Антитела к Внутреннему фактору (фактору Кастла) ИФА (IgG

Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG), EUROIMMUN
1
____________________________________________________________________________________________________
Антитела к Внутреннему фактору (фактору Кастла) ИФА (IgG)
Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG)
Иммуноферментный тест для полуколичественного или количественного определения аутоантител класса
IgG к внутреннему фактору (фактору Кастла) в сыворотке и плазме крови человека
Номер по каталогу: EA 1362-9601 G Набор рассчитан на 96 определений
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для выявления злокачественной анемии.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Набор для иммуноферментного анализа Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG) предназначен для
полуколичественного или количественного in vitro определения аутоантител класса IgG к внутреннему
фактору в сыворотке и плазме крови человека. В набор включены 8-луночные стрипы, разделяемые на
отдельные лунки, с иммобилизованным внутренним фактором. На первой стадии в лунках инкубируют
разведенные исследуемые образцы. Имеющиеся в положительных образцах специфичные антитела
класса IgG (а также классов IgA и IgM) к внутреннему фактору связываются с антигенами. Для выявления
связавшихся антител проводят вторую инкубацию, используя меченные ферментом антитела к IgG
человека (конъюгат фермента), способные вызвать цветную реакцию. Интенсивность формирующегося
окрашивания прямо пропорциональна концентрации аутоантител к внутреннему фактору в образце.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Необходимые реагенты и материалы, входящие в состав набора:
Цвет
Формат
Символ
Компоненты набора
1. Лунки планшета
с иммобилизованными антигенами; 12 стрипов планшета 8STRIPS
--12 х 8
луночных (разделяемых на отдельные лунки), в рамкедержателе;
готовые к использованию
темно2. Калибратор 1
CAL 1
1 × 2,0 мл
красный
200 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
3. Калибратор 2
CAL 2
красный 1 × 2,0 мл
20 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
4. Калибратор 3
CAL 3
розовый 1 × 2,0 мл
2 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
5. Положительный контроль
POS CONTROL
синий 1 × 2,0 мл
(IgG человека); готовый к использованию
6. Отрицательный контроль
NEG CONTROL
зеленый 1 × 2,0 мл
(IgG человека); готовый к использованию
7. Конъюгат фермента
CONJUGATE
зеленый 1×12 мл
меченные пероксидазой антитела к IgG человека (кроличьи);
готовый к использованию
8. Буфер для разведения образцов
SAMPLE BUFFER
голубой 1×100 мл
готовый к использованию
WASH BUFFER 10x
9. Промывочный буфер
бесцвет1×100 мл
10х концентрат
ный
бесцвет10. Раствор хромоген/субстрат
SUBSTRATE
1×12 мл
ный
ТМБ/Н2О2; готовый к использованию
бесцвет11. Стоп-реагент
STOP SOLUTION
1×12 мл
ный
0,5 М раствор серной кислоты; готовый к использованию
1 шт.
--12. Инструкция к набору
1 шт.
--13. Протокол с целевыми значениями
Серия
Температура хранения
Для in vitro диагностики
Невскрытый набор использовать до
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ НАБОРА
Набор должен храниться при температуре 2-8 °С. Замораживание набора не допускается. Невскрытые
компоненты набора стабильны до истечения указанного срока годности.
___________________________________________________________________________________________
_
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG), EUROIMMUN
2
____________________________________________________________________________________________________
УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ
Обращайтесь с исследуемыми образцами, калибраторами, контролями и проинкубированными стрипами
планшетов как с потенциально инфицированными материалами. Все реагенты и материалы, являющиеся
отходами, должны быть обработаны в соответствии с действующими нормативами.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание. Перед использованием все реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (1825 °С) примерно в течение 30 минут. После первого использования все реагенты стабильны до истечения
указанного срока годности при хранении при температуре 2-8°С и предохранении от микробной
контаминации, если ниже не оговорены особые условия хранения.
- Стрипы с иммобилизованными антигенами
Стрипы готовы к использованию. Вскройте предохраняющую упаковку планшета за бороздку над
застежкой. Перед вскрытием упаковки стрипы должны быть доведены до комнатной температуры во
избежание конденсации влаги внутри лунок. После вскрытия упаковки неиспользуемые стрипы сразу
верните в пакет и плотно закройте его имеющейся на пакете самоуплотняющейся застежкой. (Не
удаляйте пакет с влагопоглотителем).
После первого вскрытия упаковки стрипы с лунками, покрытыми антигенами, можно хранить в сухом
месте при температуре 2-8 °С по меньшей мере в течение 4 месяцев.
- Калибраторы и контроли
Калибраторы и контроли готовы к использованию. Перед использованием реагенты необходимо
тщательно перемешать.
- Конъюгат фермента
Конъюгат фермента готов к использованию. Перед использованием конъюгат необходимо тщательно
перемешать.
- Буфер для разведения образцов
Буфер для разведения образцов готов к использованию.
- Промывочный буфер
Промывочный буфер является 10-кратным концентратом. Если в концентрате промывочного буфера
образовались кристаллы, необходимо подогреть флакон с буфером при температуре 37 оС и тщательно
перемешать перед разведением. С помощью чистой пипетки отберите необходимое количество
концентрата буфера и разведите деионизированной или дистиллированной водой (1 часть реагента
плюс 9 частей дистиллированной воды).
Например, для одного стрипа: 5 мл концентрата плюс 45 мл воды.
Приготовленный разведенный промывочный буфер стабилен в течение 1 месяца при хранении при
температуре 2-8 °С и соблюдении правил использования.
- Раствор хромоген/субстрат
Раствор хромоген/субстрат готов к использованию. Закрывайте флакон сразу после использования,
поскольку содержащийся в нем раствор чувствителен к свету. Используемый раствор хромоген/субстрат
должен быть бесцветен. Не используйте раствор, если он окрасился в голубой цвет.
- Стоп-реагент
Стоп-реагент готов к использованию.
Внимание! Калибраторы и контроли были проверены на наличие антигена гепатита В, а также антител к
вирусу гепатита С, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью методов иммуноферментного анализа и непрямой
иммунофлуоресценции, и при этом показали отрицательные результаты. Однако, все используемые
материалы следует считать потенциально инфекционно опасными и обращаться с ними, соблюдая
необходимые меры предосторожности. Часть реагентов содержит токсичный азид натрия. Избегайте
контакта реагентов с кожей.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Исследуемые образцы: Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность: Образцы пациентов, предназначенные для исследования этим методом, можно хранить до
14 дней при температуре от +2 оС до +8 оС. Разведенные образцы необходимо использовать в течение
одного рабочего дня.
Разведение образцов:
Образцы сыворотки или плазмы крови пациентов разводят 1:101 буфером для разведения образцов.
Например, разведите 10 мкл сыворотки крови в 1,0 мл буфера для разведения образцов и тщательно
перемешайте на вортексе (пипетка для перемешивания не подходит).
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибраторы и контроли уже предварительно разведены и готовы к использованию, не
следует их разводить.
___________________________________________________________________________________________
_
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG), EUROIMMUN
3
____________________________________________________________________________________________________
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для полуколичественного анализа используют калибратор 2, а также положительный и отрицательный
контроли и исследуемые образцы. Для количественного анализа используют калибраторы 1, 2 и 3, а
также положительный и отрицательный контроли и исследуемые образцы.
Инкубация образцов
(1-я стадия)
Внесите в отдельные лунки планшета в соответствии со схемой внесения
реагентов по 100 мкл калибраторов, положительного и отрицательного
контролей или разведенных образцов сыворотки или плазмы крови.
Инкубируйте при комнатной температуре (18-25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Вручную. Удалите содержимое лунок, затем последовательно промойте все
лунки 3 раза, каждый раз внося по 300 мкл приготовленного промывочного
буфера в каждую лунку.
Автоматическая. Промойте лунки 3 раза, внося по 400 мкл приготовленного
промывочного буфера в каждую лунку (программирование устройства для
промывания планшетов в режиме переполнения: “Overflow Modus”).
Оставляйте промывочный буфер в каждой лунке в течение 30 – 60 секунд во
время каждого цикла промывки, затем удаляйте содержимое лунок. После
промывки (вручную или автоматической) тщательно удаляйте остатки
промывочного буфера из лунок, постукивая перевернутым планшетом о
фильтровальную бумагу.
Примечание. Остатки жидкости (>10 мкл), скапливающейся в лунках после
промывки, могут повлиять на субстратную реакцию и привести к получению
ложно заниженных значений оптической плотности. Неправильная промывка
(например, менее 3 промывочных циклов, слишком маленькие объемы
промывочного буфера или слишком короткое время реакции) может привести к
ложно завышенным значениям оптической плотности.
Инкубация конъюгата
(2-я стадия)
Внесите в лунки планшета по 100 мкл конъюгата фермента (меченных
пероксидазой антител к IgG человека). Инкубируйте при комнатной температуре
(18-25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Удалите содержимое лунок. Промойте, как описано выше.
Инкубация субстрата
(3-я стадия)
Внесите в лунки планшета по 100 мкл раствора хромоген/субстрат. Инкубируйте
при комнатной температуре (18-25 °С) в течение 15 минут (предохраняйте от
воздействия прямых солнечных лучей).
Остановка реакции
Внесите в лунки планшета по 100 мкл стоп-реагента в той же
последовательности и с той же скоростью, как и раствор хромоген/субстрат.
Измерение
С помощью планшетного спектрофотометра измеряют интенсивность
окрашивания в лунках при длине волны 450 нм (значение референтной длины
волны между 620 нм и 650 нм) в течение 30 минут после добавления стопреагента. Перед измерением осторожно встряхните планшет для обеспечения
равномерного распределения раствора.
СХЕМА ВНЕСЕНИЯ РЕАГЕНТОВ
A
B
C
D
E
F
G
H
1
С2
pos.
neg.
Р1
Р2
Р3
Р4
Р5
2
Р6
Р7
Р8
Р9
Р10
Р11
Р12
Р13
3
Р14
Р15
Р16
Р17
Р18
Р19
Р20
Р21
4
Р22
Р23
Р24
5
6
7
С1
С2
С3
pos.
neg.
Р1
Р2
Р3
8
Р4
Р5
Р6
Р7
Р8
Р9
Р10
Р11
9
Р12
Р13
Р14
Р15
Р16
Р17
Р18
Р19
10
Р20
Р21
Р22
Р23
Р24
11
12
Схема внесения реагентов в лунки стрипов 1–4 представляет собой образец заполнения лунок при
полуколичественном анализе 24 образцов сыворотки или плазмы крови пациентов (Р1–Р24).
___________________________________________________________________________________________
_
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG), EUROIMMUN
4
____________________________________________________________________________________________________
Схема внесения реагентов в лунки стрипов 7–10 представляет собой образец заполнения лунок при
количественном анализе 24 образцов сыворотки или плазмы крови пациентов (Р1–Р24).
Каждый из калибраторов (С1–С3), положительный (pos.) и отрицательный (neg.) контроли и каждый из
образцов сыворотки или плазмы крови пациентов вносят в отдельную лунку. Надежность
иммуноферментного анализа можно повысить внесением каждой пробы в дубликатах.
Стрипы можно разделить на отдельные лунки. Это позволяет отмерить точное количество реагентов по
числу исследуемых образцов и снизить расход реагентов.
Как положительный, так и отрицательный контроли служат внутренними контролями правильной
постановки анализа. Контроли необходимо включать в каждую постановку анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полуколичественный анализ
Оценка результатов полуколичественного анализа производится путем расчета соотношения оптической
плотности контроля или исследуемого образца и оптической плотности калибратора 2. При вычислениях
руководствуются следующей формулой:
Оптическая плотность контроля или исследуемого образца
Оптическая плотность калибратора 2
= Соотношение
EUROIMMUN рекомендует следующую интерпретацию результатов:
Соотношение < 1,0
Соотношение > 1,0
отрицательный
положительный
Количественный анализ
Для определения концентрации антител к внутреннему фактору в образцах по измеренной оптической
плотности строится калибровочная кривая. По оси Y откладывают линейные значения измеренной
оптической плотности 3 калибраторов, по оси X - соответственно линейные значения концентраций антител
к внутреннему фактору в этих калибраторах, затем соседние точки соединяются. Концентрации антител в
исследуемых образцах можно вычислить с помощью компьютера, используя способ расчета по кривой «от
точки к точке».
Ниже приводится образец типичной калибровочной кривой. Пожалуйста, не используйте эту кривую для
определения концентрации антител к внутреннему фактору в образцах.
2,0
Оптическая плотность
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
ОЕд/мл
Если значение оптической плотности исследуемого образца превышает значение оптической плотности
калибратора 1 (200 ОЕд/мл), результат записывают как “>200 ОЕд/мл”. Рекомендуется провести повторный
анализ этого образца после разведения его 1:400. Полученный при расчете по калибровочной кривой
результат в ОЕд/мл следует умножить на фактор разведения 4.
EUROIMMUN рекомендует верхний предел нормальных значений (значение cut-off или уровень
отсечения) равный 20 относительным единицам (ОЕд)/мл. EUROIMMUN рекомендует следующую
интерпретацию результатов:
< 20 ОЕд/мл
> 20 ОЕд/мл
отрицательный
положительный
При постановке анализа в дубликатах следует использовать среднее из значений в двух лунках. Если два
значения существенно отличаются друг от друга, анализ образца следует повторить.
При постановке диагноза наряду с серологическими результатами следует всегда учитывать и клинические
симптомы.
___________________________________________________________________________________________
_
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG), EUROIMMUN
5
____________________________________________________________________________________________________
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Калибровка
Поскольку не существует международной референтной сыворотки для антител к внутреннему фактору,
набор откалиброван в относительных единицах (ОЕд).
Для каждой группы выполненных тестов значения оптической плотности калибраторов и значения в
относительных единицах и/или соотношения, определенные для положительного и отрицательного
контролей, должны укладываться в указанные для данной серии набора диапазоны. К набору прилагается
протокол, включающий эти целевые значения. Если значения концентраций контролей выходят за рамки
заданных диапазонов, следовательно результаты анализа могут быть недостоверными, и тест необходимо
повторить.
Активность использованного фермента термозависима, поэтому значения оптических плотностей могут
изменяться, если не используется термостат. Чем выше комнатная температура (18-25 °С) во время
инкубации субстрата, тем будут выше значения оптических плотностей. Сходные колебания связаны и с
изменением времени инкубации. Однако, калибраторы, контроли и исследуемые образцы подвергаются
одним и тем же воздействиям, так что результаты оказываются в значительной степени
скомпенсированными при расчете по калибровочной кривой.
Антиген
На поверхности лунок планшета иммобилизован высокоочищенный внутренний фактор, выделенный из
слизистой оболочки желудка свиньи. Внутренний фактор – это гликопротеид с молекулярной массой 70 кДа,
секретирующийся париетальными клетками желудка. Он служит транспортным и защитным белком
витамина В12. Аутоантитела к внутреннему фактору бывают двух видов. Блокирующие аутоантитела (тип
1) препятствуют связыванию витамина В12 с молекулой внутреннего фактора и таким образом затрудняют
образование комплекса внутренний фактор/витамин В12. Связывающие аутоантитела (тип 2)
присоединяются к другим частям внутреннего фактора или к комплексу внутренний фактор/витамин В12.
Линейность
Линейность ИФА определяли, используя серийные разведения образцов сыворотки крови пациентов с
высокой концентрацией антител. Набор Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG) обладает линейностью в
диапазоне концентраций 2–200 ОЕд/мл.
Аналитическая чувствительность
Предел определения антител к внутреннему фактору в наборе Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG) рассчитан
на основании значения оптической плотности образца, не содержащего аналита, плюс утроенное среднее
квадратичное отклонение, и является наименьшим определяемым титром антител. Минимальная
определяемая концентрация антител в наборе Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG) составляет около 1
ОЕд/мл.
Перекрестная реактивность
Перекрестная реактивность данного набора не выявлена.
Влияние гемоглобина, триглицеридов и билирубина
Не отмечено искажения результатов при исследовании данным набором гемолизированных, липемических
или желтушных образцов с концентрацией гемоглобина до 10 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и
билирубина – до 0,4 мг/мл.
Воспроизводимость
Воспроизводимость ИФА оценивали по коэффициенту вариации (CV) в пределах одной постановки и между
постановками, проводя повторные исследования 3 образцов сыворотки крови с различной концентрацией
антител. Коэффициент вариации в пределах одной постановки оценивали по 20 определениям,
коэффициент вариации между постановками – по 4 определениям, выполненным в течение 6 разных дней.
Вариабельность в пределах постановки,
n = 20
Сыворотка Среднее значение
CV
крови
(ОЕд/мл )
(%)
1
20
5,1
2
64
4,0
3
78
5,1
Вариабельность между постановками,
n=4х6
Сыворотка
Среднее значение
CV
крови
(ОЕд/мл )
(%)
1
20
7,8
2
70
5,2
3
80
3,1
___________________________________________________________________________________________
_
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG), EUROIMMUN
6
____________________________________________________________________________________________________
Чувствительность и специфичность
21 образец сыворотки крови пациентов, предварительно охарактеризованный как положительный по
наличию аутоантител к внутреннему фактору, и 21 образец сыворотки крови здоровых доноров
исследовали набором EUROIMMUN Anti-Intrinsic Factor ELISA (IgG), а в качестве референсного метода
использовали РИА. Чувствительность и специфичность набора ИФА составила 100% относительно РИА.
n = 42
Анти-Внутренний фактор ИФА
положительные
отрицательные
Anti-Intrinsic Factor RIA
положительные
отрицательные
21
0
0
21
Ожидаемые значения
Уровни антител (IgG) к внутреннему фактору анализировали с помощью набора EUROIMMUN Anti-Intrinsic
Factor ELISA (IgG) на панели сывороток 351 здорового донора крови. При уровне отсечения (значение cutoff) 20 ОЕд/мл все доноры крови были отрицательными на антитела (IgG) к внутреннему фактору.
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Антитела к внутреннему фактору специфичны для злокачественной анемии (ЗА), но не у всех пациентов со
злокачественной анемией в сыворотке крови имеются эти антитела. Аутоантитела типа 1 к внутреннему
фактору обнаруживаются у 70% пациентов с ЗА. Аутоантитела типа 2 к внутреннему фактору выявляют у
35% пациентов с ЗА, но только в комбинации с антителами типа 1 к внутреннему фактору.
Для злокачественной анемии характерен хронический атрофический гастрит и сниженная абсорбция
витамина В12 в подвздошной кишке. Клиническими симптомами являются мегалобластная анемия и часто
неврологические заболевания. Злокачественная анемия – аутоиммунное заболевание: антитела к
внутреннему фактору и к париетальным клеткам желудка вовлечены в патогенез, также важную роль
играют клеточные иммунные механизмы.
Стандартным методом определения аутоантител к париетальным клеткам желудка является непрямая
иммунофлуоресценция с использованием замороженных срезов ткани желудка в качестве субстрата.
Аутоантитела к париетальным клеткам желудка выявляются в сыворотке крови почти при всех случаях
злокачественной анемии, часто при гастритах без анемии, но никогда у здоровых людей.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Anti-Intrinsic Factor-EA 1362-9601G_rus.doc 4/10/2009 3:19:00 PM
Оригинал: EA_1362G_A_UK_C01.doc
Version:01.03.2006
___________________________________________________________________________________________
_
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru