наборы реагентов для пцр - ДНК

 НАБОРЫ
РЕАГЕНТОВ
ДЛЯ ПЦР
Лабораторная диагностика в практике врача-клинициста занимает
одно из ведущих мест и к ней в настоящее время предъявляются
самые высокие требования, такие как:
•
•
•
•
Клиническая значимость исследования;
Высокая аналитическая чувствительностью и специфичность проводимого анализа;
Высокая воспроизводимость полученных результатов;
Высокая скорость проведения анализа.
Возможности современной ПЦР-лаборатории и, в частности, ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, позволяют проводить многофакторные, мультиплексные, количественные исследования, выявляя ДНК различных микроорганизмов в полученных образцах. В диагностике инфекционных заболеваний ПЦР дает возможность определять факт наличия инфекционного агента (качественный анализ), и определять концентрацию ДНК/кДНК в пробе (количественный анализ).
Качественный анализ используется в диагностике безусловных патогенов (таких как гонококки,
хламидии, трихомонады), и его в абсолютном большинстве случаев бывает достаточно, так как
нет ни одного протокола лечения этих инфекций, в котором бы от концентрации инфекционного
агента зависела тактика лечения.
Совсем иная ситуация складывается для условных патогенов – качественный анализ для этой
группы инфекционных агентов недостаточен, так как из самого названия «условный» следует, что
факт их присутствия не означает заболевания, и важно не просто наличие микроорганизма в исследуемом биоматериале, но и его концентрация.
В этом случае целесообразно использовать количественный ПЦР-анализ с детекцией результатов
в режиме реального времени.
В целом ряде случаев необходимо установить диагноз как можно в более короткие сроки для
исключения развития осложнений. К сожалению, такие распространенные методы диагностики
микроорганизмов, как культуральный, требуют нескольких дней для получения результата, а в
случае медленно растущих микроорганизмов (например, микобактерий) этот срок может растягиваться до нескольких месяцев. Кроме того, целый ряд микроорганизмов (таких как анаэробы)
с трудом поддаются культивированию, в результате чего лаборатория может выдавать ложноотрицательные результаты. К тому же, известно, что высеваемость различных микроорганизмов
может зависеть от состава и условий хранения бактериологических сред, что повышает требования к микробиологической лаборатории. Недостатком культурального метода также является
необходимость брать материал строго до начала антибиотикотерапии.
1
Внедрение молекулярно-биологических методов исследований
(в частности, ПЦР) позволяет решить большую часть возникающих
проблем:
• высокая скорость проведения анализа – даже самые сложные многопараметрические
методики занимают менее суток от взятия материала в работу до получения результатов
исследования;
• определение концентрации микроорганизмов в биологическом материале;
• высокая воспроизводимость результатов;
• максимальная чувствительность и специфичность;
• стандартность технологического процесса (от вида биоматериала в небольшой степени
зависит только методика выделения ДНК, все остальные стадии осуществляют абсолютно
одинаково для разных инфекционных агентов);
• возможность проводить диагностику целого ряда инфекционных агентов из одного
образца биологического материала (при использовании других методов может
возникнуть необходимость взятия нескольких соскобов у одного пациента, что
травматично и поэтому крайне нежелательно);
• получение результатов независимо от стадии инфекционного процесса;
• проведение исследования независимо от назначения пациенту антибиотикотерапии
(возможность начать эмпирическое лечение, потом уточнить диагноз);
• возможность проводить генетические исследования, в том числе определять риски
развития соматических патологий (таких как тромбофилия), и переносимость
лекарственных препаратов (например, чувствительность к варфарину).
Комплекты реагентов для выявления возбудителей
инфекционных заболеваний
Инфекции, передаваемые половым путём (ИППП) – наиболее распространённая группа в общей
структуре заболеваемости людей репродуктивного возраста.
Использование лабораторных методов исследования и, в частности,
полимеразной цепной реакции при выявлении ДНК инфекционных
агентов имеет ряд несомненных преимуществ:
•
•
•
•
•
•
выявление всех этиологических агентов заболевания при микст-инфицировании
(мультиплексный анализ);
высокая клиническая значимость при хроническом и бессимптомном течении
заболевания;
меньшая травматичность при взятии биоматериала для исследования;
высокая точность при выявлении инфекционных агентов;
высокая скорость;
экономичность исследования.
ПЦР как метод лабораторной диагностики ИППП в первую очередь может помочь в работе
врачам-дерматовенерологам, акушерам-гинекологам, неонатологам и врачам-инфекционистам.
2
Комплекты реагентов для выявления ИППП, производства
ДНК-Технология:
Хламидия трахоматис (Chlamydia trachomatis)
Микоплазма хоминис (Mycoplasma hominis)
Микоплазма гениталиум (Mycoplasma genitalium)
Уреаплазма (Ureaplasma urealyticum + parvum)
Уреаплазма парвум (Ureaplasma parvum)
Уреаплазма уреалитикум (Ureaplasma urealyticum)
Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis)
Гарднерелла вагиналис (Gardnerella vaginalis)
Нейссерия гонорея (Neisseria gonorrhoeae)
Кандида альбиканс (Candida albicans)
В дополнение к исследованию рекомендуется:
- использование реагентов КВМ для контроля качества преаналитического этапа.
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл)
или в единичных пробирках (0,5 мл или 0,2 мл).
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-РАПИД
ПРОБА-НК
ПРОБА-ГС
Материалом для исследования служат соскобы из урогенитального тракта, соскобы со слизистых, клеточный осадок мочи.
Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8 ºС
Герпесвирусные инфекции
Вирусы, относящиеся к семейству герпесвирусов, широко распространены в природе. В настоящее время известно более 100 герпесвирусов, небольшое количество из них выделены от человека. Герпесвирусы способны пожизненно персистировать в организме человека и вызывать заболевания с многообразными клиническими проявлениями.
Вирус простого герпеса (ВПГ) 1 и 2 типов
ВПГ проникает в организм человека через повреждённые кожные покровы и слизистые оболочки. В первой фазе патогенеза вирус внедряется в клетки эпителия (слизистой полости рта,
глотки или половых органов), где происходит его размножение. На слизистых и коже появляются характерные для герпетической инфекции папулы и везикулы. Вирус простого герпеса
персистирует у мужчин в мочеполовом тракте, а у женщин – в канале шейки матки, влагалище
и уретре. Заражение генитальным герпесом происходит, в основном, при половом контакте. В
период вирусемии у беременных женщин заражение плода происходит гематогенным путем,
во время родов – контактным. При герпетической инфекции в результате вирусемии в процесс
могут вовлекаться несколько органов одновременно. Возможно развитие герпетического эзофагита, пневмонита, гепатита. Поражение периферической нервной системы может протекать
в виде ганглионита, ганглионеврита, радикулоневрита, полинейропатии. Поражение центральной нервной системы при герпетической инфекции наиболее часто протекает в виде энцефалита или менингоэнцефалита.
3
Цитомегаловирусная (ЦМВ) инфекция
Вирус проникает в организм через слюну и через секреты гениталий при половых контактах, через грудное молоко и при использовании нестерильного шприца, при трансплантации органов и
переливании донорской крови, при использовании донорской спермы и яйцеклеток. Кроме того,
заражение цитомегаловирусом может произойти ещё в период внутриутробного развития плода.
Необходимым условием заражения плода является вирусемия беременных.
Вирус Варицелла-Зостер (VZV)
Вирус вызывает два типа поражений - ветряную оспу и опоясывающий лишай. Основные пути
передачи вируса - воздушно-капельный и контактный (через отделяемое везикул). Дети могут заболеть ветряной оспой при тесном контакте с больным опоясывающим лишаем.
Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ)
Единственный резервуар инфекции - человек. Основной путь передачи - воздушно-капельный,
реже трансмиссивный или половой.
В раннем возрасте инфекцию сопровождают стёртые проявления, либо она бывает вообще бессимптомной; первичное инфицирование в подростковом или более старшем возрасте может
вызвать заболевание, известное как инфекционный мононуклеоз. Для пациентов с иммунодефицитами более характерна хроническая ВЭБ инфекция. Наиболее часто хроническая инфекция
проявляется прогрессирующим лимфопролиферативным заболеванием, либо лимфомами ЦНС.
Способность возбудителя вызывать злокачественную трансформацию клеток даёт основание
предполагать участие вируса в развитии болезней злокачественного роста, таких как африканские формы лимфомы Беркитта, карцинома носоглотки у мужчин некоторых этнических групп
Южного Китая, а также саркома Капоши у пациентов со СПИДом.
Вирус герпеса 6 типа (ВГ-6)
Клинические проявления инфекции ВГ-6:
а) В-клеточная лимфома. В 80-90% случаев В-клеточных лимфом в трансформированных
клетках выделяют интегрированные фрагменты ДНК, гомологичные геному вируса, что
даёт основания рассматривать его как возможный этиологический агент.
б) Exanthema subitum (roseola infantum). Розеола детская (внезапная), или ложная краснуха острая вирусная инфекция детей младшего возраста, вызванная ВГ-6.
в) Синдром хронической усталости. Относительно недавно выделен в самостоятельную
нозологическую единицу; основание для установления этиологической роли ВГ-6 - выявление специфических антител в сыворотке пациентов.
Вирус герпеса 8 типа (ВГ-8, HHV8)
ДНК этого вируса постоянно обнаруживается в ткани СПИД-ассоциируемой саркомы Капоши, в
то время как в нормальной ткани соседних участков не выявляется. Было установлено, что HHV8
связан со всеми типами саркомы Капоши, включая эндемическую у африканцев, классическую у
пожилых людей средиземноморья и трансплантат-связанную. Показано, что за 3-10 лет развитию
саркомы Капоши предшествует инфекция, вызванная HHV8.
Лабораторная диагностика герпес вирусов идет несколькими методами: вирусологические
методы обнаружения и идентификации; методы выявления антигенов вирусов простого герпеса - иммунофлюоресцентный и иммуноферментный анализ; полимеразная цепная реакция
(ПЦР); цитоморфологические методы; выявление антител с помощью ИФА; методы оценки иммунного статуса. Материал для исследования берется в зависимости от локализации поражений (содержимое везикул, соскоб клеток, спинномозговая жидкость, аспират из бронхов,
биоптат, кровь).
4
Комплекты реагентов для выявления герпесвирусных инфекций,
производства ДНК-Технология:
Вирус простого герпеса 1,2 (HSV 1,2)
Вирус герпеса человека 6 типа (HHV 6)
Вирус герпеса человека 8 типа (HHV 8)
Вирус варицелла зостер (VZV)
Вирус Эпштейна-Барр (EBV)
Цитомегаловирус (Сytomegalovirus)
В дополнение к исследованию рекомендуется:
- использование реагентов КВМ для контроля качества преаналитического этапа.
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл)
или в единичных пробирках (0,5 мл или 0,2 мл).
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-РАПИД
ПРОБА-НК
ПРОБА-ГС
Материалом для исследования служат соскобы из урогенитального тракта, венозная кровь с ЭДТА,
содержимое пустул, везикул, язв, слюна
Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8ºС
Папилломавирусные инфекции
Одно из основных мест среди злокачественных опухолей репродуктивной системы занимает рак
шейки матки (РШМ). Он занимает второе (после рака молочной железы) место по распространенности, и составляет 14% от всех злокачественных опухолей у женщин. На территории Российской
Федерации отмечается высокий уровень запущенных стадий этого заболевания – более чем 40%
всех выявленных случаев, ежегодно от РШМ умирает более 6 000 женщин. В возрастной группе
16-40 лет РШМ является второй по значимости причиной смертности больных злокачественными
новообразованиями.
На сегодняшний день установлено, что этиологическим агентом РШМ является вирус папилломы
человека (ВПЧ). Показано, что ДНК ВПЧ выявляется более чем в 99.5% всех биоптатов РШМ.
Из более чем 120 известных на сегодня типов ВПЧ около 30 могут инфицировать эпителий урогенитального тракта. По способности вызывать злокачественное перерождение эпителия их делят
на 2 группы – высокого и низкого онкогенного риска.
К группе высокого онкогенного риска относят типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68,
73, 82. При этом тип 16 является наиболее распространенным и выявляется более чем в 50% всех
случаев РШМ в Европе.
К группе папиллом низкоонкогенного риска относят типы 6, 11, 36, 42, 43, 44, 46, 47, 50. Инфекция,
вызванная этими типами, обычно протекает в виде доброкачественных поражений шейки матки
и кондилом.
ВПЧ обычно поражают эпителий зоны трансформации шейки матки, в котором и вызывают предраковые изменения. Считается, что прогресс от инфицирования эпителия до развития РШМ занимает не менее 5 лет (в среднем 10-20 лет), и только в очень редких случаях этот процесс может
происходить за 1-2 года. Поэтому значительное место в профилактике РШМ должны занимать
исследования, позволяющие определить наличие ВПЧ-инфекции и предраковые изменения или
5
рак на ранних стадиях.
Наиболее распространенным исследованием при скрининге на РШМ и предраковые изменения
эпителия является цитологическое. При этом точность этого метода диагностики сильно варьирует в зависимости от методики взятия материала, технологии фиксации и приготовления мазков, а также квалификации исследователя. Считается, что почти треть случаев РШМ выявляется у
женщин, которые регулярно проходили скрининг с помощью цитологического исследования и,
следовательно, у этих пациентов получали ложноотрицательные результаты.
Развитие молекулярной биологии и установление роли ВПЧ в развитии РШМ привели к тому, что
ДНК-диагностика ВПЧ-инфекции рассматривается в настоящее время как основа скрининга и
профилактики этого тяжелого заболевания, и во многих странах накоплен положительный опыт
применения различных методов определения ДНК ВПЧ в скрининговых исследованиях. На основании этого опыта были сформулированы требования к методикам обнаружения ДНК ВПЧ:
- ВПЧ-тест должен выявлять только типы высокого онкогенного риска, не менее 10 генотипов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58) что обеспечивает диагностическую чувствительность теста не менее 95%;
- ВПЧ-тест должен обладать высокой чувствительностью выявления предраковых состояний и высокой специфичностью, не уступающей цитологическому исследованию;
- быть простым и быстрым в исполнении, недорогим, учет результатов должен быть автоматизирован.
Одним из лучших методов детекции для ДНК-диагностики ВПЧ является метод ПЦР в режиме «реального времени», который позволяет быстро провести исследование и получить результат. Кроме того, ПЦР в «реальном времени» позволяет проводить не только скрининг, но и количественное исследование вируса в клетках.
Комплекты реагентов для выявления папилломовирусных инфекций,
производства ДНК-Технология:
Вирус папилломы человека HPV [16, 18]
Вирус папилломы человека высокого онкогенного риска HPV (16,31,35);(33,52,58);(18,39,45,59)
Вирус папилломы человека HPV (16, 31, 33, 35, 35H, 58, 52, 67)
Вирус папилломы человека HPV (18, 45, 39, 59)
Вирус папилломы человека HPV (51,26)
Вирус папилломы человека HPV (6, 11)
В дополнение к исследованию рекомендуется:
- использование реагентов КВМ для контроля качества преаналитического этапа.
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл)
или в единичных пробирках (0,5 мл или 0,2 мл).
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-РАПИД
ПРОБА-НК
ПРОБА-ГС
Материалом для исследования служат соскобы из урогенитального тракта.
Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8ºС
6
Комплекты реагентов для выявления вирусов
гепатитов и ВИЧ
В лабораторной диагностике вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции существует ряд проблем и ситуаций, которые метод ПЦР позволяет разрешить, тем самым давая врачу возможность поставить
своевременный диагноз и начать лечение пациента:
• Наличие «серологического окна» - промежутка между инфицированием и появлением серологических маркеров, который может продолжаться до нескольких месяцев. В это время
результаты ИФА на антитела к вирусным белкам будут закономерно отрицательными, тогда
как ПЦР позволяет получить положительный результат по факту присутствия вируса в крови. После наступления сероконверсии (появления антител к вирусу) количество вируса в
крови может уменьшиться и стать меньше предела обнаружения методом ПЦР. В этом случае исследование методом ИФА будет давать положительный результат, а результат ПЦР будет отрицательным. Таким образом, эти два метода хорошо дополняют друг друга и должны
применяться вместе.
• Неопределенные или ложноположительные результаты ИФА – например, возможны ложноположительные результаты у пациента с аутоиммунными заболеваниями. В этом случае
целесообразно исследовать кровь пациента методом ПЦР.
• Наличие материнских антител у детей, рожденных инфицированными матерями. Так как
материнские антитела класса IgG проникают через гематоплацентарный барьер, то у детей, рожденных такими матерями, в течение длительного времени (до полутора лет после
родов) анализ на антитела будет положительный. При этом доказать факт наличия или отсутствия вируса в организме ребенка можно только с помощью прямых методов детекции
вируса, к которым и относится ПЦР.
• Выбор тактики лабораторного исследования и назначения схемы терапии – тактика лечения и дальнейшего ведения пациента с вирусным гепатитом С зависит от генотипа вируса.
• Выбор момента назначения терапии – для ВИЧ-инфекции назначение HAART зависит от
концентрации CD4+ и вирусной нагрузки.
• Мониторинг эффективности проводимой противовирусной терапии. Для терапии вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции разработан ряд фармакологических препаратов. Для того,
чтобы подобрать адекватные схемы их применения, необходимо определять их эффективность у конкретного пациента, и основным лабораторным критерием является количественное определение содержания вируса в крови (определение вирусной нагрузки) методом ПЦР в «реальном времени».
Исходя из решаемых задач, исследование методом ПЦР эффективно в работе врачейинфекционистов, гепатологов, для специалистов службы по борьбе и профилактике ВИЧинфекции.
7
Комплекты реагентов для выявления вирусов гепатитов и ВИЧ,
производства ДНК-Технология:
Вирус гепатита B (HBV)
Вирус гепатита А (HАV)
Вирус гепатита С (HCV)
Вирус гепатита D (HDV)
Вирус гепатита G (HGV)
Генотипирование HCV
Вирус иммунодефицита человека, ВИЧ (HIV)
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл)
или в единичных пробирках (0,5 мл или 0,2 мл).
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-НК
ПРОБА-ГС
Материалом для исследования служит венозная кровь с ЭДТА.
Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8ºС, отдельные части (Taq-полимераза) при минус 20 ºС.
Исследование биоценоза урогенитального тракта
Фемофлор®.
Набор реагентов для исследования
биоценоза урогенитального тракта у
женщин методом ПЦР в режиме
реального времени.
Вагинальный биоценоз представляет собой сложную
динамическую систему, на которую в каждый отдельный момент времени влияет множество эндогенных
и экзогенных факторов. Наиболее значимыми факторами являются возраст, репродуктивное поведение и
акушерско-гинекологический анамнез, гормональный
статус и его нарушения, использование заместительной гормональной терапии и комбинированных оральных контрацептивов, антибиотикотерапия, наличие
экстрагенитальной патологии. Состояние вагинального биоценоза оказывает серьезное влияние
на поддержание репродуктивной функции и, как следствие, на качество жизни женщины. Набор реагентов Фемофлор предназначен для выявления ДНК условно-патогенных микроорганизмов, ДНК лактобактерий и геномной ДНК человека (в качестве контроля взятия биологического материала). Данный анализ позволяет выявить этиологию инфекционного процесса, вызванного условно-патогенной флорой, определить объем назначаемой терапии и оценить ее
эффективность, что актуально при назначении лечения гинекологическим больным, в ходе прегравидарной подготовки, перед проведением хирургических вмешательств на органах малого
таза, при подготовке к ЭКО.
8
Состав комплекта реагентов для исследования биоценоза
урогенитального тракта женщин Фемофлор®.
Группа
Контроль
Специфические компоненты
комплекта реагентов
Фемофлор 4
(4 пробирки)
Фемофлор 8
(1 стрип)
Фемофлор 16
(2 стрипа)
Положительный контроль
√
√
√
Контроль взятия материала
√
√
√
Общая бактериальная масса
√
√
√
Нормофлора – Lactobacillus spp. /ВК
√
√
√
√
√
√
√
Enterobacterium spp. Аэробные
микроорганизмы
(факультативные Streptococcus spp.
анаэробы)
Staphylococcus spp.
√
Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/
Porphyromonas spp.
√
Eubacterium spp.
√
√
√
√
Sneathia spp./Leptotrihia spp./
Fusobacterium spp.
√
Анаэробные
микроорганизмы Megasphaera spp./Veillonella spp./
(строгие
Dialister spp.
анаэробы)
Lachnobacterium spp./ Clostridium spp.
√
Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
√
Peptostreptococcus spp.
√
Atopobium vaginae
√
Группа
Микоплазм
√
Mycoplasma hominis
√
√
Mycoplasma genitalium
√
√
Ureaplasma (urealyticum + parvum)
Грибы
Candida spp.
√
√
√
√
* - под spp. подразумевается широкая группа микроорганизмов, которая относится к данному роду, но может не соответствовать
полностью роду в его систематическом понимании.
Из одной биопробы методом ПЦР в «реальном времени» выполняется количественная оценка общей бактериальной массы, урогенитальной нормофлоры (лактобациллы) и комплекса аэробных
и анаэробных микроорганизмов, микоплазм, грибов рода Candida, участвующих в развитии дисбиотических процессов в урогенитальном биоценозе.
• Сравнение количества лактобацилл с общим количеством бактерий позволяет оценить
выраженность нарушений уровня нормофлоры.
• Сравнение количества представителей условно-патогенной биоты с количеством лактобацилл позволяет определить этиологическую значимость тех или иных микроорганизмов в развитии дисбиоза и степень его выраженности.
9
• Количественное определение геномной ДНК эпителиальных клеток человека в биопробе
обеспечивает контроль качества преаналитического этапа, исключает получение ложноотрицательных результатов исследования.
• Использование предлагаемого способа диагностики не только дает возможность врачуклиницисту определить объем необходимого вмешательства, но и позволяет определить
этиологическую направленность терапии.
• Индивидуальный подход к терапии позволит уменьшить число побочных эффектов для
пациентов в результате избыточного приема лекарственных препаратов.
• Впервые можно выполнять мониторинг действия лекарственных средств на микробиоту, включая оценку эффективности лечения и восстановления нормоценоза.
Данный анализ эффективен для контроля показателей состояния
микробиоценоза урогенитального тракта:
• количественного исследования общей обсемененности урогенитального тракта (ОБМ),
• исследования нормофлоры (лактобактерий);
• исследования широкого спектра факультативно и облигатно-анаэробных микроорганизмов,
значимых для развития дисбиотических нарушений микрофлоры урогенитального тракта;
• количественного исследования микоплазм, уреаплазм и дрожжеподобных грибов.
Для удобства трактовки результатов в таблице используются
цветовые маркеры в виде окрашенных квадратиков. В зависимости
от измеряемого параметра маркеры обозначают следующее:
1. Контроль взятия материала:
n количество клеток человеческого эпителия в исследуемом образце более 104
n количество клеток человеческого эпителия в исследуемом образце менее 104.
Количественные соотношения между исследуемыми группами микроорганизмов могут отличаться от истинного соотношения этих групп в «микробной пленке»
2. ОБМ
n ОБМ менее 10 5,5 . Общая бактериальная обсемененность влагалища низкая.
Количественное соотношение различных микроорганизмов может определяться в этом случае с
большой погрешностью.
n ОБМ более 10 5,5 . Общая бактериальная обсемененность достаточна для проведения
относительного анализа.
3. Нормофлора
n нормоценоз (доля лактобактерий относительно общей бактериальной массы более 80%)
n умеренный дисбиоз (доля лактобактерий от 20 до 80%)
n выраженный дисбиоз (доля лактобактерий относительно общей бактериальной массы менее 20%)
4. Факультативно- и облигатно-анаэробные микроорганизмы
n доля микроорганизма менее 1%
n доля микроорганизма от 1% до 10%
n доля микроорганизма более 10%
5. Микоплазмы
n микроорганизм не обнаружен
n микроорганизм обнаружен в количестве менее 104 ГЭ/образец
n микроорганизм обнаружен в количестве более 104 ГЭ/образец
6. Дрожжеподобные грибы
n количество грибов ниже порога чувствительности метода (103 ГЭ/образец)
n количество грибов находится в диапазоне 103-104 ГЭ/образец
n количество грибов более 104 ГЭ/образец
10
Рис. Бланк выдачи результатов Фемофлор®
№
1
РЕЗУЛЬТАТЫ
Название исследования
Абсолютный
Контроль взятия материала
10
Бакмасса
10 5,9
Относительный Lg (X/БМ)
<-->
1
-- [x]
4,4
нормо флора
2
Лактобактерии
10 5,9
факультативно-анаэробные микроорганизмы
3
Enterobacterium_spp.
не выявлено
4
Streptococcus_spp.
не выявлено
5
Staphylococcos_spp.
не выявлено
ОБЛИГАТНО-АНАЭРОБНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
6
Gard/Pre/Porph
не выявлено
7
Eubacterium_spp.
не выявлено
8
Sne/Lept/Fuso
не выявлено
9
Mega/Veil/Dial
не выявлено
10
Lachno/Clost
не выявлено
11
Mobi/Coryne
не выявлено
12
Peptostrept
не выявлено
13
Atopobium_vaginae
не выявлено
ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ГРИБЫ
14
Candida_spp.*
10 4,6
15
Myc.hominis*
не выявлено
16
Myc.genitalium**
не выявлено
17
Ureaplasma_spp.*
10 3,7
4,6 (4-6%)
МИКОПЛАЗЫ
* - Абсолютный анализ Lg (X)
№
1
** - Качественный анализ
Название исследования
Lg (X)
Бакмасса
5,9
нормо флора
2
3,7 (0,5-0,7%)
Лактобактерии
5,9
факультативно-анаэробные микроорганизмы
3
Enterobacterium_spp.
не выявлено
4
Streptococcus_spp.
не выявлено
5
Staphylococcos_spp.
не выявлено
ОБЛИГАТНО-АНАЭРОБНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
6
Gard/Pre/Porph
не выявлено
7
Eubacterium_spp.
не выявлено
8
Sne/Lept/Fuso
не выявлено
9
Mega/Veil/Dial
не выявлено
10
Lachno/Clost
не выявлено
11
Mobi/Coryne
не выявлено
12
Peptostrept
не выявлено
13
Atopobium_vaginae
не выявлено
ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ГРИБЫ
14
Candida_spp.*
4,6
15
Myc.hominis*
не выявлено
16
Myc.genitalium**
не выявлено
17
Ureaplasma_spp.*
3,7
МИКОПЛАЗЫ
11
1.0%
В дополнение к исследованию рекомендуется:
- использование метода световой микроскопии для лабораторного подтверждения местной воспалительной реакции.
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл):
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-НК-ПЛЮС (для Фемофлор®, с дополнительным буфером для растворения)
ПРОБА-ГС-ПЛЮС (для Фемофлор®, с дополнительным буфером для растворения)
Материалом для исследования служат соскобы из урогенитального тракта.
Срок хранения набора реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8ºС
Фемофлор® Скрин
Набор реагентов для скринингового исследования
микрофлоры урогенитального тракта у женщин
методом ПЦР в режиме реального времени
Фемофлор® Скрин позволяет выявлять безусловно-патогенные микроорганизмы (простейшие,
вирусы и бактерии), колонизирующие урогенитальный тракт, а также давать количественную
оценку общей бактериальной массы, лактобактерий, основных анаэробных микроорганизмов,
микоплазм и дрожжеподобных грибов, значимых для развития дисбиотических процессов различной степени тяжести.
Данный анализ эффективен для контроля основных показателей
состояния микробиоценоза урогенитального тракта:
•
•
•
•
Выявления основных патогенных микроорганизмов,
Исследования дисбиотических нарушений микрофлоры,
Оценки общей бактериальной обсемененности,
Количественной оценки микоплазм, уреаплазм и дрожжеподобных грибов.
Для врача предлагаемый подход – это:
• Оценка 14 показателей, необходимых для скринингового лабораторного обследования
урогенитального тракта:
• Выявление 7 безусловных патогенов (бактерии, вирусы и простейшие)
• Количественное исследование общей обсемененности, нормофлоры и основных
условно-патогенных микроорганизмов
• Определение этиологии инфекционного процесса
• Возможность определения объема назначаемой терапии
• Возможность проведения динамических наблюдений
• Контроль излеченности
• Контроль восстановления нормофлоры влагалища
• Высокая скорость получения результатов - возможность оперативно назначить лечение
• Контроль качества взятия материала – контроль адекватности получаемых результатов
Для лаборатории скрининговое исследование микрофлоры
урогенитального тракта методом ПЦР в режиме реального времени
Фемофлор® Скрин – это:
• Самые современные методы диагностики
• Мультиплексный анализ
• Исключение ошибок преаналитического этапа (контроль взятия материала)
12
• Простота работы лаборатории и быстрое проведение анализа
(при использовании ДТ-96, DTprime, DTlite полный цикл анализа 12 образцов по 14 показателям проходит за 3 часа)
• Программное обеспечение, облегчающее работу врача лаборанта:
• Отчет о проведенном исследовании выдается программой
в доступной для анализа врача-клинициста форме
• Готовый файл загрузки с программой амплификации можно автоматически загрузить в программу прибора, что существенно экономит время и исключает ошибки ручного
программирования прибора
• Возможность детекции положения стрипа в термоблоке и
автоматический пересчет результатов исследования, исключающий ошибки оператора
Для пациента Фемофлор® Скрин – это:
• Информативная диагностика за 1 визит к врачу
• Анализ 14 показателей, необходимых для диагностики состояния урогенитального тракта, из 1 образца биологического материала
• Одновременное выявление 7 безусловно-патогенных микроорганизмов
• Лабораторная диагностика основных параметров, описывающих состояние нормофлоры и условно-патогенных микроорганизмов
• Индивидуально подобранная терапия
• Возможность контролировать проведенное лечение и восстановление нормальной флоры
урогенитального тракта
Состав набора реагентов (1 стрип)
1.
Общая бактериальная масса/ВК
2.
нормофлора – Lactobacillus spp. /ВК
3.
Gardnerella vaginalis/ Prevotella bivia /Porphyromonas spp./ВК
4.
Ureaplasma (urealyticum + parvum)/ВК
5.
Candida spp./КВМ
6.
Mycoplasma hominis/Mycoplasma genitalium/ВК
7.
Trichomonas vaginalis/ Neisseria gonorrhoeae/ Chlamydia trachomatis/ВК
8.
Herpes symplex virus 2/ Сytomegalovirus/ Herpes symplex virus 1/ВК
В дополнение к исследованию рекомендуется:
- использование метода световой микроскопии для лабораторного подтверждения местной воспалительной реакции.
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл):
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-НК-ПЛЮС (для Фемофлор®, с дополнительным буфером для растворения)
ПРОБА-ГС-ПЛЮС (для Фемофлор®, с дополнительным буфером для растворения)
Материалом для исследования служат соскобы из урогенитального тракта
Срок хранения набора реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8ºС
13
Рис. Бланки выдачи результатов Фемофлор® Скрин
№
Название исследования
1
Контроль взятия материала
Бакмасса
2
Лактобактерии
Абсолютный
10 5,6
10 7,3
нормо флора
10 7,2
РЕЗУЛЬТАТЫ
Относительный Lg (X/БМ)
<- ->
-0,1 (65-87%)
- - х [-]
ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ГРИБЫ
3
Candida_spp.*
не выявлено
МИКОПЛАЗЫ
4
Myc.hominis*
не выявлено
5
Myc.genitalium**
не выявлено
6
Ureaplasma_spp.*
10 5,2
5,2 (0,6-0,8%)
ОБЛИГАТНО-АНАЭРОБНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
7
Gard/Pre/Porph
10 3,4
-3,9 (<0,1%)
[ - х- ] - -
патоген
8
9
10
11
12
13
T.vaginalis **
N.gonorrhoeae **
C.trachornatis **
HSV-2 **
CMV **
HSV-1 **
не выявлено
не выявлено
не выявлено
не выявлено
не выявлено
не выявлено
* – Абсолютный анализ Lg (X)
** – Качественный анализ
№
1
Название исследования
Lg (X)
Бакмасса
1.0%
7,3
нормо флора
2
Лактобактерии
7,2
ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ГРИБЫ
3
Candida_spp.*
не выявлено
МИКОПЛАЗЫ
4
Myc.hominis*
не выявлено
5
Myc.genitalium**
не выявлено
6
Ureaplasma_spp.*
5,2
ОБЛИГАТНО-АНАЭРОБНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
6
Gard/Pre/Porph
Исследование выполнил: 3,4
14
Дата: Подпись:
№
1
Название исследования
Результат
Контроль взятия материала
10 4,7
Бакмасса
10 6,8
Lg (X/ВМ)
<- ->
-0,6 (21-28%)
- - х [-]
нормо флора
2
Лактобактерии
10 6,2
АНАЭРОБНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
3
Gard/Pre/Porph
-0,4 (32-43%)
10 6,4
[---]х-
МИКОПЛАЗЫ
4
M.hominis*
не выявлено
патогены
5
M.genitalium**
ОБНАРУЖЕНО
МИКРОПЛАЗМА
6
Ureaplasma_spp.*
2,4 (<0,1%)
10 2,4
ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ГРИБЫ
7
Candida_spp.*
-2,8 (0,2%)
10 4,0
[ - х- ] - -
патогенЫ
8
Trich **
не выявлено
9
Ngon **
не выявлено
10 Chl **
не выявлено
11 HSV-2 **
не выявлено
12 CMV **
ОБНАРУЖЕНО
13 HSV-2 **
не выявлено
* - Абсолютный анализ Lg (X)
** - Качественный анализ
№
1
Название исследования
Lg (X)
Бакмасса
1.0%
6.6
нормо флора
2
Лактобактерии
6.2
АНАЭРОБНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
3
Gard/Pre/Porph
6.4
МИКОПЛАЗЫ
4
M.hominis*
не выявлено
МИКОПЛАЗЫ
5
Ureaplasma_spp.*
2,4
ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ГРИБЫ
6
Candida_spp.*
Исследование выполнил: 4,0
15
Дата: Подпись:
Наборы реагентов исследования биоценоза, производства
ДНК-Технология:
Набор реагентов для исследования биоценоза Фемофлор 4
Набор реагентов для исследования биоценоза Фемофлор 8
Набор реагентов для исследования биоценоза Фемофлор 16
Набор для скринингового исследования микрофлоры урогенитального тракта у женщин
Фемофлор-СКРИН
ПРОЧИЕ ИНФЕКЦИИ
Метод ПЦР получил широкое распространения в диагностике различных инфекций: это кишечные инфекции, туберкулез, инфекции верхних дыхательных путей и многие другие. Диагностика кишечных инфекций
Одной из актуальных проблем в диагностике кишечных инфекций существующими методами (посев на питательные среды, ИФА диагностика) является верификация возбудителя заболевания.
Этиологический спектр кишечных инфекций чрезвычайно широк и охватывает микробные, вирусные, протозойные, грибковые инвазии и их сочетания (микст-инфекции). При этом их клинические проявления характеризуются неспецифичностью, что не позволяет врачу только на основе
симптомов заболевания определить возбудитель инфекции. Все это понятным образом существенно ограничивает истинную оценку эпидемиологии кишечных дисбактериозов.
Исследования методом ПЦР позволяют с высокой точностью выявить патогены (вирусы, простейшие, анаэробы), которые не выделяются обычными бактериологическими способами, а также
определить микробные инвазии на фоне начальной антибиотикотерапии или в случае развития
химиорезистентности.
Диагностика туберкулеза
В настоящее время первичное лабораторное исследование материала на выявление микобактерии туберкулеза проводится в учреждениях общей лечебной сети путем прямой микроскопии.
Наиболее эффективное культуральное исследование проводится только в бактериологических
лабораториях противотуберкулезных учреждений областных и крупных районных центров. Использование ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени позволит проводить высокочувствительное исследование как в специализированном, так и в обще лечебном учреждении уже на первичном этапе.
В диагностике дифтерии применение ПЦР позволяет получить результат в течение су-
ток, при этом сразу определить токсигенность штаммов микроорганизма независимо от начала
антибиотикотерапии.
Зачастую по клинической картине однозначно поставить диагноз невозможно, поэтому особое
значение приобретает лабораторная диагностика, которая и позволяет установить этиологию инфекционного процесса.
ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний может помочь врачам-инфекционистам, фтизиатрам, педиатрам.
16
Комплекты реагентов для выявления прочих инфекций, производства ДНК-Технология:
Микобактерии туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis – Mycobacterium bovis complex)
Хламидия пневмонии (Chlamydia pneumonia)
Микобактерия туберкулеза (M. tuberculosis)
Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis)
Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori)
Токсигенные штаммы коринебактерии дифтерии
Гемолитический стрептококк (Streptococcus pyogenes)
Токсоплазма гондии (Toxoplasma gondii)
Вирус Эпштейна-Барр (EBV)
Легионелла пневмофила (Legionella pneumophila)
Листерия моноцитогенес (Listeria monocytogenes) Вирус варицелла зостер (VZV)
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл)
или в единичных пробирках (0,5 мл или 0,2 мл).
Для выделения ДНК в зависимости от целей лаборатории и используемого биоматериала рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНКТехнология»:
ПРОБА-РАПИД
ПРОБА-НК
ПРОБА-ГС
Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8 ºС
Особо опасные и природно-очаговые инфекции
Особо опасные инфекции – группа инфекционных заболеваний, представляющих исключительную эпидемическую опасность. Выявление случаев заболевания особо опасными инфекциями
влечёт комплекс мероприятий, направленных на предупреждение дальнейшего распространения болезни. Борьба с ООИ – одна из основных задач Всемирной Организации Здравоохранения.
Поэтому такие инфекции нуждаются в быстрой и точной диагностике, которая позволит установить причину заболевания и начать противоэпидемические мероприятия. Комплекты реагентов для выявления особо опасных и природноочаговых инфекций, производства ДНК-Технология:
Боррелия бургдорфери (Borrelia burgdorferi)
Токсигенные штаммы холерного вибриона (Vibrio cholerae)
Сибирская язва (Bacillus anthracis)
Чума (Yersinia pestis)
Туляремия (Francisella tularensis)
Вирус гриппа А штамм Н5N1 (птичий грипп)
17
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл)
или в единичных пробирках (0,5 мл или 0,2 мл).
Для выделения ДНК в зависимости от целей лаборатории и используемого биоматериала рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНКТехнология»:
ПРОБА-РАПИД
ПРОБА-НК
ПРОБА-ГС
Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8 ºС
Комплекты реагентов для выявления ГМИ
В Российской Федерации в настоящий момент создана и функционирует законодательная и
нормативно-методическая база, регулирующая производство, ввоз из-за рубежа и оборот пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников (ГМИ). Обеспечение безопасности продуктов питания, производимых с использованием ГМИ, безопасности экологической системы от проникновения чужеродных биологических видов, прогнозирование генетических аспектов биологической безопасности и создание системы государственного
контроля над оборотом генетически модифицированных материалов является одной из основных задач в области предупреждения чрезвычайных ситуаций в результате воздействия биологических факторов.
В соответствии с санитарными правилами, утвержденными главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, пороговый уровень по содержанию ГМИ в продуктах, подлежащих маркировке, устанавливается на уровне 0,9%. По состоянию на сентябрь 2005 года в
Российской Федерации разрешены для реализации населению и использованию в пищевой промышленности 13 сортов и линий генетически модифицированных источников растительного
происхождения.
Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые.
Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения» устанавливает метод идентификации ГМИ растительного происхождения, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими праймерами (на промотор 35S
и терминатор NOS). Мы рекомендуем следующую схему тестирования пищевых
продуктов на содержание ГМИ:
1. Для этапа скрининга предлагается ПЦР тест-система «ФЛАНК-ГЕН», позволяющая одновременно определять наличие в тестируемом образце промотора 35S и/или терминатора NOS.
Промотор 35S и /или терминатор NOS присутствуют во всех зарегистрированных в РФ линиях
трансгенной сои, кукурузы, риса, а также в сортах трансгенного картофеля.
2. В случае обнаружения с помощью тест-системы «ФЛАНК-ГЕН» в тестируемом образце промотора 35S и/или терминатора NOS требуется дополнительное исследование данного пищевого
продукта. Для тестирования таких образцов предлагаются тест-системы «СКАН-КУКУРУЗА» и
«СКАН-СОЯ», позволяющие установить видовую принадлежность растения, продукты переработки которого содержатся в образце и перейти к этапу количественного анализа. Тест-системы
«СКАН-КУКУРУЗА» и «СКАН-СОЯ» могут применяться независимо от тест-системы «ФЛАНКГЕН» в случаях необходимости установления видовой принадлежности растения, продукты
переработки которого содержатся в пищевом продукте.
18
Рис 1. Рекомендуемая схема тестирования пищевых продуктов на содержание ГМИ
Для этапа количественного определения выпущены в продажу комплекты «КВАНТУМ-П СОЯ» и
«КВАНТУМ-П КУКУРУЗА», позволяющие определять содержание ДНК промотора 35S относительно общей геномной ДНК сои (кукурузы). Комплект «КВАНТУМ-П СОЯ» применяется для образцов
пищевых продуктов, положительных по результатам тест-систем «ФЛАНК-ГЕН» и «СКАН-СОЯ».
Комплект «КВАНТУМ-П КУКУРУЗА» применяется для образцов пищевых продуктов, положительных по результатам тест-систем «ФЛАНК-ГЕН» и «СКАН-КУКУРУЗА». Комплекты реагентов для выявления ГМИ, производства
ДНК-Технология:
СКАН-Соя
СКАН-Кукуруза
Фланк-Ген (промотор 35S и терминатор NOS)
Промотор – ГМ Кукуруза (Промотор 35S)
Промотор – ГМ Соя (Промотор 35S)
Терминатор – ГМ Соя (Терминатор NOS)
Терминатор – ГМ Кукуруза (Терминатор NOS)
Терминатор – ГМ Картофель (Терминатор NOS)
Кукуруза линии MON 810
Квантум П – Соя (Промотор 35S)
Квантум П – Кукуруза (Промотор 35S)
19
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл)
или в единичных пробирках (0,5 мл или 0,2 мл).
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-ЦТАБ
Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8 ºС
Генетика человека
HLA
HLA (от Human Leukocyte Antigens) – комплекс генов, компактно расположенный на 6-ой хромосоме человека. На сегодняшний день установлено, что гены HLA являются, наряду с другими, генами
иммунного ответа человека.
Главная функция белков «классических» генов HLA – «представление» клеткам иммунной системы
как собственных, так и чужеродных фрагментов белка для запуска иммунного ответа. «Классические» гены HLA бывают I (A,B,C) и II класса (DRB1, DQA1, DQB1, DPB1).
HLA-типирование I класса можно проводить двумя методами: при помощи микролимфоцитоксического теста специфическими анти-HLA сыворотками и различными методами на основе ПЦР, HLA-типирование II класса – только методами на основе ПЦР
HLA-типирование широко применяется в следующих областях медицины: определение тканевой
совместимости донора и реципиента при трансплантации органов и тканей, дифференциальная
диагностика и прогноз развития аутоиммунных заболеваний, диагностика причин репродуктивных нарушений неясной этиологии.
Для диагностических целей наиболее часто используют HLA-типирование гена DRB1 на уровне
«низкого» разрешения или на уровне 13 групп аллелей. В некоторых случаях необходимо также
типирование генов HLA DQA1 и DQB1. В подавляющем большинстве случаев необходимый уровень типирования – группы аллелей: для гена DQA1 – 8 групп, для гена DQB1 – 12 групп.
Трансплантация органов и тканей
Генотипирование по локусу DRB1 на уровне групп аллелей (низкое разрешение) используется
для подбора тканесовместимых донора и реципиента при первичных трансплантациях органов, например, почек. Показано, что такой уровень генотипирования является достаточным
для обеспечения подбора тканесовместимого донора при первичной трансплантации почки
на уровне, соответствующей передовым трансплантологическим центрам мира.
Генотипирование по локусам DRB1, DQB1 на уровне групп аллелей используется для подбора потенциального донора при родственных пересадках гемопоэтических стволовых клеток,
а также для первичного скрининга потенциального донора при неродственных пересадках гемопоэтических стволовых клеток.
Аутоиммунные патологии
Риск развития сахарного диабета 1 типа, одного из наиболее тяжелых аутоиммунных заболеваний, в 10 раз выше при определении в генотипе любых двух вариантов из числа следующих:
DRB1*01, *03, *04, *08, *09, *10. Учитывая многочисленные данные мировой литературы, можно
распространить этот вывод сделанный при изучении HLA ассоциаций с сахарным диабетом 1
типа, на все аутоиммунные заболевания.
20
Репродуктивные проблемы
Различие супругов по вариантам генов HLA является одним из важных условий успешного на
ступления и вынашивания беременности. Сходство супругов между собой по вариантам генов
HLA ведет к увеличению вероятности появления зародыша с двойным набором одинаковых
вариантов генов, то есть HLA-гомозигот, что является неблагоприятным фактором, следствием
чего могут быть репродуктивные потери. Поэтому для диагностики причин репродуктивных
неудач используют HLA-типирование супругов для установления сходства между ними по вариантам генов HLA.
Комплекты реагентов предназначены для генотипирования HLA по II
классу HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 методом полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме «реального времени».
В состав набора реагентов входят:
- комплект реагентов для выделения ДНК из образцов крови;
- комплект реагентов для ПЦР-амплификации.
Характеристики комплектов реагентов:
Комплект для генотипирования по HLA-DRB1 позволяет определить 13 специфичностей на уровне групп аллелей (16 пробирок на 1 пациента, включая КВМ).
Комплект для генотипирования по HLA-DQA1 позволяет определить 8 специфичностей на уровне
групп аллелей (4 пробирки на 1 пациента).
Комплект для генотипирование по HLA-DQB1 позволяет определить 12 специфичностей на уровне групп аллелей (6 пробирок на 1 пациента).
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ
Наиболее актуальным направлением использования ПЦР в настоящее время является изучение
генетики человека, а именно – предрасположенностей к различным заболеваниям. По различным оценкам в геноме человека от 3 до 10 миллионов SNP. Точечные нуклеотидные полиморфизмы, также как более крупные генетические повреждения (делеции, хромосомные аберрации)
являются фактором риска развития многих заболеваний и обуславливают эффективность метаболизма различных веществ. Особенностью данных генетических перестроек является то, что они
могут долгое время никак себя не проявлять, а спусковым механизмом могут стать особенности
питания, беременность, прием лекарств, образ жизни и другие факторы. Очевидно, что генетическая паспортизация имеет колоссальное значение не только для популяционных исследований,
но и для практической медицины. Однако следует помнить, что наличие тех или иных полиморфизмов в геноме человека не равносильно диагнозу, а говорит всего лишь о предрасположенностях к тому или иному заболеванию. Основой для клинически значимых исследований в случае изучения генетических полиморфизмов человека служит формирование пакетных исследований.
Принцип формирования пакетных исследований изложен в таблице. Также рекомендованы дополнительные лабораторные исследования для оценки текущего состояния пациента. 21
КардиоГенетика
Тромбофилия
КардиоГенетика
Гипертония
Генетика
Метаболизма
Фолатов
Проблемы
беременности
и патологии плода
√
√
√
ИБС
√
√
√
√
√
Нарушения
мозгового
кровообращения
Артериальная
гипертензия
Кровотечения
Тромбозы и
тромбоэмболии
Применение
ОК и ГЗТ
Рак молочной
железы и яичников
√
ФармакоГенетика
Варфарина
Онко
Генетика
BRCA
√
√
√
√
√
√
ФармакоГенетика
Варфарина
√
√
Показаниями к генетическому тестированию служат:
•
•
•
•
принадлежность к группе риска
семейный характер заболевания
атипичное/ранее начало
толерантность к терапии
Преимущества определения генетических полиморфизмов методом
ПЦР в режиме реального времени:
• Технологичность (стандартные методики ПЦР с детекцией результатов в режиме реального
времени)
• Высокая скорость • Автоматическая выдача результатов (для ДТ-96, DTprime, DTlite)
• Низкая стоимость анализа
КардиоГенетика. Набор реагентов для определения
генетических полиморфизмов, ассоциированных с
риском развития заболеваний сердечно-сосудистой
системы, методом ПЦР в режиме реального времени
Набор реагентов КардиоГенетика состоит из двух комплектов: КардиоГенетика Гипертония и КардиоГенетика Тромбофилия.
КардиоГенетика Гипертония. Комплект реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития артериальной гипертензии, методом ПЦР в
режиме реального времени.
Не смотря на то, что во всем мире ведется активное изучение артериальной гипертензии (АГ), ее
причины до сих пор не установлены и в настоящее время считается, что это заболевание многофакторное. В структуре причин АГ большое значение имеет наследственная предрасположенность,
22
доказано повышение тонуса мелких артерий в ответ на длительное психоэмоциональное напряжение, ожирение практически всегда сопровождается повышением артериального давления.
Выделяют три степени АГ. За нормальное артериальное давление принят уровень ниже 130/85 мм
рт ст. Уровень артериального давления 130-139/85-89 считается повышенным нормальным.
1 степень АГ: 140-159/90-99
2 степень АГ: 160-179/100-109
3 степень АГ: более 180/110
Диагноз артериальной гипертензии ставится при обнаружении артериального давления выше
140/90 мм рт ст. не менее двух раз при повторных визитах к врачу. Артериальное давление измеряется в положении сидя. У пожилых рекомендуется измерение АД и в положении стоя. Приборы
для измерения давления в медицинских учреждениях всегда проверяются и калибруются. Необходимо делать это периодически и с домашними измерителями АД.
Кроме степени АГ в диагнозе указывается еще степень риска. При определении степени риска
учитывается множество факторов: пол, возраст, генетическая предрасположенность (наличие АГ
у родственников), количество холестерина в крови, наличие ожирения, курение, малоподвижный
образ жизни, поражение органов мишеней. Органами-мишенями называются те органы, которые
при артериальной гипертензии страдают в первую очередь. Это сердце, головной мозг, почки,
сетчатка глаза и сосуды.
В зависимости от наличия этих факторов риск бывает 1, 2 или 3 степени:
1степень риска (низкий риск) означает, что вероятность сердечно-сосудистых осложнений у
этого пациента составляет менее 15% в течение ближайших 10 лет
2 степень риска (средний риск) предполагает вероятность осложнений 15-20% в течение 10 лет
3 степень риска (высокий риск) – 20-30%
4 степень риска (очень высокий риск) предполагает вероятность осложнений более 30% в
течение ближайших 10 лет
Технические характеристики и состав комплекта реагентов:
Количество тестов в комплекте
Формат реагентов
Смеси для амплификации
ADD1: G>T
AGT: 704 T>C
AGT: 521С>T
AGTR1: 1166 A>C
AGTR2: 1675 G>A
CYP11B2: -344 C>T
GNB3: 825 C>Т
NOS3: -786 T>C
NOS3: 894 G>T ПЦР-буфер
Полимераза Taq АТ
Масло минеральное
Материал для анализа
Срок годности
Температура хранения
48 тестов
Нераскапанный
Состав комплекта:
КардиоГенетика Гипертония
8 пробирок (по 960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл
1 пробирка (960 мкл)
1 флакон (4,32 мл)
1 пробирка (216 мкл)
1 флакон (8,64 мл)
Кровь с ЭДТА
6 месяцев
+2 - +8 0С (полимераза Taq АТ - минус 20 0С)
23
КардиоГенетика Тромбофилия. Комплект реагентов
для определения генетических полиморфизмов,
ассоциированных с риском развития тромбофилии,
методом ПЦР в режиме реального времени.
Физиологический гемостаз можно представить в виде весов: при нарушении баланса между тромбогенными факторами и защитными реакциями возникает патологическое внутрисосудистое тромбообразование. Существует несколько причин такого дисбаланса, и «отправными точками» могут служить
генетически обусловленные изменения: мутации в генах V коагуляционного фактора (проакселерина) и
II фактора (протромбина), увеличение продукции ингибитора активатора плазминогена, а также дефицит протеинов C и S, антитромбина III и др.
Стоит отметить, что конкретные полиморфизмы вносят различный вклад в развитие патологических
состояний. Наибольшее значение имеют мутации в генах F2 и F5. Дефект V коагуляционного фактора
(Лейденовская мутация) передается по аутосомно-доминантному типу наследования. В результате мутации V фактор становится резистентным к воздействию активированного протеина C, что приводит
к неконтролируемому тромбообразованию в венозном и артериальном русле, зонах микроциркуляции, и в том числе в сосудах плаценты. Дефект II фактора свертывания также передается по аутосомнодоминантному типу наследования и является фактором высокого риска тромбообразования. Влияние
других генетических факторов менее выражено, однако сочетание нескольких полиморфизмов существенно увеличивает риск развития тромбофилических состояний.
Для оценки риска возникновения нарушений системы свертывания крови учитывается наличие всех
прокоагулянтных полиморфизмов, так как их сочетанное влияние может в несколько раз увеличивать
риск возникновения осложнений. Только после оценки специалистом всех факторов риска, включая
генетические, будет дано заключение, список возможных дополнительных исследований и практические рекомендации, направленные на сохранение здоровья пациента и предотвращение в дальнейшем
тромбоэмболических осложнений.
Технические характеристики и состав комплекта реагентов:
Количество тестов в комплекте
Формат реагентов
Смеси для амплификации
F2: 20210 G>A
F5: 1691 G>A
F7: 10976 G>A
F13: G>T
FGB: -455 G>A
ITGA2: 807 C>T
ITGB3: 1565 T>C
PAI-1: -675 5G>4G
ПЦР-буфер
Полимераза Taq АТ
Масло минеральное
Материал для анализа
Срок годности
Температура хранения
48 тестов
Нераскапанный
Состав комплекта:
Кардиогенетика Тромбофилия
8 пробирок (по 960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
4 пробирки (по 960 мкл)
1 пробирка (192 мкл)
1 флакон (7,68 мл)
Кровь с ЭДТА
6 месяцев
+2 - +8 0С (полимераза Taq АТ - минус 20 0С)
24
ФармакоГенетика Варфарин. Комплект реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с метаболизмом Варфарина, методом ПЦР в режиме реального времени.
Варфарин – наиболее широко применяемое в мире лекарственное средство, антикоагулянт непрямого действия. Варфарин был синтезирован еще в 40-х годах прошлого века, однако в нашей
стране он начал применяться только в 2001г. Популярность варфарина обусловлена, во-первых,
высокой эффективностью, а во-вторых – удобством применения.
Показания к назначению варфарина:
• Лечение и профилактика тромбоза и тромбоэмболии сосудов:
• острый венозный тромбоз
• тромбоэмболия легочной артерии;
• Послеоперационный тромбоз;
• Повторный инфаркт миокарда;
• В качестве дополнительного лекарственного средства при проведении хирургического или
тромболитического лечения тромбоза, а также при электрической кардиоверсии мерцательной аритмии;
• Рецидивирующий венозный тромбоз;
• Повторная тромбоэмболия легочной артерии;
• Протезирование клапанов сердца и сосудов;
• Тромбоз периферических, коронарных и мозговых артерий;
• Вторичная профилактика тромбоза и тромбоэмболии после инфаркта миокарда и при мерцании предсердий.
При использовании варфарина необходимо проводить измерение МНО – международного нормализованного отношения, т.к. основным осложнением терапии являются кровотечения, которые
могут оказаться фатальными. Риск осложнений может существенно повышаться в тех случаях,
когда параллельно назначаются другие лекарственные средства.
Генетические факторы наравне с клиническими являются значимыми в подборе индивидуальных доз варфарина. Клинические факторы определяют вариабельность дозы на 17-21%, генетические факторы определяют до 53-54% вариабельности дозы.
Технические характеристики и состав комплекта реагентов:
Количество тестов в комплекте
Формат реагентов
48 тестов
Нераскапанный
Состав комплекта:
ФармакоГенетика Варфарин
Исследуемые полиморфизмы
VKORC1: -1639 G>A CYP2C9: 430 C>T CYP2C9: A>C CYP4F2: C>T ПЦР-буфер
Полимераза Taq АТ
Масло минеральное
Материал для анализа
Срок годности
Температура хранения
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
2 пробирки (по 960 мкл)
1 пробирка (96 мкл)
1 пробирка (3,84 мл)
Кровь с ЭДТА
6 месяцев
+2 - +8 0С (полимераза Taq АТ – минус 20 0С)
25
В дополнение к исследованиям полиморфизмов рекомендуется:
- использование реагентов КВМ для контроля качества преаналитического этапа
- положительные контрольные образцы для контроля качества амплификации
Наборы реагентов поставляются нераскапанными.
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА
ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА
Материалом для исследования служит венозная кровь с ЭДТА. Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8ºС, отдельные части (Taq-полимераза) при минус 20 ºС.
ОнкоГенетика BRCA. Комплект реагентов для определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития рака молочной
железы, методом ПЦР в режиме реального времени
В мире ежегодно регистрируется более 1 миллиона случаев рака молочной железы (РМЖ), а в РФ
свыше 50 тысяч. Заболеваемость раком молочной железы в России составляет 38,9 на 100 000 населения (стандартизованные показатели за 2002 г).
Одной из самых распространенных проблем является высокая смертность от РМЖ. Летальность
на первом году с момента установления диагноза равна почти 13%. Очевидно, что эффективность
лечения выше на ранних стадиях заболевания, поэтому своевременная диагностика является актуальной задачей и может привести к значительному снижению летальных исходов. Известно, что 5-10% случаев рака молочной железы и рака яичников являются наследственными
и их развитие может быть связано с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. По данным Breast Cancer
Linkage Consortium, оба гена увеличивают риск развития РМЖ у женщин к 80 годам на 80-85%.
Технические характеристики и состав комплектов реагентов:
Количество тестов в комплекте
Формат реагентов
48 тестов
Нераскапанный
Состав комплекта:
ОнкоГенетика BRCA
Определяемые полиморфизмы
[BRCA1: 185delAG]
[BRCA1: 4153delA]
[BRCA1: 5382insC]
[BRCA2: 6174delT]
Положительный контрольный образец
(2 типа: К+1, К+2)
Реагенты для выделения ДНК
Дополнительные реагенты
Материал для анализа
Срок годности
Температура хранения
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
1 пробирка (960 мкл)
8 пробирок (по 40 мкл)
ПРОБА-РАПИД- ГЕНЕТИКА
ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА
Реагенты для контроля качества ДНК
Цельная кровь
6 месяцев
+2 - +8 0С
(полимераза ТехноTaq АТ – минус 20 0С)
26
КВМ (контроль взятия материала). Комплект реагентов для ПЦР-амплификации геномной ДНК человека в режиме реального времени.
Основная масса ошибок ПЦР-диагностики происходит на внелабораторных этапах анализа. Качество взятия биоматериала для ПЦР-исследования, дальнейшая его обработка и хранение имеют
важное значение для получения достоверных результатов на лабораторном этапе. Например, неправильно произведенное взятие материала может привести к ложноотрицательному результату
при исследовании материала на наличие ДНК внутриклеточных инфекций – в случае, если клетки
эпителия были либо не забраны для анализа, либо забраны в недостаточном количестве.
Адекватность выделения ДНК из биоматериала также оказывает существенное влияние на результаты проводимых исследований. Так, возможны значительные потери ДНК в результате неправильно выбранной или проведенной пробоподготовки. Поэтому предварительная оценка количества выделенной геномной ДНК чаще всего необходима для дальнейшего проведения анализа.
Наиболее распространенный метод оценки количества ДНК – спектрофотометрия – не слишком
удобен в применении, в первую очередь потому, что требует дополнительного оборудования.
Использование комплекта реагентов КВМ позволяет оценить приблизительное количество выделенной ДНК непосредственно по результатам ПЦР (по Cp).
Реагенты КВМ рекомендуется использовать:
• для исключения ложноотрицательных результатов при исследовании биологического материала, содержащего клетки эпителия человека (для контроля взятия материала врачомклиницистом).
• для контроля количества геномной ДНК человека, выделенной из любого вида материала.
Комплект может быть использован в клинико-диагностических лабораториях медицинских
учреждений и научно-исследовательской практике.
Интерпретация результатов анализа КВМ.
Количество
геномной ДНК
на реакцию, нг
Результат по каналу
FAM, Сp
Результат по каналу
HEX, Сp
Менее 23
Не учитывается
23 – 32
Не учитывается
32 – 38
Не учитывается
Более 38
27 – 32
Более 38
Более 32
Возможно, в препарате ДНК
присутствуют ингибиторы ПЦР
Менее 0,01
Не определяется
27 – 32
ДНК человека отсутствует или
присутствует в следовых
количествах
–
Не определяется
Не определяется
или более 32 Результат недостоверный
–
Интерпретация
ДНК человека в препарате ДНК
присутствует в достаточном для
анализа количестве
ДНК человека в препарате ДНК
присутствует в достаточном для
анализа количестве
ДНК человека в препарате ДНК
присутствует в достаточном для
анализа количестве
(за исключением генотипирования!)
ДНК человека присутствует в
недостаточном для анализа
количестве
27
Более 750
750-1
1-0,01
Менее 0,01
Наборы реагентов поставляются раскапанными по стрипованным пробиркам (8 штук по 0,2 мл)
или в единичных пробирках (0,2 мл).
Для выделения ДНК рекомендуется использовать следующие комплекты реагентов производства ООО «НПО ДНК-Технология»:
ПРОБА-РАПИД
ПРОБА-НК
ПРОБА-ГС
Материалом для исследования служат: соскобы из уретры, цервикального канала, заднего
свода влагалища, конъюктивы глаза, задней стенки носоглотки и др. слизистых, клеточный осадок мочи, венозная кровь с ЭДТА.
Срок хранения наборов реагентов – 6 месяцев
Температура хранения +2 + 8ºС.
При назначении лабораторных исследований, необходимо учитывать, что ни один диагностический метод не может заменить комплексный подход в обследовании пациента, поэтому даже при
использовании метода ПЦР надо принимать во внимание данные и других методов диагностики
(ИФА, бактериологический посев, световая микроскопия и т.д.).
28
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр.
Вступление 1
Комплекты реагентов для выявления инфекционных заболеваний 2
Герпесвирусные инфекции 3
Папилломавирусные инфекции 5
Комплекты реагентов для выявления вирусов гепатитов и ВИЧ 7
Исследование биоценоза урогенитального тракта 8
Прочие инфекции 16
Особо опасные и природно-очаговые инфекции 17
Комплекты реагентов для выявления ГМИ 18
Генетика человека 20
ДНК-Технология
Адрес офиса: г. Москва, Варшавское шоссе, д. 125 Ж,
корп. 6, бизнес-центр «Меридио»
Адрес для писем: 117587, г. Москва, а/я 181
Тел/факс: +7 (495) 980 4555
e-mail: mail@dna-technology.ru
www.dna-technology.ru