определение уровня растворимых cd38, cd50, cd95 антигенов и

УДК 616-097: 576.8.097.29 + 616.921.5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ РАСТВОРИМЫХ CD38, CD50, CD95
АНТИГЕНОВ И РАСТВОРИМОГО ГЕТЕРОДИМЕРА
«β2-МИКРОГЛОБУЛИН-HLA АНТИГЕНЫ I КЛАССА»
ПРИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ И ГРИППЕ
И.А. Шломина, Е.С. Вязьмина, В.В. Новиков
Нижегородский госуниверситет
М.А. Крыжанова, Т.Г. Мартынова
Нижегородский НИИЭМ
Проведено исследование содержания растворимых CD38, CD50, CD95
антигенов и растворимого гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены
I класса» при гриппе и заболеваниях, осложненных цитомегаловирусной
инфекцией. Показано повышение содержания CD95 и понижение содержания «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса» в сыворотке крови больных
гриппом. При цитомегаловирусной инфекции ни в одном случае не было
выявлено статистически достоверных различий между группой больных и
группой доноров.
Поверхностные маркеры клеток иммунной системы широко используют для
иммунофенотипирования клеток. Так, по наличию на мембране лимфоцитов CD4
или CD8 антигенов в крови с помощью моноклональных антител определяют количество Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Наряду с мембранными
антигенами клетки иммунной системы могут продуцировать их растворимые
формы, которые обнаруживаются в крови с помощью иммуноферментного анализа. В настоящее время обнаружено более двух десятков мембранных белков (антигенов), которые образуют растворимые формы. Показано, что они выполняют
специфические функции, связанные с регуляцией иммунных механизмов. Для
многих растворимых форм продемонстрирована диагностическая, мониторинговая и прогностическая значимость при разных видах инфекционной и неинфекционной патологии. Так, например, обнаружено, что в крови ВИЧ-инфицированных
лиц повышенный уровень растворимого CD30 антигена появляется раньше антител к ВИЧ, а содержание растворимых CD8 и CD25 антигенов коррелирует с активностью инфекционного процесса (Новиков, 1996).
CD38 антиген является бифункциональным эктоэнзимом, который преобладающе представлен на гемопоэтических клетках в период их дифференцировки.
Этот мембранный нуклеотид-метаболизирующий фермент служит также активационным поверхностным маркером зрелых клеток, отражающим степень активности клеточного звена иммунитета (Janeway, Travers, 1994). CD38 антиген принимает участие в метаболизме циклической ADP-рибозы, служащей вторичным
мессенжером активации клеток (De Flora et al., 1998).
CD50 антиген или ICAM-3 (intercellular cell adhesion molecule) принадлежит к
группе рецепторов контактного взаимодействия или молекул адгезии. По своим
структурным характеристикам этот дифференцировочный антиген входит в се225
мейство иммуноглобулинов (Козлов и др., 1995). CD50 антиген (ICAM-3) —
N-гликозилированная трансмембранная молекула (110 кДа). В особенно высокой
степени CD50 антиген представлен на покоящихся лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах. ICAM-3 — главный лиганд для LFA-1 антигена при инициации иммунного ответа, например, при адгезии Т-лимфоцитов на антиген-презентирующих Вклетках (Juan, 1994).
Человеческий Fas/APO-1 (CD95) опосредует апоптоз (запрограммированную
гибель клеток) и играет важную роль в процессах клеточного и тканевого развития. CD95 антиген экспрессирован на кортикальных тимоцитах, различных линиях лимфобластов, активированных Т и В-клетках. Он представляет собой гликозилированный трансмембранный протеин с молекулярной массой 45 кДа и принадлежит к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухолей. Показано, что
СD95 антиген, как и ряд других дифференцировочных антигенов, представлен в
организме как мембранной, так и растворимой сывороточной формой. Установлено также, что уровень растворимого CD95 антигена повышается при системной
красной волчанке, некоторых Т- и В-клеточных лейкозах. Однако значение растворимого CD95 антигена при реализации иммунного ответа на вирусные инфекции изучено недостаточно и требует более подробного исследования (Птицына и
др., 2000а).
Антигены главного комплекса гистосовместимости, как и многие мембранные
поверхностные белки, являются гликопротеидами, представленными на всех типах ядерных клеток. Молекулы антигенов HLA I класса построены из α-цепи, кодируемой областью генов HLA, и нековалентно ассоциированного с ним β2микроглобулина. Функциональная роль антигенов HLA I класса заключается в
презентации чужеродного генетического материала цитотоксическим Т-лимфоцитам, чья роль в иммунном ответе на вирусы особенно велика (Janeway,
Travers, 1994).
Целью данной работы явилось определение уровня растворимых CD38, CD50,
CD95 антигенов и растворимого гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены
I класса» при цитомегаловирусной инфекции и гриппе.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили 12 сывороток
крови больных вирусом гриппа и 14 сывороток крови больных, находящихся на
лечении во второй инфекционной больнице по поводу различных инфекционных
заболеваний, но по данным лабораторной диагностики положительных на цитомегаловирусную инфекцию, а также 24 образца сыворотки крови, полученных от
здоровых доноров и используемых в качестве контрольной группы.
Количественное содержание растворимых форм мембранных антигенов определяли с помощью иммуноферментных тест-систем, разработанных авторами.
Исследование содержания растворимого CD38 антигена проводили иммуноферментным методом с помощью поликлональных антител против поверхностных
антигенов мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров и
моноклональных антител ИКО-20, направленных против CD38 антигена (Барышников, Тоневицкий, 1997). Система для количественного определения растворимого CD50 антигена в сыворотке крови человека была сконструирована на основе
поликлональных антител против мембранных антигенов мононуклеарных клеток
крови человека, сорбируемых на твердую фазу, и моноклональных антител ИКО60 к CD50 антигену, конъюгированных с пероксидазой хрена перйодатным методом (Птицына и др., 2000б). Для определения уровня растворимой формы CD95
антигена была разработана иммуноферментная тест-система с применением мо226
ноклональных антител ИКО-160 и поликлональной сыворотки против поверхностных антигенов мононуклеарных клеток крови (Птицына и др., 2000а). Для определения в сыворотке крови растворимого гетеродимера «β2-микроглобулинHLA антигены I класса» была использована иммуноферментная тест-система с
использованием пары моноклональных антител (МКА), полученных в онкологическом центре РАМН с помощью гибридомной технологии: МКА ИКО-53 — против молекул HLA I класса, МКА ИКО-216 — против молекулы β2-микроглобулина. МКА ИКО-53 предварительно очищали риванолом по общепринятой методике (Фримель, 1987) и сорбировали на твердую фазу (полистироловые планшеты). МКА ИКО-216 конъюгировали с пероксидазой хрена перйодатным методом и использовали в качестве конъюгата. Концентрацию растворимых антигенов
оценивали, переводя единицы оптической плотности в условные единицы (УЕ).
Результаты и их обсуждение. Сравнение усредненного уровня CD95 антигена
в крови больных гриппом и в крови здоровых доноров обнаружило статистически
достоверные различия между группами в значениях данного показателя. У здоровых доноров уровень CD95 антигена соответствовал 359.0±38.5 УЕ (n = 10), у
больных он был равен 516.1±44.5 УЕ (n = 12), что в 1.7 раза превышает значение
показателя у здоровых доноров (p < 0.05) (рис. 1). Еще большее различие показателей наблюдалось при сравнении усредненного уровня гетеродимера «β2-микроглобулин-антигены HLA I класса», но уже в сторону понижения. У больных уровень гетеродимера составлял 473.2±45.2 УЕ (n = 12), у здоровых доноров он был
равен 1045.0±171.2 УЕ (n = 16), т. е. значение показателя у здоровых доноров в 2.2
раза превышает значение показателя у больных (p < 0.05). Аналогичные данные
были получены недавно зарубежными исследователями. Известно, что при вакцинации против гриппа у лиц, не заболевающих затем гриппом, регистрируется
повышение уровня растворимых антигенов гистосовместимости I класса. Соответственно, лица, которые несмотря на вакцинацию заболевали гриппом, характеризовались отсутствием изменений данного показателя или он понижался. Этот
факт хорошо согласуется с полученными нами данными о снижении содержания
гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса». Представляется весьма вероятным, что, используя данный показатель, можно идентифицировать лиц,
входящих после вакцинации в группу риска по заболеваемости гриппом.
160
140
144
120
128
100
80
100
60
65
40
45
20
0
1
2
3
4
5
Рис. 1. Уровень растворимых CD38, CD50, CD95 антигенов
и растворимого гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса»
в крови больных гриппом:
1 — здоровые доноры; 2 — CD95; 3 — CD50; 4 — β2-m-HLA I класса; 5 — CD38
227
Сравнение усредненных уровней CD50 и CD38 антигенов в крови больных
гриппом и в крови здоровых доноров не выявило статистически достоверных различий между группами в значениях данного показателя. Уровень CD50 у больных
соответствовал 275.8±73.9 УЕ (n = 12), у здоровых доноров — 426.5±92.7 УЕ
(n = 16). Уровень CD38 у больных составил 274.2±73.7 УЕ (n = 12), у здоровых
доноров — 213.8±80.2 УЕ (n = 16) (рис. 1). Можно, однако, заметить небольшое
понижение уровня CD50 антигена и небольшое повышение содержания CD38 антигена по сравнению с группой здоровых доноров, но эти показатели не выходили
за рамки статистически достоверных различий. В связи с выявленной нами тенденцией к снижению содержания растворимого CD50 антигена интересными
представляются данные, полученные группой германских авторов, проводивших
сравнительное исследование частоты простудных заболеваний и уровня CD54 и
CD58 антигенов, являющихся, как и CD50, молекулами адгезии. Была выявлена
высокая обратная корреляция между уровнем CD58, а также CD54 антигена и
частотой простудных заболеваний. Дополнительное исследование подтвердило,
что частота простудных заболеваний ассоциирована с низким уровнем растворимых молекул адгезии, с высокой способностью к пролиферации нестимулированных и стимулированных Т-клеток и с более высокой способностью клеток к продукции в условиях in vitro таких цитоконов, как IFN-гамма, IL-2, IL-6 и IL-10
(Becker et al., 1996).
140
120
100
80
128
98
100
91
60
40
53
20
0
1
2
3
4
5
Рис. 2. Уровень растворимых CD38, CD50, CD95
и растворимого гетеродимера «β2-микроглобулин-HLA антигены I класса»
в крови ЦМВ-инфицированных лиц
1 — здоровые доноры; 2 — CD95; 3 — CD50; 4 — β2-m-HLA I класса; 5 — CD38
Сравнение усредненных уровней сывороточных CD50, CD95, CD38 антигенов
и «β2-микроглобулин-антигены HLA I класса» при заболеваниях, осложненных
цитомегаловирусной инфекцией, и в крови здоровых доноров ни в одном случае
не выявило статистически достоверных различий между группами (рис. 2). Можно только отметить небольшое понижение уровней CD95, CD50 антигенов и «β2микроглобулин-антигены HLA I класса», однако, оно не выходило за рамки статистически достоверных различий. Уровень CD95 антигена у больных составил
228
382.2±75.7 УЕ (n = 14), у здоровых доноров он был равен 418.7±123.3 УЕ (n = 15).
Уровень CD50 антигена у больных соответствовал 115.0±39.9 УЕ (n = 14), у здоровых доноров — 218.7±119.5 УЕ (n = 17). Уровень гетеродимера «β2микроглобулин-антигены HLA I класса» составил 886.6±97.7 УЕ (n = 14) и
905.0±87.7 УЕ (n=16) у больных и доноров, соответственно. Полученные нами
данные подтверждаются данными иностранной литературы: группа немецких исследователей обнаружила, что цитомегаловирусная инфекция не влияет на изменение уровня HLA (Zavazava et al., 1993). Только при рассмотрении усредненного
уровня CD38 антигена можно заметить небольшое повышение уровня этого показателя у больных по сравнению с группой доноров, однако оно тоже не выходило
за рамки статистически достоверных различий. У больных уровень CD38 антигена соответствовал 314.9±12.7 УЕ (n = 14), у здоровых доноров он был равен
246.1±80.0 УЕ (n = 24) (рис. 2). Полученные результаты подтверждаются нашими
неопубликованными данными, которые показали, что в содержании CD38 антигена в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных лиц, несущих IgM анти-ЦМВ антитела, по сравнению с группой доноров статистически достоверных изменений выявлено не было.
Таким образом, учитывая большое разнообразие дифференцировочных антигенов и многообразие их функций, можно заключить, что функциональное и диагностическое значение их растворимых форм изучено далеко не полностью.
Предполагается, что в дальнейшем будет проведен сравнительный анализ содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов по отношению к ряду
других лабораторных и клинических показателей и будет получена информация о
возможной прогностической роли растворимых антигенов в оценке риска заболеваемости гриппом как у вакцинированных, так и невакцинированных лиц. Представляется достаточно вероятным, что последующие исследования должны выявить более глубокое понимание роли ряда представителей нового класса иммуномодулирующих соединений — растворимых дифференцировочных антигенов — в формировании и регуляции иммунного ответа на такие широко распространенные, социально-значимые вирусные инфекции, как грипп и ЦМВ.
ЛИТЕРАТУРА
Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. М., 1997.
Козлов И.Г., Горлина Н.К., Чередеев А.Н. Рецепторы контактного взаимодействия //
Иммунология. 1995. № 4. С. 14–24.
Новиков В.В. Растворимые формы дифференцировочных антигенов гемопоэтических
клеток // Гематология и трансфузиология. 1996. № 6. С. 40–43.
Птицына Ю.С. и др. Растворимые формы дифференцировочных антигенов как естественные регуляторные факторы иммунитета // Материалы научной конференции, посвященной 70-летию Нижегородского НИИЭМ «Естественные факторы защиты в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний». Н. Новгород, 2000а. С. 84−85.
Птицына Ю.С. и др. Разработка и апробация иммуноферментной тест-системы для
определения растворимой формы CD50 антигена (ICAM-3) // Тез. докл. Междунар. конф.,
посвященной памяти акад. РАМН и РАМТН И.Н. Блохиной «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии». М.; Н. Новгород, 2000б. С. 30–31.
Фримель Г. Иммунологические методы. М., 1987. 417 с.
229
Becker N. et al. Epidemiologic investigation of serum levels of the soluble forms of CD25,
CD54 and CD58, and T cell responsiveness after stimulation via the CD2-dependent pathway in a
random sample of the general population // Immunobiology. 1996. V. 195. P. 47–60.
De Flora A. et al. Ectocellular CD38-catalyzed synthesis and intracellular Ca (2+)-mobilizing
activity of cyclic ADP-ribose // Cell Biochem. Biophys. 1998. V. 28. P. 45–62.
Janeway Ch. A., Travers P. Immunobiology: The immune system in health and disease. New
York; London, 1994.
Juan M. CD50 (interсellular adhesion molecule 3) stimulation induces calcium mobilization
and tyrosine phosphorylation through p59 fyn and p56 in Jurkat T cell line // J. Exp. Med. 1994.
V. 179. P. 1747–1756.
Zavazava N., Bottcher H., Ruchholtz W.M. Soluble MHC class I antigens (sHLA) and antiHLA antibodies in heart and kidney allograft recipients // Tissue Antigens. 1993. V. 42. P. 20–26.
230