Эволюция диагностики вирусных гепатитов в Службе крови
реклама
Эволюция диагностики вирусных гепатитов в Службе крови Туполева Татьяна Алексеевна Голосова Татьяна Васильевна Филатов Феликс Петрович Успехи клинической трансфузиологии не снижают опасность передачи с кровью и ее дериватами возбудителей инфекционных заболеваний. Среди инфекций передаваемых трансфузионным путем важная проблема во многих странах - это вирусные гепатиты. У нас в стране заболеваемость парентеральными гепатитами остается по прежнему высокой ( не менее 100000 в год). 40 30 ХВГ ХГС 20 10 0 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 100 80 60 ОГВ ОГС 40 20 0 1998 2000 2003 2004 2007 2008 «Вирусные гепатиты в РФ» Справочник 2009 г. Манефестные формы острых гепатитов 25% Бессимптомные и стертые формы острых гепатитов встречаются чаще (75%). Соотношение различных форм вирусного гепатита В 16 14 12 10 8 6 4 2 0 субклинический клинический При субклиническом течении ВГВ хронизация процесса наступает в 15% случаев, по сравнению с клинически выраженными формами (4%). Снижение риска заражения пациентов при гемотрансфузиях является одной из актуальных проблем трансфузионной медицины. Решение этой проблемы представляется возможным при создании и внедрении в лабораторную практику службы крови современных быстрых надёжных и чувствительных методов обнаружения вирусов в донорской крови. Эволюция методов обследования донорской крови 1960 г Билирубин Сифилис 1972 – 74 г HBsAg Сифилис Билирубин 1987 г HBsAg Анти-ВИЧ Сифилис АЛТ 1994 г HBsAg Анти-ВИЧ Сифилис АЛТ Анти HCV Заболеваемость посттрансфузионными гепатитами в мире 30% 10% 1% 0,6% Чувствительность различных методов выявления HBsAg РПГ ВИЭФ РПГА в 10-100 раз ниже, чем ВИЭФ 1000 нг 5-20 нг ИФА ПЦР 0.1-1 нг 10 мол.НК Reduction of Risk of Transfusion Transmitted Hepatitis B Volunteer Donors HBsAg HTLV 1.0 % Post-Transfusion Hepatitis 30 HTLV-I/II HCV 1.0 25 HIV-1 20 15 10 5 ALT HIV-1/2 HCV 2.0 HCV/HIV NAT CUE Anti-HBc HCV 3.0 p24 Ag HTLV 2.0 WNV NAT HBsAg 3 Bacterial detection 19 6 19 9 7 19 1 7 19 3 7 19 5 7 19 7 7 19 9 8 19 1 8 19 3 8 19 5 8 19 7 8 19 9 9 19 1 9 19 3 9 19 5 9 19 7 99 20 01 20 03 20 05 0 Chagas? Babesiosis? Andromeda strain? Year of Introduction of Test After H. Alter New York Blood Center В России официальная регистрация ПТГ относится только к гепатитам В и С. Известно, что к возникновению гепатитов причастны и другие вирусы с парентеральным механизмом передачи инфекции. ВГВ-25-30% ВГС-50-60% ЦМВ-4-6% Другие ЭБВ-0,5% ЦМВ-2-10% По данным ученых из Голландии По нашим данным Молекулярные маркеры вирусов гепатитов и герпесвирусов в биоптатах печени (n=56) ДНК ВГВ N=20 45% ДНК ВЭБ N=14 32% РНК ВГС N=6 ДНК ЦМВ N=3 5,3% ?⇒ Нужно смотреть • серологические • и молекулярные маркеры ВЭБ и ЦМВ в донорском материале. Использование высокочувствительных ИФА-тестов при обследовании доноров и реализация программ вакцинопрофилактики ВГВ, несомненно, способствовали снижению ПТГ. Тем не менее, нулевой риск инфицирования при переливании компонентов и препаратов донорской крови остается пока недостижимой целью. Сравнительный анализ структуры донорских кадров в России свидетельствует о серьёзных изменениях, продолжающихся в донорском движении: • Миграция населения – приток доноров из энденмичных по вирусным гепатитам регионов. • Увеличение числа доноров из социально неблагополучных слоев общества В ряде стран Западной Европы, Северной Америки молекулярные методы используются в национальных масштабах для отбора донорской крови в формате минипулов и даже больших производственных пулов плазмы уже много лет. Эти страны характеризуются • низкими показателями эндемичности по ВГВ и ВГС • и высококачественной системой отбора доноров Выявляемость инфицированных ВГВ доноров, находящихся в периоде пресероконверсионного «окна», тесно связана с эндемичностью HBV в регионе. 1 Случай выявления в периоде «окна»: Эндемичность Низкая Средняя Высокая Число донаций 350000610000 50000 5000 Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет сократить негативное окно для • ВГВ – в полтора раза, • а для ВГС – в 3 раза, соответственно снижая риск передачи этих вирусов через донорскую кровь и ее препараты. ?⇒ Нужно смотреть • ДНК ВГВ • РНК ВГС В последние 10 лет внимание трансфузиологов привлечено к проблеме так называемого «HBsAgнегативного» гепатита, связанного с существованием латентно текущей (скрытой) НВ-вирусной инфекции. В этом случае ДНК ВГВ определяется в гепатоцитах печени, в плазме крови она может содержаться в очень низких концентрациях (менее 200 МЕ/мл) или вообще не обнаруживаться. При серопозитивном варианте скрытой инфекции в русле крови циркулируют «изолированные» анти-НВс или в сочетании с анти-HBs;при серонегативном – антительные маркеры отсутствуют. Существует несколько механизмов, ответственных за не обнаруживаемый HВsAg при скрытом гепатите В у больных с изолированными анти-НВс и позитивных по HBV ДНК. • HВsAg может отсутствовать благодаря мутациям, таким как делеции в пре-S области, которые могут блокировать экспорт этого антигена • мутации главных гидрофильных петель (аминокислоты 98-156) могут воздействовать на конформацию антигена и его связывание со специфическими антителами • при наличии циркулирующих иммунных комплексов, которые формируются за счет антигенов и их специфических антител • может быть благодаря коинфекции HVC, при которой ядерные протеины HVC мешают репликации HBV и синтезу вирусных протеинов. • Низкая концентрация HВsAg. Распространенность латентной НВ-вирусной инфекции среди доноров США, Канада, страны Западной Европы, Япония Россия от 0 до 4,6% (среднее значения 1-1,2%) от 0,9 до 5,6% Для Службы крови эпидемиологическое значение скрытой НВ-вирусной инфекции очевидно, т.к. вирусная безопасность напрямую связана с выявлением латентных вирусоносителей среди доноров. ?⇒ Нужно смотреть • Анти-НВс • Анти-НВs По данным японских ученых дозы крови с уровнями анти-HВs выше 100 МЕ/мл должны быть безопасны. Переливание: • 22 компонентов HBV ДНК – позитивных при индивидуальном NAT, которые содержали анти-HВs нет HBV-трансмиссии. • 37 компонентов, которые не содержали анти-HВs 10 случаев возникновения инфекции. \F. Blain Hollinger. Hepatitis B virus infection and transfusion medicine: science and the occult. (review). Transfusion 2008, vol.48, p.1001-1021. Тесты для обнаружения анти-НВс вызывают большую дискуссию среди работников Службы крови из-за определенного числа доноров, которые некорректно отстраняются в связи с ложноположительными результатами. Ложноотрицательные реакции Следует осознавать, что обязательный контроль крови и плазмы, даже при полном соответствии всем требованиям, оставляет вероятность ложноотрицательной реакции, которая может быть обусловлена следующими причинами 1. 2. 3. 4. низкая репликативная активность вируса, иммунологическое “окно”, недостаточная чувствительность тест-систем, человеческий фактор. Поэтому каждая кровь должна рассматриваться как потенциально контаминированная. Для медицинских работников Службы крови, которые связаны с безопасностью трансфузий, главный интерес состоит в идентификации доноров с HBV-инфекцией, которая может быть пропущена современными скринирующими методами. Повышенная чувствительность и специфичность этих тестов уменьшила риск, но не ликвидировала его. Увеличение числа доноров и реципиентов, которые были вакцинированы против гепатита В также способствует этой безопасности. Последствия вакцинопрофикактики ВГВ: • + снижение числа фульминантных форм с летальным исходом за счет дикого штама • - искусственная селекция скрытого гепатита за счет мутантных форм вируса с меньшей репликативной активностью. Наши наблюдения: • Методы диагностики ВГВ в донорской крови регулярно совершенствуются (ИФА,ПЦР) • Заболеваемость острым вирусным гепатитом В населения снижается, но остается значительным число хронических больных. Вопрос об адекватности – то ли мы смотрим? В нашей лаборатории ПЦР диагностика осуществляется с 1999 года. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВГВ И ВГС НА СТАНЦИИ ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ ПЦР+ (РНК ВГС) ИФА (а-ВГС) Количество образцов + 5 3 - 553 1 Всего 558 4 FRT ИФА (HBsAg) Количество образцов ПЦР+ (ДНК ВГВ) + 2 1 - 439 9 Всего 441 10 FRT Результаты тестирования пулированных образцов плазм доноров на ДНК ВГВ. Величина пула, содержащего или не содержащего образец, контаминированный по ДНК ВГВ Результат в АмплиСенс HВVFRT Результат в АмплиСенс100-R ВГВ-470/770-ВКО 6 (ДНК+) + + 6 (ДНК+) - - 6 - - 6 - - 6 - - 12 (ДНК+) - - 12 (ДНК+) - - 12 - - 12 - - 12 - - всего позитивных по ДНК ВГВ пулов: 1 1 ?⇒ Нужно тестировать в формате минипулов • ПЦР-скринирование пулированной плазмы на ВГВ может быть недостаточно эффективным из-за его низких концентраций в период серонегативного окна (1-2.400 геном-экв/мл); это обусловлено более продолжительным временем удвоения ВГВ, составляющим 2,8 дня - по сравнению с 17 часами для ВГС и 22 часами для ВИЧ-1. • ПЦР-скринирование в формате минипулов имеет минимальное преимущество и по сравнению с новыми ИФА-тестами на ВГВ (на HBsAg). • В то же время ПЦР индивидуальных образцов обеспечивает обнаружение ВГВ на 25-36 дней раньше – и, конечно же, с более высокой чувствительностью, нежели ИФА-тесты. Разработана и используется ПЦР в мультиплексном формате При проведении ПЦР в мультиплексном формате возникает ряд трудностей: • количество одновременно идентифицируемых мишеней ограничивается возможными межпраймерными взаимодействиями, • перекрывание спектров поглощения и испускания, используемых флуорофоров не позволяет одновременно регистрировать более четырёх-пяти продуктов амплификации в одной реакции. Применение ПЦР в формате биочипов для детекции вирусов иммунодефицита (ВИЧ-СПИД) и гепатитов В и С (ВГВ и ВГС) в донорской крови Работа выполнена в лаборатории клинико-вирусологической диагностики гепатитов и СПИД ГНЦ РАМН и в Лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Схема микрочипа для одновременного количественного определения HIV-1, HBV и HCV. Все ячейки находятся внутри единой камеры микрочипа объемом 25 мкл, содаржащей все необходимые реагенты. Схема второй стадии ПЦР на микрочипе. В случае применения олигонуклеотидных микрочипов, благодаря физическому разделению индивидуальных гелевых ячеек с иммобилизованными в них праймерами, стало возможным применение одного неспецифичного ДНКсвязывающего флуоресцентного красителя (SYBR Green I) для одновременного и независимого выявления всех продуктов мультиплексной ПЦР. Возможности метода на основе олигонуклеотидных микрочипов Качественный и количественный анализ вирусных маркеров: • может быть использован в донорстве • для оценки противовирусной терапии у больных. Применение олигонуклеотидных микрочипов, представляется наиболее перспективным подходом для одновременной идентификации и количественного анализа различных генетических мишеней. Методика позволяет расширять спектр исследуемых инфекций на одном микрочипе. Профилактика посттрансфузионных гепатитов завтра • ПЦР- и ИФА-диагностика расширенного спектра инфекционных агентов в исходном сырье с применением микрочипов. • Противовирусная инактивация всех компонентов и препаратов крови Спасибо за внимание
