Полный текст диссертации 25.03.2015 г.

Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Федеральный центр охраны здоровья животных»
(ФГБУ «ВНИИЗЖ)
На правах рукописи
Абдуллоев Хушбахт Сатторович
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА
ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА QX
06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с
микотоксикологией и иммунология»
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Макаров Владимир Владимирович
Научный консультант:
кандидат ветеринарных наук
Фролов Сергей Владимирович
Владимир-2015
2
Оглавление
Введение
4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
10
1.1 Общие сведения о болезни
10
1.2 Таксономия вируса
11
1.3 Физико-химические свойства вируса
11
1.4 Особенности эпизоотологии и патогенез
12
1.5 Диагностика и классификация штаммов вируса ИБК
13
1.6 Инфекционная активность вируса ИБК
19
1.7 Иммунитет
23
1.7.1 Пассивный иммунитет
23
1.7.2 Активный иммунитет
24
1.8 Контроль и профилактика ИБК
27
1.9 Заключение по обзору литературы
31
2. Собственные исследования
33
2.1 Материалы
33
2.2 Методы исследования
36
2.2.1 Оценка эпизоотической ситуации
36
2.2.2 Подготовка вируссодержащего материала
36
2.2.3 Определение условий культивирования штамма QX вируса
ИБК на куриных эмбрионах
36
2.2.4 Репродукция вируса на культурах клеток
36
2.2.5 Титрование вируса
36
2.2.6 Определение степени антигенного родства
37
2.2.7 Оценка патогенных свойств штамма QX
38
2.2.8 Оценка
протективной
функции
вакцины
из
штамма
Н120 серотипа Mass против заражения штаммом QX
38
2.2.8.1 Тест на цилиостаз
38
2.2.8.2 Выделение нуклеиновой кислоты
39
3
2.2.8.3
ПЦР
с
обратной
транскрипцией
и
(ОТ-ПЦР)
секвенирование фрагмента гена S1
39
2.2.9 Статистическая обработка результатов экспериментов
39
3. Результаты собственных исследований
40
3.1 Вирус ИБК генотипа QX. Эпизоотическая ситуация
40
3.2 Культивирование вируса ИБК штамма QX в КЭ и в культурах
клеток
44
3.3 Оценка антигенной чистоты рабочих расплодок
51
3.4
Изучение
антигенной
«удаленности»
штамма
QX
по
отношению к другим штаммам вируса ИБК
53
3.4.1 Исследование гомологичной нейтрализующей активности
иммунных сывороток крови кур
54
3.4.2 Оценки антигенной удаленности штамма QX по отношению к
другим штаммам вируса ИБК
56
3.4.3 Сравнение антигенных свойств вируса ИБК штаммов QX и
L1148 в реакциях с сыворотками к вирусам Н120, 4/91, D27, и QX
63
3.5 Патогенные свойства штамма QX
65
3.6 Использование теста на цилиостаз и ПЦР для оценки
результативности вакцинации (протективного действия) вакцины
71
3.7 Обсуждение результатов исследования.
80
4. Выводы
88
5. Практические предложения
89
6. Список литературы
92
Приложения
112
4
Введение
Актуальность
темы.
Инфекционный
бронхит
кур
–
вирусная
высококонтагиозная болезнь птиц, возбудителем которой является представитель
третьей группы семейства Coronaviridae Gammacoronavirus, Avian infectious
bronchitis virus. Болезнь имеет широкое распространение и поражает птиц всех
возрастов и направлений продуктивности. Характеризуется многообразием
клинических признаков, вызывая поражения респираторной, мочевыделительной,
репродуктивной и пищеварительной систем. Развитие заболевания среди
восприимчивого поголовья сопровождается значительными экономическими
потерями, которые складываются из гибели молодняка птиц (до 20% поголовья),
снижения привесов, снижения яичной продуктивности, отрицательной конверсии
корма и др. Профилактические мероприятия, направленные на предупреждение
инфекции, значительно осложняются антигенной вариабельностью возбудителя,
количество вариантов которого превышает 50 серотипов. Столь гетерогенная
популяция вируса ИБК объясняется, во-первых, природой РНК-содержащих
вирусов, склонных к мутациям, во-вторых, интенсивным применением живых
вакцин, в-третьих, иммунным прессингом со стороны вакцинированного
организма, что способствует преимущественному отбору и закреплению новых
серовариантов вируса. На сегодняшний день нет чётких рекомендаций по
классификации выделяемых изолятов вируса ИБК, но наиболее часто для этих
целей используются молекулярные и серологические методы. В настоящий
момент молекулярные методы диагностики вируса ИБК имеют первостепенное
значение в диагностике ИБК. Многочисленные исследования по классификации
штаммов вируса ИБК показали, что данные молекулярной диагностики совпадают
с данными серологической диагностики.
В
разный
период
времени
на
конкретных
территориях
имеет
распространение определённый антигенный спектр вируса ИБК. Так, на примере
Европы можно проследить, что голландские варианты вируса ИБК (штаммы
D1466, D274) были доминирующими в 1980-е гг., серотип UK793B (штамм 4/91) –
в начале 1990-х гг., итальянские штаммы серотипа Italy 02 – в конце прошлого
5
века и начале этого, а в последнее время широко распространился китайский
вирус, относящийся к генотипу QX [11, 14, 17, 74].
Вирусы, относящиеся к генотипу QX, вызывают различные клинические
формы заболевания и были выделены как от невакцинированной, так и от
вакцинированной птицы [48, 50, 58, 78, 124, 146, 158, 159]. Вирус ИБК генотипа
QX был выявлен в РФ на Дальнем Востоке еще в 2001 г. [5], затем вирус был
обнаружен и в европейской части РФ [15]. В РФ за последние годы было
выделено несколько изолятов, относящихся к генотипу QX из птицехозяйств
Ивановской, Ростовской, Ульяновской областей и Краснодарского края. В связи с
выделением в РФ относительно нового и малоизученного вируса ИБК генотипа
QX
существует
научный
и
практический
интерес
к
изучению
его
иммунобиологических свойств. Таким образом, изучение иммунобиологических
свойств вируса ИБК генотипа QX штамма IBV RF 08-10 (далее по тексту штамма
QX) является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.
Степень разработанности проблемы. Изучению вопросов экологии,
фенотипических свойств вируса ИБК, а также разработке мер борьбы с болезнью
посвящено много научных публикаций. И в принципе на сегодняшний момент
отработан подход к диагностике, культивированию и разработке средств
профилактики в случае возникновения нового вируса ИБК актуального
антигенного типа.
Впервые вирус ИБК генотипа QX был выделен и охарактеризован учеными
из КНР, которые выделили вирус от бройлеров с поражением железистого
желудка. Позже генетически идентичные вирусы выявляли в странах ЕС, в
России, на Ближнем Востоке от больных птиц с признаками нефрозо-нефрита и
патологией репродуктивной системы. Генетически схожие изоляты вируса ИБК,
выделенные в разных странах, стали называть «QX-подобными».
Главным средством диагностики вируса ИБК являются молекулярные
методы. На сегодняшний момент в базе данных GenBank представлена
нуклеотидная последовательность генетически родственных штаммов этого
генотипа. Для серологической идентификации вирусов генотипа QX доступны
6
коммерческие наборы на основе РТГА. В плане вирусологических исследований
вируса генотипа QX, помимо работ зарубежных учёных, некоторый опыт имеется
и в ФГБУ «ВНИИЗЖ». В первую очередь здесь проводятся молекулярные
исследования данного вируса и по результатам полногеномного секвенирования
было показано, что генотип QX вируса ИБК значительно отличался от референсштаммов вируса ИБК и имел всего 60% гомологии по аминокислотной
последовательности.
Также
проводились
вирусологические
исследования,
направленные на изучение патогенности вируса для цыплят. В результате его
патогенность не была установлена [15].
В связи с широкой распространенностью вируса ИБК серотипа D 388 (т.н.
QX-подобный
штамм)
в
странах
Европы
разрабатывается
стратегия
специфической профилактики и борьбы с ним. Зарубежными учеными изучена
протективность «классической» вакцины на основе штамма Н120 серотипа Mass
против вируса генотипа QX [87]. Также было доказано, что последовательная
иммунизация цыплят против ИБК вакцинами из разных серотипов: Mass и 793/В –
обеспечивает высокий уровень защиты против заражения вирулентным вирусом
генотипа QX [146]. Голландскими учёными была разработана живая вакцина на
основе аттенуированного в КЭ штамма вируса генотипа QX [87]. Вакцина на
основе аттенуированного штамма вируса генотипа QX была разработана и
американскими учеными.8Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод, что
инфекционный бронхит кур, где этиологическим агентом является вирус генотипа
QX, является актуальной проблемой во многих странах мира, и поэтому
проводится огромная работа по изучению многих аспектов болезни.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы
являлось углубленное изучение иммунобиологических свойств вируса ИБК
генотипа QX, выделенного на территории РФ в 2010 г.
В рамках основной цели были определены следующие задачи:
- провести анализ эпизоотической ситуации по ИБК в мире и в РФ, где
этиологическим агентом выступает вирус генотипа QX;
- определить динамику накопления штамма QX вируса ИБК в КЭ;
7
- установить возможность адаптации вируса ИБК к культурам клеток
различного происхождения и определить влияние адаптации на антигенные
свойства вируса;
- изучить степень антигенного родства в реакции нейтрализации;
- определить патогенность штамма QX для птицы разного возраста;
- оценить протективные свойства коммерческой вакцины из серотипа Mass
против заражения вирусом штамма QX.
Научная новизна исследований. В процессе исследований были получены
следующие результаты, представляющие научный интерес.
1. Проанализирована эпизоотическая ситуация по ИБК, где этиологическим
агентом
является
вирус
генотипа
QX,
оценена
степень
распространенности вируса данного генотипа в России и в мире.
2. Определены условия культивирования вируса генотипа QX в КЭ.
Установлены условия для адаптации вируса к культурам клеток
различного происхождения и продемонстрировано отсутствие влияния
культивирования в искусственных условиях на антигенную структуру
вируса.
3. Выявлена степень антигенного родства вируса ИБК генотипа QX,
выделенного на территории РФ, относительно референс-штаммов вируса.
Показано, что наименьшее антигенное родство вирус генотипа QX имеет с
вирусом серотипа Mass и несколько большее, но также значительно
отличное от вируса серотипов 793/В и D274.
4. Определена степень патогенности в экспериментальных условиях для птиц
разного возраста и установлено его негативное влияние на органы
респираторной, мочевыделительной и репродуктивной систем.
Практическая и теоретическая значимость исследования. В процессе
научно-исследовательской работы по теме диссертации были разработаны три
методических
рекомендации
(одобрены
ученым
заместителем директора ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2014 г.).
советом
и
утверждены
8
Результаты, полученные при выполнении работы, позволили оценить
эпизоотическую ситуацию по ИБК генотипа QX в мире и в РФ. Установлены
основные иммунобиологические свойства вируса ИБК штамма QX, такие, как
культуральные
свойства,
патогенность
для
птицы
разного
возраста,
интенсивность репродукции вируса на неиммунной и иммунной птице с
использованием непрямых методов обнаружения вируса (оценка цилиарной
активности трахеи и ПЦР-РВ), изучена протективная активность коммерческой
вакцины из серотипа Mass в отношении вируса штамма QX.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Анализ эпизоотической ситуации по ИБК, где этиологическим агентом является
вирус генотипа QX, и оценка степени распространенности вируса данного
генотипа в России и в мире.
2. Параметры культивирования вируса генотипа QX в куриных эмбрионах.
Условия для адаптации вируса ИБК к культурам клеток различного
происхождения и её влияние на антигенные свойства вируса.
3. Степень антигенного родства штамма QX с референс-штаммами вируса ИБК.
4. Оценка протективных свойств коммерческой вакцины из серотипа Mass
против заражения вирусом генотипа QX.
5. Подход к изучению интенсивности патологического процесса, инициируемого
вирусом ИБК в организме птицы на основе непрямых методов обнаружения
вируса (оценка цилиарной активности трахеи и ПЦР-РВ).
Личный
вклад
соискателя.
Диссертационная
работа
выполнена
самостоятельно. В ходе выполнения работы практическую и консультативную
помощь оказывали сотрудники ФГБУ «ВНИИЗЖ» В.Ю. Кулаков, Д.Л. Долгов,
Б.Л. Манин и руководитель ООО «Тест-Пущино» М.В. Возняк, за что автор
выражает искреннюю признательность.
Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации
доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «Популяционное
здоровье животных и эмерджентные инфекции в современных условиях».
(Междунар. научно-практ. конф., Волгоград, 2013); «Современные проблемы
9
гуманитарных и естественных наук» (XVI Международная науч.-практ. конф.,
Москва, 2013); «Инновационные процессы в АПК» (VI Международная науч.практ. конф. преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов Москва,
2014).
Промежуточные результаты экспериментов вошли в материалы ежегодных
отчетов лаборатории профилактики болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» 20132014гг.
Публикация
научных
исследований.
По
материалам
диссертации
опубликованы 4 научных работы, в том числе 3 работы в изданиях,
рекомендованных ВАК РФ для кандидатских и докторских диссертаций.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах
компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные
исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список
литературы, который состоит из 194 источников, в том числе 171-зарубежных
авторов. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 11 рисунками и дополнена
приложением аннотаций документов.
Место
выполнения
работы.
Исследования
по
теме
диссертации
проводились в течение 2012-2015 гг. на базе лаборатории профилактики болезней
птиц
ФГБУ
«Федеральный
центр
охраны
здоровья
животных»
(ФГБУ
«ВНИИЗЖ»).
Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность научному
руководителю д.б.н., профессору Макарову Владимиру Владимировичу и к.в.н.
Фролову Сергею Владимировичу за помощь в организации и выполнении этапов
работы, а также за повседневное внимание искренне благодарит сотрудников
лаборатории профилактики болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ».
10
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Общие сведения о болезни
Инфекционный бронхит кур (ИБК) - вирусная контагиозная болезнь кур,
возбудителем которой является представитель семейства Coronaviridae, рода
Gammacoronavirus. ИБК - экономически значимое заболевание, так как
сопровождается гибелью цыплят, снижением привесов, ухудшением конверсии
корма и показателей яичной продуктивности [2, 3, 6, 188]. Несмотря на широкое
применение специфических профилактических препаратов, заболевание остается
одной из главных проблем птицеводства [2, 13, 122, 123].
Американские ученые Schalk и Hawn в 1931 г. [169] описали неизвестную
болезнь дыхательной системы молодых цыплят, которая характеризовалась
высокой контагиозностью и гибелью. Далее, Beach и Schalm в 1936 г. [34]
доказали вирусную этиологию заболевания, а в 1937 г. Baudette [122]
культивировал вирус в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Вирус ИБК –
первый представитель семейства Coronaviridae в истории изучения возбудителей
этого семейства. В последующие годы вирус ИБК, помимо респираторной
болезни, был причиной снижения яичной продуктивности, развития нефрозонефритов, миопатий и других клинических признаков.
В настоящее время заболевание встречается во всех странах мира с
развитым птицеводством. Штаммы серотипа Massachusetts (Mass) вируса ИБК
были единственным антигенным вариантом вируса до середины 1950 г. и на его
же основе изготавливались вакцины. Jungherr et al. в 1956 г. [130] в реакции
нейтрализации (РН) определили новый антигенный вариант вируса ИБК, который
отличался от вируса серотипа Mass. За последние 60 лет было выявлено и
зарегистрировано огромное количество серотипов и вариантов вируса ИБК,
которые, к сожалению, не имеют единой системы классификации. В настоящее
время считают, что столь высокое генетическое и антигенное разнообразие вируса
связано с точечными мутациями и рекомбинациями в геноме вируса [4, 50, 93,
95].
Перекрестная
защита
между
серотипами
вакцинопрофилактика этой болезни затруднительна [18].
невысока,
и
потому
11
1.2 Таксономия вируса
Вирус ИБК (Avian infectious bronchitis virus) относится к семейству
Coronaviridae роду Gammacoronavirus. По современным данным номенклатуры
вирусов семейства Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae объединяются в
недавно организованный порядок Nidovirales. Семейство Coronaviridae состоит из
родов Coronavirus (всего 4 группы), Torovirus и ряд других еще не
классифицированных коронавирусов позвоночных [123].
Коронавирусы в свою очередь имеют внутригрупповую цифровую
классификацию 1, 2, 3, 4 или альфа, бета, дельта, гамма, соответственно. Альфабета-дельта Coronavirus вызывают различные заболевания млекопитающих и
птиц. Gammacoronavirus объединяет коронавирусы птиц (ИБК, коронавирусы
индеек и фазанов). В серологических реакциях было показано значительное
антигенное внутривидовое различие коронавирусов птиц, хотя анализ генома этих
вирусов указывал на высокий процент гомологии [42, 45, 83].
1.3 Физико-химические свойства вируса
Вирус ИБК – оболочечный, округлой или плеоморфной формы вирус
размером 80-120 нм в диаметре. Геном вируса состоит из одноцепочечной РНК,
которая образует комплекс с нуклеокапсидным белком (N). Билипидная оболочка
клеточной мембраны окружает нуклеокапсид вириона, что делает вирион
чувствительным к липидным растворителям, например, хлороформу [113].
Комплекс РНК и нуклеокапсидный белок (спиральный нуклеокапсид) окружен
мембраной. Оболочка вируса содержит три вирусных белка: белок шипов (S),
гликопротеин типа I, который формирует на поверхности вируса пепломеры,
напоминающие корону, мембранный белок (М) и гидрофобный оболочечный
белок (E). Также известен ряд неструктурных белков вируса, которые участвуют в
стадии репликации [121].
Плотность частиц вируса в растворе хлористого цезия составляет 1,24 г/мл.
Большинство штаммов вируса ИБК инактивируются в течение 15 минут при 56ºС
или за 90 минут при 45ºС. Автоклавирование и воздействие микроволн
губительно сказывается на инфекционной активности вируса, но вирусная РНК
12
может быть обнаружена в ОТ-ПЦР. Вирус в составе экстраэмбриональной
жидкости (ЭЭЖ) куриных эмбрионов (КЭ) может остаться жизнеспособным в
течение многих лет при минус 30ºС, а в лиофилизированном виде – до 50 лет.
Вирус ИБК может быть выделен из инфицированных тканей, консервированных в
50% глицерине, что стоит учитывать при транспортировке образцов для
исследования. Некоторые штаммы вируса устойчивы при рН 3, тогда как
некоторые в кислой среде инактивируются. В культуре клеток вирус более
стабилен при рН 6,0-6,5 чем при рН 7,0-7,5. Вирус эфирлабильный, но некоторые
штаммы сохраняют активность после воздействия 20% эфира (4°С, 18 ч).
Воздействие 50% хлороформом при комнатной температуре в течение 10 мин и
0,1% дезоксихолатом натрия (4°C, 18 ч) полностью инактивирует вирус [144].
Вирус ИБК чувствителен к наиболее распространенным дезинфицирующим
средствам, в том числе 0,05% или 0,1% бетапропиолактону [63] или 0,1%
формалину. Бетапропиолактон не влияет на антигенные свойства вируса [145, 56].
1.4 Особенности эпизоотологии и патогенез
ИБК – заболевание преимущественно кур (Gallus gallus domesticus), но
ученым удавалось выделить вирус от фазанов, цесарок, индеек, голубей и гусей с
различными патологиями [24, 43]. Воротами инфекции являются верхние
дыхательные пути, где вирус реплицируется в эпителиальных тканях органов
дыхания, а также вирус может реплицироваться в других органах, имеющих
эпителиальные клетки (почки, яйцевод, придатки, пищевод, железистый желудок,
слепокишечные миндалины, бурса Фабрициуса).
Источником болезни является больная птица, выделяющая вирус в
окружающую среду с экскретами. Заражение в основном происходит воздушнокапельным путем или контактно через обслуживающий персонал или инвентарь.
Мнения ученых о трансовариальной передаче вируса расходятся [119].
Неодинаково мнение исследователей и о роли петушков в распространении
вируса, т.к ряд племенных хозяйств не применяет профилактическую вакцинацию
петушков [37, 151]. Ученым удавалось выделить вирус ИБК из семенников и
спермы [36]. Некоторые авторы связывали эпидидимиты и камни в придатках
13
семенников
с
воздействием
вируса
ИБК
[119,
151].
Показана
также
чувствительность птиц к болезни в зависимости от породы [39, 41, 144]. Влияние
сезонности на развитие болезни в условиях промышленного птицеводства не
имеет большого значения, так как птиц выращивают круглогодично, а
зоогигиенические
нормы
практически
одинаковы
во
всех
временных
промежутках. Несмотря на высокую чувствительность к дезинфектантам и
повсеместно проводимую специфическую профилактику в настоящее время не
существует стран, благополучных по ИБК. Некоторые штаммы вируса способны
вызывать болезнь у 100% поголовья, а смертность может достигать 20% [124].
Болезнь распространена по всему миру, однако существуют эндемичные штаммы,
характерные для той или иной географической зоны в определенное время.
В последнее время все чаше в литературе встречаются научные статьи по
тематике молекулярной эпизоотологии ИБК в мире [25, 137, 138]. Ученым
удается определить молекулярно-генетические свойства штаммов вируса ИБК,
выделенных еще в 40-х годах прошлого столетия [74].
1.5 Диагностика и классификация штаммов вируса ИБК
Диагностика
ИБК
основана
на
выделении
вируса
и
определении
специфического иммунного ответа серологическими методами. Наиболее часто в
лабораторной практике используется вирусовыделение в КЭ, в трахеальной
органной культуре (ТОК), в культуре клеток, молекулярно-генетические и
серологические методы исследований. Успешная диагностика инфекции зависит
от ряда факторов, в том числе от времени отбора проб от момента возникновения
болезни, от уровня иммунитета к вирусу в момент заражения, от количества
отобранных проб, от вида и качества проб, от генетических особенностей птицы,
от способа содержания птицы [82]. Все штаммы вируса ИБК могут быть
выделены из дыхательных путей в высоких концентрациях, особенно из трахеи в
течение первых 3–5 дней после заражения. Вследствие того, что титр вируса
значительно снижается на второй неделе после заражения, обнаружение вируса в
этот период времени становится практически невозможным. При хроническом
течении
ИБК
наибольшую
диагностическую
ценность
имеют
пробы
14
слепокишечных миндалин и смывы
из
прямой кишки,
нежели пробы
респираторных органов [29, 35, 60, 128, 178]. Для повышения эффективности
диагностики ИБК в качестве одного из методов рекомендуют использовать
восприимчивых индикаторных птиц, содержать которых рекомендуют в течение
недели совместно с другими птицами [94].
Прямые
методы
обнаружения
вируса.
Вирусовыделение
является
основным методом диагностики вируса ИБК. Вирус ИБК хорошо размножается в
10-дневных куриных эмбрионах и в высоких титрах накапливается в ЭЭЖ КЭ
через 48-60 ч после заражения [16, 101]. При этом чувствительность эмбрионов к
одному и тому же вирусу ИБК может быть неодинаковой [68, 157]. Выделение
вируса и его серологическую идентификацию довольно успешно проводят также
в ТОК [62]. Эта культура не требует предварительной адаптации вируса, но имеет
высокую чувствительность. Обычно о положительной реакции судят по
замедлению или прекращению двигательной активности реснитчатого эпителия,
которое наступает через 3-4 сут после инокуляции, в зависимости от штамма и
дозы вируса [8, 59].
Для вирусовыделения ИБК также успешно используют различные культуры
клеток, но цитопатическое действие (ЦПД) и бляшки наблюдаются только в
первично трипсинизированных тканях эмбрионов кур [91]. Иногда для
репликации вируса и проявления ЦПД необходимо провести адаптацию вируса к
данной культуре путём проведения нескольких пассажей [116]. Otsuki et al. [144]
изучали размножение вируса ИБК в различных типах клеток и клеточных линий,
включая первично трипсинизированные клетки почки эмбрионов кур, клетки
HeLa, ВНК-21. Ими было показано, что только штаммы Beaudette и Holte
вызывают ЦПД в культуре клеток ВНК-21, тогда как подобные изменения в
культуре клеток HeLa не выявляются. Другими учеными при изучении патогенеза
вируса ИБК удавалось адаптировать его к фибробластам эмбрионов кур, к
клеткам эпителия трахеи, к культуре клеток Vero [179].
В настоящее время в диагностике ИБК широко используется метод ПЦР для
обнаружения генома вируса ИБК. Разработаны и применяются на практике
15
множество модификаций данного метода, о чем свидетельствуют большой объем
исследований во всём мире. Был разработан и широко внедрен в лабораторную
практику метод ОТ-ПЦР. Метод был впервые разработан Jackwood et al. в 1997 г.
[125] для амплификации гена S субъединцы S1. Также было разработано
обнаружение гена N вируса ИБК в ОТ-ПЦР [52].
Многие вирусы животных и человека агглютинируют красные клетки
крови, включая вирус ИБК. Однако вирус ИБК не агглютинирует эритроциты без
предварительной обработки трипсином или нейраминидазой. РГА можно
использовать для экспресс-выявления вируса ИБК в аллантоисной жидкости,
особенно при исследовании полевых изолятов [40, 79, 187].
Метод иммуноферментного анализа впервые был разработан в 1970 г. и
широко используется в ветеринарной практике для обнаружения антител к вирусу
ИБК [57, 141, 191]. Однако для обнаружения антигена ИФА оказался непригоден
из-за низкой чувствительности, которая составляет 102-103 ЦД 50.
Классификация
вируса
ИБК.
На
сегодняшний
день
отсутствует
общепризнанная система классификации вируса ИБК. Согласно рекомендациям
МЭБ, классификацию вируса ИБК проводят функциональными тестами, изучая
иммунобиологические свойства вируса, и нефункциональными тестами, где
изучается геном вируса [31].
Серологическая
классификация
вируса
основана
на
использовании
серологических методов – РТГА и РН, выполненных в КЭ, в ТОК или в культуре
клеток.
В 1956 г. впервые обнаружили антигенную гетерологичность между двумя
штаммами серотипа Mass и Conn вируса ИБК в реакции нейтрализации (РН) [91].
В настоящее время данный метод используется редко по нескольким причинам:
он трудоемкий, дорогостоящий и длительный, плохо поддаётся стандартизации и
имеются технические сложности, связанные с чувствительностью биологических
систем
к
неадаптированному
вирусу
и
необходимостью
получения
специфических гипериммунных сывороток [57, 64, 132]. Поэтому данный метод в
16
рутинных диагностических целях применяется редко, однако в научноисследовательских работах по идентификации вируса не имеет аналога [103, 106].
Использование РТГА для серологической идентификации вируса ИБК
имеет своих сторонников и противников. Исследования ряда авторов показали,
что серологическая идентификация штаммов вируса ИБК в РТГА существенно не
отличается от идентификации в РН, выполненной в ТОК [41, 60]. Напротив,
другие ученые считают, что из-за высокой перекрестной реакции между
штаммами вируса ИБК РТГА менее специфична, чем РН [59].
В настоящее время для оценки антигенного родства между штаммами
вируса ИБК в научных целях используют ИФА на основе моноклональных
антител к S1 белку [30]. Так, ученые из Китая охарактеризовали 8 вариантных
штаммов вируса ИБК с помощью ИФА на основе моноклональных антител [50].
G. K. Zellen и J. Thorsen [194], оценивая антигенное родство референтных
штаммов вируса ИБК с помощью ИФА, показали высокую специфичность
данного метода и его превосходство перед РН.
С тех пор, как было установлено антигенное разнообразие вируса ИБК, с
использованием серологических методов было выявлено огромное количество
антигенных вариантов вируса ИБК, количество которых в настоящее время
достигает, по разным литературным данным, более 70 [17].
Характеристика и группирование штаммов вируса по генетическому
признаку определяет генотип. Генетическая идентификация вируса ИБК методом
ПЦР в настоящее время широко используется. Данный метод основан на
разработке
штаммспецифических
праймеров,
амплифицирующих
наиболее
вариабельный участок гена вируса ИБК, т.е. S1- ген. L. Calvin et al. [173] впервые
описали
данный
метод
и
смогли
идентифицировать
и
типировать
30
зашифрованных проб, которые ранее были серотипированы в РН. Результаты их
работы не расходились с данными в РН. Молекулярные основы антигенной
изменчивости вируса ИБК обычно определяют нуклеотидным секвенированием
гена, кодирующего белок S или субъединцу S1 белка S. Это связано тем, что в
белке S1 обнаружено большинство эпитопов, отвечающих за выработку
17
нейтрализующих антител [43, 77, 172]. Однако в литературе встречаются
сообщения ученых о генотипировании изолятов вируса ИБК по другим
структурным белкам (M,N).
В настоящее время метод генетической идентификации вируса ИБК
значительно чаще применяется при вирусологических работах, что, в свою
очередь, вытесняет классические серологические методы РН и РТГА. Анализ
доступной литературы показывает, что мнения исследователей о корреляции
между молекулярными и серологическими методами при классификации
штаммов разнятся.
Одни авторы показали, что антигенно родственные варианты вируса ИБК
имели низкое генетическое сходство, составляющее от 20 до 50% [44, 125, 168].
D. Саvanagh [43] также доказал, что штаммы вируса ИБК, идентифицированные в
РН
как
гетерологичные,
имели
незначительные
различия
нуклеотидной
последовательности, составляющие 2-3%. С другой стороны, M. Jackwood et al.
[74], исследуя полиморфизм длин рестрикционных фрагментов гена S1, показали
его корреляцию с серотипом и идентифицировали более 1000 изолятов вируса
ИБК. Особо следует отметить результаты научных трудов S. Ladman et al. [132],
которые изучали вопросы антигенного родства и протективного уровня между 5
штаммами вируса ИБК, выделенными на территории США. Авторы убедительно
показали, что генетическое типирование вируса ИБК коррелирует с данными по
типированию вируса in vivo, где были изучены перекрестные протективные
свойства. На рисунке 1 приведены несколько примеров таких исследований,
которые были систематизированы по доступным литературным данным. Таким
образом, в большинстве случаев результаты генетической классификации,
полученные на основе нуклеотидного секвенирования гена S1 вируса ИБК,
согласуются с результатами серологической классификации, полученными в РН,
что в итоге позволяет корректно проводить специфическую профилактику
болезни [75].
18
120
Перекрестная
защита, %
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Гомология по белку S1, %
ссылки
:
Abde l-Monein, 2006
Ge lb et al., 2005
Meir e t al., 2004
Ladman et al., 2006
Cavanagh, 1997
Cook et al., 2001
Liu et al., 2009
Рисунок 1. Корреляция между уровнем гомологии по S1 гену вируса ИБК и уровень
перекрестной зашиты между штаммами по данным 7 публикаций
Основными преимуществами молекулярных методов для генетической
классификации являются скорость выполнения анализа и высокая специфичность
[47, 53]. Незаменимым считается данный метод в молекулярной эпизоотологии и
при проведении мониторинговых исследований. Однако отсутствует прямая связь
между генетической структурой и фенотипическими свойствами возбудителя и в
первую очередь с антигенной активностью.
Идентификация вируса ИБК в протектотипы – наиболее подходящая
классификация
с
практической
точки
зрения.
Сущность
этого
способа
классификации состоит в изучении протективности штаммов in vivo с
использованием метода перекрестной иммунизации, а отнесение нового штамма к
определённому протектотипу производят на основании протективной защиты
[31, 44, 102, 105]. Однако этот метод трудоемкий, дорогой, требует наличия
восприимчивых
птиц
и
соблюдения
специальных
условий
проведения
эксперимента. Поскольку эта классификация новая, то будут копиться данные о
количестве и распределении вируса ИБК в протектотипы. По-видимому,
количество протектотипов будет явно меньше, чем серотипов, что подтверждают
19
результаты исследования M. R. Shirzad [174]. Авторы показали, что штаммы
вируса,
относящиеся
к
разным
серологическим
группам,
обеспечивали
перекрестный иммунитет.
К
сожалению,
не
существует
единой
системы
классификации
и
идентификации штаммов вируса ИБК, которые могли бы стандартизировать этот
процесс. Поэтому к выделению и идентификации вируса ИБК необходимо
подходить комплексно.
1.6 Инфекционная активность вируса ИБК
Тяжесть и исход инфекции ИБК во многом зависит от биологии вируса.
Такие свойства, как патогенность и антигенность, а также взаимодействие вируса
ИБК с другими патогенами будут определять тяжесть и исход болезни [112].
Особенности патогенеза вируса ИБК. Механизм патогенности вируса ИБК,
как и многих других представителей семейства Coronaviridae, связан с
репликацией вируса в чувствительных клетках и системным нарушением
гомеостаза.
Вирус размножается в основном в верхних дыхательных путях, что
впоследствии приводит к виремии и к поражению других органов [164]. Вирус
может реплицироваться в эпителии органов ЖКТ, бурсы Фабрициуса, органов
мочеполовой системы [9]. В целом высокая концентрация вируса обнаруживается
в слизистой трахеи и в фекалиях птиц в период острого течения болезни и в
стадии реконвалесценции [61]. В некоторых случаях ИБК протекает латентно, и
больная
птица
является
потенциальным
источником
заболевания.
Инфицированные птицы выделяют вирус постоянно в окружающую среду и
загрязняют инвентарь, яйцо и обслуживающий персонал, которые являются
основными источниками непрямого пути передачи инфекции [61].
Респираторные признаки болезни чаще наблюдаются у молодняка птиц, и
чаще всего обусловливаются вторичными бактериальными инфекциями [129].
Репликация вируса ИБК в тканях респираторной системы вызывает характерные,
но не патогномоничные признаки, такие, как кашель, чихание, трахеальные
хрипы, носовые истечения. Иногда могут наблюдаться воспаление и припухлость
20
периорбиты
и
синусов.
В
несложных
случаях
клинические
симптомы
сохраняются в течение 7-14 сут. У больных цыплят наблюдают депрессию,
снижение привесов. Гибель цыплят часто возникает из-за асфиксии вследствие
закупорки нижних отделов трахеи слизью. Вирус также может размножаться в
эпителиальных клетках легких и воздухоносных мешков. Репликация вируса в
этих тканях приводит к очаговым пневмониям и аэросаккулитам [49, 104, 193].
Особый интерес заслуживают некоторые штаммы ИБК, вызывающие
преимущественное поражение урогенитальных органов взрослых птиц [37].
Нефропатогенные штаммы вируса ИБК, как правило, не вызывают у больных
птиц респираторные признаки болезни [71, 141, 142], но могут быть причиной
высокой смертности поголовья [110, 133, 152, 155]. R. Glahn et al. [98], изучая
штамм Gray вируса ИБК в организме птиц биохимическими методами, пришли к
выводу о том, что тяжесть и исход поражения почек зависят от уровня
содержания кальция в рационе.
Поражение ЖКТ не всегда проявляется клинически или не имеет
клинического значения при массовом содержании птиц. Несмотря на это,
вспышки ИБК с развитием провентрикулитов были отмечены в птицеводческих
хозяйствах Китая [124]. Главной проблемой при кишечной репликации вируса
является длительная персистенция в организме, что может быть причиной
длительной экскреции во внешнюю среду [128]. В последние десятилетия часто
при проведении диагностических и мониторинговых мероприятий выявляют QXподобные штаммы вируса ИБК, которые филогенетически происходят из Китая.
Ученые отмечали высокую смертность поголовья, достигающую 20%, при
вспышках ИБК, вызванных штаммами QX [124].
Патогенное действие вируса ИБК на репродуктивные органы обусловлено
его тропностью и репликацией в эпителиальных клетках. Ранняя инфекция среди
цыплят влечет за собой серьезные необратимые повреждения репродуктивных
органов молодок [51]. Особенно это актуально для репродуктивных птиц и птиц
яичного направления. Из-за инфекции у молодок нарушается процесс развития
яйцевода, что приводит к появлению «ложных несушек» и значительно снижает
21
экономические показатели [3, 49, 69]. У взрослых кур-несушек наблюдают
различные дисфункции от депигментации яиц до снижения яйценоскости до 50%
[51, 163].
Патология репродуктивной системы петушков, связанная с вирусом ИБК,
также рассматривается в научных публикациях. Некоторые авторы описывают
эпидидимит и образование камней в семенных канальцах или в придатках [36,
143], связанные с инфекцией ИБК, тогда как другие не обнаруживали
повреждения в строме семенника [151]. Вирус ИБК был выделен из спермы
инфицированных петушков спустя две недели после заражения [60], но до сих пор
в доступной литературе нет данных о передаче половым путём.
Вирус
ИБК
непрерывно,
в
течение
семи
месяцев,
выделяли
в
инфицированных, а также и вакцинированных стадах [28]. Возможным
объяснением этого феномена являются постоянное перекрёстное инициирование
в результате непрерывной экскреции вируса во внешнюю среду [60].
В начале 1990 г. в Англии от бройлеров с поражением мускулатуры был
выделен вируса ИБК серотипа 793/В [32]. В связи со способностью данного
возбудителя вызывать развитие миопатий он был подробно исследован. Было
установлено, что данный вирус вызывал различную патологию, не характерную
для ИБК, и до момента его выделения ученые не сталкивались с подобным
клиническим проявлением болезни. В экспериментальных условиях было
доказано, что вирус непосредственно не влияет на развитие миопатии
пекторальных мышц, но косвенно воздействует на её развитие. По мнению
ученых,
особенность
патогенеза
ИБК
была
связана
с
образованием
иммунокомплексов в стенке сосудов, что приводило к резкому ухудшению
транспортировки питательных веществ к этой группе мышц и к развитию
атрофии [82]. Некоторые ученые выделяли вирус серотипа 793/В от больных
бройлеров из трахеи и слепокишечных миндалин, но не удавалось выделить вирус
из мышц. Однако некоторым ученым с помощью ПЦР удалось обнаружить геном
вируса 793/В в пораженных мышечных тканях [32].
22
Антигенная изменчивость вируса ИБК. Идентификация возбудителя,
связанного с
реальной
вспышкой
болезни,
представляет
проблему при
диагностике вследствие непрерывного антигенного изменения вируса ИБК,
которое способно индуцировать «прорыв вакцинации» [42]. С момента
обнаружения серологических отличий штаммов вируса ИБК от классических
штаммов серотипа Mass учеными было выделено огромное количество
антигенных типов вируса ИБК по всему миру.
Антигенные варианты вируса ИБК, как полагают, возникают вследствие
различных изменений в геноме. Это свойство характерно и для других РНКсодержащих вирусов. С другой стороны, появлению новых антигенных вариантов
вируса способствует иммунный прессинг со стороны организма птицы из-за
проведения специфических и неспецифических мероприятий по борьбе с
болезнью [43].
Ассоциированное течение инфекции. Взаимодействие вируса ИБК на
системном уровне при смешанном течении с другими инфекционными агентами,
такими, как бактерии, вирусы, простейшие, микоплазмы, изучено достаточно
широко [27, 84]. H. Adler et al. [27] в своих экспериментах показали, что
одновременное инфицирование молодок вирусом ИБК серотипа Mass и
M.gallisepticum вызывает у птиц тяжелые клинико-патологоанатомические
изменения, тогда как при заражении по отдельности такие нарушения не
обнаруживали. Подобные исследования были проведены J.T Blake. [36] на курахнесушках и было выявлено, что яйценоскость и качество яиц были ниже у птиц,
зараженных одновременно вирусом ИБК и M.gallisepticum. Однако изучение
смешанного течения вируса ИБК и M.synoviae не приводило к развитию подобной
клинической и патологической картины [84, 97, 106, 195]. Уникальную
экспериментальную модель разработали J. Smith et al. [176], заключающуюся в
одновременном заражении птиц вирусом ИБК и E.сoli, что часто возникает в
естественных условиях.
вирулентные
свойства
Позже, используя эту модель,
изолятов вируса
ИБК,
ученые описали
протективность вакцин
и
восприимчивость различных генетических линий птиц [39, 65, 70]. Известно, что
23
вирус ИБК при культивировании в КЭ интерферирует с вирусом ньюкаслской
болезни. L.G Raggi et al. [161] доказали, что интерференция между этими
вирусами происходит и на уровне организма. О наличии интерференции авторы
судили по низким титрам антител к вирусу НБ в РТГА, что свидетельствовало об
угнетении вируса НБ вирусом ИБК. Аналогичные выводы сделали J. Gelb et al.
[88], используя в своих экспериментах различные комбинации штаммов вирусов
НБ и ИБК. L.G. Raggi et al. [161] не выявили интерференци между вирусом ИБК и
вирусом инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ). Однако А.М. Pattison et al. [147]
считают, что аэрозольная вакцинация против ИБК ухудшает иммунологическую
толерантность и способствует увеличению смертности при инфекции вирусом
ИЛТ.
Большинство опубликованных данных показывает, что инфицирование
птиц вирусом ИБК приводит к повышению восприимчивости к другим патогенам.
Кроме того, увеличивается степень и продолжительность оппортунистической
инфекции [152].
1.7 Иммунитет
1.7.1 Пассивный иммунитет.
Это невосприимчивость за счет пассивно, извне приобретенных готовых
факторов иммунной защиты, главным образом антител. Врожденный иммунитет
против внешних агентов включает физические барьеры, обеспечиваемые кожей и
слизистыми оболочками, растворимые факторы, такие, как лизоцим, комплемент
и белки острой фазы, а также клетки, такие, как макрофаги, гранулоциты и
естественные киллеры (NK) [23]. Тем не менее, врожденный иммунитет
характеризуется отсутствием специфичности и иммунологической памяти [81].
Так как применение методов искусственной специфической пассивной защиты в
птицеводстве ограничено, изучение роли материнских антител (МАТ) при ИБК
научно и практически оправдано. IgG, которые передаются от вакцинированных
кур через желток потомству, могут быть обнаружены в сыворотке и в слизистой
дыхательных путей вылупившихся цыплят [152]. Было показано, что такие
антитела защищают цыплят от контрольного заражения в течение 4 недель в
24
зависимости от методов контрольного заражения и последующей оценки защиты
[73]. В свою очередь, МАТ могут снизить активность живых вакцин,
применяемых в суточном возрасте [72, 73, 135, 139]. Однако, несмотря на разные
мнения об эффективности вакцинации против ИБК в суточном возрасте, ее
рутинно проводят в птицеводстве. Тем не менее, вакцинация цыплят с МАТ в
суточном возрасте против ИБК стимулирует выработку активного иммунитета в
дыхательной системе [135]. Изучению роли МАТ при инфицировании вирусом
ИБК и развитию активного иммунитета в ответ на вакцинацию посвящена работа
S. P. Mondal et al. [139]. Авторы сообщали, что суточные цыплята имели высокий
уровень МАТ в сыворотке (5,2 lg) и относительно низкий в дыхательных путях
(2,7 lg). Тем не менее, уровень защиты от ИБК у этих цыплят зависел от МАТ,
обнаруживаемых в респираторном тракте. В заключение они пришли к выводу,
что вакцинация цыплят в суточном возрасте истощает уровень МАТ в
респираторном тракте, и, как результат, снижает их резистентность к
инфицированию вирусом ИБК.
Имеется публикация, где показана положительная корреляция между
экономическими потерями, вызванными ИБК, и низкими или неровными титрами
антител у птицы в мясном птицеводстве. Авторы пришли к выводу, что стратегия
вакцинации родительского стада должна быть направлена на обеспечение
высокого и ровного иммунного статуса к ИБК у потомства [118, 188].
1.7.2 Активный иммунитет.
Активный
иммунитет
формируется
вследствие
активации
антиген-
специфических эффекторных механизмов, в том числе B-клеток (гуморальных),
Т-клеток (клеточных) и макрофагов, а также выработкой клеток памяти.
При экспериментальном заражении птиц или других животных вирусом
ИБК отмечали иммунологическую реакцию организма, сопровождающуюся
выработкой специфических антител. Гуморальные антитела, вырабатывающиеся
в ответ на заражение вирусом ИБК, у птиц выявляют в ИФА, РН, РТГА и т.п. [75,
100, 189]. Выявление высоких титров гуморальных антител коррелирует с низким
уровнем вирусовыделения из почек и герминативных органов и обеспечивает
25
надежную защиту от снижения яйценоскости [75]. Тем не менее, ряд ученых
полагает, что уровень гуморальных антител не коррелирует с устойчивостью птиц
при контрольном заражении [29, 85]. Значение B-клеток при инфекции вирусом
ИБК было изучено в экспериментах, когда птиц подвергали искусственному
иммунодефициту (бурсэктомия, обработка циклофосфамидом) [81, 85, 61 149,
192]. У птиц с иммунодефицитом отмечали тяжелое и продолжительное
проявление болезни с длительным периодом выделения вируса [81, 103].
Существуют три основных класса иммуноглобулинов птиц: IgM, или
ранние, IgG или IgY, и IgA. В организме птицы, инфицированной вирусом ИБК,
IgM выявляют в первые дни после инфекции, их уровень не стабилен и достигает
своего пика к 8 дню после инфицирования [76, 111, 184]. Хотя и было показано,
что выявление таких иммуноглобулинов в ИФА является информативным при
диагностике ряда инфекций, но в рутинных диагностических исследованиях при
ИБК этот анализ не применяется [111]. В 1980-х гг. J. Н. Darbyshire et al. [73]
разработали метод выявления IgG методом ИФА и показали, что метод обладает
высокой чувствительностью. IgG против вируса ИБК выявляют уже через 4 дня
после инфицирования. Их концентрация достигает своего пика через 21 день, а
далее происходит их снижение. Оценка поствакцинального иммунитета основана
на выявлении антител данного класса с помощью доступных коммерческих ИФАнаборов [190].
Ряд исследователей предполагает, что выработка активного иммунитета к
вирусу ИБК связана с условиями содержания и кормления [65, 66, 67].
Более века назад выдающийся иммунолог А. М. Безредка ввел в науку
понятие
"местный
иммунитет".
Он
определил
местный иммунитет как
формирование невосприимчивости к инфекции отдельного органа, например,
кожи или кишечника. Местный иммунитет дыхательных путей у птиц зависит от
лимфоидной ткани, расположенной в голове и в трахеобронхиальной области [33,
174]. Антитела к вирусу ИБК в верхних дыхательных путях играют важную роль
в защите от инфекции [111, 184]. Было показано, что у инфицированных кур
специфические к вирусу ИБК IgA и IgG обнаруживаются в трахеальных смывах
26
[152, 163]. Однако в более ранних исследованиях при изучении роли местных
антител к вирусу ИБК ученые не определили потенциальное значение их в
иммунитете. Было показано, что обнаружение высоких титров антител в слезной
жидкости не гарантировало защиту птиц от контрольного заражения, тогда как
некоторые птицы с более низкими показателями антител были устойчивыми [92,
94].
Этот
феномен
организованностью
устойчивости
иммунной
можно
системы:
объяснить
комплексной
структурно-физиологических
приспособлений устойчивости, неспецифических и специфических факторов
иммунитета.
Так как вирус является внутриклеточным паразитом, очевидно, что
клеточный иммунитет будет играть большую роль в иммунопатогенезе инфекции.
Тем не менее, в доступной литературе сообщения, касающиеся роли клеточноопосредованного иммунитета при ИБК, ограниченны.
Была доказана антиген-специфическая пролиферация Т-лимфоцитов у
инфицированных или вакцинированных вирусом ИБК цыплят [183]. Химический
иммунодефицит, вызванный обработкой цыплят циклоспорином с последующим
заражением вирусом ИБК, приводил к высокой смертности из-за развития
болезни [81]. В своих исследованиях доктор Pei J. [148] показал, что Т-клетки
памяти играют важную роль при остром течении ИБК. Он доказал, что Т-клетки
памяти, полученные в промежутке от 3 до 6 недель после заражения птицы,
защищали других птиц от клинического проявления болезни в результате
заражения штаммом Grey вируса ИБК. Эти клетки памяти были определены как
CD8.
Цитотоксические
Т-лимфоциты
(CTL)
играют
важную
роль
в
регулировании многих вирусных инфекции у млекопитающих. Цитотоксические
лимфоциты индуцируются в селезенке цыплят при иммунизации высокой и
низкой дозами аттенуированного и вирулентного вируса ИБК. После первичного
введения вируса окулярным методом цитотоксические клетки в периферической
крови не обнаруживают, после повторного введения происходит выработка
цитотоксических клеток в периферической крови в течение 10 сут. Их количество
27
в крови быстро снижается до низкого уровня, тогда как в селезенке их
обнаруживают
в
течение
нескольких
недель.
Это
подтверждает,
что
цитотоксические клетки имеются в запасе в виде активных клеток в селезенке, и
там же имеются клетки памяти, способные быстро размножаться [53].
Максимальный специфический ответ цитотоксических лимфоцитов (CTL) на
вирус ИБК с лизисом 82% меченых клеток-мишеней был обнаружен через 10 сут
после инфицирования. Специфический CTL-ответ не снижался до тех пор, пока
титр вируса был высоким в почках и легких (8 сут). Таким образом, прекращение
болезни связано со специфическим вирусу ИБК CTL-ответом, и показана его
главенствующая роль в патогенезе острой инфекции. В дальнейшем уровень CTL
обычно снижается, а увеличивается количество IgG. На поздних стадиях
инфицирования основная роль в защите от инфекции принадлежит гуморальному
иммунитету [172, 177].
Очевидно, что имеется необходимость в проведении исследований,
направленных на изучение функций иммунитета при инфицировании вирусом
ИБК. Такие знания позволят в дальнейшем в диагностике и профилактике
болезни.
8. Контроль и профилактика ИБК
На сегодняшний день нет ни одной страны с интенсивным птицеводством,
благополучной по ИБК [31]. Это подтверждается ежегодными отчетами странчленов МЭБ.
В идеале для контроля ИБК достаточно выполнение основных требований
биобезопасности: соблюдение практики "все пусто-все занято", очистка и
дезинфекция, строгая изоляция и замена поголовья [43]. Тем не менее,
соблюдение этих норм оказывается невозможным в основном для птичников,
выращивающих бройлеров, из-за интенсивности программы производства мяса. В
этих условиях иммунизация остается единственным надежным инструментом в
контроле ИБК [43, 115, 116, 134].
Идея специфической иммунизации птиц против ИБК возникла из
наблюдений за инфекциями, возникающими в полевых условиях. Было
28
установлено, что птицы, инфицированные вирусом ИБК до яйцекладки (между 8
и 16 неделями), становились невосприимчивыми к болезни до момента
яйцекладки [91].
Для
специфической
профилактики
ИБК
используются
живые,
инактивированные и векторные вакцины [6, 10, 11, 17, 18, 89, 107, 154, 156, 176,
186 ].
Наиболее широко используются живые вакцины из штамма "H" серотипа
Mass различного уровня аттенуации, которые были разработаны в Германии в
начале 1960-х гг. В качестве живых вакцин используются аттенуированные
штаммы,
которые
ослаблены
последовательными
пассажами
в
куриных
эмбрионах, в культуре клеток или в ТОК. Было показано, что с увеличением
количества пассажей, как правило, иммуногенность и эффективность препаратов
падает [91, 130, 164]. Живые вакцины, прежде всего, применяют для защиты
поголовья птицы от инфекции в раннем возрасте, а также для «праймирования»
иммунной системы птицы перед введением инактивированной вакцины. При этом
они формируют комплексный иммунитет, в том числе и местный для защиты от
инфекции в раннем возрасте [87]. Как правило, живые вакцины применяют одним
из методов массовой иммунизации: аэрозольно в инкубаториях, методом
выпаивания с водой или крупно-капельным распылением [13]. Было также
показано
одновременное
применение
с
иммуностимуляторами,
что
способствовало улучшению иммунного ответа со стороны организма птиц [1, 19].
В зависимости от эпизоотической обстановки живые вакцины применяют
методом крупно-капельного распыления среди кур-несушек в период яйцекладки.
Большинство используемых в мире вакцин против ИБК относится серотипу Mass.
Однако существуют вакцины на основе и других серотипов, применение которых
в некоторых странах ограничено [87]. Вакцины определенного серотипа или
генотипа, как правило, обеспечивают надежную защиту против гомологичного
контрольного заражения. Существует определенная перекрестная защита от
гетерологичного вируса ИБК, уровень которой может колебаться от высокого до
самого низкого [80].
29
В последнее время в программе вакцинации против ИБК рекомендуют
использовать вакцины на основе серологически отличных штаммов [86]. Было
показано, что вакцинация живыми аттенуированными вирусами, относящимися к
различным
серотипам,
например,
Mass
и
4/91,
обеспечивает
широкую
перекрестную защиту [146]. Более высокого уровня защиты достигали, когда эти
вакцины применяли последовательно с двухнедельным интервалом, в отличие от
одновременного применения. Неудовлетворительные результаты были получены
при одновременном инфицировании вирусом инфекционной бурсальной болезни
[99, 150].
В некоторых странах мира, в частности, в США, широко применяются
бивалентные живые вакцины, изготовленные из двух разных штаммов. Так, J.J.
Gelb et al. [94] пришли к выводу, что бивалентная вакцина против ИБК, состоящая
из штаммов серотипов Mass и Ark, обеспечивает более надежную защиту от
болезни, чем вакцины, изготовленные на основе штаммов серотипов Mass и JMK
или на основе штаммов серотипов Mass и Conn.
Недостатком использования живых вакцин в производственных условиях
является то, что вирус, ввиду своих природных свойств, чувствителен к факторам
окружающей среды, которые могут легко его инактивировать [43]. Этот фактор
часто приводит к недостаточной эффективности вакцинации в полевых условиях
[75, 117]. Поэтому для получения эффективной защиты в производственных
условиях среди бройлеров была
показана
необходимость ревакцинации.
Несоблюдение инструкции по применению вакцин часто приводит к снижению
эффективности препаратов, пролонгированной циркуляции вирусвакцины, что в
результате повышает восприимчивость поголовья к E. сoli и другим бактериям
[26], а иногда к повышению вирулентности и реверсии штаммов [106].
При разработке вакцин на стадии доклинических исследований проводят
оценку протективной активности вакцин. Для определения протективности
вакцин используется метод контрольного заражения иммунных цыплят обычно
через 3 недели после иммунизации. Протективность вакцин определяют методами
реизоляции контрольного вируса, оценкой цилиарной активности трахеи,
30
гистологической оценкой органов-мишеней и другими вирусологическими
методами [31, 54]. Так, J. H Darbyshire et al. [72] в своих опытах по контрольному
заражению с оценкой цилиарной активности после заражения показали, что
цыплята, привитые вакциной из штамма Н120, были защищены против различных
серотипов вируса ИБК.
Инактивированные вакцины против ИБК впервые были сконструированы в
1960-1970 гг. для получения длительного иммунитета у кур-несушек в период
яйцекладки [43]. Данные препараты изготавливаются на основе масляного
адъюванта, а в качестве антигена используют инактивированный вирус ИБК.
Однократное
применение
инактивированной
вакцины
не
обеспечивает
надлежащую защиту от снижения яйценоскости [38, 86, 92, 111] и повреждения
цилиарной активности трахеи [45]. Многие авторы сообщали, что только
двукратная вакцинация инактивированной вакциной обеспечивала сохранение
цилиарной активности трахеи [113, 114, 115].
Общий подход к профилактике ИБК в стадах кур-родителей и в стадах курнесушек предполагает двукратное применение живой вакцины в период роста
птицы и однократное введение инактивированной вакцины за месяц до начала
яйцекладки [38, 90, 97].
В настоящее время разрабатываются субвирусные, векторные и другие
генно-инженерные
вакцины,
не
имеющие
недостатков
существующих
биопрепаратов [90, 115,]. Экспериментально была показана эффективность
векторной вакцины на основе гликопротеина S вируса ИБК [88, 114]. M.
Jackwood. et al. [126] сконструировали синтетические пептиды, основанные на
аминокислотной последовательности белка S1 вируса ИБК штаммов Ark99 и
Mass41. Введение вышеуказанных пептидов в организм птицы не дало
положительного результата.
В литературе приводятся результаты экспериментов о применении ДНКвакцины, сконструированной на основе S1 белка вируса ИБК. Применение этого
препарата in ovo обеспечивало защиту цыплят против контрольного заражения
вирулентным вирусом штамма Ark в дозе 5 lg ЭИД50 в 8-суточном возрасте [156].
31
Применение ДНК-вакцины против ИБК in vivo также индуцировало адекватный
иммунный ответ и обеспечивало эффективную защиту против контрольного
заражения, по данным S.H. Seo et al. [171]. Вакцины, сконструированные на
основе рекомбинантных белков и других технологий, имеют перспективу в
будущем и могут изменить взгляд на настоящую программу специфической
профилактики. Тем не менее, эти вакцины должны быть безопасными,
эффективными и, что немаловажно, менее дорогими, чтобы было обеспечено их
практическое применение в птицеводстве.
1.9 Заключение по обзору литературы
Инфекционный
бронхит
кур
–
заболевание,
характеризующееся
контагиозностью и широким распространением по всему миру. Это первое
экономически значимое заболевание среди респираторных инфекций известное в
птицеводстве [2, 6]. С момента открытия вируса до настоящего времени вирус
ИБК объединяет более 50 серологических вариантов и еще больше генотипов.
Огромное разнообразие вирусной популяции ученые объясняют природой
коронавирусов как одного из представителей РНК-содержащих вирусов, которые
характеризуются неустойчивостью и склонностью к мутациям. Классификация
штаммов и изолятов вируса ИБК не имеет единой концепции. В настоящее время
при диагностических процедурах для дифференциации штаммов прибегают к
молекулярно-биологическим методам исследования, определяя генотип вируса. С
этой
целью
анализируют
аминокислотные
последовательности
гена
S1,
индуцирующего образование нейтрализующих антител. Анализ литературных
данных
показывает,
принадлежности
что
вируса
результаты
ИБК
не
по
всегда
определению
коррелируют
с
генетической
результатами
серотипирования. Иммунитет, полученный на один серотип вируса ИБК, часто не
способен защитить организм от заболевания, вызванного другим, неродственным
серотипом. И наоборот, может наблюдаться перекрестная защита от контрольного
заражения даже тогда, когда результаты РН показывали значительные отличия
между вакцинным штаммом и изолятом. Поэтому наиболее достоверным, однако
32
трудоемким,
методом
является
классификация
штаммов
по
концепции
«протектотипа», который определяется in vivo.
Изучению вопросов профилактики ИБК в промышленном птицеводстве
посвящено огромное количество публикаций [2, 6, 17, 21, 90, 97, 108, 155].
Неоднократно была доказана эффективность «классической» вакцины на основе
штамма Н120 серотипа Mass, который широко применяют в промышленном
птицеводстве. Генетическое разнообразие вируса ИБК, которое выявляют
практически повсеместно, усложнило программу вакцинопрофилактики, но
разработка новых вакцинных препаратов не нашла практического оправдания.
Это связано с тем, что существует высокий процент перекрестной защиты между
антигенными вариантами вируса ИБК.
Несмотря на масштабные экономические контакты между странами,
связанные с перемещением продуктов от птиц, и широкое распространение
вируса ИБК в различных птицеводческих хозяйствах, существуют эндемичные
штаммы, которые встречаются только в определенных странах. Появление новых
вариантов вируса ИБК в несвойственных географических зонах характеризуется
экзотичностью инфекции. Примером таких явлений может послужить недавно
выделенная новая генетическая ветвь QX вируса ИБК. Впервые вирусы этой
генетической группы с абсолютно нехарактерной клинической картиной
заболевания – провентиркулитом-были выделены в КНР, в 1997 г. Позже, в
других провинциях КНР вирус ИБК генотипа QX часто выделяли у бройлеров с
патологией почек. Уже через несколько лет вирусы, отнесенные к этой
генетической группе, встречали в РФ и в других странах Евразии.
В коллекцию музея штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010 г.
депонирован вируса ИБК генотипа QX штамм IBV RF 08-10. Еще ранее учеными
из
этого
учреждения
были
изучены
биологические
свойства
изолята,
относящегося к генотипу QX. Однако в существующих научных сообщениях
комплексное изучение иммунобиологических свойств мало отражено, что делает
актуальным эту тему для исследований.
33
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы исследований
2.1.1 Штаммы вируса ИБК
В работе использовали следующие штаммы вируса ИБК:
- вакцинный штамм Н120, серотип Mass;
- вакцинный штамм D274, серотип D207;
- вакцинный штамм 4/91, серотип 793/В;
- штамм IBV RF 08-10 (далее QX), генотип QX;
- штамм L1148, серотип D388.
Штаммы Н120 и QX были паспортизированы и депонированы в Коллекции
штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья
животных». Штаммы D274, 4/91 и L1148 хранятся в рабочей коллекции штаммов
микроорганизмов лаборатории профилактики болезней птиц.
2.1.2 Сыворотки
Для
серологических
реакций
использовали
штаммоспецифические
гипериммунные сыворотки, которые были получены к следующим штаммам
вируса ИБК: Н120, серотип Mass, D274, серотип D207, 4/91, серотип 793/В, IBV
RF 08-10 генотипа QX (серотип неизвестен). Для получения сывороток
использовали 40–50-суточных цыплят категории СПФ, которых двукратно
иммунизировали. Для первичной иммунизации использовали исследуемый штамм
живого вируса ИБК, репродуцированный в эмбрионах кур и полученный в виде
ЭЭЖ, который вводили внутривенно. Для второй иммунизации использовали
смесь инактивированного вируса того же штамма и полного адъюванта Фрейнда в
соотношении 1:1. Через 14 сут после последней иммунизации цыплят
обескровливали (Приложение №3). Далее методом отстоя и центрифугирования
отделяли сыворотку и исследовали на активность в ИФА. Затем образцы
объединяли в общий пул сывороток и хранили при температуре минус 200С до
проведения исследований.
34
2.1.2 Эмбрионы кур, культуры клеток
Использовали эмбрионы кур 9-11- и 20-21-суточного срока инкубации,
категории СПФ фирмы Lohman Tiehrzuch (Германия) для культивирования и для
изготовления культуры клеток, соответственно. Эмбрионы инкубировали при
температуре 37±0,5°С и относительной влажности воздуха 60%.
В
опытах
использовали
следующие
культуры
клеток:
первично
трипсинизированные культуры фибробластов (ФЭК) и почек эмбрионов кур
(ПЭК), перевиваемую культуру клеток почки зеленой африканской мартышки
(клетки Vero), почки КРС (MDBK), почки теленка (RBT), трахеальная органная
культура (ТОК) куриных эмбрионов. ФЭК готовили из кожно-мышечной ткани
10-12-суточных СПФ КЭ, ПЭК из почечной ткани 20-21-суточных КЭ. ТОК – по
ранее стандартной методике с небольшими модификациями [9]. Эксплантаты
трахеи инкубировали в культуральных плашках при температуре 37,50С в
присутствии 5% CO2.
2.1.3 Подопытная птица
В лабораторных экспериментах использовали цыплят категории СПФ.
Цыплят выводили из оплодотворенных СПФ-яиц фирмы Lohman Tiehrzuch. Птиц
содержали в изолированных боксах. Условия содержания и кормления
поддерживали в рамках соответствующих зоогигиенических нормативов.
2.1.4 Растворы и реактивы
В работе использовали следующие растворы и реактивы.
1.
Фосфатно-буферный раствор (ФБР), pH 7,2-7,4.
2.
Раствор натрия хлорида 0,9%, рН 7,0.
3.
Раствор L-глютамина.
4.
Сыворотка крови КРС.
5.
Фетальная сыворотка крови теленка (BIOCLOT, Бразилия).
6.
0,25% раствор трипсина.
7.
Смесь растворов трипсина (0,25%) и версена (0,02%).
8.
Раствор Хенкса (рН 7,1-7,2).
9.
Раствор Хенкса с добавлением ГЛА, рН 7,2-7,4.
35
10. Среды культуральные Игла, 199, ПСС, ПСП, а также DMEM или
DMEM/F12 (Sigma, США).
11. Желатин порошкообразный из кожи свиней, тип А (Sigma, США).
12. Антибиотики (бензилпенициллина натриевая соль, стрептомицина
сульфат, гентамицина сульфат (4% раствор), «Байтрил» (5 и 10% растворы).
Все реактивы имели квалификацию «ч.д.а.» и «х.ч.», для приготовления
растворов использовали бидистиллированную или деминерализованную воду.
2.1.5 Диагностикумы
Использовали набор для обнаружения антител к вирусу ИБК в непрямом
ИФА, Synbiotics (США). В соответствии с Инструкцией по использованию набора
определяли наличие антител к вирусу ИБК в сыворотке крови. Положительной
оценкой реакции считали величину Sp>0,150 что соответствует титру антител
1:165. Отрицательным значением титров антител считали значения 1:164 и ниже.
Набор РТГА для выявления антител к вирусу ИБК (производитель GD
Animal Health, Нидерланды). РТГА выполняли согласно Инструкции по
применению набора.
2.1.6 Оборудование и лабораторная посуда
В процессе выполнения экспериментальных работ использовали следующее
оборудование:
- низкотемпературные холодильники MDF-792 и U5386S («Sanyo»,
Япония);
- термостат электрический с водяной рубашкой тип 3Ц-1125 (Украина);
- СО2 термостат Sanyo МСО-15АС (Япония);
- магнитные мешалки ММ-3М (Россия);
- инвертированный микроскоп «Макромед И» (Россия);
- центрифуга «Mistral 6L» (Measuring Scientific equipment LTD, Англия);
- культуральные пластиковые флаконы и плашки («Costar», США);
- пипетки серологические одноразовые;
- автоматические дозаторы 25 мкл-1000мкл;
36
2.2 Методы исследований
2.2.1 Оценка эпизоотической ситуации
Объектом исследования являлись результаты лабораторных исследований,
оригинальных работ и первичных публикаций по нозогеографии, эпизоотологии
ИБК. Поиск информации осуществлен в базах данных (PubMed, OIE Publications)
и научных изданиях «Avian Disease», «Avian Pathology».
2.2.2 Подготовка вируссодержащего материала
При проведении вирусологических исследований использовали суспензии
вируса ИБК штамм QX в составе ЭЭЖ КЭ и культуральной жидкости.
2.2.3 Определение условий культивирования штамма QX вируса ИБК в
куриных эмбрионах
Культивирование вируса ИБК в КЭ проводили по общепринятой методике
[20]. Вируссодержащий материал вносили в аллантоисную полость в объеме
0,2см3 с титром инфекционной активности 1000 ЦД50. После заражения отверстия
в скорлупе заливали парафином. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили
через 24 ч после заражения, затем с интервалом не более 6 ч. Гибель эмбрионов
до 24 ч считали неспецифической. Через заданный интервал времени от
инфицированных эмбрионов отбирали пробы ЭЭЖ и ХАО для исследований.
2.2.4 Репродукция вируса ИБК в культурах клеток
Репродуктивную способность вируса ИБК в культурах клеток изучали
путем выполнения серийных «слепых» пассажей. Первый пассаж вируса ИБК на
всех культурах выполняли материалом, инфекционная активность которого
составляла
≈100
соответствующие
ЦД50/см³.
Для
культуральные
следующих
жидкости.
пассажей
использовали
Вируссодержащие
материалы
вносили на освобожденный от среды клеточный монослой в объеме 0,1см³. Далее
инфицированную культуру в течение часа выдерживали в термостате при
температуре
(37,0
±0,5)°С,
после
чего
удаляли
инокулят
и
вносили
поддерживающую среду. Параллельно для каждой клеточной линии проводили
контроль
на
исключение
неспецифических
дегенеративных
изменений.
37
Ежедневно проводили микроскопию всех клеточных культур и оценивали
морфологическое состояние клеток.
2.2.5 Титрование вируса
Для оценки инфекционного титра вируса ИБК в качестве чувствительных
тест-объектов использовали исследуемые клеточные культуры, выращенные в
виде монослоя на дне пенициллиновых флаконов, ТОК в полистироловых
плашках и эмбрионы СПФ-кур. Применяли стандартный метод последовательных
разведений, при котором разбавление вирусных материалов проводили на
питательной среде или на ФБР.
Инфицирование
клеточных
культур
выполняли
путем
внесения
приготовленных разведений вирусных материалов во флаконы с монослоем или в
лунки плашек с ТОК. КЭ инокулировали в аллантоисную полость через
перфорированную скорлупу с помощью шприца. Отверстие в скорлупе закрывали
стерильным парафином. Учитывали ЦПД в монослое культур клеток, цилиостаз в
ТОК, гибель КЭ и другие патологоанатомические проявления. Неспецифической
реакцией считали гибель КЭ или ЦПД на культуре или в ТОК в период 24 ч после
заражения. Расчет величины инфекционного титра вируса проводили по методу
Кербера через 7 сут инкубации.
2.2.6 Определение степени антигенного родства
Реакция нейтрализации
Для постановки реакции нейтрализации использовали ТОК по методике
О.А. Чупиной [8] с небольшими модификациями. В основу РН брали
стандартный, классический метод, описанный в Руководстве по вирусологии [20].
Титр вируснейтрализующих антител вычисляли по Керберу на основании полного
цилиостаза на ТОК и ЦПД в культуре клеток через 5-6 сут инкубации после
инокуляции культуры. Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали
индексом нейтрализации, который представляет собой разность показателей
логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток.
Оценкой антигенной «близости» штаммов (по сыворотке или по вирусу) считали
соотношение гомо- и гетерологичных индексов, установленное в виде доли
38
инфекционного вируса, который не образовал иммунных комплексов в
гетерологичной
системе
(оценка,
обратная
стандартной
величине
"r",
характеризующей антигенную близость или "родство").
2.2.7 Оценка патогенных свойств штамма QX
Патогенные свойства вируса изучали в острых опытах. Для исследования
использовали
суточных
СПФ-цыплят,
серонегативных
кур-несушек
180-
суточного возраста и серонегативных петушков этого же возраста. Для выявления
клинического проявления ИБК птиц осматривали 2 раза в день. Регистрировали и
отмечали птиц с депрессией, конъюнктивитами, чиханием и с признаками
диспноэ. У павших и подвергшихся диагностическому убою птиц проводили
некроскопию. С особым вниманием исследовали трахею, легкие, почки и
репродуктивные
органы.
Патогенные
свойства
вируса
для
кур-несушек
определяли путем сравнения показателей продуктивности до инфицирования и
после инфицирования в течение месяца. По окончании опыта также учитывали
результаты патологоанатомического изменения внутренних органов.
2.2.8 Оценка протективной функции вакцины из штамма Н120
серотипа Mass против заражения штаммом QX
Для изучения протективных свойств вакцины для цыплят СПФ-кур против
заражения штаммом QX провели ряд опытов. Эффективность вакцинации
исследовали по следующим параметрам: клинико-патологоанатомическому
проявлению болезни, активности ресничек мерцательного эпителия трахеи,
наличию вирусного генома в органах-мишенях с помощью ПЦР.
2.2.8.1Тест на цилиостаз
Цилиарная активность мерцательного эпителия трахеи является одним из
критериев оценки патогенности вируса ИБК и защищенности цыплят. С целью
определения его активности через 6 сут после инфицирования группу цыплят
подвергали эвтаназии и препарировали трахею до бифуркации с минимальным
травматизмом. Затем трахею помещали в питательную среду ПСС и с помощью
бритвенного лезвия готовили срезы колец трахеи (эксплантаты) по 0,5-1 мм.
Использовали следующие оценки: 0 - цилиостаз охватывает менее 1/4 периметра
39
внутренней поверхности трахеи, 0,25 - охват не менее 1/4 периметра, 0,50 - охват
не менее 1/2 периметра, 0,75 - охват не менее 3/4 периметра, 1,00-охват более 3/4
периметра. Результирующим показателем цилиостаза в данном образце (CS)
являлось среднее значение из n – числа единичных оценок (CS=Σcs/n).
2.2.8.2 Выделение вирусной РНК
Для выделения РНК из исследуемого образца применяли набор для
выделения нуклеиновых кислот с сорбентом NucleoS+ (ООО «Биоком», Россия) в
соответствии Инструкцией производителя.
2.2.8.3 ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и секвенирование
фрагмента гена S1
ОТ-ПЦР проводили согласно Методическим указаниям [12]. Определение
нуклеотидной последовательности фрагмента гена S1 вируса ИБК осуществляли
по методу Сэнгера с использованием флуоресцентно меченных терминирующих
нуклеотидов на автоматическом секвинаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems,
США).
Полученные
нуклеотидные
последовательности
сравнивали
с
последовательностями референс-штаммов вируса ИБК, опубликованными в
международной базе данных GenBank с помощью программы BioEdit, версия
7.0.5.3.
2.2.9 Статистическая обработка результатов экспериментов
Использовали общепринятые в биологии методы статистической обработки
данных. Применяли стандартные методы обработки выборок варьирующих
переменных, в том числе с использованием непараметрической статистики [7, 22].
Вычислительные операции и графические построения выполняли с помощью
приложения Microsoft Office Excel. При обработке экспериментальных данных и
интерпретации результатов оказывал консультативную помощь и принимал
непосредственное
участие
ведущий
научный
сотрудник
лаборатории
профилактики болезней птиц кандидат ветеринарных наук В.Ю. Кулаков.
40
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Вирус ИБК генотипа QX. Эпизоотическая ситуация
Анализ распространения вируса ИБК генотипа QX среди кур включал в
себя следующие этапы:
- определение нозоареала и хронологии распространения вируса ИБК
генотипа QX в мире (по данным научных публикаций);
- изучение распространения вируса ИБК генотипа QX на территории России
в 2005-2014 гг.
3.1.1 Распространение вируса ИБК генотипа QX в мире
На основании анализа научных публикаций [15, 58, 78, 124, 146, 158, 159].,
содержащих информацию об эпизоотологии вируса ИБК генотипа QX в период с
1996 по 2014 гг., была построена хронология начальных этапов распространения
возбудителя, проведено картографирование неблагополучных территорий и
определен нозоареал (рисунок 2).
Вирус ИБК, демонстрирующий не свойственную данному возбудителю
клиническую картину болезни (провентрикулит - воспаление железистого
желудка), был обнаружен в сентябре 1996 г в провинциях Циндао и Шандонг в
КНР. Болезнь сопровождалась высокой смертностью среди кур 25-70-суточного
возраста. Генетический анализ показал, что в сравнении с известными в то время
генотипами вируса
ИБК, структура генома выделенного изолята имела
существенные отличия в гене S1. На этом основании выделенный изолят был
определен как вирус ИБК отдельного генотипа, который позже назвали QX.
В РФ распространение генотипа QX было отмечено в 2001 г на территории
Дальнего Востока, и в 2002 г – на европейской части.
В Европе первые сообщения о циркуляции вируса QX-генотипа, появились
в Голландии в 2003 г. В период с 2003 по 2004 гг. болезнь отмечалась на
бройлерах и характеризовалась поражением почек. Среди кур-несушек болезнь
проявлялась повреждением репродуктивных органов
Стрелками показаны наиболее вероятные направления первичного распространения возбудителя
Рисунок 1. Нозоареал вируса ИБК генотипа QX в период с 1996 по 2014 гг. (выделен красным).
41
42
В последние 10 лет изоляты вируса ИБК, генетически родственные
китайскому вирусу (так называемые QX-подобные), выделяли во Франции,
Бельгии, Италии, Венгрии, Швейцарии, Германии, Англии, Польше, Греции,
Словении, Швеции, Дании, Финляндии.
3.1.2 Встречаемость вируса ИБК генотипа QX на территории России и
стран СНГ в 2005-2014 гг.
В основу данного анализа были положены результаты лабораторных
исследований, проведённых в ФГБУ «ВНИИЗЖ», по выявлению генома вируса
ИБК из патматериала птицеводческих хозяйств разных регионов РФ и стран СНГ.
Исследования по выявлению генома вируса ИБК за 2005-2014 гг. были проведены
сотрудниками лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» при
непосредственном участии к.б.н. Овчинниковой Е.В.
Всего за указанный период в ПЦР было исследовано 2330 проб внутренних
органов птиц более чем из 300 птицефабрик, где присутствовал характерный для
ИБК респираторный симптомокомплекс и прилагаемые сопроводительные
документы указывали на необходимость подтверждения соответствующего
диагноза. Геном вируса ИБК был выявлен в 815 пробах, что составило 35% от
общего количества изученных образцов.
Большинство положительных образцов относились к генотипу Mass (30%).
Существенную часть (28%) составили образцы, отнесенные к генотипу 793/В.
Также, 28% были отнесены к генотипу D274. Генотип QX был выявлен в 14%
случаев.
Исследовали динамику встречаемости генотипа QX.в период 2005-2014 г.г.,
продолжительность которого составила восемь лет. Поскольку общее количество
тестируемых
образцов
за
год,
содержащих
геном
вируса
ИБК,
было
приблизительно одинаковым (т.е 815/9 ≈ 90), то считали возможным определять
среднегодовой процент встречаемости (Pc) генотипа QX по общему знаменателю,
а именно по формуле: Y= (S+/90) ×100, где S+- число образцов отнесенные
генотипу QX.
43
Таким образом, была получена хронологическая диаграмма встречаемости
вируса ИБК генотипа QX в границах изученного периода. Кроме этого был
проведен корреляционно-регрессионный анализ, который позволил определить
коэффициент корреляции изучаемых параметров K=0,83 и построить модель
(полином) их связи (рисунок 2).
40
Y
35
Y = 0,0178x 6 - 214,34x 5 + 1E+06x 4 - 3E+09x3 + 4E+12x 2 - 3E+15x + 1E+18
30
25
20
15
10
5
0
2004
2006
2008
2010
2012
2014
X
2016
-5
Рисунок 3. Встречаемость (Y, %) генотипа QX от числа образцов (n≈90), где
присутствовал геном вируса ИБК, выделенных на территории РФ и стран СНГ,
соответственно
годам
(x).
Пунктиром
показано
построение,
проведенное
по
регрессионной модели.
Представленная на рисунке 3 хронологическая диаграмма частоты
встречаемости
на указанной территории не была равномерной. Распределение оценок Y имело
два выраженных максимума, которые были отмечены в 2008 г (≈34%) и в 2011
г.(≈27%). При этом в 2005 г (≈7%), в 2009 г. (≈9%) и в 2013 г.(5%) присутствовали
очевидные минимумы, и 2014 г. QX-положительных образцов зарегистрировано
не было.
44
Однако присутствие явной хронологической волнообразности процесса не
дает оснований считать, что среди вариантов вируса ИБК представительство QXгенотипов монотонно снижается. При этом построенная регрессионная модель,
имеющая коэффициент адекватности K²=0,7, прогнозирует в ближайшие два года
очередной подъем показателя Y.
Проведенный эпизоотологический анализ показал, что распространение
вируса ИБК генотипа QX с 1996 г. имело очевидную направленность, и течение
последних 19 лет возбудитель регистрируется во многих странах Европы, Азии и
Африки,
где
присутствует
развитое
птицеводство.
Хронология
частоты
встречаемости данного генотипа имеет волнообразный характер. Очередной
вероятный подъем распространения вируса QX-генотипа ожидается на период
2015 -2017 гг.
3.2 Культивирование вируса ИБК штамма QX в КЭ и в культурах
клеток
Культивирование в КЭ
Проведение
научно-исследовательских
иммунобиологических
свойств
работ
вирусов
требует
по
изучению
стандартизации
вируссодержащего материала, используемого для проведения исследований,
главным
образом
по
гомогенности
вирусной
популяции,
отсутствию
контаминации посторонними вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами, а
также по показателю инфекционной активности.
Поэтому изучение условий культивирования вируса в КЭ и получение
необходимого
объема
высокоактивного
вирусного
материала
для
иммунологических исследований стали нашей первой задачей.
В
качестве
лиофилизированный
исходного
вирусный
вирусного
материал
материала
вируса
ИБК
использовали
штамма
QX
с
инфекционной активностью 4,1 lg ЦД50/см3, полученный из коллекции штаммов
микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Эмбрионы СПФ-кур 10-суточного срока инкубации использовали для
заражения
исходным
вирусом.
В
экспериментах
определяли
динамику
45
накопления инфекционного вируса, элективные зоны вируса для репликации в
КЭ.
Наиболее простым и практичным методом заражения КЭ является
заражение в аллантоисную полость. Было проведено три серии экспериментов.
Накопление вируса в организме КЭ оценивали титрованием ЭЭЖ и суспензии
ткани ХАО на ТОК. Перед титрованием из тканей ХАО готовили 10% суспензию
на физиологическом растворе с добавлением антибиотиков. Экспериментальный
T, lgЦД50/ 0,1 cм3
материал в виде установленных значений титра вируса представлен на рисунке 4.
4,5
ЭЭЖ (lgT)
ХАО (lgT)
4
3,5
3
2,5
2
1,5
30
36
48
54
68
77
85
96
Время культивирования,ч
Рисунок 4. Динамика накопления инфекционного вируса ИБК штамма QX в ЭЭЖ и в
ХАО
Результаты, приведенные на рисунке 4, демонстрируют, что в обоих типах
исследуемых образцов для вируса существовал явно выраженный период
накопления, который заканчивался после 54 ч инкубации. В период с 36 по 54 ч
культивирования вирус накапливался в максимальных титрах. Величина среднего
значения титра в этот период в ЭЭЖ составила 3,2±0,2 lgЦД50/0,1 см3, тогда как в
ткани ХАО средний титр был 2,3±0,19 lgЦД50/0,1 см3. Указанные величины имели
существенные различия (p≤0,02). Далее, в период снижения титра, статистической
разницы в оценках инфекционного тира вируса не было. Полученные данные
указывали на то, что концентрация вируса в ЭЭЖ более чем на порядок
превосходила аналогичный показатель в ХАО. Поскольку развитие вируса не
могло происходить вне живых клеток, то, вероятно, ЭЭЖ явилась "резервуаром",
где возбудитель скапливался, размножаясь в ткани ХАО. При этом ткань ХАО в
46
период наиболее интенсивной репродукции вируса сохраняла свою структурную
целостность
(по
крайней
мере
на
макроуровне).
В
период
до
54
ч
культивирования при овоскопии явных вирусобусловленных эмбриопатических
явлений не наблюдали.
Информация о репродукции вируса в эмбрионах СПФ-кур может быть
полезна при составлении хронологического графика культивирования.
В процессе дальнейших исследований развития вируса ИБК в эмбрионах
СПФ-кур установлено, что эмбриопатическое действие возбудителя могло быть
обнаружено у определенного процента эмбрионов после 50 ч культивирования.
Патологические процессы выявлялись только при вскрытии эмбрионов, где
наблюдались точечные кровоизлияния на ХАО и патологию развития самого
эмбриона. Инфицированный эмбрион, как правило, был деформирован и
существенно
отставал
в
росте
(карликовость)
по
отношению
к
неинфицированным контрольным эмбрионам (рисунок 5).
Таким образом, на основании проведенных опытов можно сделать
заключение о том, что штамм QX при инфицировании СПФ-эмбрионов кур в
аллантоисную полость в период 36 ÷54 ч. культивирования способен был
накапливаться в экстраэмбриональной жидкости в титре 4,2±0,2 lgЦД50/1 см3.
А
Рисунок 5. Эмбриопатическое действие вируса ИБК штамма QX
А- геморрагическое воспаление ХАО;
B-отставание в развитии инфицированного эмбриона по отношению контроля;
В
47
Адаптация вируса ИБК штамма QX к культурам клеток
Основной задачей данного этапа исследований было определение спектра
клеточных культур, чувствительных к данному возбудителю. Предметом
исследований были следующие культуры: первичная культура фибробластов
эмбрионов кур (ФЭК), первичная культура почек эмбрионов кур (ПЭК),
перевиваемая культура почки зеленой мартышки (Vero), перевиваемая культура
гепатоцеллюлярной карциномы цыпленка (LMH), перевиваемая культура почки
КРС (MDBK), перевиваемая культура почки теленка (RBT).
В экспериментах планировали исследовать возможность стимуляции
репродукции и цитопатического действия вируса в результате добавления в
состав питательной среды трипсина (1мг/100 мл).
Все
клеточные
культуры
были
выращены
в
виде
монослоя
на
плоскостенных культуральных флаконах с рабочей поверхностью 25 см² (Costar,
США). Для испытания каждой клеточной культуры использовали не менее 15
флаконов с завершенным монослоем, которые были разделены на 4 группы с
соответствующим числом флаконов (фл): I-фл (вирус+среда+трипсин), II- фл.
(вирус+среда), III-3 фл (среда+трипсин), IV- 3 фл (среда). Для заражения
использовали вирусный материал, который представлял из себя разбавленную с
питательной средой ПСС ЭЭЖ в соотношении 1:2. Инфекционная активность
составляла 4,1 lgЦД50/см³.
Все флаконы освобождали от соответствующей ростовой среды. Во
флаконы из групп I и II вносили вирусный материал в объеме 0,1 см³. Во флаконы
из групп III и IV в том же объеме вносили питательную среду. Все культуральные
флаконы содержали в течение 1 часа в термостате при 37ºС.
Далее, во флаконы из групп I и III добавляли 10 мл среды ПСС, содержащей
трипсин, а во флаконы из групп II и IV в том же объеме аналогичную среду без
трипсина. Все культуральные флаконы содержали в термостате при 37ºС.
Ежедневно проводили микроскопию всех клеточных культур и оценивали
морфологическое состояние клеток. Использовали оптический инвертированный
микроскоп «Микромед» (объективы х6, х10, окуляр х4). При необходимости
48
морфологию
инфицированной
культуры
сравнивали
с
соответствующим
контролем. Также по контрольным флаконам определяли время наступления
спонтанной
токсико-трофической
дегенерации
клеток.
Продолжительность
наблюдения за данным типом клеточной культуры устанавливали по сроку
наступления спонтанной токсико-трофической дегенерации в контроле культуры
(группа III и/или IV). До обнаружения указанных явлений из флаконов группы I и
II отбирали пробы, считая их ВСМ. Пробы сохраняли до следующего пассажа при
4ºС. Все последующие пассажи выполняли по аналогии с первым пассажем. Из
флаконов, где наблюдали признаки морфологических изменений монослоя,
которые отличались от контроля, отбирали пробы культуральной жидкости для
оценки величины титра вируса.
Результаты наблюдения морфологии клеточного монослоя соответственно
испытанным клеточным культурам и пассажам приведены в таблице 1.
Из данных таблицы 1 следует, что вирусиндуцированный цитопатический
эффект в подавляющем большинстве наблюдали только в группах I. При этом
действие вируса полностью отсутствовало без стимуляции трипсином (группа II).
Трипсин в испытанной концентрации не оказал заметного влияния на состояние
клеточного
монослоя
(группа
III).
Продолжительность
полноценного
существования клеточных линий до появления признаков дегенерации (группа
IV) составляла от 4 до 6 сут. Более продолжительное культивирование приводило
к закислению среды и указанным дегенеративным процессам. На этом основании
отбор проб культуральной жидкости проводили в период до 96 ч.
Исследовали накопление инфекционного вируса в культурах клеток ФЭК,
ПЭК, RBT. С этой целью в образцах культуральной жидкости, которые были
отобраны на 3, 5, 7 пассажах возбудителя, определяли величину инфекционного
титра вируса для данной культуры. Указанные типы культур выращивали в виде
монослоя на дне пенициллиновых флаконов, которые использовали для
титрования. Присутствие признаков ЦПД во флаконе считали положительной
реакцией единичного тест-объекта.
49
Таблица 1 - Оценки морфологического состояния клеточного монослоя в исследуемых
культурах клеток соответственно проведенным пассажам вируса
Культура клеток
№
группы
ФЭК
ПЭК
LMH
Vero-V
MDBK
RBT
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
Номер пассажа
1
2
3
4
5
6
7
-*
-
±**
±
±
±
-
+***
++
±
~
±
±
±
±
±
~
~
++
~
-
++
~****
++++
~
~
~
~
~
~
±
~
~
~
±
~
~
~
+++
~
~
~
++++
~
~
~
++++
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
±
~
~
~
++++
~
~
~
++++
~
~
~
++++
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
++++
~
~
~
++++
~
~
~
++++
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
~
++++
~
~
~
*
нет изменений;
**
сомнительная реакция;
***
присутствуют изменения структуры монослоя, наступившие ранее, чем признаки спонтанной
токсико-трофической дегенерации клеток в контроле (количество знаков указывает на процент
пораженной площади монослоя: «+»- до 25%; «++» до 50%; «+++» - до 75%; «++++» - более
75%);
****
не исследовали;
Титрование проводили путем последовательных разведений изучаемого
материала, величину инфекционного тира вируса (ТЦД50) рассчитывали по
методу Кербера. Оценку титра проводили не менее чем в трех повторностях (n≥3).
Полученные результаты представлены в виде диаграммы, отражающей средние
значения титров, на рисунке 6.
50
T
5
4
3
ФЭК
ПЭК
RBT
2
1
0
3
5
7
пассаж
Рисунок 6. Величина инфекционного титра (T, lgТЦД50/см³) вируса ИБК штамм QX
в культуральной жидкости соответственно пассажам, проведенным в культурах клеток
ФЭК, ПЭК и RBT
Приведенные на графике данные позволяют считать, что все перечисленные
культуры клеток после третьего пассажа демонстрируют увеличение накопления
вируса. Установленные на третьем пассаже титры инфекционного вируса
(lgТЦД50/см³) для культур ФЭК, ПЭК и RBT (2,11±0,3; 2,58±0,17 и 1,85±0,1,
соответственно) к пятому пассажу значительно возросли (2,5±0,2, 3,5±0,3 и
1,95±0,2,
соответственно).
После
пятого
пассажа
накопление
вируса
стабилизировалось. Усредненные оценки титров 5-7 пассажа включительно для
исследованных культур ФЭК, ПЭК, RBT составили: 2,83±0,17; 3,73±0,18;
2,49±0,53, соответственно.
Исследовали антигенные свойства вируса, адаптированного к культуре
клеток RBT. С этой целью провели реакцию нейтрализации. Использовали
сыворотку от СПФ-цыплят в возрасте 53 сут через 28 сут после их иммунизации
исходным (не адаптированным к культуре) вирусом. Чувствительной тестсистемой являлась указанная культура, выращенная в виде монослоя на дне
пенициллиновых флаконов (аналогия с тест системой для титрования вируса).
Реакцию ставили с переменными разведениями сыворотки и постоянной дозой
вируса (ß-вариант). Для испытания каждого разведения использовали не менее 6
флаконов
с
культурой.
Реакцию
ставили
стандартным
способом.
В
подготовленные двукратные разведения сыворотки в диапазоне (1:16÷1:512)
вносили одинаковый объем вируса в дозе 100 ТЦД50. Параллельно аналогичную
51
операцию проводили с нормальной сывороткой СПФ-цыплят. Кроме этого, на
среде без сыворотки контролировали величину дозы испытанного вируса.
Величину нейтрализующего эффекта сыворотки (НД50) и оценку использованной
дозы вируса (ТЦД50) рассчитывали по методу Кербера. Эксперимент повторяли в
трех повторностях.
Было установлено, что средняя оценка нейтрализующего действия
сыворотки составила величину 7,4±0,32 log2 НД50/0,1см³ против инфекционного
вируса в дозе 100 ТЦД50. При этом нейтрализующего эффекта сыворотки от СПФцыплят для исследованных разведений не наблюдали. Полученные результаты
свидетельствовали, что вирус 7 пассажа на культуре клеток RBT активно
реагировал в РН с сывороткой, имеющей антитела к вирусу ИБК, т.е сохранил
соответствующие антигенные свойства.
В результате проведенной работы на этапе исследований адаптации вируса
ИБК штамма QX было установлено, что вирус ИБК при стимулирующем
действии трипсина может быть адаптирован к первичным культурам клеток ФЭК
и ПЭК, а также перевиваемой культуре RBT. Наибольшее накопление вируса
было отмечено на 6 и 7 пассажах на культуре ПЭК (приближенно 4 lgТЦД50/см³).
При этом вирус седьмого пассажа на культуре клеток RBT мог быть
нейтрализован сывороткой гомологичной исходному вирусу.
3.3 Оценка антигенной чистоты рабочих расплодок
Исключали присутствие контаминантов, которые могли бы индуцировать
антитела у цыплят. С этой целью получали гипериммунные сыворотки от СПФцыплят. Цыплят в возрасте 25 сут прививали инфекционным вирусом окулярно в
дозе 3 lg ЦД50/0,2см3 двукратно с интервалом 2 недели. Затем провели третью
иммунизацию внутримышечным введением вирусного антигена в смеси с полным
адъювантом Фрейнда. Отбор проб крови для получения сывороток проводили
через 4 недели после последней прививки. Далее сыворотки были объединены в
общий материал. В тексте материал обозначен как сыворотка против вируса ИБК
штамм QX.
52
Полученную сыворотку исследовали в ИФА и РТГА с использованием
стандартных диагностических наборов для определения антител против вируса
ИБК, ИББ, РЕО, метапневмовируса, ИЛТ, ИЭП, ССЯ-76 и M.gallisepticum. За
основу был принят перечень возможных контаминантов, которые требуют
исключения
при
паспортизации
вирусных
штаммов
в
коллекции
микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Полученные результаты представлены в
таблице 2.
Таблица 2 - Активность сыворотки, полученной к вирусу ИБК штамм QX
в РТГА и в ИФА с гомологичным антигеном и антигенами других вирусов
Реакция
Антиген
Оценка титра*
Минимальный
положительный титр**
ИФА
РТГА
ИБК
7943 (5011÷12589)
165
ИББ
2÷141
551
РЕО
11÷57
378
Пневмовирус
1÷98
260
MG
57÷134
149
ИЛТ
0÷30
340
ИЭП
211÷798
3397
ИБК
194 (157÷238)
≤4
НБ
3,03 (2,4÷3,7)
≤8
ССЯ
2,3 (2,1÷2,8)
≤8
*
Величина среднего геометрического титра и диапазон стандартной ошибки, полученной
в результате не менее трех повторностей;
**
Величина порогового значения, соответствующая положительной реакции в данном
диагностическом наборе
Приведенные в таблице 2 данные иллюстрируют, что как в ИФА, так и в
РТГА ни одна из гетерологичных реакций не вышла за рамки порогового
положительного показателя. В биологическом смысле это означало, что в
пределах разрешимости использованных реакций антитела против перечисленных
вирусов, а также микоплазм в сыворотке, полученной на вирус ИБК штамм QX,
53
не регистрировались. Следовательно, предназначенные для экспериментов
расплодки вируса ИБК штамм QX контаминантов не содержали.
3.4 Изучение антигенной «удаленности» штамма QX по отношению к
другим штаммам вируса ИБК
Анализ литературных данных показывает, что, несмотря на широкое
применение и высокую достоверность молекулярных методов исследования,
данные по генотипированию не всегда кореллируют с серотипированием. Задачей
настоящего
этапа
исследований
являлось
определение
количественных
показателей, характеризующих антигенную близость штамма QX по отношению к
другим штаммам вируса ИБК, выделенным в разное время и относящимся к
разным генетическим группам. В работу были включены штаммы Н120, 4/91,
D274 и штамм L1148. Перечисленные штаммы вируса находились в составе
экстраэмбриональной жидкости, полученной после расплодок в эмбрионах СПФкур.
В серологических экспериментах по антигенной дифференциации штаммов
использовали реакцию нейтрализации в варианте постоянной концентрации
сыворотки и переменных доз вируса (α-вариант). При данном способе постановки
реакции оценочным показателем был принят стандартный индекс нейтрализации
как соотношение инфекционных титров вируса, установленных в гомо- и
гетерологичных системах.
Для проведения реакции нейтрализации были получены иммунные
сыворотки от СПФ-цыплят в возрасте 53 сут через 28 сут после их иммунизации
штаммами QX, Н120, 4/91 и D274, соответственно. Указанные сыворотки в
заданной концентрации использовали при титровании соответствующих штаммов
вируса для оценки нейтрализующего эффекта.
В качестве чувствительной тест-системы использовали трахеальную
органную культуру (в виде срезов толщиной 0,5-1 мм), которую инкубировали в
лунках на пластиковых панелях в среде ПСС. Индикацию инфекционного
действия вируса регистрировали по проявлению эффекта цилиостаза с помощью
инвертированного оптического микроскопа.
54
Для проведения реакции нейтрализации готовили последовательные
десятикратные разведения вирусного материала на среде ПСС, содержащей
иммунную сыворотку. Контроль инфекционной активности вируса проводили
путем параллельного титрования на 5% нормальной сыворотке крови кур,
приготовленной также на культуральной среде. Далее смесь выдерживали в
термостате при температуре 37°С в течение 30 минут. Для испытания каждого
разведения вируса использовали не менее 4 чувствительных тест-объектов (лунок
на планшете со срезами трахеи). Цилиостатический эффект оценивали через 6 сут.
Значение инфекционного титра вируса (ЦД50) вычисляли по методу Кербера.
3.4.1 Исследование гомологичной нейтрализующей активности
иммунных сывороток крови кур
Определяли величину наименьшей концентрации иммунных сывороток
(антисывороток),
при
которой
в
гомологичных
реакциях
происходит
статистически полная нейтрализация инфекционного вируса. С этой целью на
культуральной среде готовили растворы антисывороток, содержащие 10, 5, 2,5 и
1,25%
сыворотки.
На
приготовленных
растворах
проводили
титрование
гомологичных штаммов вируса. Полученные результаты представлены в
таблице 3.
Анализ данных, приведенных в таблице 3, позволил сделать заключение,
что если иммунные сыворотки имели концентрацию 10%, то их нейтрализующая
способность для всех гомологичных штаммов была абсолютна (остаточная
инфекционность вируса не регистрировалась, полный цилиостаз). При снижении
концентрации антисывороток признаки инфекционного действия вируса начинали
проявляться, т.е отмечали цилиостаз.
55
Таблица 3 – Результаты исследования нейтрализующего действия иммунных
сывороток крови кур против штаммов вируса ИБК в гомологичных реакциях
Величина инфекционного титра вируса (lgСД50/0,1 см³), установленная при титровании ВСМ на
разбавителе, содержащем различные концентрации гомологичных иммунных сывороток.
Контроль вируса - нормальная сыворотка.
Гомологичный
штамм вируса
H120
Ср. знач. (x±m)
4\91
Ср. знач. (x±m)
D274
Ср. знач. (x±m)
QX
Ср. знач. (x±m)
Концентрация иммунной сыворотки, %
10
5
2,5
1,25
≤0,00*
≤0,00
≤0,00
0,75
≤0,00
0,75
≤0,00
1,25
~**
≤0,00
0,75
1,25
≤0,00
≤0,00
~
~
0,00***
0,19±0,19
0,25±0,25
1,08±0,17
≤0,00
0,75
0,75
1,00
≤0,00
0,75
≤0,00
≤0,00
≤0,00
≤0,00
0,75
1,75
0,00
0,50±0,25
0,50±0,25
0,92±0,51
≤0,00
0,75
1,25
0,75
≤0,00
≤0,00
~
1,75
~
0,75
2,00
1,75
≤0,00
≤0,00
1,25
~
0,00
0,38±0,38
1,50±0,25
1,42±0,33
≤0,00
0,75
≤0,00
≤0,00
≤0,00
≤0,00
0,75
~
~
≤0,00
≤0,00
≤0,00
≤0,00
≤0,00
1,25
1,25
0,00
0,19±0,19
0,50±0,31
0,42±0,42
Нормальная
сыворотка (10%)
5,25
5,75
5,25
~
5,42±0,17
5,75
6,0
6,00
5,92 ±0,08
5,25
5,25
5,75
5,25
5,38 ±0,13
4,25
5,0
4,5
~
4,58±0,22
вирусные материалы титровали, начиная с разведения 1:10, на этом основании отсутствие
цилиостатического эффекта в испытанных разведениях оценивали как ≤0,00 lgСД50/0,1
см³ (т.е. величина инфекционного титра составила ≤1СД50/0,1 см³);
не определяли;
при выполнении вычислительных операций оценки ≤0 принимали как равные 0
*
**
***
Статистически значимая (t=x/m>tp≤0,05) остаточная инфекционность была
отмечена в реакции гомологичной сыворотки со штаммом D274 (1,50/0,25=6,00 >
tp≤0,05=4,30)
при
концентрации
реагента
2,5
%
и
со
штаммом
Н120
(1,08/0,17=6,35>tp≤0,05=4,30) при концентрации 1,25%. Остальные показатели
формально превосходили нулевое значение, однако, при данных условиях,
статистической значимостью не обладали.
На этом основании приняли, что наименьшая концентрация антисывороток,
при которой в гомологичных реакциях происходит статистически полная
нейтрализация инфекционного вируса всех изучаемых штаммов, соответствует
5%. Указанная величина была принята для проведения всех гетерологичных
реакций.
56
3.4.2 Оценки антигенной удаленности штамма QX по отношению к
другим штаммам вируса ИБК
При выполнении серологических исследований, задачей которых являлось
установление антигенной близости изучаемых штаммов на основе гомо- и
гетерологичных
индексов
нейтрализации,
был
принят
ряд
условий,
ограничивающих возможное влияние различных неспецифических факторов на
результат эксперимента. Принято, что:
• исходным титром инфекционного вируса данного штамма считать
оценку ЦД50, установленную при титровании с 5% нормальной
сывороткой кур;
• иммунные сыворотки в гомо- и гетерологичных реакциях использовать
в концентрации 5%;
• определять гомологичный индекс нейтрализации как соотношение
исходного и гомологичного титров данного штамма;
• гетерологичные индексы нейтрализации определять по сыворотке (при
титровании
тест-штамма
с
гетерологичными
иммунными
сыворотками) и по вирусу (при титровании тест-сыворотки с
гетерологичными штаммами вируса);
• оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке или по
вирусу) считать соотношение гомо- и гетерологичных индексов
нейтрализации, установленное в виде доли инфекционного вируса,
который не был нейтрализован в гетерологичной системе (оценка,
обратная стандартной величине "r", характеризующей антигенную
близость или "родственность").
Принятые обозначения, порядок вычислений первичных данных и
производных показателей в виде алгоритма представлен в таблице 4.
57
Таблица 4 - Принятые обозначения, порядок вычислений первичных данных и
производных показателей, используемых при установлении антигенной удаленности
между штаммами вируса по индексам нейтрализации
Обозначения и характеристики реагентов
S0 нормальная сыворотка крови, полученная от СПФцыплят в (отрицательный контроль)
Sj иммунная сыворотка крови, полученная от СПФцыплят в возрасте 53 сут через 28 сут после иммунизации
штаммом Vj вируса ИБК, где j - условный номер штамма
V1; S1; V2; S2 штаммы вируса (Vj) и образцы сывороток (Sj),
которые в
различных комбинациях могут
быть
использованы в гомологичных (hom: V1×S1) или
гетерологичных (het: V1×S2) реакциях
Первичные данные
T0.1 = V1×S0 величина инфекционного титра вируса (lgЦД50),
установленная при титровании штамма V1, в присутствии
5% нормальной сыворотки
Thom.1 = V1×S1 величина инфекционного титра вируса (lgЦД50),
установленная при титровании штамма V1, в присутствии
5% гомологичной сыворотки S1 (гомологичная оценка)
Thet.s.2 = V1×S2 величина инфекционного титра вируса (lgЦД50),
установленная при титровании штамма V1, где в качестве
разбавителя была использована 5% гетерологичная
сыворотка S2 (оценка по гетерологичной сыворотке)
Thet.v.2 = V2×S1 величина инфекционного титра вируса (lgЦД50),
установленная при титровании штамма V2, где в качестве
разбавителя была использована 5% гетерологичная
сыворотка S1 (оценка по гетерологичному вирусу)
Производные показатели (индексы)
lgINhom.1 = lgT0.1-lgThom.1гомологичный индекс нейтрализации штамма V1
lgINhet.s.2 = lgT0.1-lgThet.s.2гетерологичный индекс нейтрализации штамма V1 по
сыворотке S2
lgINhet.v.2 = lgT0.2-lgThet.v.2гетерологичный индекс нейтрализации штамма V2 по
сыворотке S1
Показатели антигенной близости штаммов
lg(1/rs) = lgINhom.1 - lgINhet.s.2
показатель односторонней антигенной удаленности
штамма V1 от штамма V2 (обратное значение антигенной
близости) по сыворотке
lg(1/rv) = lgINhom.2 - lgINhet.s.1
показатель односторонней антигенной удаленности
штамма V1 от штамма V2 (обратное значение антигенной
близости) по вирусу
При проведении статистического анализа результатов использовали
следующие методы. По выборкам варьирующих переменных (x) определяли
средние величины (X) и их статистические характеристики:
q=Ex²-(Ex)²; m²=[q/(n-1)×1]
[1]
Проверку значимости оценок X выполняли по t-критерию Стьдента:
58
t= X/m≥tp, где: tp - табличное значение коэффициента соответственно pуровню значимости. Для дифференциации средних величин в группе, состоящей
из k-числа выборок, использовали
метод Шеффе [22], основанный на
статистическом операторе вида:
D=(Eq ×k-1)/(N-k),
[2]
где: Eq - общая сумма квадратов отклонений от средних во всех выборках;
N - общее количество элементов всех выборок (N=En, где: n - объем одной
выборки).
На основании значения D проводили статистическое сравнение средних
величин (X и Y) путем проверки выполнимости следующего неравенства:
Fxy=(X-Y)²/(D/nx+D/ny)≥Fp,
где:
Fp
-
табличное
[3]
значение
коэффициента
Синедекора-Фишера
соответственно p-уровню значимости.
Для штаммов QX, Н120, 4/91 и D274 определили исходные титры
инфекционного вируса, а также установили оценки остаточной инфекционности в
реакциях
с
гомологичными
сыворотками
(гомологичные
титры)
и
соответствующие индексы нейтрализации. Результаты приведены в таблице 5.
Из данных таблицы 5 следует, что исходные титры изучаемых штаммов
были неодинаковы. Инфекционная активность штамма QX имела существенные
различия со всеми остальными материалами (p≤0.01). Это обстоятельство,
очевидно, определенным образом отразилось и на значениях гомологичных
индексов нейтрализации (INhom).
Однако следует отметить, что исходная инфекционная активность вируса не
была связана с эффективностью гомологичной нейтрализации (Thom.). Например,
установленное для самого активного штамма значение Thom.D274=0,688±0,104
существенно
(p≤0,001)
превосходило
соответствующую наименее активному штамму.
величину
Thom.QX=0,063±0,063,
59
Таблица 5 - Значения исходных и гомологичных титров вируса, а также оценка
гомологичных индексов нейтрализации вируса ИБК штаммов QX, Н120, 4/91 и D274
*
**
***
#
T0.QX=VQX×S0
Thom.QX=VQX×SQX
lgINhom.QX=lgT0-lgThom.QX
4,00
4,00
4,00
3,75
3,938
0,00
0,25
0,00
0,00
0,063±0,063**
4,00
3,75
4,00
3,75
3,875±0,072
T0.H120 =VH120×S0
Thom.H120=VH120×SH120
lgINhom.H120=lgT0lgThom.H120
5,00
6,00
6,00
~***
5,667
0,25
0,00
0,25
0,25
0,188±0,063
5,25
6,00
5,75
~
5,667±0,156
T0.4/91 =V4/91×S0
Thom.4/91=V4/91×S4/91
lgINhom.4/91=lgT0lgThom.4/91
6,00
5,50
5,50
~
5,667
1,00
0,75
0,25
0,75
0,688±0,067
5,00
4,75
5,25
~
5,000±0,102
T0.D274 =V D274×S0
Thom. D274=V D274×S D274
lgINhom. D274=lgT0-lgThom.
6,75
6,75
6,50
6,50
6,625
0,75
1,00
0,50
0,50
0,688±0,120
6,00
5,75
6,00
6,00
5,938±0,054
(D=0,282)#
(D=0,141)#
(D=0,101)#
D274
обозначения показателей см. в таблице 4;
выделены средние значения и их стандартные ошибки (x±m);
исследование этой позиции не проводили
статистический оператор Шеффе для внутригрупповой дифференциации средних
значений
Значения
гетерологичных
индексов
нейтрализации
штамма
QX,
установленные в реакциях с сыворотками SН120, S4/91, и SD274, и аналогичные
оценки, полученные в реакциях сыворотки SQX с гетерологичными штаммами, а
также оценки соответствующих показателей их односторонней антигенной
удаленности (по сыворотке и по вирусу) представлены в таблицах 6 и 7.
60
Таблица 6 - Значения гетерологичных индексов нейтрализации штамма QX*,
установленные в реакциях с сыворотками SН120, S4/91, и SD27, и оценка соответствующих
показателей односторонней антигенной удаленности (1/rs)
Thet.s.H120=VQX×SH
lgINhet.s.H120=T0.QX**Thet.s.H120
lg(1/rs.H120) = lgINhom.QX**lgINhet.s.H120
3,75
3,00
3,75
3,75
0,188
0,938
0,188
0,188
3,687
2,937
3,687
3,687
3,500***
Thet.s.4/91=VQX×S4/91
lgINhet.s. 4/91 = T0.QX-Thet.s.4/91
lg(1/rs.4/91) = lgINhom.QXlgINhet.s.4/91
2,75
2,50
2,75
3,00
1,188
1,438
1,188
0,938
2,687
2,437
2,687
2,937
2,687
Thet.s.D274=VQX×SD274
lgINhet.s.D274=T0.QX -Thet.s.D274
lg(1/rs.D274)=lgINhom.QXlgINhet.s.D274
3,25
2,75
3,00
3,00
0,688
1,188
0,938
0,938
3,207
2,687
2,937
2,937
2,942
(D=0,152)#
*
**
***
#
обозначения показателей см. в таблице 4;
использованы средние оценки из таблицы 5;
выделены средние значения;
в скобках указан статистический оператор Шефе для дифференциации средних
значений
Приведенные в таблицах 6 и 7 данные демонстрируют, что все показатели
односторонней антигенной удаленности (1/rs и 1/rv) штамма QX от исследуемых
вариантов
вируса
ИБК
по
тесту
t=X/m≥tp≤0.05
были
значимы.
Это
свидетельствовало о том, что примененный тип оценок позволял обнаружить и
количественно характеризовать искомый эффект антигенных различий. При этом
установленные в обеих системах величины 1/r имели определенные различия.
По результатам реакций с гетерологичными сыворотками наибольшая
удаленность была установлена для штамма Н120, для которого соответствующий
средний показатель составил величину lg(1/rs.H120) = 3,500. Указанная оценка была
61
достоверно (p≤0,01) наибольшей по группе. Также соответствующее штамму
Н120 значение lg(1/rv.H120) =5,000 было статистически наибольшим (p≤0,01) и в
другой системе при дифференциации по вирусу.
Таблица 7 - Значения гетерологичных индексов нейтрализации для SQX*,
установленные в реакциях со штаммами VН120, V4/91 и VD274, а также оценки
соответствующих показателей односторонней антигенной удаленности (1/rv)
Thet.v.H=VH120×SQX
lgINhet.v.H120=T0.H120**Thet.v.H120
4,75
5,25
5,00
5,00
Thet.v.4/91=V4/91×SQX
lg(1/rvH120)
lgINhet.v.H120
0,917
0,417
0,667
0,667
lgINhet.v.4/91 = T0.4/91-Thet.v.4/91
4,50
4,25
4,00
4,25
4,75
5,25
5,00
4,50
lgINhom.H120-
4,750
5,250
5,000
5,000
5,000***
lg(1/rv4/91)=lgINhom.4/91lgINhet.v.4/91
1,167
1,417
1,667
1,417
Thet.v.D274=VD274×SQX lgINhet.v.D274=T0.D274-Thet.v.D274
=
3,833
3,583
3,333
3,583
3,583
lg(1/rv.D274)=lgINhom.D274lgINhet.v..D274
1,857
1,375
1,625
2,125
4,081
4,563
4,313
3,813
4,193
(D=0,124)
*
**
***
#
обозначения показателей см. в таблице 2;
использованы средние оценки из таблице 3;
выделены средние значения;
в скобках указан статистический оператор Шефе для дифференциации средних
значений
Варианты 4/91 и D274 в обеих системах демонстрировали несколько
меньшую удаленность от штамма QX. При этом средние оценки lg(1/rs.4/91)=2,687
и
lg(1/rs.D274)=2,942,
а
также
lg(1/rv4/91)=3,583
и
lg(1/rv.D274)=4,193
были
статистически тождественны. Это означало, что степень антигенной близости
указанных вариантов вируса ИБК к штамму QX была приближенно одинаковой.
62
Важно отметить, что порядок расположения штаммов по степени
удаленности в обеих системах был подобен. Различия использованных систем
состояли лишь в масштабах полученных оценок 1/rs и 1/rv. Это указывало на
эквивалентность реакций, происходящих в различных системах. Вероятно, что
как антитела, так и вирусный антиген в гетерологичных системах реагировали
подобным образом.
Для подтверждения эквивалентности использованных дифференцирующих
систем соответственно испытанным штаммам определили средний параметр
положения оценок lg(1/rs) и lg(1/rv). С этой целью внутри каждой системы провели
ранжирование отмеченных показателей по возрастанию. Таким образом, каждому
однократно
измеренному
значению
был
(x)
присвоен
ранг
(x→y),
характеризующий его параметр положения в данной системе. Далее значения
рангов нормировали по общему числу элементов в системе: z=y/(N+1), где: N=En;
n - число элементов в одной группе. На этом основании оценка параметра
положения приобрела размерность доли (0<z<1) и стала независимой от числа
элементов в системе (n). После чего для каждого штамма в данной системе
определили
величину
среднего
нормированного
ранга
Полученные
(Z).
результаты представлены в таблице 8.
Таблица 8 - Средние нормированные ранги показателей односторонней антигенной
удаленности по сыворотке ( lg1/rs) и по вирусу lg(1/rv) штаммов H120, 4/91 и D274 от
штамма QX
Штамм
Показатель
H120
4/91
D274
lg(1/rs)
0,779
0,279
0,519
lg(1/rv)
0,808
0,212
0,481
Из результатов, представленных в таблице 8, следует, что независимо от
типа примененной дифференцирующей системы средние параметры положения
оценок lg(1/rs) и lg(1/rv) соответственно изученным штаммам были практически
одинаковы. Это обстоятельство позволило считать использованные системы и
соответствующие
показатели
антигенной
дифференциации
штаммов
63
эквивалентными. Обобщенный результат в виде дендрограммы представлен на
рисунке
7,
который
схематично
демонстрирует
показатель
антигенной
удаленности штамма QX от референс-штаммов.
Рисунок 7. Дендрограмма антигенной разности штаммов вируса ИБК
3.4.3 Сравнение антигенных свойств вируса ИБК штаммов QX и L1148
в реакциях с сыворотками к штаммам Н120, 4/91, D27, и QX
Исследовали
возможность
антигенной
дифференциации
генетически
близких штаммов QX и L1148. Использовали методический подход, изложенный
в виде алгоритма в таблице 2. Оценивали гетерологичные индексы нейтрализации
(lgINhet.s) штамма L1148, установленные в реакциях с сыворотками SН120, S4/91,
SD274, и SQX. При постановке реакций в качестве положительного контроля
параллельно использовали нормальную сыворотку (S0). Полученные результаты
приведены в таблице 9.
Из данных таблицы 9 следует, что все полученные значения lgINhet.s по
тесту t=X/m≥tp≤0.05 были статистически значимы (lgINhet ≠ 0), т.е. во всех реакциях
нейтрализующее действие иммунной сыворотки превышало реакцию вируса с
нормальной сывороткой. Однако эффективность нейтрализации у исследуемых
сывороток имела значительные различия.
64
Таблица 9 - Значения гетерологичных индексов нейтрализации (lgINhet.s)* штамма
L1148, установленные в реакциях с сыворотками SН120, S4/91, SD27, и SQX
T0.L1148 =VL1148×S0**
Thet.s.H120=VL1148×SH120
lgIN0=T0.L1148-Thet.s.H120
6,75
6,25
0,50
6,25
5,75
0,50
6,25
6,00
0,25
0,417±0,083**
T0.L1148 =VL1148×S0
Thet.s.4/91=VL1148×S4/91
lgIN=T0.L1148-Thet.s.4/91
6,25
4,75
1,50
6,25
4,50
1,75
6,50
5,25
1,25
1,500±0,144
T0.L1148 =VL1148×S0
Thet.s.D274=VL1148×SD27
lgIN=T0.L1148-Thet.s.D274
6,50
5,75
0,75
6,25
5,00
1,25
6,00
5,00
1,00
1,000±0,144
T0.L1148 =VL1148×S0
Thet.s.QX =VL1148×SQX
lgIN=T0.L1148-Thet.s.QX
6,50
2,25
4,25
6,00
1,25
4,75
6,00
1,75
4,25
4,417±0,163
(D=0,172)#
*
**
***
#
обозначения показателей см. в таблице 2;
в качестве положительного контроля во всех реакциях использована нормальная
сыворотка (S0);
выделены средние значения;
в скобках указан статистический оператор Шеффе для дифференциации средних
значений
Наибольший
продемонстрировала
средний
сыворотка,
индекс
нейтрализации
гомологичная
штамму
(lgINhet.s.QX=4,417)
QX.
Отмеченный
показатель существенно отличался (p≤0,001) от всех остальных. При этом
средний индекс, соответствующий штамму Н120 (lgINhet.s.H120=0,417), был
наименьшим (p≤0,01). Величины, соответствующие штаммам 4/91 и D274
65
(lgINhet.s.4/91=1,147 и lgINhet.s.D27=1,00), заняли промежуточное положение и между
собой существенных различий не имели.
Важно отметить, что приведенные в таблицах 6 и 7 индексы нейтрализации
(lgIN.), полученные в реакциях сывороток SН120, S4/91, SD274, и SQX со штаммом QX,
и аналогичные показатели, полученные с этими сыворотками со штаммом L1148
(таблица 9), демонстрировали очевидное подобие.
Для проверки этого предположения был проведен анализ соответствия
средних
параметров
положения
соответствующих
значений
lgINhet.s,
установленных в реакциях указанных сывороток с отмеченными штаммами. С
этой целью была использована ранее описанная процедура ранжирования,
вычисления нормированных рангов и средних значений Z. Полученные
результаты приведены в таблице 10.
Таблица 10 - Средние нормированные ранги индексов нейтрализации (lgINhet.s)
сывороток SН120, S4/91, SD27, и SQX со штаммами QX и L1148
Сыворотка
Штамм
SН120
S4/91
SD27
SQX
QX
0,206
0,397
0,566
0,853
L1148
0,154
0,396
0,603
0,872
Результаты, представленные в таблице 10, иллюстрируют, что средние
параметры положения индексов нейтрализации (lgIN.), полученных в реакциях
сывороток SН120, S4/91, SD27, и SQX со штаммами QX и L1148, имели высокий
уровень совпадения. Следовательно, реакция каждой использованной иммунной
сыворотки
с
указанными
штаммами
имела
близкую
количественную
характеристику. В биологическом смысле это могло свидетельствовать об
подобии антигенных структур данных штаммов.
3.5 Патогенные свойства штамма QX
Известно, что вирус ИБК генотипа QX может вызывать разную
клиническую
картину
болезни
у
кур
всех
возрастов
и
направлений
66
продуктивности. При этом клинико-патологоанатомическое проявление болезни у
молодняка связано с респираторным и нефрозо-нефритным синдромами, а среди
кур-несушек - с репродуктивным синдромом. Учитывая эти данные, опыты по
определению степени патогенности штамма QX выполняли на птице разного
возраста. С этой целью использовали серонегативных к вирусу ИБК СПФ-цыплят
суточного возраста, кур-несушек и петушков 180-суточного возраста.
Эксперимент 1. Было сформировано 2 группы цыплят (20 голов в опытной,
10 голов в контрольной), которых выводили в лабораторных условиях из
оплодотворенных яиц СПФ-кур. Цыплят содержали в изолированных боксах с
положительным атмосферным давлением. В 5-суточном возрасте цыплят опытной
группы интраназально инфицировали вирусом ИБК, штамм QX в дозе 3 lg
ЦД50/0,1см3, тогда как цыплят контрольной группы не заражали. Затем проводили
клиническое наблюдение за цыплятами и определяли показатели заболеваемости
в виде доли заболевших особей от общей численности группы на момент
наблюдения (с=a/b, где: а - количество заболевших особей; b - численность
группы)
(рисунок
Кроме
8).
клинических
показателей
оценивали
патологоанатомические показатели болезни. Согласно протоколу опыта через 6
сут после инфицирования 10 цыплят из опытной и 5 цыплят из контрольной
группы подвергали эвтаназии. Проводили патологоанатомическое вскрытие и
оценивали
патологическую
картину
болезни,
определяли
активность
реснитчатого эпителия трахеи (CS-показатель). За остальными цыплятами
наблюдали еще 2 недели, после чего также оценивали патологическую картину
болезни.
Диаграмма на рисунке 8 иллюстрирует, что в течение заданного периода
наблюдений распределение оценок заболеваемости в контрольной и опытной
группах имели выраженные отличия. У цыплят опытной группы первые
клинические симптомы ИБК регистрировались спустя 72 ч после инфицирования,
и в дальнейшем количество больных птиц возрастало и достигало максимума
через 6 сут. Клинические признаки в основном характеризовались депрессией,
серозными
истечениями
из
носовых отверстий
и
признаками
диспноэ.
67
Наблюдалась связь между интенсивностью показателя заболеваемости и полным
цилиостазом у цыплят, подвергшихся диагностическому убою через 6 сут после
инфицирования (данные не представлены).
Заболеваемость, доли.
1
0,8
ОПЫТ
КОНТРОЛЬ
0,6
0,4
0,2
0
3
5
7
9
11
13
Сутки после инфицирования
Рисунок 8. Динамика заболеваемости ИБК опытных (♦) и контрольных (■) цыплят
после инфицирования
Особое внимание заслуживает анализ результатов патологоанатомического
вскрытия инфицированных птиц. Основные признаки болезни через 6 сут после
инфицирования штаммом QX наблюдали со стороны респираторных органов и
почек. При этом изменения были следующими: наличие серозно-слизистого
экссудата в носовой полости и в трахее, отек легких, увеличение размеров и отёк
почек; почки имели пестрый рисунок вследствие скопления в канальцах уратов,
иногда до 0,5 см в диаметре (рисунок 9). Проведенные исследования показали,
что вирус ИБК, штамм QX характеризуется умеренной вирулентностью для СПФцыплят и вызывает у них развитие респираторного и нефрозо-нефритного
синдрома.
68
Рисунок 9. Почки СПФ-цыплят через 6 сут после инфицированния вирусом ИБК
штамм QX
Эксперимент 2. Необходимость проведения экспериментов по изучению
патогенных свойств вируса ИБК штамм QX для кур-несушек обоснована тем, что
вирус ИБК является одной из главных причин снижения яичной продуктивности,
а изоляты вируса генотипа QX в некоторых местах были причиной появления
«ложных несушек» и развития патологии яйцеводов, сопровождающейся
характерным клиническим признаком «поза пингвина».
Кур-несушек 180-суточного возраста в количестве 7 голов инфицировали
вирусом ИБК штамм QX в дозе 4 lg ЦД50/см3/гол окулярно-назальным методом.
Пять несушек такого же возраста оставили интакными для контроля. Птиц
помещали в отдельные боксы и далее содержали в одинаковых условиях. В
контрольной и опытной группах еженедельно в течение месяца вычисляли
процент
яйценоскости
до
инфицирования
и
в
течение
месяца
инфицирования. Таким образом судили о влиянии вируса
на
после
уровень
яйценоскости. Процент яйценоскости до и после инфицирования приведён на
рисунке 10.
яйценоскость, %
69
90
80
Опыт
Контроль
70
60
заражение
50
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 недели
Рисунок 10. Яйценоскость кур-несушек контрольной и опытной группы
Представленный на рисунке 10 график иллюстрирует, что яйценоскость кур
до заражения составляла в среднем в пределах 75-77%. У кур опытной группы
после введения штамма QX яйценоскость снизилась и находилась на уровне 71%.
Это снижение считали существенным.
Кроме
того,
по
результатам
патологоанатомического
вскрытия,
проведённого после завершения эксперимента у двух голов в опытной группе,
выявляли атрофию яичников без явных признаков их функционирования.
Таким образом, было показано, что вирус ИБК штамм QX имеет тропность
к репродуктивным органам кур-несушек и может вызывать у них снижение
продуктивности.
Эксперимент 3. Поражение органов размножения петушков вирусом ИБК
обусловлено репликацией вируса в придатках семенника, которые выстилает
мерцательный эпителий. Проведение экспериментов было обусловлено данными
о том, что вирус ИБК может вызывать эпидидимит и образование камней в
придатках.
Из
петушков
180-суточного
возраста
сформировали
опытную
и
контрольную группы, которые содержали в отдельных боксах. Опытную группу
петушков (7 голов) инфицировали вирусом ИБК, штамм QX в дозе 4lg
70
ЦД50/см3/гол интраназальным методом. Цыплят контрольной группы оставили
интактными (5 голов). Условия содержания и кормления цыплят в обеих группах
в течение всего опыта были идентичны. Ежедневно за птицами вели клиническое
наблюдение. Через 10 недель после инфицирования петушков подвергали
эвтаназии и провели патологоанатомическое вскрытие.
У инфицированных петушков первые признаки ИБК появились через 5 дней
после введения вируса и характеризовались непродолжительным чиханием.
Данные респираторные признаки уже не отмечали через 10 сут после заражения.
Далее в течение всего времени эксперимента клинический статус опытных птиц
не отличался от контрольных.
Патологоанатомическое
вскрытие
продемонстрировало
значительные
изменения в морфологии семенников у инфицированных петушков. Так, 5 из 7
петушков имели относительно небольшие размеры семенника, тогда как у
петушков в контрольной группе они были значительно больше. Кроме того, у 4 из
7 инфицированных петушков обнаруживали в придатках камни размером
примерно 0,1-0,5 мм (рисунок 11).
Рисунок 11. Морфология семенников с придатками у петушков, инфицированных
вирусом ИБК (контрольная (А) и опытная (В) группы)
Таким образом, можно сделать заключение, что вирус ИБК штамм QX
имеет широкий тканевой тропизм и может вызывать различную патологию у
цыплят, а также у взрослых птиц.
71
3.6 Использование теста на цилиостаз и ПЦР для оценки
результативности вакцинации (протективного действия вакцины)
Развитие инфекционного процесса, обусловленного вирусом ИБК, не всегда
может сопровождаться выраженной клинической картиной.
Это
обстоятельство
затрудняет
диагностику
заболевания
птиц
в
производственных условиях и существенно снижает достоверность получаемых
результатов при проведении научных исследований, связанных с необходимостью
клинических наблюдений болезни. Данная проблема становится особенно важной
при выполнении экспериментов, целью которых является оценка напряженности
поствакцинального иммунитета.
В
этой
связи
считали
целесообразным
исследовать
возможность
использования методов, позволяющих определить наличие инфекционного
процесса в организме птицы при отсутствии клинической картины болезни на
макроуровне.
Учитывая специфику патогенеза инфекционного бронхита кур, при
изучении развития возбудителя в организме птицы наиболее вероятной областью
для обнаружения вируса приняли трахею и почки. Указанные органы являются
наиболее важными мишенями при "вирусной атаке" организма. В качестве
методов, объективно отражающих присутствие вируса, приняли тест на цилиостаз
(ЦС) и полимеразную-цепную реакцию в варианте реального времени (ОТ-ПЦРРВ).
План эксперимента предполагал введение гомо- и гетерологичного штамма
вируса в организм иммунизированных и интактных птиц и последующее
сравнение
ЦС-показателей,
отражающих
вирусиндуцированные
поражения
реснитчатого эпителия трахеи, и данных ПЦР, отражающих концентрацию
генетического материала возбудителя в тканях органов-мишеней.
Из цыплят, в возрасте 1 сут, выведенных из СПФ-яиц, образовали четыре
группы (№ 1, 2, 3, 4) по 25 голов. Группы содержались в изолированных боксах,
исключающих горизонтальную передачу вируса. В каждой группе цыплят
72
пронумеровали (использовали номерные ножные кольца-клипсы). От цыплят
выборочно отбирали пробы сыворотки крови.
В первые сутки группы 1 и 3 были привиты коммерческой вакциной против
ИБК из штамма Н120. Вакцина в виде суспензии была введена интраназально в
дозе 4 lgЭИД50 в объеме 0,1 см³. Группы 2 и 4 не прививали (контрольные
группы).
Через 21 сут после прививки цыплятам в группах 1 и 2 ввели вирус ИБК
штамм QX. Вируссодержащий материал в виде суспензии на ФБР был введен
интраназально в дозе 3 lgЭИД50 в объеме 0,1 см³. Аналогичным образом цыплятам
в группах 3 и 4 ввели вирус ИБК штамм H120. Перед прививками в группах 1 и 3
выборочно были взяты пробы сывороток крови. Результат серологических
исследований представлены в таблице 11.
Из данных таблицы 11 следует, что до начала эксперимента СПФ-цыплята
были серонегативны к вирусу ИБК. На 21 сутки после вакцинации, проведенной в
группах 1 и 3, птица продемонстрировала гуморальный иммунный ответ. Средняя
величина тира антител в ИФА составила 1:1096, что соответствует средним
титрам антител, получаемых после применения живых вакцин против ИБК.
Через 6 сут. после введения штамма QX и повторной прививки штаммом
Н120 птиц, имеющих в группах одинаковые номера, подвергли эвтаназии и
произвели препарирование трахеи и почек.
Для исследования трахеи был определен участок органа длиной 8 ÷ 12 мм в
проксимальном направлении от бифуркации. От каждой группы по 20
отпрепарированных образцов было исследовано в ОТ-ПЦР-РВ. Одновременно
определяли активность ресничек мерцательного эпителия трахеи (CS показатель).
Для исследования ткани почек от органа (в произвольном месте) отделяли
участок массой 0,5 ÷ 0,7 г. От каждой группы в ОТ-ПЦР-РВ было исследовано по
20 препарированных образцов.
73
Таблица 11 - Титры антител в сыворотках крови СПФ-цыплят,
установленных в ИФА*
Выборочные оценки титров до
вакцинации
Выборочные оценки титров через
21 сут после иммунизации
коммерческой вакциной против
ИБК штамма Н120
* Представлены стандартные бланки результатов исследования титров сывороточных
антител в лаборатории эпизоотологии и мониторинга "ВНИИЗЖ". Исполнитель: ведущий
биолог А.С.Соркина
Тест на цилиостаз. За основу была принята методика определения
цилиларной активности эпителия трахеи птиц, изложенная в сообщении О.А.
Чупиной [8]. Для оценки состояния эпителиальных ресничек в образце одной
трахеи в точках, равноудаленных от краев препарата, готовили не менее 4
74
кольцевых срезов толщиной около 1 мм. Срезы от каждого образца трахеи
помешали в лунки пластиковых панелей в среде ПСС и исследовали в
инвертированном оптическом микроскопе.
Индикацию
инфекционного
действия
вируса
регистрировали
по
проявлению эффекта цилиостаза. Оценкой масштаба цилиостаза единичной
пробы (сs) считали долю неподвижных (или десквамированных) ресничек,
наблюдаемую в горизонтальной проекции на окружности (периметре) внутренней
поверхности среза трахеи. Использовали следующие оценки: 0 - цилиостаз
охватывает менее 1/4 периметра, 0,25 - охват не менее 1/4 периметра, 0,50 - охват
не менее 1/2 периметра, 0,75 - охват не менее 3/4 периметра, 1,00-охват более 3/4
периметра. Результирующим показателем цилиостаза в данном образце трахеи
(CS) являлось среднее значение из n-числа единичных оценок (CS=Σcs/n).
В соответствии с назначенными номерами птиц в изученных группах
определяли
CS-показатели.
Кроме
этого,
соответственно
штаммам,
использованным для вторичной прививки, между параллельно установленными
значениями CS в контрольной и в опытных группах вычисляли оценки контраста
(dQX и dH120), которые характеризовали относительную "агрессивность" вируса для
вакцинированных птиц. Полученные результаты приведены в таблице 12.
Из
данных,
представленных
в
таблице
12,
следует,
что
оценки
цилиостатических эффектов были значимы во всех исследованных группах птиц.
Это указывало, что во всех случаях воздействие вируса отражалось на состоянии
реснитчатого эпителия трахеи. Однако установленные средние значения ('x) были
неодинаковы. Например, показатель 'CS2= 0,77±0,06, характеризующий результат
инфекции штамма QX для интактных (контрольных) птиц, существенно
превосходил (p≤0,001) аналогичный показатель 'CS4, установленный для штамма
Н120. На этом основании допустимо считать, что штамм QX в большей степени
влиял на состояние чувствительных клеток.
75
Таблица 12 - Показатели цилиостаза (CS) и результаты их сравнений в виде оценок
контраста (dCS), установленные соответственно использованным штаммам и
порядку их применения
Н120/QX*
№
CS1
CS2
dQX = CS2 - CS1
CS3
CS4
dH120= CS4 - CS3
1
0,50
1,00
0,50
0,28
0,05
-0,23
2
0,05
0,73
0,68
0,00
0,73
0,73
3
0,25
1,00
0,75
0,05
0,05
0,00
4
0,50
1,00
0,50
0,00
0,28
0,28
5
1,00
0,50
-0,50
0,00
0,05
0,05
6
1,00
1,00
0,00
0,05
0,50
0,45
7
0,25
1,00
0,75
0,00
0,50
0,50
8
0,25
0,73
0,48
0,00
0,00
0,00
9
0,05
0,50
0,45
0,25
0,25
0,00
10
0,05
0,73
0,68
0,00
0,00
0,00
11
0,25
1,00
0,75
0,25
0,50
0,25
12
0,50
0,25
-0,25
0,00
0,00
0,00
13
0,25
1,00
0,75
0,25
0,25
0,00
14
0,50
1,00
0,50
0,25
0,25
0,00
15
0,05
0,50
0,45
0,28
0,73
0,45
16
0,73
0,73
0,00
0,00
0,00
0,00
17
0,73
1,00
0,28
0,05
0,28
0,23
18
0,25
1,00
0,75
0,05
0,50
0,45
19
0,05
0,25
0,20
0,25
0,00
-0,25
20
0,05
0,50
0,45
0,05
0,25
0,20
0,77±0,06
0,41±0,03
0,10±0,03
0,26±0,05
0,16±0,06
'x±m** 0,36±0,07
*
**
Н120/Н120
в числителе указан штамм, который использовали для вакцинация; в знаменателе - штамм,
которым проводили вторую прививку;
приведены среднее значение и их стандартные ошибки
Далее следует отметить существенное превышение цилиостатического
эффекта (p≤0,002), обусловленного штаммом QX при использовании его на
привитых птицах ('CS1=0,36±0,07) по отношению к штамму Н120 (CS3=0,10±0,03).
Это позволяет считать, что вирус штамма QX на иммунном фоне обладал
относительно большей инвазивностью.
76
Сопоставление оценок 'dQX=0,41±0,03 и 'dH120=0,16±0,06, характеризующих
относительный
эффект
цилиостатического
воздействия
вируса
с
учетом
контрольной оценки, также показало превосходство штамма QX (p≤0,001).
Полимеразно-цепная
реакция
(ОТ-ПЦР-РВ).
Предназначенные
для
исследований пробы биоматериалов содержали в криопробирках при минус 70°С.
Нуклеиновую кислоту выделяли на роботизированной станции Tecan Freedom
EVO-100 из 100 мкл образца суспензии с помощью набора «Magna DNA Prep 100»
(ООО БиоКом, г. Москва).
При
постановке
ОТ-ПЦР-РВ
флуоресцентно-меченого
использовали
олигонуклеотидного
систему
зонда,
праймеров
выбранных
и
для
амплификации фрагмента нетранслируемой области генома вируса (UTR)
согласно методическим указаниям [12]. Учет результатов реакции проводили при
помощи прибора Corbett research Real-Time PCR System (Rotogene, Австралия),
где регистрировали количество циклов амплификации.
Оценочным показателем реакции приняли номер цикла, при котором
достигался пороговый уровень флюоресценции продуктов амплификации (Ct пороговый цикл). В соответствии с условиями выполнения теста установленное
значение Ct находилось в обратной зависимости от концентрации исходного
генетического материала вируса. При проведении исследований реакцию считали
отрицательной (геном вируса не определяется), если Ct≥41.
Результаты, полученные в ОТ-ПЦР-РВ при исследовании образцов трахеи,
представлены в таблице 13.
Приведенные данные позволяют считать, что во всех позициях анализа
наличие и концентрация вирусного генома могли быть достоверно установлены.
Все средние оценки 'Ct являются статистически значимыми.
77
Таблица 13 - Количество циклов амплификации (Ct) и результаты их сравнений в виде
оценок контраста (∆Ct), установленные в образцах ткани трахеи соответственно
использованным штаммам и порядку их применения
Н120/QX*
№
Н120/Н120
Ct1
Ct2
∆QX = CS1 – CS2
Ct3
Ct4
∆H120= Ct3 - Ct4
1
21,2
16
5,2
35,2
22,3
12,9
2
33,7
26
7,7
41
30,22
10,78
3
23,5
25,3
-1,8
36
35
1
4
31,3
30,9
0,4
30,01
16,3
13,71
5
41
19,2
21,8
32
19
13
6
24,7
31,2
-6,5
41
20
21
7
25
19
6
40
25,1
14,9
8
38
19,36
18,64
41
33,6
7,4
9
35
28
7
41
23,6
17,4
10
31
21
10
37
18,2
18,8
11
33
20
13
33
35
-2
12
29
19
10
30
26,1
3,9
13
28
19
9
36
33,23
2,77
14
41
22
19
24
20,1
3,9
15
35
23
12
23
22
1
16
21
24
-3
29
18,9
10,1
17
21
22
-1
41
33
8
18
32
21,7
10,3
41
20,3
20,7
19
26
22
4
36,2
23,7
12,5
20
26,8
36,1
-9,3
30,25
22,3
7,95
6,62±1,88
34,88±1,29
24,90 ±1,38
10.0±1,52
'x±m** 29,86±1,41 23,2±1,13
*
в числителе указан штамм, который использовали для вакцинация; в знаменателе - штамм,
которым проводили вторую прививку;
**
приведены средние значения и их стандартные ошибки
Далее было установлено, что средние показатели 'Ct2=23,2±1,13 и 'Ct4=24,90
±1,38 оказались статистически равным. Это, в свою очередь, указывало на
одинаковое по величине количество вируса обоих штаммов, который находился в
тестируемых образцах. Следовательно, интенсивность репродукции обоих
штаммов в трахее интактной птицы была приближенно одинаковой.
78
Достоверные различия в пользу штамма QX (p≤0,02) были отмечены при
сопоставлении
показателей,
характеризующих
развитие
возбудителя
при
введении его в организм привитых птиц 'Ct1=29,86±1,41 и 'Ct3=34,88±1,29. На
этом основании возникает предположение, что у птиц, привитых штаммом Н120,
вариант QX имел более эффективное воспроизводство, чем гомологичный вирус
при повторном введении. На такую возможность также указывает и меньшая по
величине и средняя оценка контраста '∆QX =6,62±1,88 в сравнении с аналогичным
показателем
'∆H120=10±1,52.
Однако
при
данных
условиях
проведения
эксперимента это положение статистически не подтвердилось.
На основании полученных средних значений 'Ct в диапазоне 10≤'Ct≤35, в
исследуемых
образцах
ткани
трахеи
вычисляли
ожидаемую
величину
инфекционного титра вируса ИБК (“lgT). Для соответствующих расчетов
использовали ранее опубликованную формулу [5]:
lg"T=(-0,2648)Ct + 9,3919
[4].
Установили, что у обоих штаммов прогнозируемое накопление вируса в
трахее интактных птиц было приближенно равным. В границах ошибки
измерений соответствующие величины составили от 2,8 до 3,6 (lgЭИД50/0,1 см³).
При этом на иммунном фоне ожидаемый инфекционный титр для штамма QX
составил приблизительно 1,5 lgЭИД50/0,1 см³, тогда как для штамма Н120 средняя
прогнозируемая оценка титра имела величину не более 0,16 lgЭИД50/0,1 см³.
На этом основании допустимо сделать заключение, что влияние иммунной
реакции птицы на развитие вируса штамма QX было менее выражено, чем на
репродукцию штамма Н120, и коэффициент указанного соотношения составил
величину1,34 lgЭИД50/0,1 см³ (соответствующие значения титров различались в
22 раза).
Изучение накопления генома вируса ИБК штаммов QX и Н120 в образцах
ткани почек проводили в соответствии с ранее изложенной методикой и порядке,
аналогичном исследованию ткани трахеи. Полученные результаты приведены в
таблице 14.
79
Таблица 14 - Количество циклов амплификации (Ct) и результаты их сравнений
в виде оценок контраста (∆Ct), установленные в почках соответственно
использованным штаммам и порядку их применения
Н120/QX
№
Н120/Н120
Ct1
Ct2
∆QX = CS1 – CS2
Ct3
Ct4
∆H120= Ct3 - Ct4
1
30,20
25,00
5,20
35,60
33,10
2,50
2
41,00
18,60
22,40
34,20
31,90
2,30
3
41,00
38,50
2,50
39,00
36,00
3,00
4
25,00
34,30
-9,30
41,00
25,00
16,00
5
37,30
17,70
19,60
41,00
29,30
11,70
6
25,00
36,80
-11,80
41,00
34,20
6,80
7
29,00
22,30
6,70
41,00
41,00
0,00
8
31,20
27,60
3,60
37,10
31,20
5,90
9
22,00
41,00
-19,00
36,60
36,00
0,60
10
27,00
29,00
-2,00
29,00
34,10
-5,10
11
18,00
25,00
-7,00
33,10
30,20
2,90
12
29,00
14,00
15,00
34,50
31,90
2,60
13
15,00
15,00
0,00
36,02
30,00
6,02
14
30,00
15,00
15,00
28,70
19,30
9,40
15
33,00
26,00
7,00
34,30
20,36
13,94
16
22,00
16,00
6,00
41,00
33,00
8,00
17
31,00
26,00
5,00
37,30
34,80
2,50
18
33,00
25,00
8,00
34,00
29,00
5,00
19
28,00
24,00
4,00
38,00
36,90
1,10
20
30,00
26,00
4,00
34,20
31,70
2,50
3,75±2,55
36,33±0,84
31,45±1,17
4,88±1,12
'x±m** 28,89±1,50 25,14±1,77
*
в числителе указан штамм, который использовали для вакцинация; в знаменателе - штамм,
которым проводили вторую прививку;
**
приведены средние значения и их стандартные ошибки
Результаты, представленные в таблице 14, демонстрируют, что все средние
оценки ('Ct), характеризующие накопления генома вируса ИБК, являются
значимыми, пригодны для анализа и позволяют сделать следующие заключения.
80
Количество генетического материала штамма QX существенно превышало
аналогичный показатель, установленный для штамма Н120 как у интактных [('Ct2
=25,14±1,77) > ('Ct4=31,45±1,17)]p≤0,005, так и у привитых птиц [('Ct1 =28,89±1,50) >
'Ct3=36,33±0,84)]p≤0,001. На основании приведенных оценок прогнозируемый
средний титр инфекционного вируса составил 2,74 lgЭИД50/0,1 см³ и 1,06
lgЭИД50/0,1 см³, в порядке упоминания штаммов, у интактных птиц, а так же 1,74
lgЭИД50/0,1 см³ и 0,23 lgЭИД50/0,1 см³, в том же порядке, у иммунных птиц.
Таким
образом,
на
невакцинированной
птице
эффективность
воспроизводства штамма QX превосходила аналогичную оценку штамма Н120 в
48 раз, а на иммунном поголовье - в 32 раза.
Полученная для штамма QX оценка среднего контраста '∆QX= 3,75±2,55 при
данных условиях эксперимента была статистически незначима. В биологическом
смысле это означало, что влияние иммунизации для репродукции вируса было
несущественным. При этом развитие вируса штамма Н120 значимо зависело от
наличия иммунитета у подопытной птицы [('∆H120/m =4,88/1,12=> t p≤0,001 =3,65].
3.7 Обсуждение результатов исследования
Несмотря на высокие достижения науки проблемы профилактики ИБК до
конца не решены. Это подтверждается данными лабораторных исследований и
часто возникающими вопросами со стороны ветеринарных специалистов
птицехозяйств о мерах борьбы с ИБК. В дополнение к этому не может быть не
отмечено наличие многочисленных публикаций ученых, касающихся ИБК, число
которых за последнее время по данным PubMed увеличивается. Глобальность
проблемы ИБК можно отметить также тем, что ежегодно, уже тринадцатый раз
подряд,
организуется
Всемирный
конгресс
по
проблемам
корона-
метапневмовирусов птиц.
В доступных научных публикациях анализу эпизоотической ситуации, или,
точнее, аналитической эпизоотологии ИБК посвящено мало работ. Особенно это
было характерно для первоначального периода изучения болезни в 1940-1980 гг.
Скорее всего это было связано с отсутствием достаточных данных о болезни и ее
природе и, наконец, с экономическим интересом стран-импортеров продуктов
81
птицеводческой промышленности. Сейчас с помощью современных методов
молекулярной диагностики стало возможным изучать молекулярные основы и
механизмы развития эпизоотического процесса и проводить филогенетический
анализ.
Анализ эпизоотической ситуации по ИБК, связанный с вирусом генотипа
QX, свидетельствует, что впервые вирус с отличительной генетической
характеристикой появился в конце 1990-х гг. в КНР. При этом болезнь
проявлялась не типичным для ИБК симптомом - провентрикулитом. В начале
2000-х гг. генетические родственные вирусы ИБК выделяли на Дальнем Востоке и
в некоторых странах Европы. В настоящее время генотип QX является
эндемичным в некоторых регионах мира.
На территории России вирус ИБК, относящиеся к генотипу QX, были
выявлены на Дальнем Востоке еще в 2001 г. [14], затем и в Европейской части
РФ. В качестве главных факторов такого быстрого распространения вируса ИБК
генотипа QX учёные выделяют такие, как тесные экономические связи между
странами и перенос вируса дикими и синантропными птицами [4, 96, 170].
За последние три года выявление изолятов вируса ИБК генотипа QX на
территории РФ значительно сократилось, а в 2014 г. их вовсе не было выявлено.
Одним из факторов снижения частоты выявления генотипа QX в России можно
объяснить изменением стратегии вакцинопрофилактики, суть которой состоит в
применением живых вакцин из разных серотипов. Эффективность такой
стратегии вакцинации была доказана в отношении изолятов вируса ИБК генотипа
QX, выполненных C. Terregino et al., 2008 [146].
Проведение
иммунобиологических
научно-исследовательских
свойств
вирусов
работ
требует
по
изучению
стандартизации
вируссодержащего материала, используемого для проведения исследований,
главным образом по гомогенности вирусной популяции, по отсутствию
контаминации посторонними вирусами, бактериями, грибами и микоплазмаим, а
также по показателю инфекционной активности.
82
Поэтому изучение условий культивирования вируса в КЭ и получение
необходимого объема специфичного и высокоактивного вирусного материала для
иммунологических исследований стало нашей первой задачей.
Методика культивирования вакцинных штаммов вируса ИБК отработана
производителями вирусвакцин, кроме того, имеются данные по динамике
накопления вируса ИБК штамма Н120 в КЭ на основе количественной ПЦР [7].
Условия культивирования в КЭ нового вируса из генотипа QX не отработаны, и
они могут отличаться.
Для культивирования вируса QX использовали 9-11 суточные эмбрионы
СПФ-кур. Инфицирование проводили в полость аллантоиса и на ХАО. Через
заданный интервал времени отбирали пробы ХАО и ЭЭЖ и определяли в них
концентрацию вируса.
Таким образом, на основании проведенных опытов можно сделать
заключение о том,.
По
результатам
опытов
было
установлено,
что
штамм
QX
при
инфицировании СПФ-эмбрионов кур в аллантоисную полость в период 36÷54 ч
культивирования способен был накапливаться в экстраэмбриональной жидкости в
титре 4,2±0,2 lgЦД50/1 см3. При этом, в ткани ХАО «урожай» вируса был на
порядок ниже. Схожие результаты в отношение штамма Н120 были получены С.В
Фроловым и другими [16, 21].
Наряду с культивированием вируса ИБК штамм QX в КЭ была исследовано
возможность его адаптации к различным культурам клеток. Выявление спектра
чувствительных клеток естественного хозяина и других линий перевиваемых
культур являлось основной задачей в исследованиях. Имеются сообщения, что
вирус ИБК можно адаптировать к культурам клеток ПЭК и Vero [35, 179]. В
наших опытах по адаптации вируса к культурам клеток испытывали влияние
трипсина на репродуктивную способность вируса. В экспериментах было
показано, что добавление трипсина в дозе 1 мг на 100 мл питательной среды
стимулирует размножение вируса в культурах клеток. В результате проведенной
работы на этапе исследований "адаптации" вируса ИБК штамм QX было
83
установлено, что вирус ИБК при стимулирующем действии трипсина может быть
адаптирован к культурам клеток ФЭК, ПЭК и RBT. Таким образом, нам удалось
получить несколько культурально-адаптированных популяций вируса ИБК.
Аналогичные выводы по культивированию вируса ИБК в культурах клеток
сделала L. Helena et al. [120].
Далее исследовали антигенные свойства вируса, адаптированного к
культуре клеток RBT. Полученные результаты свидетельствовали, что вирус
седьмого пассажа на культуре клеток RBT активно реагировал в РН с сывороткой,
имеющей антитела к вирусу ИБК, т.е был нейтрализован специфической
сывороткой.
Антигенную чистоту вирусной расплодки подтверждали серологическими
методами, при этом исключали присутствие контаминантов, которые могли бы
индуцировать антитела у цыплят. С этой целью получали гипериммунные
сыворотки от СПФ-цыплят.
Полученную сыворотку исследовали в ИФА и в РТГА с использованием
стандартных диагностических наборов для определения антител против вирусов
ИБК, ИББ, РЕО, ИЛТ, ИЭП, ССЯ-76, метапневмовируса и M.gallisepticum. Было
установлено, что антитела против перечисленных вирусов, а также микоплазм, в
сыворотке, полученной на вирус ИБК штамм QX, не регистрировались.
Следовательно, предназначенные для экспериментов расплодки вируса ИБК
штамм QX контаминантов не содержали.
Вирусы ИБК генотипа QX являются относительно «новыми», недавно
появившимися, в настоящее время широко распространёнными в птицеводстве во
многих частях мира. вируса ИБК штамм QX был отнесён к генотипу QX на
основании генетической структуры, однако другие его свойства были мало
исследованы. Таким образом, изучение основных иммунобиологических свойств
данного вируса стало предметом следующих исследований.
Задачей следующего этапа работы являлось определение количественных
показателей, характеризующих антигенную близость штамма QX по отношению к
другим референс-штаммам вируса ИБК, относящимся к разным генетическим
84
группам. В работу были включены штаммы Н120, 4/91, D274 и штамм L1148. В
серологических экспериментах по антигенной дифференциации использовали
реакцию нейтрализации в варианте постоянной концентрации сыворотки и
переменных доз вируса (α-вариант).
Для стандартизации реакции на первом этапе определяли нейтрализующую
активность
гомологичных
сывороток.
Испытывали
разные
концентрации
сывороток. Было показано, что наименьшая концентрация антисывороток, при
которой
в
гомологичных
реакциях
происходила
статистически
полная
нейтрализация инфекционного вируса всех изучаемых штаммов, соответствует
5%. Указанная величина была принята для проведения всех гетерологичных
реакций.
Второй
этап
экспериментов
включал
в
себя
проведение
реакции
перекрестной нейтрализации, где определяли гомо- и гетерологичные индексы
нейтрализации. Оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке lg(1/rs)
или по вирусу lg(1/rv)) считали соотношение гомо- и гереологичных индексов
нейтрализации (оценка обратная стандартной величине "r", характеризующей
антигенную близость
или
"родственность").
По
результатам
реакций
с
гетерологичными сыворотками наибольшая удаленность была установлена для
штамма Н120, для которого соответствующий средний показатель составил
величину lg(1/rs.H120) = 3,500. Также соответствующее штамму Н120 значение
lg(1/rv.H120) = 5,000 было статистически наибольшим (p≤0,01) и в другой системе
при дифференциации по вирусу.
Варианты 4/91 и D274 в обеих системах демонстрировали несколько
меньшую удаленность от штамма QX. При этом средние оценки lg(1/rs.4/91)=2,687
и
lg(1/rs.D274)=2,942,
а
также
lg(1/rv4/91)=3,583
и
lg(1/rv.D274)=4,193
были
статистически тождественны. Это означало, что степень антигенной близости
указанных вариантов вируса ИБК к штамму QX была приближенно одинаковой.
Важно отметить, что порядок расположения штаммов по степени
удаленности в обеих системах был подобен. Различия использованных систем
состояли лишь в масштабах полученных оценок 1/rs и 1/rv. Это указывало на
85
эквивалентность реакций, происходящих в различных системах. Вероятно, что
как антитела, так и вирусный антиген в гетерологичных системах реагировали
подобным образом.
Далее исследовали возможность антигенной дифференциации генетически
близких
штаммов
QX
и
L1148.
Оценивали
гетерологичные
индексы
нейтрализации (lgINhet.s) штамма L1148, установленные в реакциях с сыворотками
SН120, S4/91, SD274, и SQX. При постановке реакций в качестве положительного
контроля параллельно использовали нормальную сыворотку (S0). Полученные
результаты продемонстрировали, что средние параметры положения индексов
нейтрализации (lgIN.), полученных в реакциях сывороток SН120, S4/91, SD27, и SQX со
штаммами QX и L1148, имели высокий уровень совпадения. Следовательно,
реакция каждой использованной иммунной сыворотки с указанными штаммами
имела близкую количественную характеристику. В биологическом смысле это
могло свидетельствовать об подобии антигенных структур данных штаммов.
Для изучения патогенных свойств вируса ИБК штамм QX был проведен
острый опыт на СПФ-цыплятах и взрослой птице. По результатам клинических
наблюдений, патологоантомического вскрытия и теста на цилиарную активность
было устновлено, что штамм имеет широкий тропизм и поражет многие органы и
ткани. Изучаемый штамм патогенен для СПФ-цыплят, вызывая поражение
респираторных органов и почек. Он также патогенен и для врослой птицы,
вызывая поражение органов репродуктивной системы у несушек и петушков.
На
заключительном
этапе
исследований
изучали
эффективность
вакцинации в отношении изучаемого вируса. Оценка напряженности иммунитета
при ИБК является непростой задачей и выполняется комплексно. В качестве
методов, позволяющих определить наличие инфекционного процесса после
повторного введения вируса в организм птицы, использовали тест на цилиостаз и
ПЦР. Многие авторы, в том числе и О.А. Чупина [8], отмечали изменение
активности мерцательного эпителия трахеи в результате введения вируса ИБК
[55, 62, 72].
86
На основании анализа показателей цилиостаза на интактных (контрольных)
птицах было показано, что штамм QX обладает большей «агрессивностью» для
эпителиальных клеток респираторного тракта по сравнению со штаммом Н120 и в
большей степени влиял на состояние чувствительных клеток. Также было
установлено, что вакцинация гетерологичным штаммом (Н120) не оказывала
существенного влияния на репликацию вируса в эпителиальных клетках
респираторного тракта.
J.K. Cook et al. [62] также установили низкую эффективность вакцинации
гетерологичным вирусом в отношении QX – подобного штамма. Основываясь на
показателе цилиостаза, они пришли к выводу, что эффективность вакцинации
составляла не более 55%.
Использование
молекулярно-биологических
способов
для
оценки
иммунитета является перспективным подходом. В соответствии с условиями ОТПЦР-РВ значение Ct (цикл амплификации) находится в обратной зависимости от
концентрации исходного генетического материала вируса, что и позволило нам
оценить накопление вирусного генома в органах иммунных и неиммунных
цыплят. Установили, что у обоих штаммов прогнозируемое накопление вируса в
трахее интактных птиц было приближенно равным. В границах ошибки
измерений соответствующие величины составили от 2,8 до 3,6 lgЭИД50/0,1 см³.
При этом на иммунном фоне ожидаемый инфекционный титр для штамма QX
составил приближенно 1,5 lgЭИД50/0,1 см³, тогда как для штамма Н120 средняя
прогнозируемая оценка титра имела величину не более 0,16 lgЭИД50/0,1 см³.
На этом основании сделали заключение, что влияние иммунной реакции
птицы на развитие вируса штамма QX было менее выражено, чем на
репродукцию штамма Н120, и коэффициент указанного соотношения составил
величину 1,34 lgЭИД50/0,1 см³.
Однако накопление вирусного генома в тканях почек иммунных и
неиммунных цыплят имело особенности. Количество генетического материала
вируса
штамма
QX
существенно
превышало
аналогичный
показатель,
установленный для штамма Н120 как у интактных [('Ct2 =25,14±1,77) >
87
('Ct4=31,45±1,17)]p≤0,005,
так
и
у
привитых
птиц
[('Ct1
=28,89±1,50)>
'Ct3=36,33±0,84)]p≤0,001. На основании приведенных оценок прогнозируемый
средний титр инфекционного вируса составил 2,74 и 1,06 lgЭИД50/0,1 см³, в
порядке упоминания штаммов, у интактных птиц, а так же 1,74 и 0,23 lgЭИД50/0,1
см³, в том же порядке, у иммунных птиц.
Таким
образом,
на
невакцинированной
птице
эффективность
воспроизводства штамма QX превосходила аналогичную оценку штамма Н120.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что однократное применение
вакцины против ИБК штамм Н120 не обеспечивает полную защиту от
контрольного заражения штаммом QX, что сопровождалось выраженным
накоплением вирусного генома в почках иммунных цыплят.
88
5 ВЫВОДЫ
1. Согласно
данным
эпизоотологического
обследования
и
лабораторных
исследований вирус инфекционного бронхита кур нового для РФ генотипа QX
имеет широкое распространение во многих странах Евразии и в период 2005-2014
гг. регулярно регистрируется на территории страны.
2. К вирусу инфекционного бронхита кур генотипа QX чувствительны 9-11 суточные куриные эмбрионы категории СПФ с развитием специфических
эмбриопатических изменений. Эта система может быть использована для
культивирования вируса.
3. Репродукция вируса инфекционного бронхита кур генотипа QX в культурах
фибробластов, клеток почек куриных эмбрионов (ФЭК и ПЭК), перевиваемых
клетках почки теленка (RBT) активируется в присутствии трипсина. Это условие
может быть использовано для адаптации вируса к клеточным культурам.
4. Вирус
генотипа
статистической
QX
по
результатам
(математической)
серологических
интерпретации
исследований
имеет
и
существенные
антигенные отличия от референсных штаммов вируса инфекционного бронхита
кур Н120, 4/91, D274, выражающиеся в неполной перекрестной нейтрализации
инфекционности с индексами от 2,9 lgЦД50/см³ до 3,5 1 lgЦД50/см³.
5. К вирусу генотипа QX, выделенному на территории РФ, восприимчивы куры
различного возраста. Патогенные свойства характеризуются преимущественным
поражением почек у цыплят и репродуктивным синдромом у взрослой птицы.
6. По данным количественной ПЦР коммерческая вакцина против инфекционного
бронхита кур на основе штамма Н120 не обладает достаточной протективной
способностью
в
отношении
вируса
генотипа
QX,
предупреждая
у
вакцинированных цыплят только респираторную инфекцию, но не вирусную
репродукцию в тканях почек.
89
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для оценки антигенного родства штаммов вируса ИБК рекомендуется
использовать разработанный алгоритм:
§ исследование гомологичной нейтрализующей активности иммунных
сывороток с целью определения концентрации антисывороток в αвариант реакции нейтрализации;
§ определение гетерологичного индекса нейтрализации по сыворотке (при
титровании тест-штамма с гетерологичными иммунными сыворотками)
и по вирусу (при титровании тест-сыворотки с гетерологичными
штаммами вируса);
§ Оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке или по вирусу)
считать соотношение гомо- и гетерологичных индексов нейтрализации,
установленное в виде доли инфекционного вируса, который не был
нейтрализован в гетерологичной системе (оценка, обратная стандартной
величине
"r",
характеризующей
антигенную
близость
или
"родственность").
2. Для оценки степени защиты птиц против инфекционного бронхита после
вакцинации рекомендуется комплексный подход, включающий регистрацию
изменений в респираторных органах (цилиостаз) и репродукцию вирулентного
вируса методом ПЦР.
3. Для научно-исследовательских и практических целей предлагаются
комиссионно испытанные, одобренные Ученым советом и утвержденные
заместителем
директора
ФГБУ
«ВНИИЗЖ»
следующие
нормативно-
методические документы:
§ Методические рекомендации по культивированию и титрованию вируса
инфекционного бронхита кур в перевиваемой культуре клеток RBT
(приложение 1);
§ Методические
рекомендации
по
выявлению
антител
к
вирусу
инфекционного бронхита кур в реакции нейтрализации в культуре
клеток RBT (приложение 2);
90
§ Методические рекомендации по получению гипериммунных сывороток
птиц к вирусу инфекционного бронхита кур (приложение 3).
91
Список сокращений и условных обозначений:
ВСМ – вируссодержащий материал
ИБК – инфекционный бронхит кур
ИН – индекс нейтрализации
ИФА – иммуноферментный анализ
МАТ – материнские антитела
НД50 - 50% нейтрализующее действие сыворотки
ПСП – питательная среда полусинтетическая
ПСС – питательная среда синтетическая
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РГА – реакция гемагглютинации
РДП – реакция диффузной преципитации
РКЭ – развивающиеся куриные эмбрионы
РН – реакция нейтрализации
РНК – рибонуклеиновая кислота
РТГА – реакция торможения гемагглютинации
СПФ – свободный от патогенных факторов
ТОК – трахеальная органная культура
ФБР – фосфатно-буферный раствор
ХАО – хориоаллантоисная оболочка
ЦА – цилиарная активность
ЦД50 – 50% цилиостатическая доза (доза вируса, вызывающая цилиостаз в 50%
инфицированных трахеальных колец)
ЦПД – цитопатическое действие
ЭИД50 – 50% эмбриональная инфицирующая доза
ЭЭЖ – экстраэмбриональная жидкость
92
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Балашов, В. В. Влияние препарата ветостим на некоторые гематологические
показатели и иммунный статус цыплят-бройлеров при профилактике болезни
Ньюкасла и инфекционного бронхита кур / В. В. Балашов, В. И. Плешакова //
Ученые записки Казанской гос. акад. вет. медицины. – 2013. – Т. 214. – С. 77–
82.
2. Борисов, А. В. Инфекционный бронхит кур: особенности эпизоотологии и
профилактики / А. В. Борисов, В. В. Борисов // Farm Animals. – 2014. – № 1. –
С. 72–74.
3. Борисов, А.В. Инфекционный бронхит кур, современная ситуация и меры
борьбы, влияние вариантных штаммов на продуктивность кур / А.В. Борисов
// 8-й Международный ветеринарный конгресс по птицеводству, г. Москва,
19-22 апр. 2012 г. (2-й Международный ветеринарный конгресс, г. Москва,
19-23 апр. 2012 г.). - М., 2012. - С. 53-57.
4. Бочков, Ю.А. Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного
бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России:
дис...канд. биол. наук / Бочков Юрий Александрович. – Владимир, 1999. -126
с.
5. Дандал, А. Ш. Применение полимеразной цепной реакции в режиме
реального времени для опосредованной оценки инфекционного титра вируса
инфекционного бронхита кур / А.Ш. Дандал, Х.С. Абдуллоев // Ветеринарная
практика . - 2013. - № 3. - С. 28-32.
6. Джавадов, Э. Д. Диагностика и профилактика новых инфекционных болезней
птиц / Э. Д. Джавадов // Farm Animals. – 2013. – № 2. – С. 69–75.
7. Закс, Л. Статистическое оценивание / Л. Закс. – М.: Статистика, 1976. – 598 с.
8. Изучение антигенного родства изолята «Калужский» к различным серотипам
вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина, С.В.Фролов, Г.В
Батченко [и др.] // Ученые зап. УО ВГАВМ. 2005. – Т. 41, вып. 2, ч. 1, - С. 5657.
93
9. Иммуногистохимический
метод
выявления
штамма
М41
вируса
инфекционного бронхита кур в железистой части желудка и нервной системе
экспериментально заражённых куриных эмбрионов / А.С. Абдель-Монейм, П.
Злотовски, Дж. Вейтс [и др.] // Рос. вет. журн. С.-х. животные. - 2009. - № 2. C. 34-37.
10. Каспарьянц, С. А. Профилактика инфекционного бронхита кур вакциной
«Пулвак IB Праймер» на одной из птицефабрик Центрального региона
России / С.А. Каспарьянц, Н.Л. Соколова // Биозащита и биобезопасность. –
2011. - №4. – С.15-18.
11. Каспарьянц, С.А. Вакцина Пулвак IB Праймер против вариантных штаммов
вируса инфекционного бронхита кур / С.А. Каспарьянц, А.Д. Чекмарев //
Ветеринария. - 2009. - № 1. - C. 15-16.
12. Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного
бронхита кур методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени / Е. В.
Овчинников, Л. О. Щербакова, А. В. Андриясов [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». –
Владимир, 2010. – 10 с.
13. Николаева, И.П. Инфекционный бронхит кур / И.П. Николаева, С.Н.
Гаврилов // Ветеринарная газета. - 2011. - № 2. - C. 6.
14. Овчинникова, Е.В. Молекулярно-биологические свойства изолятов вируса
инфекционного бронхита кур, выявленных на территории России в период с
2005 по 2011 гг: дис… канд. биол. наук / Овчинникова Евгения Валерьевна. –
Владимир, 2012 – 117с.
15. Овчинникова, Е. В. Биологические свойства изолята IBV08-10 вируса
инфекционного бронхита кур генотипа QX / Е. В. Овчинникова, А. В.
Селиверстов // Ветеринария и кормление. – 2012. – № 5: материалы 3-й
Междунар. науч.-практ. конф. "Достижения молодых ученых – в вет.
практику". – С. 36–37.
16. Оптимальные условия культивирования вакцинных штаммов вируса ИБК /
А.В.Борисов, А.А.Гусев, Т.В. Хлыбова [и др.] // Пробл. инфекц. патологии сх. животных: тез. докл. конф. – Владимир, 1997. – С.144.
94
17. Профилактика инфекционного бронхита кур / Б. Я. Бирман [и др.]. – Изд. 2-е,
доп. и перераб. - Минск: Бизнесофсет, 2008. - 88 с.
18. Разработка высокоиммуногенной вакцины против инфекционного бронхита
кур, вызванного вариантными штаммами / М.В. Гирин, Д.С. Сурнев, Д.А.
Лозовой [и др.] // 2-й Международный Конгресс-Партнеринг и Выставка по
биотехнологии и биоэнергетике "ЕвразияБио-2010": сб. тез. - М., 2010. - С.
55-56.
19. Симакова, Н.М. Влияние вакцинации против инфекционного бронхита на
фоне применения пробиотиков на иммуноморфогенез у цыплят раннего
возраста / Н.М. Симакова, П.А. Красочко, Е.А. Карпенко // Эпизоотология,
иммунобиология, фармакология и санитария. - 2010. - №1. - С. 32-42.
20. Троценко, Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко,
Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.:Колос,
1999. – 272с.
21. Фролов, С.В. Разработка ассоциированной вакцины против инфекционного
бронхита кур и ньюкаслской болезни: дис...канд. вет. наук / Фролов Сергей
Владимирович - Владимир, 200. -172 с.
22. Холлендер, М. Непараметрические методы статистики / М. Холлендер, Д.А.
Вульф. - М.: Финансы и статистика, 1983. - С. 214 - 220.
23. Эпизоотологический лексикон: учеб. пособие / В.В. Макаров, А.А. Гусев,
Е.В. Гусев. – М.: Колос, 2001. – 176 с.
24. VII. International Symposium on Avian Corona- and Pneumoviruses and
Compilating Pathogens, Rauischholzhausen, Germany, 18-21 June 2012:
Proceedings / World Vet. Poultry Assoc., Clinic for Birds, Reptiles, Amphibians
and Fish Justus Liebig University, Giessen, Germany. – Wetter, Germany, 2012. –
358 p.
25. A “new” strain of infectious bronchitis virus infecting domestic fowl in Great
Britain / R. E Gough, C. J. Randall, M. Dagless [et al.] // Vet. Rec. – 1992. –
V.130. – P.493–494.
26. Ability of Massachusetts-type infectious bronchitis virus to increase colibacillosis
95
susceptibility in commercial broilers: a comparison between vaccine and virulent
field virus / M.G. Matthijs, J.H. van Eck, W.J. Landman, J.A. Stegeman // Avian
Pathol. – 2003. – Vol.32. – P.473-481.
27. Adler, H.E. The effect of infectious bronchitis virus on chickens infected with
Mycoplasma gallisepticum / H.E. Adler, D.A. McMartin, H. Ortmayer // Avian
Dis. – 2008. – Vol.6. – P.267-268.
28. Alexander, D. J. A long-term study of the pathogenesis of infection of fowls with
three strains of avian infectious bronchitis virus / D.J. Alexander, R. E. Gough //
Res. Vet. Sci. – 1978. – Vol.24. – P.228-230.
29. Alexander, D. J. Isolation of avian infectious bronchitis virus from experimentally
infected chickens / D.J. Alexander, R. E. Gough // Res. Vet. Sci. – 1977. – Vol.23.
– P.344.
30. Antigenic and S-l genomic characterization of the Delaware variant serotype of
infectious bronchitis virus / J.J. Gelb, C.L. Kceler, W.A. Nix [et al.] // Avian Dis. –
1997. – Vol.41. – P.661-669.
31. Avian infectious bronchitis [Электронный ресурс]. – Режим доступа:
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health standards/tahm/2.03.02_AIB. pdf
(дата обращения 22.10.14)
32. Avian infectious bronchitis and deep pectoral myopathy—A case control study / D.
O. Almeida, R. Tortelly, E. R. Nascimento [et al.] // Poult. Sci. – 2012. – Vol. 91 –
P. 3052–3056.
33. Baba, T. Harderian gland dependency of immunoglobulin A production in the
lacrimal fluid of chicken / T. Baba, K. Masumoto, S. Nishida [et al.] //
Immunology. – 1988. – Vol.65. – P.67-71.
34. Beach, J.R. A filterable virus distinct from that laryngotracheitis: the cause of
respiratory disease of chicks / J.R. Beach, O.W. Schalm // Poult.Sci. – 1936. –
Vol.15. – P.199-206.
35. Bhattacharjee, P. S. Susceptibility of organ cultures from chicken tissues for strains
of infectious bronchitis virus isolated from the intestine / P.S. Bhattacharjee, R. C.
Jones // Avian Pathol. – 1997. – Vol.26. – P.553-563.
96
36. Blake, J.T. Effects of experimental chronic respiratory disease and infectious
bronchitis on pullets / J.T. Blake // Am. J. of Vet. Res. – 1962. – Vol.23. – P.847849.
37. Boltz, D. A. Avian infectious bronchitis virus: a possible cause of reduced fertility
in the rooster / D.A. Boltz, M. Nakai, J. M. Bahr // Avian Dis. – 2004. – Vol.48. –
P.909-915.
38. Box, P. G. Protection of laying hens against infectious bronchitis with inactivated
emulsion vaccines / P.G. Box, A. V. Beresford, B. Roberts // Vet. Rec. – 1980. –
Vol.106. – P.264-268.
39. Breadth of protection of the respiratory tract provided by different live-attenuated
infectious bronchitis vaccines against challenge with infectious bronchitis viruses
of heterologous serotypes / J.K.A. Cook, S.J. Orbell, M.A. Woods, M.B Huggins //
Avian Pathol. – 1999. – Vol.28. – P.477-485.
40. Brown, A. J. Application of the hemagglutination inhibition test to typing of
infectious bronchitis virus / A.J. Brown, C.D. Bracewell // Vet. Rec. – 1985. –
Vol.116. – P.47–48.
41. Bumstead, N. Genetic differences in susceptibility to a mixture of avian infectious
bronchitis virus and Escherichia coli / N. Bumsted, M.B. Huggins, J.K. Cook // Br.
Poult. Sci. – 1989. – Vol.30. – P.39-48.
42. Cavanagh, D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus / D. Cavanagh // Vet.
Res. – 2007. – Vol.38. – P.281-297.
43. Cavanagh, D. Infectious Bronchitis. Diseases of Poultry / D. Cavanagh, J. Gelb //
Diseases of Poultry. – Iowa, 2008. – P.117-135.
44. Cavanagh, D. Relationship between sequence variation in the S1 spike protein of
infectious bronchitis virus and the extent of cross-protection in vivo / D. Cavanagh,
M.M. Ellis, J.K. Cook // Avian Pathol. – 1997. – Vol. 26. – P.63-74.
45. Cavanagh, D. Severe acute respiratory syndrome vaccine development:
Experiences of vaccination against avian infectious bronchitis coronavirus / D.
Cavanagh // Avian Pathol. – 2003. – Vol.32. – P.567-582.
46. Chandra, M. Comparative nephropathogenicity of infectious bronchitis virus in
97
bursectomized and nonbursectomized chickens / M. Chandra // Am. J. Vet. Res. –
1988. – Vol.49. – P.831-834.
47. Characterisation of strains of infectious bronchitis virus isolated in Chile // A.
Cubillos, J. Ulloa, V. Cubillos, J.K.Cook // Avian Pathol. – 1991. – Vol.20. – P.8599.
48. Characterization of an infectious bronchitis virus isolated from vaccinated broiler
breeder flocks / D. Parsons, M. M. Ellis, D. Cavanagh, J. K. Cook // Vet. Rec. –
1992. – Vol.131. – P.408–411.
49. Characterization of New variants of avian infectious bronchitis virus in Tunisia / H.
Bourogâa, K. Miled, L. Gribâa [et al.] // Avian Dis. - 2009. - Vol. 53, № 3. - P.
426-433.
50. Chen, H.W. Identification of Taiwan and China-like recombinant avian infectious
bronchitis viruses in Taiwan / H. W. Chen, Y.P. Huang, C.H Wang // Virus Res. –
2009. – Vol.140. – P.121-129.
51. Chew, P.H. Pathogenicity of attenuated infectious bronchitis viruses for oviducts of
chickens exposed in ovo / P.H. Chew, P.S. Wakenell, T. B. Farver // Avian Dis. –
1997. – Vol. 41. №3. – P.:598-603.
52. Chousalkar, K.K. LNA probe-based real-time RT-PCR for the detection of
infectious bronchitis virus from the oviduct of unvaccinated and vaccinated laying
hens / K.K. Chousalkar, B.F. Cheetham, J.R. Roberts // J. Virol. Methods. - 2009. Vol. 155, N 1. - P. 67-71.
53. Chubb, R.C. The detection of cytotoxic lymphocyte activity in chickens infected
with infectious bronchitis virus or fowlpox virus / R.C. Chubb, V. Hyunh, R. Law
// Avian Pathol. – 1987. – Vol.16. – P.395-405.
54. Chubb, R.C. The effect of the suppression of circulating antibody on resistance to
the Australian avian infectious bronchitis virus / R.C. Chubb // Res. Vet. Sci. –
1974. – Vol.17. – P.169-173.
55. Colwell, W. M. Effects of avian infectious bronchitis virus (IBV) on tracheal organ
cultures / K.M. Colwell, P.D. Lukert // Avian Dis. – 1969. – Vol.13. – P.888-894.
56. Comparative analysis of the effect of glycyrrhizin diammonium and lithium
98
chloride on infectious bronchitis virus infection in vitro / L. Jing, Y. Jiechao, S.
Xiuwen [et al.] // Avian Pathol. – 2009. – Vol.38. – №3. – P.215-221.
57. Comparison of a microneutralisation test with ELISA and precipitin tests for
detection of antibodies to infectious bronchitis virus in chickens / G.E. Wilcox [et
al.] // Aust Vet. J. – 1985. – Vol.60. – P.119-122.
58. Comparison of the pathogenicity of QX-like, M41 and 793/B infectious bronchitis
strains from different pathological conditions / Z. Benyeda, T. Mato, T. Suveges
[et.al] // Avian Pathol. – 2009. – Vol.38. – P.449-456.
59. Cook, J. K. Comparison of the haemagglutination inhibition test and the serum
neutralization test in tracheal organ cultures for typing infectious bronchitis virus
strains / J. K. Cook, A.J. Brown, C.D Bracewell // Avian Pathol. – 1987. – Vol.16.
– P.505– 511.
60. Cook, J. K. Duration of experimental infectious bronchitis in chickens / J.K. Cook
// Res. Vet.Sci. – 1968. – Vol. 9. – P. 506.
61. Cook, J. K. Recovery of infectious bronchitis virus from eggs and chicks produced
by experimentally inoculated hens / J.K. Cook // Avian Pathol. – 1971. – Vol.81. –
P.203-211.
62. Cook, J. K. The use of chicken tracheal organ cultures for the isolation and assay of
avian infectious bronchitis virus / J. K. Cook, J. H. Darbyshire, R. W. Peters //
Arch. Virol. -1976. – Vol.50. – P.118.
63. Cook, J.K. Infectious bronchitis immunity: Its study in chickens experimentally
infected with mixtures of infectious bronchitis virus and Escherichia coli / J.K.
Cook, H.W. Smith, M.B. Huggins // J. gen. Virol. - 1986. – Vol.67. – P.1427-1434.
64. Cook, J.K. The classification of new serotypes of infectious bronchitis virus
isolated from poultry flocks in Britain between 1981 and 1983 / J.K. Cook // Avian
Path. – 1984. – Vol.13. – P.733-741.
65. Cook, J.K. Use of an infectious bronchitis virus and Escherichia coli model
infection to assess the ability to vaccinate successfully against infectious bronchitis
in the presence of maternally-derived immunity / J.K.A. Cook, M.B. Huggins,
M.M.Ellis // Avian Pathol. – 1991. – Vol.20. – P.619-626.
99
66. Cook, M.E. Diet-induced immunosuppression / M.E. Cook // Poultry Immunology.
– England, 1996. – P.317-325.
67. Сook, M.E. Nutrition and immune response of domestic fowl / M.E. Cook //
Critical Reviews in Poultry Biology. – 1991. – Vol.3. – P.167-189.
68. CpG Oligodeoxynuckleotides activate innate immune response that suppresses
infectious bronchitis virus replication in chicken embryos / A. Dar, A. Potter, S.
Tikoo [et al.] // Avian Dis. - 2009. - Vol. 53, № 2. - P. 261-267.
69. Crinion, R. A. P. Pathogenicity of four serotypes of avian infectious bronchitis
virus for the oviduct of young chickens of various ages / R.A. Crinon, M.S.
Hofstad // Avian Dis. – 1972. – Vol.16. – P.351-363.
70. Cumming, R.B. The control of avian infectious bronchitis/nephrosis in Australia /
R.B. Cumming// Austral. Vet. J. – 1969. – Vol.45. – P.200-203.
71. Cumming, R.B. The pathogenesis of nephritis evoked by Australian IB viruses /
R.B. Cumming, R.C Chubb // Proceedings 1st Intern. Symp. on Infectious
Bronchitis. – Rauischholzhausen, 1995. – P.129-132.
72. Darbyshire, J.H. Assessment of cross-immunity in chickens to strains of avian
infectious bronchitis virus using tracheal organ cultures / J.H. Darbyshire // Avian
Pathol. – 1980. – Vol.9. – P.179-184.
73. Darbyshire, J.H. Humoral antibody response and assessment of protection
following primary vaccination of chicks with maternally derived antibody against
avian infectious bronchitis virus / J.H. Darbyshire R.W. Peters // Res. Vet. Sci. 1985. – Vol.38. - P.14-21.
74. Data from 11 years of molecular typing infectious bronchitis virus field isolates /
M. W. Jackwood [et.al] // Avian Dis. – 2005. Vol.49. – P.614-618.
75. De Wit, J. J. Detection of infectious bronchitis / J.J. De Wit // Avian Path. - 2000. Vol.29. – P.71-93.
76. De Wit, J.J. The efficacy of infectious bronchitis virus vaccinations in the field:
association between the α-IBV IgM response, protection and vaccine application
parameters / J.J. De Wit, W.A.J Swart, T.H.F. Fabri // Avian Pathol. – 2010. –
Vol.39. – P.123-132.
100
77. Detection and strain differentiation of infectious bronchitis virus in tracheal tissue
from experimentally infected chickens by reverse transcription-polymerase chain
reaction. Comparison with an immunohistochemical technique / K.J. Handberg,
O.L. Nielsen, M.W. Pedersen, P.H. Jorgensen // Avian Path. - 1999. – Vol.28. –
P.327-335.
78. Detection of IBV QX in commercial broiler flocks in the UK / R.M. Irvine, W.J.
Cox, V. Ceeraz [et al.] // Vet. Rec. - 2010. - Vol. 167, № 22. - P. 877-879.
79. Detection of Infectious Bronchitis Virus in Allantioc Fluid by Rapid
Hemagglutination Test / R. Momayez, P. Gharahkhani, R. Toroghi, S.A.
Pourbakhsh // Arch. Razi Ins – 2005. – Vol.59. – P.47-54
80. Development and use of the H strain of avian infectious bronchitis virus from the
Netherlands as a vaccine: a review / G. Bijlenga, J.K.A. Cook, J. Gelb, J.J. de Wit
// Avian Pathol. – 2004. – Vol.33. – P.550-557.
81. Dhinakar Raj, G. Effect of T-cell suppression by cyclosporin on primary and
persistent infections of infectious bronchitis virus in chickens / G. Dhinakar Raj,
R.C. Jones // Avian Pathol. – 1997. – Vol.26. – P.257-276.
82. Dhinakar Raj, G. Infectious bronchitis virus: Immunopathogenesis of infection in
the chicken / G. Dhinakar Raj, R. C. Jones // Avian Pathol. - 1997. – Vol. 26. –
P.677-706.
83. Discovery of seven novel mammalian and avian Coronaviruses in the genus
Deltacoronavirus
supports
bat
Coronaviruses
as
the
gene
source
of
Alphacoronavirus and Betacoronavirus and avian Coronaviruses as the gene source
of Gammacoronavirus and Deltacoronavirus / Y. P. C. Woo, S. K. P. Lau, C. S. F.
Lam [et al.] // J. Virology. – 2012. – Vol. 86, № 7. – P. 3995–4008.
84. Effect of a live Mycoplasma synoviae vaccine on the production of eggshell apex
abnormalities induced by a M. synoviae infection preceded by an infection with
infectious bronchitis virus D1466 / A. Feberwee, C.J. Morrow, S.A. Ghorashi [et
al.] // Avian Pathol. - 2009. - Vol. 38, № 5. - P. 333-340.
85. Effect of in ovo bursectomy on the course of an infectious bronchitis virus
infection in line C White Leghorn chickens / J.K. Cook, T.F. Davison, M.B.
101
Huggins, P. McLaughlan // Arch. Virol. – 1991. – Vol.118. – P.225-234.
86. Effects of infectious bronchitis virus (Arkansas strain) on laying chickens / M.A.
Muneer, D. A. Halvorson, V. Sivanandan [et al.] // Avian Dis. – 1986. – Vol.30. –
P.644-647.
87. Efficacy and safety of an attenuated live QX-like infectious bronchitis virus strain
as a vaccine for chickens / H.J. Geerligs [et al.] / Avian Pathol. – 2011. – Vol.40. –
P.93-102.
88. Evaluating viral interference between infectious bronchitis virus and Newcastle
disease virus vaccine strains using quantitative reverse transcription-polymerase
chain reaction / J. Jr. Gelb, B.S. Ladman, M.J. Licata [et al.] // Avian Dis. – 2007. –
Vol.51. – P.924-34.
89. Evaluation of the protection conferred by commercial vaccines and attenuated
heterologous isolates in China against the CK/CH/LDL/97I strain of infectious
bronchitis coronavirus / S. Liu [et al] // Vet. J. – 2009. – Vol.179. – P.130-136.
90. Expression of the infectious bronchitis virus spike protein by recombinant vaccinia
virus and induction of neutralizing antibodies in vaccinated mice / F.M. Tomley,
A.P. Mockett, M.E. Boursnell [et al.] // J. Gen. Virol. – 1987. – Vol.68. – P.22912298.
91. Fabricant, J. The early history of infectious bronchitis / J. Fabricant // Avian Dis. –
1998. – Vol.42. – P.648-650.
92. Finney, P. M. Studies with a bivalent infectious bronchitis killed virus vaccine /
P.M. Finney, P. G. Box, H. C. Holmes / Avian Pathol. – 1990. – Vol.19. – P.435450.
93. Gallardo, R. A. Host intraspatial selection of infectious bronchitis virus populations
/ R.A. Gallardo, V. L. van Santen, H. E. Toro // Avian Dis. – 2010. – Vol.54. –
P.807-813.
94. Gelb, J. Infeclious bronchitis / J. Gelb // A Laboratory Manual for the Isolation and
Identiticalion of Avian Pathogens / American Association of Avian Pathologists. 3rd ed. - Kennett Square, 1989. – P.124-127.
95. Genetic diversity of avian infectious bronchitis Coronavirus in recent years in
102
China / H. Ma, Y. Shao, Ch. Sun [et al.] // Avian Dis. – 2012. – Vol. 56, № 1. – P.
15–28.
96. Genetically diverse coronaviruses in wild bird populations of northern England /
L.A. Hughes, C. Savage, C.Naylor [et al.] // Emerg Infect Dis. – 2009. – Vol.15. –
P. 1091-1094.
97. Giambrone, J.J. Effects of infectious bursal disease on the responsiveness of the
chickens to Mycoplasma synoviae, Newcastle disease and infectious bronchitis /
J.J. Giambrone, C.S. Eidson, S.H. Kleven // Am. J. Vet. Res. – 1977. – Vol.38. – P.
251-253.
98. Glahn, R. P. Order of exposure to high dietary calcium and Gray strain infectious
bronchitis virus alters renal function and the incidence of urolithiasis / R.P. Glahn,
R. F. Wideman Jr, B. S. Cowen // Poult. Sci. – 1989. – Vol.68. – P.1193.
99. Gough, R. E. Comparison of duration of immunity in chickens infected with a live
infectious bronchitis vaccine by three different routes / R.E. Gough, D. J.
Alexander // Res. Vet. Sci. – 1979. – Vol.26. – P.329-332.
100. Gough, R.E. Comparison of serological tests for the measurement of primary
immune response to avian infectious bronchitis virus vaccines / R.E. Gough, D.J.
Alexander // Vet. Microbiol.. – 1977. – Vol.2. – P.289-301.
101. Guy, J.S. Isolation and propagation of coronaviruses in embryonated eggs / J.S.
Guy // Methods Mol. Biol. – 2008. – Vol.454. – P.109-117.
102. Hitchner, S. B. Growth curve studies of chick embryo-propagated infectious
bronchitis virus / S. B. Hitchner // Poult. Sci. – 1955. – Vol.34. – P.590-594.
103. Hitchner, S.B. Evaluation of the immunity response to infectious bronchitis virus /
S.B. Hitcher, G.S. Appleton, R.W. Winterfield, // Avian Dis. – 1964. – Vol.8. –
P.153-162.
104. Hoerr, F. J. Clinical aspects of immunosuppression in poultry / F.J. Hoerr // Avian
Dis. – 2010. – Vol.54. – P.2-15.
105. Hofstad, M.S. Antigenic and immunological studies of several isolates of avian
infectious bronchitis virus / M.S. Hofstad // Avian Dis. – 1961. – Vol.5. –P.102107.
103
106. Hopkins, S.R. Increased incidence of airsacculitis in broilers infected with
mycoplasma synoviae and chicken-passaged infectious bronchitis vaccine virus /
S.R. Hopkins, H.W Yoder // Avian Dis. – 1984. – Vol.28. – P.386-396.
107. Hopkins, S.R. Studies on methods for determining the efficacy of oil emulsion
vaccines against infectious bronchitis virus / S.R. Hopkins, C.W. Beard // J. Am.
Vet. Med. Assoc. - 1985. – Vol.187. - Р.305.
108. Houadfi, M. Isolation of avian infectious bronchitis viruses in Morocco including
an enterotropic variant / M. Houadfi, RC. Jones // Vet. Rec. – 1985. – Vol. 20. – P.
1985.
109. Humoral and cell-mediated immune responses to different doses of attenuated
vaccine against avian infectious bronchitis virus / C. H. Okino [et al.] // Viral
Immunol. – 2013. – Vol. 26, № 4. – Р. 259–267.
110. Identification of a novel nephropathogenic infectious bronchitis virus in Israel / R.
Meir [et al] // Avian Dis. – 2004. – Vol.48. – P.635-641.
111. IgM responses in chicken serum to live and inactivated infectious bronchitis virus
vaccines / N.R. da Silva. Martins, A.P.A. Mockett, A.D.T. Barrett, J.K.A. Cook //
Avian Dis. – 1991. – Vol.35. – P.470-475.
112. Ignjatović, J. Avian infectious bronchitis virus / J. Ignjatović, S. Sapats // Rev.
Sci. Techn. – 2000. – Vol.19. – P.493-508.
113. Ignjatovic, J. The S1 glycoprotein but not the N or M proteins of avian infectious
bronchitis virus induces protection in vaccinated chickens / J. Ignjatovic, L. Galli //
Arch. Virol. – 1994. – Vol.138. – P.1-2.
114. Induction of anti-viral immune responses by immunization with recombinantDNA encoded avian coronavirus nucleocapsid protein /A.M. Boots, B. J. BenaissaTrouw, W. Hesselink [et al.] // Vaccine. – 1992. – Vol.10. – P.119-124.
115. Induction of protective immunity in chickens vaccinated with infectious
bronchitis virus S1 glycoprotein expressed by a recombinant baculovirus /C.S.
Song, Y. J. Lee, C. W. Lee [et al.] // J. Gen. Virol. – 1998. – Vol.79. – P.719-723.
116. Infectious bronchitis disease and control // Intern. Poult. Prod. - 2008. - Vol. 16,
№ 4. – P. 36.
104
117. Infectious bronchitis serology in broilers and broiler breeders: Correlations
between antibody titers and performance in vaccinated flocks / P.De Herdt, R.
Ducatelle, E. Uyttebroek [et al.] // Avian Dis. – 2001. – Vol.45. – P.612-619.
118. Infectious bronchitis virus field vaccination coverage and persistence of
Arkansas-type viruses in commercial broilers / M.W. Jackwood, D.A. Hilt,A.W.
McCall [et al.] / Avian Dis. – 2009. – Vol.53. – P.175-183.
119. Infectious bronchitis virus in testicles and venereal transmission / R.A. Gallardo,
F.J. Hoerr, W.D. Berry [et al.] // Avian Dis. - 2011. - Vol. 55, № 2. - P. 255-258.
120. Infectious bronchitis virus replication in the chicken embryo related cell line /L.
Helena [et al.] // Avian Pathol. – 2003. – Vol. 32. - P. 413-417.
121. Infectious bronchitis virus S2 expressed from recombinant virus confers broad
protection against challenge / H. Toro, W. Zhao, C. Breedlove [et al.] // Avian Dis.
– 2014. – Vol. 58, № 1. – P. 83–89.
122. Infectious bronchitis virus variants: a review of the history, current situation and
control measures / J.J. (Sjaak) de Wit,, J.K.A. Cook, H.M.J.F. van der Heijden //
Avian Pathol. - 2011. - Vol. 40, № 3. - P. 223-235.
123. International Symposium on Infectious Bronchitis and Pneumovirus Infections in
Poultry, Rauschholzhausen, Germany, 15–18 June 1998 / World Veterinary Poultry
Association, Institut für Geflügelkrankheiten Justus-Liebig-Universität. – Giessen,
1998. – 380 p.
124. Isolation and identification of glandular stomach type IBV (QX IBV) in chickens
/ Y. D. Wang, Y.L. Wang, Z. Zhang [et.al] // Chin. J. Animal Quarantine. – 1998. –
Vol.15. – P.1-3.
125. Jackwood, M.W. Further development and use of a molecular serotype
identification test for infectious bronchitis virus / M.W. Jackwood, N.M.H. Yousef,
D.A. Hilt // Avian Dis. - 1997. – Vol.41. –P.105-110.
126. Jackwood, M.W. Production and immunogenicity of multiple antigenic peptide
(MAP) constructs derived from the SI glycoprotein of infectious bronchitis virus
(IBV) / M.W. Jackwood, D.A. Hilt // Adv. Exp. Med. Biol. – 1995. – Vol.380. –
P.213-219.
105
127. Jones, B.V. The preparation of chicken tracheal organ cultures for virus isolation,
propagation, and titration / B.V. Jones, R.M. Hennion // Methods Mol. Biol. –
2008. – Vol.454. – P.103-7.
128. Jones, R. C. Re-excretion of an enterotropic infectious bronchitis virus by hens at
point of lay after experimental infection at day old / R.C. Jones, A. G. Ambali //
Vet. Rec. – 1987. – Vol.120. – P.617-618.
129. Jones, R.C. Viral respiratory diseases (ILT, aMPV infections, IB): are they ever
under control? / R.C. Jones // British Poult. Sci.. - 2010. - Vol. 51, № 1. - P. 1-11.
130. Jungherr, E.L. Naturally acquired passive immunity to infectious bronchitis in
chicks / E.L. Jungherr, N.L. Terrell // Am. J. Vet. Res. – 1948. – Vol.2. – P.201205.
131. Klieve, A.V. Respiratory disease and immunity to challenge produced by
Australian strains of infectious bronchitis virus / A.V. Klieve, R.B. Cumming //
Avian Pathol. – 1990. – Vol.19. – P.305-312.
132. Ladman, B.S. Infectious bronchitis virus S1 gene sequence comparison is a better
predictor of challenge of immunity in chickens than serotyping by virus
neutralization / B.S. Ladman, A.B. Loupos, J. Gelb // Avian Pathol. – 2006. –
Vol.35. – P.127-133.
133. Li, H. Sequence analysis of nephropathogenic infectious bronchitis virus strains
of the Massachusetts genotype in Beijing / H. Li, H. Yang // Avian Pathol. – 2001.
– Vol.30. – P.535-541.
134. Mardani, K. Rapid differentiation of current infectious bronchitis virus vaccine
strains and field isolates in Australia / K. Mardani, G. Browning, J. Ignjatovic //
Austral. Vet. J. – 2006. – Vol.84. – P.59-66.
135. Mockett, A.P.A. Maternally-derived antibody to infectious bronchitis virus: its
detection in chick trachea and serum and its role in protection / A.P.A. Mockett,
J.K.A. Cook, M.B. Huggins // Avian Pathol. – 1987. – V.16. – P.407-416.
136. Mockett, A.P.A. The detection of specific IgM to infectious bronchitis virus in
chicken serum using an ELISA / A.P.A. Mockett, J.K. Cook // Avian Pathol. –
1986. – Vol.15. – P.437-446.
106
137. Molecular epidemiology of avian infectious bronchitis in Brazil from 2007 to
2008 in breeders, broilers, and layersr / L.Y.B. Villarreal, T.L. Sandri, S.P. Souza
[et al.] // Avian Dis. - 2010. - Vol. 54, № 2. - P. 894-898.
138. Molecular epizootiology of infectious bronchitis virus in Sweden indicating the
involvement of a vaccine strain / A. Farsang, C. Ros, Lena H. M. Renström / Avian
Pathol. – 2002. – Vol.31. – P.229-236.
139. Mondal, S. P. Maternal antibody to infectious bronchitis virus: its role in
protection against infection and development of active immunity to vaccine / S.P.
Mondal, S. A. Naqi // Vet. Immunol. Immunopathol. – 2001. – Vol.79. – P.31-40.
140. Monreal, G. Comparison of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),
haemagglutination-inhibition test and agar-gel precipitation test for detection of
antibodies to avian infectious bronchitis virus / G. Monreal, H.J. Bauer, J.J.
Wiegmann //Avian Pathol. – 1985. – Vol.14. – P.421-43.
141. Nephritis associated with infectious bronchitis virus Cal99 variant in game
chickens / M. França, P.R. Woolcock, M. Yu [et al.] // Avian Dis. - 2011. - Vol.55,
№ 3. - P. 422-428.
142. Nephropathogenic infectious bronchitis in Pennsylvania chickens 1997-2000 /
A.F. Ziegler, B. S. Ladman, P. A. Dunn [et al.] // Avian Dis. – 2002. – Vol.46. –
P.847-858.
143. Orchitis in roosters with reduced fertility associated with avian infectious
bronchitis virus and avian metapneumovirus infections / L.Y. Villarreal, P. E.
Brandao, J. L. Chacon [et.al.] // Avian Dis. – 2007. – Vol.51. – P.900-904.
144. Otsuki, K. Comparison of the susceptibility to infectious bronchitis virus infection
of two inbred lines of White Leghorn chickens / K. Otsuki, M.B. Huggins, J.K.
Cook // Avian Pathol. – 1990. – Vol.19. – P.467–475.
145. Otsuki, K. Studies on avian infectious bronchitis virus (IBV). 1 Resistance of IBV
to chemical and physical treatments / K. Otsuki, H. Yamamoto, M. Tsubokura //
Arch. Virol. - 1979. – Vol. 60. - P.25-32.
146. Pathogenicity of a QX strain of infectious bronchitis virus in specific pathogen
free and commercial broiler chickens, and evaluation of protection induced by a
107
vaccination programme based on the Ma5 and 4/91 serotypes / C. Terregino, A.
Toffan, M.S Beato [et al.] // Avian Pathol. – 2008. – Vol.37. – P.487-493.
147. Pattison, M. The effect of live infectious bronchitis vaccine on the course of
infectious laryngotracheitis / M. Pattison, R.E. Gough, P.S. Dawson / Vet. Res. –
1971. – Vol.75. – P.643-644.
148. Pei, J. Memory T cells protect chicks from acute infectious bronchitis virus
infection / J. Pei, W.E. Briles, E.W. Collisson // Virology. – 2003. – Vol.306. –
P.376-384.
149. Pejkovski C. Immunosuppressive effect of infectious bursal disease virus on
vaccination against infectious bronchitis / C. Pejkovski, F. G. Davelaar, B.
Kouwenhoven // Avian Pathol. – 1979. – Vol.8. – P.95–106.
150. Pensaert, M. Vaccination of chickens against a Belgian nephropathogenic strain
of infectious bronchitis virus B1648 using attenuated homologous and heterologous
strains / M. Pensaert, C. Lambrechts // Avian Pathol. – 1994. – Vol.23. – P.631641.
151. Prepubertal exposure to the live attenuated avian infectious bronchitis virus
induces epididymal stones in the rooster after puberty / U.H. Jackson, D. A. Boltz,
M. Nakai [et al.] // Poult. Sci. – 2006. – Vol.43. – P.280-285.
152. Presence of viral antigens and antibody in the trachea of chickens infected with
avian infectious bronchitis virus / R.A. Hawkes, J.H. Darbyshire [et al] // Avian
Pathol. – 1983. – Vol.12. – P.331-340.
153. Protection induced by infectious laryngotracheitis virus vaccines alone and
combined with Newcastle disease virus and/or infectious bronchitis virus vaccines /
A. Vagnozzi, M. García, S.M. Riblet, G. Zavala // Avian Dis. - 2010. - Vol. 54, №
4. - P. 1210-1219.
154. Protection of chickens after live and inactivated virus vaccination against
challenge with nephropathogenic infectious bronchitis virus / B.S. Ladman, C.R
Pope, A.F. Ziegler [et al.] // Avian Dis. – 2002 – Vol.46. – P.938-944.
155. Protection of chickens against renal damage caused by a nephropathogenic
infectious bronchitis virus / J.K. Cook [et al.] // Avian Pathol. – 2001. – Vol.30. –
108
P.423-426.
156. Protection of chickens from infectious bronchitis by in ovo and intramuscular
vaccination with a DNA vaccine expressing the S1 glycoprotein / D.R.
Kapczynski, D. A. Hilt, D. P. Shapiro [et al.] // Avian Dis. – 2003. – Vol.47. –
P.272-285.
157. Purchase, H. G. Genetic differences among chicken embryos in response to
inoculation with an isolate of infectious bronchitis virus / H.G. Purchase, C.H.
Cunningham, B.R. Burmester // Avian Dis. – 1966. – Vol.10. – P.162-172.
158. QX genotypes of infectious bronchitis virus circulating in Europe / I. Monne1, G.
Cattoli1, R. Jones [et al.] // Vet. Rec. – 2008. – Vol.163. – P. 606-607.
159. QX-type infectious bronchitis virus in commercial flocks in the UK / V. Valastro,
I. Monne, M. Fasolato [et al.] // Vet. Rec. - 2010. - Vol. 167, № 22. - P. 865-866.
160. Raggi, L.G. Co-existence of infectious bronchitis and infectious laryngotracheitis
/ L.G. Raggi, J. Asmar, G.G Lee // Avian Dis. – 1967. – Vol.11. – P.419-426.
161. Raggi, L.G. Lack of correlation between infectivity, serologic response and
challenge results in immunisation with an avian infectious bronchitis vaccine / L.G.
Raggi, G.G. Lee // J. Immunol. – 1965. – Vol.94. – P.538-543.
162. Raj, G.D. Cellular immune responses in infectious bronchitis virus infections of
chickens / D.G. Raj, R.C. Jones // International Symp. on Infectious Bronchitis
Virus and Pneumorvirus Infections in Poultry. – Rauischholzhausen, 1998. –
P.293-309.
163. Raj, G.D. Local antibody production in the oviduct and gut of hens infected with a
variant strain of infectious bronchitis virus / G.D. Raj, R.C. Jones // Vet. Immunol.
and Immunopathol. – 1996. – Vol.53. – P.147-161.
164. Rapid heat-treatment attenuation of infectious bronchitis virus / M.W. Jackwood,
D.A. Hilt, H.S. Sellers [et al.] // Avian Pathol. - 2010. - Vol. 39, № 3. - P. 227-233.
165. Rapid NK-cell activation in chicken after infection with infectious bronchitis
virus M41 / L. Vervelde, M. G. R. Matthijs, D. A. van Haarlem, J. J. de Wit, C. A.
Jansen // Vet. Immunol. and Immunopathol. – 2013. – Vol. 151, № 3–4. – Р. 337–
341.
109
166. Ratanasethakul, C. Effect of environmental temperature on the mortality in
vaccinated chickens after challenge with Australian infectious bronchitis virus / C.
Ratanasethakul, R.B. Cumming // Austral. Vet. J. – 1985. – Vol.60. – P.254-256.
167. S1 gene characteristics and efficacy of vaccination against infectious bronchitis
virus field isolates from the United States and Israel (1996 to 2000) / J. Gelb [et al]
// Avian Pathol. – 2005. – Vol.34. – P.194-203.
168. S1 gene sequence analysis of a nephropathogenic strain of avian infectious
bronchitis virus in Egypt / A.S. Abdel-Moneim [et al.] // Virology J. – 2006. –
Vol.3. – P.78.
169. Schalk, A. F. An apparently new respiratory disease in baby chicks / A. F. Schalk,
M. C. Hawn // J. Am. Vet. Med. Assoc. - 1931. – Vol.78. – P.413-422.
170. Sentinel bird approach to isolating infectious bronchitis virus / J. Gleb, P. A.
Fries, C. K. Crary [et al.] // J. Am. Vet. Med. Ass. – 1987. – V.190. – P.1628. 1987.
171. Seo, S.H. Adoptive transfer of infectious bronchitis virus primed alphabeta T cells
bearing CD8 antigen protects chicks from acute infection / S.H Seo, J. Pei, W.E.
Briles // Virology. – 2000. – Vol.269. – P.183-189.
172. Seo, S.H. Specific cytotoxic T lymphocytes are involved in in vivo clearance of
infectious bronchitis virus / S.H. Seo, E W Collisson // J. Virol. – 1997. – Vol.71,
№7. – P.5173–5177.
173. Serotype Identification of Avian Infectious Bronchitis Virus by RT-PCR of the
Peplomer (S-1) Gene / C.L. Calvin [et.al] // Avian Dis. – 1998. – Vol.48. – P.275284.
174. Sharma, J.M. Introduction to poultry vaccines and immunity /J.M. Sharma //
Adv.Vet. Med. – 1999. – Vol.41. – P.481-494.
175. Shirzad, M. R. Efficacy of vaccination programmes using two commercial live
infectious bronchitis vaccines against a field IRFIB 32 strain / M.R. Shirzad, K.
Asasi, A. Mohammadi // Bulg. J. Vet. Med. – 2012. – Vol.15, №4. – P.260−272.
176. Smith H.W. The experimental infection of chickens with mixtures of infectious
bronchitis virus and Escherichia coli / H.W. Smith, J.K. Cook, Z.E. Parsell // J.
Gen. Virol. – 1985. – Vol.66. – P.777–786.
110
177. The carboxyl- terminal 120-residue polypeptide o f infectious bronchitis virus
nucleocapsid induces cytotoxic T lymphocytes and protects chickens from acute
infection / S.H. Seo, L. Wang, R. Smith, E.W. Collisson // J. Virol. – 1997. –
Vol.71. – P.7889- 7894.
178. The effect of intranasal exposure to Mycoplasma synoviae and infectious
bronchitis virus on the development of lesions and agglutinins / N.O. Olson, H.E.
Adler, A.Y. DaMassa, R.E. Corstvet // Avian Dis. – 1964. – V.8. – P.623-631.
179. The infection of primary avian tracheal epithelial cells with infectious bronchitis
virus / Ching-I Shen [et.al] // Vet Res. – 2010. – Vo.41, №6. – P. 221-227.
180. The isolation and characterization of six avian infectious bronchitis virus isolated
in Morocco / M. D. El Houadfi [et al] / Avian Pathol. – 1986. – Vol.15. – P.93-105.
181. The required sample size in vaccination-challenge experiments with infectious
bronchitis virus, a meta-analysis / J. J. de Wit, G. J. Boelm, T. J. W. M. van Gerwe,
W. A. J. M. Swarta // Avian Pathol. – 2013. – Vol. 42, № 1. – P. 9–16.
182. Thompson, G. Systemic and local antibody responses to infectious bronchitis
virus in chickens inoculated with infectious bursal disease virus and control
chickens / G. Thompson, H. Mohammed, B. Bauman, S. Naqi // Avian Dis. – 1997.
– Vol.41. – P.519-527.
183. Timms, L.M. Cell mediated and humoral immune response of chickens to live
infectious bronchitis vaccines / L.M. Timms, C.D. Bracewell // Res. Vet. Sci. –
1981. – Vol.31. – P.182-189.
184. Transfer of IgG from serum to lachrymal fluid in chickens / H. Toro, P. Lavaud,
P. Vallejos, A. Ferreira // Avian Dis. – 1993. – V.37. – P.60-66.
185. Transmissibility of infectious bronchitis virus H120 vaccine strain among broilers
under experimental conditions / M.G.R. Matthijs, A. Bouma, F.C. Velkers [et al.] //
Avian Dis. - 2008. - Vol. 52, № 3. - P. 461-466.
186. Transmission of infectious bronchitis virus within vaccinated and unvaccinated
groups of chickens / J.J. De Wit, M. C. de John, A. Pijpers, J. H. Verheijden //
Avian Pathol. – 1998. – Vol.27. – P.464-471.
187. Trypsin-induced hemagglutination assay for the detection of infectious brornchitis
111
virus / M. S. Mahmood, M. Siddique, I. Hussain, A. Khan // Pakistan.Vet. J. –
2004. – Vol.24. – P.4-7.
188. Van den Bos R. Early IBV protection is essential in parent stock / R. Van den Bos
// World Poultry. - 2009. - Vol. 25, № 9. - P. 28-30.
189. Van Leerdam B. Diagnosis of IBV field challenge / B. van Leerdam, P. Kuhne //
World Poult. - 2009. - Vol. 25, № 1. - P. 36-38.
190. Van Leerdam B. Understanding Elisa results for effective IBV vaccination / B.
van Leerdam, P. Kuhne // World Poult. - 2008. - Vol. 24, № 12. - P. 30-31.
191. Winterfield, R.W. Some characteristics of isolates of infectious bronchitis virus
from commercial vaccines / W.R. Winterfield, A.M. Fadly // Avian Dis. – 1972. –
Vol.16. – P.746-755.
192. Winterfield,
R.W.
Vaccination
against
infectious
bronchitis
virus
and
immunosuppressive effects of infectious bursal disease / R.W. Winterfield, F.J.
Hoerr, A.M. Fadly // Poult. Sci. – 1978. – Vol.57. – P.386-91.
193. Yoder, H.W. Influence of environment on airsacculitis: effects of relative
humidity and air temperature on broilers infected with Mycoplasma synoviae and
infectious bronchitis / H.W. Yoder, L.N. Drury, S.R. Hopkins // Avian Dis. – 1977.
– Vol.21 – P.195-208.
194. Zellen, G. K. Determination of the Antigenic Relationships among Six Serotypes
of Infectious Bronchitis Virus Using the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
and Serum-Neutralization Test / G. K. Zellen, J. Thorsen // Avian Dis. – 1987. –
Vol. 31. – P.455-458.
112
ПРИЛОЖЕНИЯ
113
Приложение№ 1
114
Приложение№ 2
115
Приложение№ 3