореза принято указывать отношение расстояния, пройденного белковой полосой от начала рабочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозначают Rf. Оборудование и реактивы. Прибор для проведения электрофореза, центрифуга. Растворы для гелей: 1) 1 н. HCl – 48 мл, трис – 36.6 г, тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) – 0.23 мл в 100 мл водного раствора, рН 8.9; 2) 30 г акриламида, 0.8 г метиленбисакриламида в 100 мл водного раствора; 3) 1.4 мг/мл персульфата аммония; 4) 6.4 мл 1М H3PO4, 1.43 г трис, 0.02 мл ТЕМЕД в 25 мл раствора, рН 6.9; 5) 2.5 г акриламида, 0.63 г метиленбисакриламида в 25 мл водного раствора; 6) 40 мг/л рибофлавина. Все растворы, кроме (3), можно хранить в холодильнике несколько месяцев, раствор (3) – не более недели. Для приготовления смесей используются нагретые до комнатной температуры растворы. Разделяющий гель (7.5 %): сливают вместе 1 часть раствора (1), 2 части раствора (2), 1 часть Н2О, 4 части раствора (3). Гель образуется в течение 30 мин. Концентрирующий гель: сливают вместе 1 часть раствора (4), 2 части раствора (5), 1 часть растовра (6), 4 части Н2О. Гель (2.5 %) формируется за 15–30 мин в зависимости от интенсивности синих лучей солнца, или люминесцентной лампы. Электродный буфер: 1 г трис, 5 г глицина в 1 л водного раствора (рН 8.3). 0.001%-й раствор бромфенолового синего, 40%-я сахароза. Ход работы. Белки из растительной ткани экстрагируют подходящим буфером. Его состав мало влияет на результаты разделения белков, определяемые составом буферов в ПААГ и электродных сосудах. Для более четкого разделения белков экстракт очищают от низкомолекулярных примесей пропусканием через колонку с сефадексом G-25. Эта процедура необходима, если исходный экстракт имеет высокую ионную силу. Затем белковый экстракт уплотняют глицерином или сахарозой, доводя их концентрацию в растворе до 10–20 %, и добавляют 1 каплю раствора бромфенолового синего на 1–2 мл экстракта. На 1 см2 поверхности геля наносят 0.1–2 мг белка в растворе. В течение 15–40 мин проводят концентрирование белков при 100–200 В, 3–6 мА/см2. За это время белки проходят концентрирующий гель и соби19 раются на старте разделяющего геля. Разделение белков ведут при 300 В, 10–5 мА/см2 в течение 1.5–2 ч, пока полоса лидирующего красителя не приблизится к нижней границе геля. Гели окрашивают на активность и на гомогенность соответствующими методами. Работа 2. Электрофорез белков с ДДС по Лэммли Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсульфата натрия (ДДС) в присутствии β-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в ПААГ белковые зоны распределяются таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. ДДС – ионное соединение с поверхностно-активными свойствами, часть молекул отрицательно заряжена. ДДС адсорбируется на гидрофобных участках цепи, что приводит к денатурации белка. Т. к. предварительная обработка белка и последующий электрофорез проводят в ДДС, то в данном случае фактически определяют молекулярную массу отдельных полипептидных цепей. Оборудование и реактивы. Прибор для электрофореза, водяная баня. Электродный буфер: 1.2 г трис, 5.7 г глицина, 0.1 % ДДС в 1 л водного раствора, рН 8.3. Буфер для проб: 0.756 г трис, 1 г ДДС, 10 мл глицина, 5 мл β-меркаптоэтанола, 1 мг бромфенолового синего, концентрированная HCl до рН 6.8 в 100 мл раствора. Растворы для гелей: 1) 30 г акриламида, 0.8 г N,Nметиленбисакриламида в 100 мл водного раствора, 2) 280 мг персульфата аммония в 100 мл водного раствора, 3) 18.6 г трис, 0.4 г ДДС, концентрированная HCl до рН 8.8 (примерно 2.7 мл) в 100 мл водного раствора, 4) 6.04 г трис, 0.4 г ДДС, концентрированная HCl до рН 6.8 (примерно 4.6 мл) в 100 мл раствора воды. Все растворы, кроме раствора (2), можно хранить несколько месяцев в холодильнике, раствор (2) готовить еженедельно. Разделяющий гель (15 % акриламида, 0.375 М трис-буфера, 0.1 % ДДС): 2 части раствора (1), 1 часть раствора (2), 1 часть раствора (3), 0.0012 части ТЕМЕД. Полимеризуется за 30–40 мин при комнатной температуре (сли20 вают нагретые до комнатной температуры растворы). Концентрирующий гель (5 % акриламида, 0.125М трис-буфера, 0.1 % ДДС): 2 части раствора (1), 3 части раствора (2), 3 части раствора (4), 4 части воды, 0.0072 части N,N,N',N-тетраметилэтилен диамина (ТЕМЕД). Полимеризуется за 30–40 мин при комнатной температуре. Ход работы. Пробу смешивают с буфером для проб в соотношении 1 : 1 и нагревают на водяной бане при 80 оС в течение 5 мин. На 1 см2 поверхности геля наносят 0.1–2 мг белка в растворе. До тех пор пока белки не войдут в гель, электрофорез ведут при 50 В. Напряжение 100 В поддерживают, пока белки не достигнут разделяющего геля. Разделение ведут при 200 В в течение 2 ч и заканчивают, когда полоса лидирующего красителя приблизится к концу геля. Для построения калибровочной кривой и определения молекулярной массы субъединиц используются стандартные маркерные белки (кДа): целлюлаза – 94,6; бычий сывороточный альбумин – 66,2; яичный альбумин – 45; карбоангидраза – 31; лизоцим – 14,4; цитохром с – 12,5. После проведения электрофореза гели окрасить по методике с нитратом серебра. Гели хранить в 7%-й уксусной кислоте. Для расчета молекулярной массы субъединиц фермента с помощью ДДС-ПААГ электрофореза необходимо построить калибровочную кривую по белкам с известной молекулярной массой. Работа 3. Универсальное окрашивание белков в ПААГ Как только прекращается действие электрического поля, разделившиеся белковые зоны склонны «расплываться» в силу тепловой диффузии. Поэтому сразу после окончания разделения белки необходимо фиксировать в тех местах геля, куда они успели дойти. Проще всего это сделать осаждением из раствора прямо в геле. Для фиксации осаждением пригодны крепкие растворы уксусной кислоты или трихлоруксусной кислоты. Часто фиксацию белков совмещают с их окрашиванием. Наиболее часто для прокрашивания белка после электрофореза в ПААГ используется амидо-черный 10В и кумасси бриллиантовый синий R-250. Второй из них более чувствительный, равномернее связывается с различными белками, слабо сорбируется ПААГ и поэтому легко от него отмывается. Однако после 21 прокрашивания с помощью кумасси близко расположенных друг от друга белковых полос между ними может остаться окрашенный фон. Препараты амидо-черного не отличаются постоянством своих характеристик, и результаты окрашивания при использовании различных партий этого красителя могут быть не похожи друг на друга. На порядок величины лучшую чувствительность дает окрашивание белков ионами серебра. После осаждения белков трихлоруксусной кислотой и ацетоном, тщательной промывки ацетоном и водой гель переносят на 8 минут в 0.1%-й раствор AgNO3. Затем после отмывки водой в такой же объем карбоната натрия и 0.02%-й формальдегид. Окрашенные полосы белка появляются через несколько минут. Механизм окрашивания неясен, но, по-видимому, он в чем-то сходен с восстановлением серебра в фотографическом процессе. Оборудование и реактивы. Реакционная смесь 1: 25%-я ХУ, 30%-й этиловый спирт, 200 мг кумасси на 100 мл воды. Реакционная смесь 2: 1 г амидо-черного 10В растворить в 100 мл 7%-й уксусной кислоты. Реакционная смесь 3: 58.5 мл 50%-й ацетон, 1.5 мл 50%-й ТХУ, 0.1 мл формальдегида. Реакционная смесь 4: 0.1 мл 10% Na2S2O3 в 60 мл Н2О. Раствор тиосульфата следует готовить непосредственно перед проявлением. Реакционная смесь 5: 0.12 г AgNO3, 0.6 мл формальдегида довести до 60 мл Н2О. Реакционная смесь 6: в 60 мл Н2О внести 1.2 г Na2CO3, 0.06 мл 10%-го раствора Na2S2O3, 0.06 мл формальдегида. Ход работы. 1. Проявление белков с помощью кумасси бриллиантового синего R-250. После проведения электрофореза извлечь гелевую пластинку и поместить в реакционную смесь 1 на 3–24 часа. Краситель, не связанный с белком, отмывают 7%-й уксусной кислотой. Для этого раствор красителя заменяют отмывающим раствором на 1–2 часа, повторяя эту процедуру несколько раз. Хранят отмытый гель в том же растворе, который использовался для его отмывания. 22 2. Проявление протеинов с помощью амидо-черного 10В. Поместить гелевую пластинку в реакционную смесь 2 на несколько суток, после чего промыть окрашенный гель несколько раз водой. В свежеприготовленном красителе белковые полосы окрашиваются в темносиний цвет, в постоявшем – почти в черный. 3. Окрашивание белков нитратом серебра. 1. Фиксация: поместить гелевую пластину в реакционную смесь 3 на 20 минут. 2. Отмыть гель водой в течение 5–10 минут. 3. Предобработка геля 50%-м ацетоном в течение 5–10 мин. 4. Залить гелевую пластинку реакционной смесью 4 на 1 минуту, после чего отмыть гель несколько раз водой. 5. Окраска серебром: поместить гель на 8 мин в реакционную смесь 5, после чего отмыть его несколько раз водой. 6. Проявление: опустить гель в реакционную смесь 6 до появления белковых полос. 7. Для хранения залить гелевую пластинку 7%-й уксусной кислотой. Работа 4. Специфическое проявление белков в ПААГ Ферментативную активность белковых компонентов исследуемой смеси после электрофоретического разделения можно выявить либо после элюции их из геля, либо непосредственно в геле. В первом случае гель разрезают на отдельные диски, гомогенизируют в соответствующем буфере, центрифугируют или фильтруют и в надосадочной жидкости измеряют ферментативную активность. Во втором случае белковые полосы специфически прокрашивают непосредственно в геле. Оборудование и реактивы. Реакционная смесь 1: 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 8.3, 20 мМ малат, 3мМ НАД+, нитросиний тетразолий (предварительно растворенный в 0.5 мл этиленгликоля) и феназинметасульфат в расчете 4 мг на 10 мл раствора. Реакционная смесь 2 (указаны конечные концентрации): 2-амино-2метил-1,3-пропандиольный буфер – 25 мМ, рН 8.5, цитохром с – 2 %, мочевина – 2 М, хлористый кальций – 1.2 мМ. Реакционная смесь 3: 25 мМ 2-амино-2-метил-1,3-пропандиольный буфер, рН 8.5, содержащий 1.2 мМ хлористый кальций. 23 Ход работы. 1. Специфическое проявление дегидрогеназ. Дегидрогеназы после их электрофоретического разделения в ПААГ обычно прокрашивают с помощью нитросинего тетразолия. Этот метод успешно используется для выявления многих и неокислительных ферментов, каталитическая активность которых может быть определена с использованием дегидрогеназ в качестве вспомогательных ферментов. Сущность метода заключается в следующем. Под действием дегидрогеназы в присутствии соответствующего субстрата происходит восстановление НАД+ (или НАДФ+). При участии феназинметасульфата (который выполняет роль вспомогательного переносчика) водород затем переносится на нитросиний тетразолий. Этот краситель в окисленном состоянии имеет желтую окраску и хорошо растворим в воде. Его восстановленная форма (диформазан) практически нерастворима в воде и окрашена в фиолетовый цвет. Восстановленная форма красителя сорбируется на той белковой фракции в геле, под действием которой произошло восстановление НАД+ (НАДФ+). Таким образом, появление окрашенной полосы будет свидетельствовать о наличии в геле исследуемого фермента; вместе с тем идентифицируется его местоположение. Для прокрашивания белковых полос на малатдегидрогеназную активность гель после окончания электрофореза сразу вынимают из пластинки, споласкивают в воде или буферном растворе и помещают в реакционную смесь 1. Гель инкубируют в темноте при 37 оС в течение 15–120 мин. После прокрашивания гель промывают дистиллированной водой и хранят в 7%-й уксусной кислоте. Окраска стабильна в течение недели. 2. Выявление протеаз. Если после диск-электрофореза препарата протеазы гель выдержать в растворе денатурированного цитохрома с, то за счет протеолитического действия на общем коричневом фоне геля проявится светлая полоса, которая соответствует положению протеазы в геле. Сразу после окончания электрофореза гель споласкивают дистиллированной водой или буферным раствором, помещают в реакционную смесь 2 и инкубируют при 37 оС в течение 1 ч. Затем гель переносят в реакционную смесь 3, и выдерживают еще час при той же температуре, после чего помещают в 12.5%-й раствор ТХУ. 24 ТЕМА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ Кинетика ферментативной реакции (т. е. зависимость скорости реакции от ее условий) определяется в первую очередь свойствами катализатора, вследствие чего она значительно сложнее, чем кинетика некаталитических реакций. Ферментативная активность зависит, в основном, от следующих факторов: концентрация фермента и субстрата, рН, присутствие ингибиторов и активаторов. Работа 1. Определение константы Михаэлиса Если фермент подчиняется кинетике Михаэлиса – Ментен, можно определить кинетические параметры реакции: константу Михаэлиса (Км) и максимальную скорость. V [S] V = max K m + [S] В случае односубстратной реакции задача сводится к получению серии данных, характеризующих зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата, и к соответствующей графической обработке этих данных. В более часто встречающихся случаях двух- или трехсубстратной реакции эксперимент ставят таким образом, чтобы, меняя концентрацию одного из субстратов, обеспечить присутствие другого в насыщающей концентрации. Условия проведения ферментативной реакции. Прежде чем приступить к постановке кинетических экспериментов, необходимо выполнить ряд условий. 1. Подобрать концентрацию фермента, при которой скорость реакции была бы пропорциональна количеству добавляемого белкакатализатора. 2. Подобрать условия инкубации, при которых обеспечивалось бы постоянство всех параметров кроме того, который исследуется, т. е. в ходе эксперимента не должна изменяться температура. 3. Начинать реакцию следует внесением фермента или одного из субстратов, добавляемых в минимальном объеме при быстром перемешивании реакционной смеси. 25 4. Обеспечить условия измерения начальной скорости реакции, поскольку скорость ферментативной реакции со временем снижается. Это можно объяснить снижением степени насыщения фермента субстратом, который расходуется в процессе ферментативной реакции; увеличением скорости обратной реакции (если реакция обратима); возможным ингибированием фермента образующимися продуктами реакции; изменением условий, например, снижением рН в ходе реакции; инактивацией фермента и др. Оборудование и реактивы. Спектрофотометр, кюветы, пипетки, гомогенный ферментный препарат МДГ. Среда спектрофотометрирования: 50 мМ трис-HCl буфер, рН 9.0, 1 мМ НАД+. Отдельно готовится 50 мМ малат (М.в. 134.1 г/л). Ход работы. Для определения константы Михаэлиса МДГ по малату в 2 мл среды спектрофотометриярования внести 0.01 мл раствора МДГ и начать реакцию добавлением различных концентраций малата – от 0.25 мМ до 2.5 мМ (при внесении 0.01 мл 50 мМ малата в кювету концентрация субстрата в среде спектрофотометрирования будет соответствовать 0.25 мМ). Измерить скорость ферментативной реакции при 10 различных значениях концентрации малата (0.25 мМ, 0.5 мМ, 0.75 мМ, 1.0 мМ, 1.25 мМ, 1.5 мМ, 1.75 мМ, 2.0 мМ, 2.25 мМ, 2.5 мМ). Далее построить график в двойных обратных координата (по Лайнуиверу – Берку), и определить с его помощью Км МДГ по малату. 26 Работа 2. Определение зависимости скорости реакции от температуры Скорость ферментативной реакции повышается в 1,5–2,2 раза с повышением температуры на 10 оС. Поэтому такого понятия, как «температурный оптимум активности», не существует. Вместе с тем в условиях экcперимента существует определенное значение температуры, при котором активность фермента максимальна; дальнейшее увеличение температуры приводит к снижению скорости реакции. Следует иметь в виду, что это происходит в результате денатурации части фермента. Оптимальная температура действия фермента зависит от соотношения между влиянием температуры на скорость ферментативной реакции, с одной стороны, и на скорость денатурации фермента – с другой. Оборудование и реактивы. Водяная баня, термостат, пробирки, спектрофотометр, раствор слюны, йод, 1%-й раствор крахмала. Ход работы. 1. Исследование влияния температуры на активность амилазы слюны. В 4 пробирки наливают по 5 мл 1%-го раствора крахмала. Первую пробирку помещают в кипящую водяную баню, вторую – в термостат при 40 оС, третью оставляют при комнатной температуре, четвертую помещают на лед. Через 10 минут во все пробирки, оставляя их в тех же условиях, прибавляют по 1 мл раствора слюны и перемешивают. Гидролиз крахмала наблюдают в реакции с йодом. Для этого на стеклянную пластинку наносят несколько капель раствора йода и смешивают их с каплями смеси, которую отбирают из каждой пробирки через 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 мин. По изменению окрашивания раствора крахмала с йодом судят о степени гидролиза в каждой пробирке. В пробирке, которая содержалась на водяной бане при 100 оС, смесь окрашивается в синий цвет, поскольку фермент инактивирован, и гидролиз крахмала здесь не происходит. В других пробирках окраска зависит от степени гидролиза крахмала: в пробирке, находившейся в термостате, раствор приобретает желтый цвет, в третьей и четвертой – красный или фиолетово-красный. Сделать вывод о влиянии температуры на скорость протекания биохимической реакции. 27 Работа 3. Определение зависимости скорости реакции от рН Разные ферменты максимально активны при разных значениях рН; при рН выше и ниже оптимальной их активность снижается. Оптимум рН обычно находится в пределах, близких к нейтральной среде. Для некоторых энзимов – в кислой или щелочной области. Эффект рН складывается из влияния на стабильность фермента и на величину ионизации функциональных групп его белковой части, субстратов и кофакторов. Для экспериментального определения оптимума рН измеряют скорость ферментативной реакции, используя буферные растворы с различными значениями водородного показателя. На кривую зависимости активности фермента от рН существенное влияние могут оказывать такие факторы, как состав буфера и величина ионной силы. Оборудование и реактивы. 0.1 М фосфатный буфер с значениями рН 5.8, 6.2, 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0, раствор слюны, 0.1%-й раствор йода в 0.2%-м растворе йодида калия, 1%-й раствор крахмала. Ход работы. Определение влияния рН на активность амилазы слюны по изменению интенсивности окрашивания раствора крахмала с йодом. Для этого в семь пробирок налить по 2 мл фосфатного буферного раствора с различными значениями рН (5.8, 6.2, 6.6, 6.8, 7.2, 7.6, 8.0). Затем прилить по 5 мл 1%-го раствора крахмала и по 1 мл слюны. Содержимое пробирок перемешать и поместить в термостат на 10 мин при 38 оС. После инкубации в термостате во все пробирки прибавляют по 5 капель йода, перемешивают, наблюдают окраску и отмечают активность. Для амилазы слюны оптимум рН 6.8, а в кислой и щелочной среде активность фермента снижается. Работа 4. Исследование влияния ингибиторов Ингибиторы, специфически взаимодействующие с ферментами, делятся на две группы – необратимые и обратимые. Действие необратимых ингибиторов можно наблюдать, блокируя функционально важные группы ферментов (например, модифицируя SH-группы йодацетатом). Большинство ингибиторов ферментов действуют обратимо, т. е. не вносят в молекулу фермента каких-либо изменений после своей диссоциации. Обратимое ингибирование может быть конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное. Конкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор и 28 субстрат имеют сходные структуры и конкурируют за связывание с активным центром фермента. Неконкурентное ингибирование наблюдается, когда ингибитор и фермент не сходны по структуре и ингибитор присоединяется к регуляторному центру фермента. При бесконкурентном ингибировании ингибитор присоединяется к комплексу фермент–субстрат. Принцип действия ингибитора, тип его ингибирования определяют путем сравнения кинетики реакции в присутствии ингибитора и без него. Для определения констант ингибирования используются различные координаты – Лайнуивера – Берка, Иди – Хоффсти, Уэбба и пр. Для определения типа ингибирования и величины Кi широко используется метод Диксона. Если построить зависимость 1/Vo от [I] при различных [S], то абсцисса общей точки пересечения этих прямых линий дает константу ингибирования, т. е. этот метод требует измерения изменения скорости реакции при нескольких заданных постоянных концентрациях субстрата при изменении концентрации ингибитора. Оборудование и реактивы. 1) 1%-й раствор NaCl, CuSO4, раствор слюны, йод. 2) 1%-й раствор малоновой кислоты, 1%-й раствор метиленового синего, ткань поперечно-полосатой мышцы. 3) спектрофотометр, среда спектрофотометрирования МДГ (50 мМ трис-НCl буфер, рН 7.5, 0.15 мМ НАДН, две различные концентрации оксалоацетата: 0.05 мМ и 0.15 мМ), 100 мМ MnCl2 (М.в. 198 г/л), гомогенный ферментный препарат. Ход работы. 1. Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы слюны • В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, во вторую – 8 капель воды и 2 капли 1%-го раствора хлорида натрия, в третью – 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди (II). • В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной (1 : 10) слюны, содержимое пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин. • В это время готовят три пробирки с водой (по 1 мл в каждой), подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 2–3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В первой пробирке появляется фиолетовая или краснобурая окраска, во второй пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в третьей пробирке, где ионы меди тормозят 29 действие амилазы, окраска остается синей. Если описанной картины не наблюдается, то опыт повторяют через 10 мин. Результаты вносят в таблицу. • Записывают в тетрадь полученные результаты. Делают выводы о характере влияния хлорида натрия и сульфата меди на активность амилазы. 2. Выявление ингибирующего действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы (в присутствии соединений, структурно сходных с янтарной кислотой (малоновая, щавелевая, глутаровая, фенилпропионовая), но неспособных дегидрироваться, может происходить блокирование активного центра сукцинатдегидрогеназы и тем самым тормозить протекание нормальной реакции). В 3 пробирки внести по 3–4 г тщательно измельченной ткани поперечно-полосатой мышцы. В первую прибавить 0,4 мл дистиллированной воды, во вторую – 0,2 мл 1%-го раствора малоновой кислоты и 0,2 мл воды, а в третью – 0,4 мл 1%-го раствора малоновой кислоты. Во все пробирки долить по 1 мл 1%-го раствора янтарной кислоты, и по 2–3 капли 1%-го раствора метиленового синего. Содержимое пробирок перемешать, добавить по 3–4 капли вазелинового масла и выдерживать в термостате при 38 оС. Через 5–10 мин в первой пробирке произойдет почти полное исчезновение голубой окраски, некоторое уменьшение интенсивности окраски во второй пробирке и полное сохранение ее в третьей. 3. Определение типа ингибирования и значения Ki МДГ ионами цинка (по Диксону). Для этого следует измерить скорость ферментативной реакции при добавлении в среду спетрофотометрирования ионов Mn2+ в концентрациях 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 мМ (при внесении 0.01 мл 100 мМ MnCl2 в 2 мл кювету концентрация субстрата в среде спектрофотометрирования будет соответствовать 0.5 мМ). Измерение следует провести с различными концентрациями оксалоацетата – 0.05 мМ и 0.15 мМ. Концентрация НАДН и объем внесения фермента остаются неизменными. Далее построить график зависимость 1/Vo от [Mn2+] при различных концентрациях оксалоацетата, и определить с его помощью тип ингибирования и Ki. 30 Приложение 1 Приготовление растворов (NH4)2SO4 различной степени насыщения Степень насыщения раствора при 0 о С, % 0 5 10 15 20 31 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Количество (г) твердого (NH4)2SO4 различной степени насыщения на каждые 100 мл исходного раствора 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 10,7 8,0 5,4 2,6 0 13,6 10,9 8,2 5,5 2,7 16,6 13,9 11,1 8,3 5,6 19,7 16,8 14,1 11,3 8,4 22,9 20,0 17,1 14,3 11,5 26,2 23,2 20,3 17,4 14,5 29,5 26,6 23,6 20,7 17,7 33,1 30,0 27,0 24,0 21,0 36,6 33,6 30,5 27,5 24,4 40,4 37,3 34,2 31,0 28,0 44,2 41,1 37,9 34,8 31,6 48,3 45,0 41,8 38,6 35,4 52,3 49,1 45,8 42,6 39,2 56,7 53,3 50,0 46,6 43,3 61,1 57,8 54,4 51,0 47,6 65,9 62,4 58,9 55,5 51,9 70,7 67,1 63,6 60,0 56,5 0 2,7 0 5,7 2,8 0 8,5 5,7 2,8 0 11,7 8,7 5,8 2,9 0 14,8 11,9 8,8 5,9 2,9 18,2 15,0 12,0 9,0 6,0 21,4 18,4 15,3 12,2 9,1 24,8 21,7 18,7 15,5 12,5 28,4 25,3 22,1 19,0 15,8 32,1 28,9 25,8 22,5 19,3 36,0 32,8 29,5 26,2 22,9 40,1 36,7 33,4 30,0 26,7 44,2 40,8 37,4 34,0 30,6 48,5 45,1 41,6 38,1 34,7 52,9 49,5 45,9 42,4 38,8 0 3,0 0 6,1 3,0 0 9,3 6,2 3,1 0 12,7 9,4 6,3 3,1 0 16,1 12,9 9,6 6,4 3,2 19,7 16,3 13,1 9,8 6,6 23,3 20,0 16,6 13,4 10,0 27,2 23,8 20,4 17,0 13,6 31,2 27,7 24,2 20,8 17,3 35,3 31,7 28,3 24,7 21,2 0 3,2 0 6,7 3,3 0 10,2 6,8 3,4 0 13,9 10,4 6,9 3,4 0 17,6 14,1 10,6 7,1 3,5 0 Приложение 2 Некоторые свойства сефадексов Тип сефадекса G-10 G-15 G-25 (грубый) G-25 (средний) G-25 (тонкий) G-25 (сверхтонкий) G-50 (грубый) G-50 (средний) G-50 (тонкий) G-50 (сверхтонкий) G-75 G-75 (сверхтонкий) G-100 G-100 (сверхтонкий) G-150 G-150 (сверхтонкий) G-200 G-200 (сверхтонкий) 40–120 40–120 Степень набухания (в мл воды на 1 г сухого сефадекса) 1±0,1 1,5±0,2 Общий объем после набухания (в мл на 1 г сухого сефадекса) 2–3 2,5–3,5 100–300 2,5±0,2 4–6 1000–5000 3 1 50–150 2,5±0,2 4–6 1000–5000 3 1 20–80 2,5±0,2 4–6 1000–5000 3 1 10–40 2,5±0,2 4–6 1000–5000 3 1 100–300 5±0,3 9–11 1500–30 000 3 1 50–150 5±0,3 9–11 1500–30 000 3 1 20–80 5±0,3 9–11 1500–30 000 3 1 10–40 5±0,3 9–11 1500–30 000 3 1 40–120 7,5±0,5 12–15 3000–70 000 24 3 10–40 7,6±0,6 12–15 3000–70 000 24 3 40–120 10±1 15–20 4000–150 000 72 5 10–40 10±1 15–20 4000–150 000 72 5 40–120 15±1,5 20–30 5000–400 000 72 5 10–40 15±1,5 20–30 5000–400 000 72 5 40–120 20±2 30–40 5000–800 000 72 5 10–40 20±2 30–40 5000–800 000 72 5 Диаметр частиц (в сухом состоянии, мкМ) 32 Предел фракционирования белков по величине молекулярной массы до 700 до 1500 Минимальное время набухания в кипри компящей натной водятемпераной туре бане 3 1 3 1 Приложение 3 Ионообменные адсорбенты, обычно используемые для хроматографии белков Область Способная к ионизации Обозначение диссоМатрица группа циации, рН Анионообменники: аминоэтил-(АЭ-) – О – CH2 – CH2 –NH2 4–9 Целлюлоза Целлюлоза, седиэтиламиноэтил – O – CH2 – CH2– 6–9 фадекс, биогель (ДЭАЭ-) N(C2H5)2 триэтиламиноэтил – O – CH2 – CH2 – 6–9 Целлюлоза (ТЭАЭ-) – N+ (C2H5)3 – O – CH2 – CH2– Целлюлоза, сегуанидиноэтил– NH – C –NH2 8,5–10 фадекс (ГЭ-) NH Катионообменники: Целлюлоза, секарбоксиметил4–6 – O – CH2 – COOH фадекс, биогель (КМ-) 2–4 Целлюлоза, фосфо-(Ф-) – O – PO3H2 (7–10) сефадекс 2–4 Целлюлоза, – O – CH2 – CH2 – O – сульфоэтил-(СЭ-) (7–10) сефадекс SO3H 33 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман. – М. : Наука, 1985. – 536 с. 2. Практикум по биохимии / под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. – М. : Изд-во МГУ, 1989. – 509 с. 3. Практикум по биохимии растений / С.М. Щипарев [и др.]. – СПб. : Изд-во СПб. ун-та, 1996. – 200 с. 4. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. – М. : Высш. шк., 1980. – 272 с. 5. Клиническая биохимия / В.Н. Бочков [и др.]. – М. : Изд-во МГУ, 2004. – 506 с. 6. Чиркин А.А. Практикум по биохимии / А.А. Чиркин. – Минск : Новое знание, 2002. – 512 с. 7. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии / Л.М. Пустовалова. – Ростов н/Д. : Феникс, 1999. – 540 с. 34 Учебное издание Климова Мария Александровна, Епринцев Александр Трофимович ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИХ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ Учебно-методическое пособие для вузов (Практикум) Редактор И.Г. Валынкина Подписано в печать 25.08.08. Формат 60×84/16. Усл. печ. л. 2,09. Тираж 50 экз. Заказ 1295. Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. 394000, г. Воронеж, пл. им. Ленина, 10. Тел. 208-298, 598-026 (факс) http://www.ppc.vsu.ru; e-mail: pp_center@ppc.vsu.ru Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3. Тел. 204-133. 35 36
