АДСОРБЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ (ВИРУСОВ) НА
реклама
На правах рукописи КАЛАШНИКОВА Ирина Васильевна АДСОРБЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ (ВИРУСОВ) НА ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ СОРБЕНТОВ МОНОЛИТНОГО ТИПА Специальность 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2008 2 Работа выполнена в Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук. Научный руководитель: доктор химических наук Т. Б. Тенникова Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор В. П. Зубов доктор химических наук, профессор Л. А. Карцова Ведущая организация: Кафедра биотехнологии Санкт-Петербургский Государственный Технологический институт (Технический Университет) Защита диссертации состоится «22» мая 2008 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Большой пр. В.О., д. 31, конференц-зал. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института высокомолекулярных соединений РАН. Автореферат разослан «18» апреля 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, к. физ.-мат. наук Н.А. Долотова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Выделение и тонкая очистка вирусов имеет огромное значение при производстве вакцин и других медицинских препаратов на их основе. Диагностика заболеваний, основанная на высокочувствительном детектировании вируса, направлена на раннее его выявление и своевременное проведение противоэпидемических мероприятий. Применяемые на практике традиционные методы выделения и детектирования вирусов, в том числе и хроматографические, как правило, демонстрируют низкую эффективность. Вероятно, причиной этому являются как физико-химические, так и биохимические особенности вирусов, а именно, их низкая диффузионная подвижность, связанная с большим размером, а также сложная многокомпонентная и достаточно лабильная структура вирусных частиц. Монолитные сорбенты, в частности, твердый макропористый сополимер 2,3эпоксипропилметакрилата (глицидилметакрилата) с этиленгликольдиметакрилатом (ГМАЭДМА), широко используются в качестве стационарных фаз при реализации различных процессов, основанных на межфазовом переносе вещества (хроматография, биоконверсия, твердофазный химический синтез). Высокая проницаемость монолитных сред, обусловленная особенностями морфологической структуры, обеспечивает специфический механизм быстрого переноса вещества, характеризуемый преобладанием конвекции над диффузией. В результате реализуется возможность использования существенно более высоких скоростей элюции, чем в случае традиционных дисперсных сорбентов, что позволит избежать деструкции биопродукта и, соответственно, потери его активности. Таким образом, разработка и оптимизация методологического комплекса, включающего как высокоэффективную сепарацию вирусов, так и их достоверную идентификацию с использованием современных полимерных материалов, в частности, монолитных сорбентов и новейших подходов диагностики вирусных инфекций с привлечением биочиповой технологии, является, несомненно, актуальной задачей. Цель исследования. Целью настоящей работы являлось исследование особенностей адсорбции крупных модельных частиц и вирусов на функционализированной поверхности ГМА-ЭДМА монолитных фаз в динамическом формате, т. е. в режиме высокоэффективной жидкостной хроматографии на метакрилатных монолитах, а также в статическом формате с использованием трехмерных биочипов с аналогичной полимерной поверхностью. В практические цели исследования также входила разработка схем выделения и методов детектирования вирусов, с учетом выявленных особенностей адсорбции вирусоподобных частиц на поверхности монолитных фаз. В связи с вышесказанным, были поставлены и решались следующие задачи: _ конструирование физико-химических моделей вирусов с использованием различных материалов и методов; _ исследование особенностей адсорбционного поведения модельных наночастиц в динамических условиях различных вариантов высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ); _ построение модельной системы, имитирующей взаимодействие вирус-клетка, при участии специально сконструированных наночастиц и функционализированной поверхности монолитного сорбента; _ на примере модельных наночастиц, разработка методов биоанализа в формате биочипа, построенных на использовании монолитных полимерных слоев; _ разработка и оптимизация хроматографических схем выделения вируса гриппа из сложных биологических образцов, а также диагностической нанотест-системы для детектирования вируса гриппа непосредственно в клиническом материале. Объектами исследования являлись физико-химические модели вирусов, полученные с использованием методов сшивки белка с помощью диальдегида и ковалентной мо- 4 дификации поверхности полимерных наносфер белками и другими лигандами, имитирующими компоненты вирусной оболочки, а также вирусы гриппа. В качестве методов исследования использовались: спектрофотометрия в УФ- и видимой областях, элементный анализ, ИК-спектроскопия, колориметрические, биохимические и биологические методы; экслюзионный, ионообменный и аффинный варианты жидкостной хроматографии; зональный и фронтальный хроматографические методы анализа; флюоресцентный и иммуноферментный методы анализа; метод твердофазной денситометрии (в УФ и видимой области спектра); полиакриламидный гель-электрофорез. Научная новизна. На примере вирусоподобных синтетических частиц впервые научно обоснована возможность реализации скоростных эффективных процессов сепарации крупных биологических объектов (вирусов) с использованием ионообменного и биоаффинного вариантов жидкостной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках, отличающихся избирательностью адсорбции и энергией взаимодействия вещества с поверхностью стационарной фазы. Впервые показана возможность проведения количественного анализа вирусоподобных частиц в формате 3D-биочипов на основе макропористого сополимера ГМА-ЭДМА с использованием детектирующего метода твердофазной денситометрии. Путем выбора из широкого ряда кандидатов оптимального лиганда впервые предложен эффективный метод выделения вируса гриппа А (H1N1), основанный на псевдо-аффинном варианте хроматографии на монолитах. Впервые предложен высокочувствительный метод детектирования вирусов гриппа А и В с использованием разработанной тест-системы (биочипа). Практическая значимость работы. Сконструированы биораспознающие системы для сепарации вирусов методом высокоэффективной псевдо-аффинной хроматографии на монолитах. Предложен метод чувствительной и эффективной диагностики вирусов гриппа А и В с использованием специально сконструированных 3D-биочипов (трехмерных биочипов). Таким образом, разработан и оптимизирован методологический комплекс, включающий сепарацию вирусов и их достоверную идентификацию с привлечением одного и того же ГМА-ЭДМА сорбента монолитного типа. Основные положения, выносимые на защиту: _ Физико-химические модели вирусов (вирусоподобные наночастицы) могут быть получены контролируемыми методами сшивки белка с использованием диальдегида, а также ковалентной модификации полимерных наносфер белком и другими лигандами; _ Адсорбция вирусоподобных наночастиц на функционализированной поверхности сорбента (монолита) определяется природой белка, локализованного на их поверхности; _ Величина максимальной адсорбционной емкости сорбента в аффинном и ионообменном вариантах ВЭМДХ уменьшается с увеличением размера наночастиц и не зависит от скорости потока подвижной фазы; _ Усложнение микроокружения на поверхности как сорбента, так и наночастиц в модельной системе, имитирующей взаимодействия «вирус-клетка», может оказывать влияние на характеристики биоспецифического связывания; _ Использование различных подходов к иммобилизации лигандов при создании эффективных псевдо-аффинных носителей демонстрирует возможность увеличения производительности хроматографических процессов, основанных на биоспецифическом взаимодействии вируса гриппа с адсорбционно-активными сайтами сорбента; _ Методологические подходы детектирования и количественной оценки связывания, разработанные на примере вирусподобных частиц в формате непроточных ГМА- 5 ЭДМА слоев (биочипов), могут быть положены в основу чувствительных тестсистем для диагностики вируса гриппа. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на ряде международных и российских симпозиумов и конференций: 5th International Symposium «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), 2nd Monolith Summer School «Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis» (Порто Рож, Словения, 2006), 4th International Congress on Analytical Sciences (Москва, Россия, 2006), The Young Scientists’ and Students’ International Scientific Conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007), а также обсуждались на научно-практическом семинаре «Ионный обмен, хроматография и альтернативные методы» Российского Менделеевского химического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2007) и были представлены на конкурсе молодых ученых ИВС РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2006). Публикации. По материалам диссертации опубликовано десять печатных работ, включающих 3 полнотекстовые статьи и 7 тезисов докладов. Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, а также в подготовке докладов и публикаций. Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Обсуждения результатов, Экспериментальной части, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 168 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 44 рисунками, список цитируемой литературы включает 209 источников. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обоснована актуальность темы, обозначена ее научная новизна и практическая значимость, сформулированы цели и задачи исследования. Глава 1. Обзор литературы состоит из четырех разделов. В первом разделе рассмотрены различные методы конструирования модельных биосистем (частиц) на основе синтетических и природных полимеров. Во втором разделе обсуждается хроматографический метод выделения и исследования вирусов, его особенности и варианты. Третий раздел посвящен монолитным ГМА-ЭДМА сорбентам, их синтезу и морфологии, а также особенностям хроматографического разделения анализируемых веществ с их использованием. И, наконец, четвертый раздел касается практического приложения принципа комплементарности в двух форматах, а именно, динамическом (аффинная хроматография) и статическом (биочипы) видах разделений. Глава 2. Результаты и обсуждение. 2.1. Конструирование моделей вирусов Адсорбционные особенности вирусов в динамических условиях хроматографического процесса определяются, в первую очередь, их физико-химическими параметрами, а именно, размером, формой и химическим строением поверхности данных объектов. Таким образом, первой задачей данной работы являлось конструирование модельных частиц, близких к сферической форме, размером 20-120 нм и с поверхностным слоем, содержащим, подобно вирусу, «сигнальные» белки, ответственные за взаимодействие модели с функционализированной поверхностью сорбента. В качестве таких «сигнальных» биомолекул на первом этапе исследования были выбраны хорошо известные и детально изученные с точки зрения хроматографического поведения белки, а именно, соевый ингибитор трипсина, трипсин и овальбумин. Наиболее простым способом получения модельных наночастиц является использование белка в качестве основы для его дальнейшего укрупнения. Инструментом для создания таких частиц в нашем случае являлась реакция ковалент- 6 ной сшивки глобул нативного белка с использованием глутарового диальдегида (ГДА). Продукты реакции очищали от избытка ГДА и анализировали методом гельхроматографии. С целью получения конъюгатов достаточного размера оптимизировали условия реакции сшивки белка, а именно, значения рН реакционной среды, соотношение реагентов в реакционной смеси, время реакции. Несмотря на тщательный подбор условий, продукт реакции представлял собой набор конъюгатов с различной степенью сшивки, т.е. в растворе имелась смесь образований, имеющих различный размер, а также примесь исходного белка. Согласно полученным данным, средний размер образующихся наночастиц соответствовал лишь минимальным размерам вирусов, а именно, 20-40 нм. В качестве альтернативы предыдущему методу создания структурных моделей вирусов использовались полистирольные наносферы, поверхность которых может быть функционализирована различными лигандами. Ковалентную иммобилизацию белка на поверхности полимерных наносфер, содержащих реакционноспособные карбоксильные группы, проводили по известному двустадийному методу активации функциональных групп с использованием 1-гидроксибензотриазола и водорастворимого карбодиимида. Количество иммобилизованного на поверхности наносфер белка (Таблица 1) определяли методом Лоури, а степень заполнения поверхности латексных частиц белком рассчитывали с использованием следующих формул: *Nmax = S'/S, **Nmax = N'/ N, где S' – площадь поверхности латексной частицы, S – площадь поперечного сечения глобулы белка, N' – количество глобул белка, N – количество наночастиц. На примере овальбумина (Таблица 1), путем двукратного по сравнению с расчетным увеличения количества белка в реакционной смеси, удалось получить латексные частицы с бóльшим покрытием поверхности. Таблица 1 Характеристики полистирольных наночастиц (ПС), модифицированных соевым ингибитором трипсина (СИТР), трипсином (ТР) и овальбумином (ОВА) Частица Nmax, максимальное число глобул белка, связанных с Заполнение поверхности поверхностью 1 наносферы наносфер белком, % Теория Эксперимент ПС-СИТР 1600 700 44 ПС-ТР 1600 1100 69 700 300 44 ПС-ОВА 700 400 56 2.2. Исследование особенностей динамической адсорбции модельных частиц методом высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ) Скоростная хроматография на ультракоротких монолитных колонках (дисках) с различной поверхностной функциональностью являлась основным методом исследования адсорбционного поведения наночастиц, полученных двумя описанными выше методами. Использование хорошо изученных белков в качестве сигнальных при формировании вирусоподобных частиц предоставляет исключительные возможности сравнения адсорбционного поведения в динамических условиях нативных белков и крупных наночастиц на их основе. Материал использованных в работе монолитных носителей, выполненных в форме дисков размером 12х3 мм (CIM® Disks, BIA Separations, Любляна, Словения), представляет собой жесткий макропористый сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА) (60 и 40 мол.%, соответственно), получаемый методом свободнорадикальной полимеризации в блоке. Используемые носители характеризовались следующими параметрами: средний размер пор – 1.5 мкм, удельная площадь поровой поверхности – 10-15 м2/г, общая пористость – 0.6 мл/мл сорбента, объем диска – 0.34 мл. 7 2.2.1. Ионообменная ВЭМДХ модельных частиц Метод зонального элюирования С целью изучения влияния скорости потока подвижной фазы на адсорбцию крупных частиц на функционализированной поверхности монолитных сорбентов использовался метод зонального элюирования. При этом на колонку (диск) с различной скоростью потока подвижной фазы наносились фиксированные объемы растворов наночастиц, модифицированных овальбумином, определенной концентрации. Известно, что для эффективного разделения время пребывания частицы в массе сорбента (tres) должно значительно превышать время ее внутрипорового диффузионного движения (tfilm). Рассчитанное минимальное время пребывания наночастицы в слое сорбента при скорости потока 6 мл/мин соответствовало 2 секундам и превышало время внутрипоровой диффузии, составляющее всего 0.1 секунды (Таблица 2). Таким образом, даже для исследуемых крупных частиц скорость потока подвижной фазы равная 6 мл/мин удовлетворяла требованию tres >> tfilm. Следовало бы ожидать, что уменьшение времени пребывания частицы в массе сорбента должно привести к пропорциональному уменьшению числа вероятных контактов частиц с адсорбционными центрами сорбента в единицу времени, что в свою очередь, вызывает снижение адсорбционной емкости. Однако проведенные опыты показали, что уменьшение времени пребывания наночастицы в массе сорбента в шесть раз сопровождалось уменьшением адсорбционной емкости сорбента только в 3.8 раза (Таблица 2). Таблица 2 Результаты зонального метода анализа, полученные для наносфер, модифицированных овальбумином (ПС-ОВА), в ионнообменном варианте ВЭМДХ Скорость потока, tпреб, tдиф, Количество элюируемых ПС-ОВА, мл/мин сек сек мг белка/мл сорбента 1.0 12 0.6 0.200 ± 0.02 3.0 4 0.2 0.085 ± 0.02 6.0 2 0.1 0.053 ± 0.02 Подобный результат является подтверждением теории конвекционного механизма массопереноса в высокопроницаемых пористых системах. И действительно, рассчитанное с использованием уравнения Ďe = v0 l/3 (v0 – конвективная скорость потока и l – длина разделительного слоя) значение кажущейся диффузивности Ďe, равное 4х10-5 см2/сек, на три порядка превышает значение свободной диффузии в растворе латексных частиц De ≈ 6х10-8 см 2/сек, полученное независимым физическим методом (метод диффузии). Метод фронтального элюирования Количественная оценка влияния скорости потока подвижной фазы на максимально возможную величину адсорбционной емкости анионообменных сорбентов осуществлялась методом фронтального элюирования. В этом варианте через сорбент (CIM DEAE Disk) пропускали растворы наночастиц, модифицированных соевым ингибитором трипсина (СИТР), различной концентрации до полного насыщения всех адсорбционных сайтов сорбента. В соответствии с законами хроматографии на монолитах, где величина адсорбции вещества не зависит от скорости потока подвижной фазы, экспериментальные изотермы, полученные при скоростях 1, 3 и 10 мл/мин, оказались практически идентичными. Соответственно, величина максимальной адсорбционной емкости диска, определяемая графически линеаризацией изотерм адсорбции в обратных координатах 1/Q – 1/С, для крупных частиц остается постоянной при разных скоростях элюции. Кроме того, в процессе экспериментов была выявлена зависимость объема пробы, наносимого до полного насыщения адсорбционных центров сорбента, от скорости потока подвижной фазы. Вероятно, некоторая доля крупных частиц, ввиду их малой диффузионной подвижности, при высоких скоростях элюции способна «проскакивать» сквозь стационарную фазу без взаимодействия с 8 ней, а увеличение объема наносимой пробы при возрастании скорости потока компенсирует уменьшение числа эффективных контактов. С использованием скорости потока 3 мл/мин осуществлялось исследование влияния размеров модельных наночастиц на величину максимальной адсорбционной емкости. Линеаризация полученных методом фронтального элюирования изотерм адсорбции позволила получить значения максимальной адсорбционной емкости (Qmax, Таблица 3). Таблица 3 Значения максимальной адсорбционной емкости (Qmax) различных форм овальбумина (ОВА) и соевого ингибитора трипсина (СИТР) (ионообменные CIM диски) Белок СИТР ОВА Образец Нативный Конъюгат 1 Конъюгат 2 ПС-СИТР (44%) Нативный Конъюгат ПС-ОВА (44%) ПС-ОВА (56%) R, нм 2.0 8.7 15.6 42.0 3.0 8.7 43.0 43.0 Qmax, мг белка/мл сорбента 28.7 ± 0.05 7.9 ± 0.03 2.3 ± 0.03 0.2 ± 0.02 30.0 ± 0.03 1.7 ± 0.02 1.3 ± 0.02 1.7 ± 0.02 Q’max x 10 -14, глобул или частиц/мл сорбента 7200 (1) 67 (1) 0.7 (1) 0.1 (2) 4020 (1) 14.6 (1) 0.4 (2) 0.6 (2) (1) Q’max = (Q max/ M)*NA Q’max = Q max/ Q’, где Q’= q/N Q max - количество десорбируемого белка (мг), рассчитанное из данных фронтального анализа; Q’ max - количество белка (мг), рассчитанное с использованием формул (1) и (2); M - молекулярная масса белка; NA - число Авогадро; Q’ – количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 наносферой; q – суммарное коли-чество белка, иммобилизованное на поверхности всех наносфер в растворе; N – количество наносфер в растворе. (2) Согласно вычисленным значениям Qmax, в ряду нативный белок - конъюгат белка – модифицированные белком полимерные наносферы наблюдалось естественное снижение этой величины. Подтверждением того, что адсорбция анализируемых частиц определялась ионной природой белка, может служить пропорциональное увеличение максимальной адсорбционной емкости при увеличении количества белка (овальбумина), иммобилизованного на поверхности полимерных частиц (Таблица 3). Тем не менее, даже невысокие для крупных частиц значения адсорбционной емкости монолитного сорбента, особенно в сравнении со значениями, полученными для нативных белков, превосходят емкости, зафиксированные с использованием мембранных адсорберов или сорбентов гелевого типа. Одним из возможных путей увеличения производительности монолитного сорбента может быть увеличение его объема. Действительно, при увеличении объема сорбента втрое наблюдалось практически пропорциональное увеличение максимальной адсорбционной емкости для полимерных наносфер, модифицированных овальбумином; при этом оперативное давление изменялось крайне незначительно, что позволяло использовать те же высокие скорости элюции, как и в случае одной сепарационной единицы. Разделение модельных смесей (градиентная анионообменная ВЭМДХ) Абсолютная идентичность картин разделения в одинаковых условиях градиентной АО ВЭМДХ пар двух модельных белков (овальбумина и трипсина) и соответствующих модифицированных латексов (Рис. 1 а и б) подтвердила доминирующее участие белка в адсорбции сформированных частиц на ионогенной поверхности сорбента. Следует отметить, что разделение смеси конъюгатов (Рис. 1 в) в идентичных условиях градиента оказалось затруднительным. Время выхода с колонки конъюгата овальбумина (К-ОВА) (Рис. 1 в) заметно уменьшилось по сравнению с нативным белком (Рис. 1 а), что свидетельствует об уменьшении суммарного отрицательного заряда в результате сшивки глобул. Таким образом, доказано, что в ионообменном варианте хроматографии адсорбция наночастиц, несущих белки на внешней поверхности, определяется ионной природой бел- 9 ка и, как правило, подчиняется тем же законам, что и адсорбция нативных белков. Другим важным результатом, полученным в данной серии экспериментов, является подтверждение пригодности морфологии используемой монолитной стационарной фазы для реализации скоростных процессов адсорбционного разделения частиц, значительно превосходящих по размеру исследованных ранее крупных биологических объектов, таких как белки и ДНК. 100 (в) 25 100 50 α=2.1 80 80 60 60 20 80 ПС- OBA 40 40 K- TP, K- OBA K- OBA K- TP 40 80 35 15 60 B (%) 100 α=1.25 45 A (280 нм) TP A (280 нм) α=2.1 (б) OBA A (280nm) (а) 100 ПС- TP 10 60 30 B (%) 25 40 20 B (%) K- OBA K- TP 40 15 20 20 5 20 20 10 5 0 0,0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 t (мин) 2,5 3,0 0 0,0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 t (мин) 2,5 3,0 0 0,0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 t (мин) 2,5 3,0 ® Условия: 12x3 мм CIM QA диск; модельные пары: (а) ОВА (2.0 мг/мл) - ТР (3.0 мг/мл); (б) ПС-OВА (0.1 мг белка/мл) – ПС-ТР (0.1 мг белка/мл); (в) К-ОВА (0.2 мг/мл) – К-ТР (0.4 мг/мл); cкорость потока подвижной фазы: 3 мл/мин; подвижная фаза: 20 мM Трис–HCl, pH 7.6 (буфер А), 1M NaCl в 20 мM Трис–HCl буфере, pH 7.6 (буфер В); объем петли составлял 400 мкл; градиент: 0-1 мин – 0% B; 1-1.02 мин от 0 до 10% B; 1.02-2.02 мин – 10% B; 2.022.04 мин от 10 до 20% B; 2.04-3.04 мин – 20% B; 3.04 – 3.06 мин от 20 до 100% B; 3.06 – 4 мин – 100% B; 4-4.02 мин от 100 до 0% B; 4.02-5 мин – 100% A. Рис. 1. Хроматографическое разделение методом АО ВЭМДХ на CIM QA диске пар двух модельных белков (а), соответствующих модифицированных латексов (б) и пар двух конъюгатов белков (в). 2.2.2. Поведение вирусоподобных частиц в условиях биоаффинной адсорбции на поверхности монолитных фаз (ВМДАХ) Исследование адсорбции, основанной на принципе биокомплементарного связывания в условиях сквозного потока жидкости (аффинная хроматография на монолитных фазах), является адекватным инструментом проповерхность верки способности создаваемых частиц, сосорбента держащих белок на внешней поверхности, к биокомплементарному связыванию. Наблюдаемый положительный эффект может служить доказательством сохранности третичной - трипсин - полимерная наносфера структуры белка, независимо от способа его - соевый ингибитор трипсина укрупнения. Изучение характеристик биоафРис. 2. Варианты анализа аффинной адсорб- финного связывания в ряду нативный белок – ции производных СИТР И ТР. конъюгат белка – модифицированные белком латексные наночастицы проводилось с использованием модельной аффинной пары соевый ингибитор трипсина – трипсин (СИТР-ТР). При этом были реализованы две возможные ситуации локализации партнеров (Рис. 2). Ковалентное связывание СИТР с поверхностью сорбента осуществлялось при высоких значениях рН (9-10), при которых эпоксидная группа наиболее вероятно взаимодействует с боковыми ε-аминогруппами остатков лизина. Иммобилизация ТР осуществлялась с использованием водорастворимого карбодиимида через предварительное аминирование поверхности монолитного носителя. Зональное элюирование Серия экспериментов, подобная разделениям в ионообменном варианте ВЭМДХ, была выполнена в режиме аффинной хроматографии, где исследовалось адсорбционное 10 поведение полимерных наночастиц, поверхностно-модифицированных трипсином. При этом роль аффинного партнера выполнял соевый ингибитор трипсина, иммобилизованный на поверхности монолитного сорбента. В данном варианте хроматографии шестикратное увеличение скорости потока подвижной фазы вызывало уменьшение адсорбционной емкости сорбента в 2.5 раза. Как уже обсуждалось ранее, конвекционный поток подвижной фазы сквозь проницаемый слой сорбента увеличивает эффективную диффузионную подвижность частиц, характеризуя происходящие динамические адсорбционные процессы как конвекционно-контролируемые. Именно этим объясняется возможность использования высоких скоростей элюирования в варианте более сложной адсорбции, отличающейся от ионной гораздо более низкой поверхностной концентрацией лигандов и, как следствие, меньшим числом эффективных контактов между комплементарными молекулами. Наиболее важно, что аффинная адсорбция крупных частиц в условиях потока подвижной фазы подчиняется абсолютно тем же закономерностям, наблюдаемым ранее для белков, обладающих гораздо меньшими размерами и, соответственно, бóльшими коэффициентами внутрипоровой диффузии. Фронтальный анализ Для количественной оценки теоретически возможной адсорбционной емкости аффинных сорбентов, Qmax, использовался метод фронтального элюирования. Как и в ионообменной хроматографии, величина Qmax уменьшалась с увеличением размера анализируемых объектов и не зависела от скорости потока подвижной фазы (Таблица 4). Как следует из Таблицы 4, заметная разница в значениях адсорбционной емкости сорбента для конъюгатов К-ТР и К-СИТР, по всей вероятности, обусловлена снижением биологической активности трипсина вследствие затрагивания ответственных за поддержание активной конформации ε-аминогрупп лизина при сшивке глобул ГДА, имеющей место при щелочных значениях рН. Интересно отметить, что процесс десорбции укрупненных комплементов происходил в тех же достаточно жестких условиях, как и в случае пар, образованных индивидуальными белками (рН 2.0). Данный факт является подтверждением прочности формирующихся биокомплементарных комплексов, т. е. идентичности их констант диссоциации с константами нативных комплексов. Таблица 4 Данные фронтального анализа, полученные для различных форм трипсина (ТР) и соевого ингибитора трипсина (СИТР) в аффинном варианте ВЭМДХ -7 Лиганд ρх10 , моль/ Комплемент Q max, Q’max x10-13, мл сорбента мг белка/мл глобул или частиц/ сорбента мл сорбента СИТР 0.26 ± 0.02 660 (1) ТР 0.8 К-СИТР (R = 11.6 нм) 1.58 ± 0.02 31 (1) ПС-СИТР 0.40 ± 0.02 1.4 (2) ТР 0.38 ± 0.02 950 (1) СИТР 1.1 К-TР (R = 15.6 нм) 0.09 ± 0.02 0.3 (1) ПС-TР 0.21 ± 0.02 0.5 (2) (1) Q’max = (Q max/ M) х NA Q’max = Q max/ Q’, где Q’= q/N Q max - максимальная адсорбционная емкость сорбента, т. е. количество адсорбированного белка (мг), рассчитанное из данных фронтального анализа; Q’ max - количество белка (мг) рассчитанное с использованием формул (1) и (2); M молекулярная масса; NA - число Авогадро; Q’ - количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 наносферой; q – суммарное количество белка, иммобилизованного на поверхности всех наносфер в растворе; N - количество наносфер в растворе. (2) 2.2.3. Моделирование взаимодействий вирус-клетка Известно, что помимо белков-антигенов, участвующих во взаимодействии вирусклетка, в состав оболочки вирусов входят и другие компоненты, такие как липиды и угле- 11 воды, которые могут вносить дополнительный вклад в механизм адсорбционных взаимодействий вируса с поверхностью сорбента. Поэтому дальнейшие экспериментальные шаги были направлены на постепенное усложнение микроокружения белка на поверхности наночастиц, приближая его к составу вирусной оболочки. Основой для создания вирусоподобных частиц служили два типа полимерных карбоксилированных наносфер на основе полистирола (ПС) и полиметилметакрилата (ПММА) размерами 63.5 и 80 нм, соответственно. В наших экспериментах с ПММАД частицами находящийся в поверхностном слое декстран имитировал олигосахаридную составляющую микроокружения. Роль моделируемого вирусного антигена выполнял белок трипсин. Фосфатидилэтаноламин (ФТЭА) и глюкозамин (ГА) были выбраны в качестве низкоспецифических лигандов, отвечающих за липидную и углеводную составляющие микроокружения белка, воссоздаваемого на поверхности синтетических наночастиц. Ковалентную иммобилизацию аминосодержащих лигандов на поверхности наносфер, содержащих реакционноспособные карбоксильные группы, осуществляли согласно ранее упомянутому методу с использованием водорастворимого карбодиимида. Таким образом, были получены частицы, содержащие один или несколько лигандов различной природы и специфичности. Те же фосфолипид и углевод (ФТЭА и ГА) использовались для построения приближенной структуры наружной клеточной мембраны на поверхности ГМА-ЭДМА сорбента. Аффинный партнер трипсина, СИТР, на поверхности сорбента выполнял роль моделируемого клеточного рецептора. Концентрация выбранных аминосодержащих лигандов, иммобилизация которых осуществлялась одностадийной реакцией их ковалентного связывания с эпоксидными группами сорбента, представлена как ρ в Таблице 5. Таким образом, модификацией поверхности латексных наночастиц и монолитного сорбента была получена упрощенная биокомплементарная система, представленная на Рис. 3. Использование в данной системе аффинной пары СИТР-ТР в качестве модельной взаимодействующей пары «рецептор-антиген» позволило осуществить контроль аффинного распознавания при построении модели взаимодействий «вирус – клетка». Количественное исследование биоспецифического связывания комплементов (СИТР-ТР), выполняемое в условиях скоростной аффинной хроматографии с использованием метода фронтального элюирования, позволило оценить влияние микроокружения на адсорбционную емкость сорбента и термодинамическую устойчивость образующихся аффинных комплексов (Таблица 5). При этом сравнивались два экспериментальных случая (Рис. 3), а именно, (1) когда осуществлялась иммобилизация единственного белка, СИТР, на поверхности сорбента, и (2) когда два выбранных компонента (ФТЭА и ГА) одновременно формировали микроокружение данного белка на поверхности монолитной фазы, тем самым, приближая ее к поверхности клетки, атакуемой вирусом. ГМА-ЕДМА монолитный диск - ПММАД наносфера - ПС наносфера - глюкозамин (1) (2) - фосфатидилэтаноламин (ФТЭА) - трипсин - соевый ингибитор трипсина Рис. 3. Варианты исследования биоспецифического связывания. Предварительно были проведены хроматографические эксперименты, в которых участвовали монолитный сорбент, с ковалентно присоединенным СИТР, а также находя- 12 щиеся в подвижной фазе ПММАД и ПС частицы, модифицированные ФТЭА (68.2% заполнение поверхности) или ГА (57.1% заполнение поверхности). Результаты данных экспериментов подтвердили наличие неспецифических взаимодействий обсуждаемых липидных и сахаридных лигандов с поверхностью ГМА-ЭДМА-СИТР полимера. Из данных Таблицы 5 очевидно, что постепенное усложнение поверхностной структуры наносфер приводило к снижению их адсорбции на поверхности сорбента, модифицированного единственным белком. Данный результат можно объяснить как стерическими факторами, так и наличием связей различной природы, способных конкурировать со специфическим взаимодействием лиганд - комплемент. Кардинально противоположная ситуация наблюдалась в процессах адсорбции частиц с разным поверхностным составом на многокомпонентной поверхности сорбента (Таблица 5). За исключением наносфер, модифицированных только трипсином, где число адсорбированных наночастиц снижалось более чем в два раза по сравнению с адсорбцией на монолите, модифицированным единственным лигандом - СИТР, адсорбционная емкость (Qmax) с тонкой подстройкой поверхностного микроокружения белка в худшем случае практически не изменялась, а в лучшем - увеличивалась (Таблица 5). Таблица 5 Количественные характеристики аффинного взаимодействия, полученные методом фронтального анализа Комплемент Заполнение Лиганд(ы) поверхности СИТР СИТР-ГА-ФТЭА -5 6 наносфер Q’max х 10 , K’diss х 10 , Q’max х 10-5, K’diss х 106, лигандом, М частиц/глобулы М чаcтиц/глобулы % лиганда лиганда ПС-ТР 48.4 7.2 1.0 3.3 1.9 ПС-ТР-ГА 43.1/37.5 2.5 0.6 4.2 0.6 ПС-ТР-ФТЭА 45.0/36.0 2.1 0.6 3.1 0.2 ПС-ТР-ГА-ФТЭА 41.9/11.7/44.6 1.4 1.4 1.5 0.3 ПММАД-ТР 1.2 3.8 1.6 9.2 66.8 Обозначения: ПС _ полистирольные карбоксилированные наносферы; ПММАД _ полиметилметакрилатные карбоксилированные наносферы, стабилизированные декстраном; СИТР_ соевый ингибитор трипсина; ТР _ трипсин; ФТЭА _ фосфотидилэтаноламин; ГА _ глюкозамин. (1) Q’max = (Q max/Q)/ρ, где Q= q/N (2) K’diss= (K/Q)х 1/NА Обозначения: Q max - максимальная адсорбционная емкость, количество белка (мг), рассчитанное из результатов фронтального анализа; Q’max - максимальная адсорбционная емкость, рассчитанная по формуле (1); NA - число Авогадро; Q количество белка (мг), связанное с одной наносферой; q - суммарное количество белка (мг), связанное со всеми наносферами, находящимися в растворе; N - количество наносфер в растворе; ρ - концентрация лигандов, иммобилизованных в единице объема сорбента; K’diss - константа диссоциации аффинного комплекса, рассчитанная по формуле (2); К – константа, найденная из линеаризованных в координатах 1/Q – 1/С изотерм адсорбции. Стандартное отклонение при линеаризации изотермы адсорбции 0.9895-0.9987 (Origin). В случае частиц ПС-ТР увеличившееся значение константы диссоциации комплекса (K’diss) показывало, что микроокружение лиганда на поверхности сорбента вносило некоторый вклад в дестабилизацию аффинного комплекса. Наличие аминосахара на поверхности частиц ПС-ТР-ГА практически никак не отразилось на величине константы диссоциации аффинного комплекса, образующегося в условиях микроокружения СИТР из трех компонентов разной природы. Вероятно, именно липидная составляющая в составе ПСТР-ФТЭА и ПС-ТР-ГА-ФТЭА частиц придавала дополнительную прочность аффинному комплексу по сравнению с упрощенной формой взаимодействия. В случае частиц ПММАД-ТР полисахаридные цепи, по-видимому, ингибировали связывание вирусоподобных частиц со сложной поверхностью сорбента, поскольку значение константы диссоциации увеличилось почти в 2.5 раза (Таблица 5), хотя данное снижение прочности комплекса 13 не повлияло заметно на величину адсорбционной емкости. В данном случае можно говорить скорее о псевдо-аффинной адсорбции с более слабой энергией взаимодействия комплементов. Хотя полученные результаты представляют определенный научный интерес относительно комплексообразования белков, окруженных функциональными лигандами отличной специфичности, с практической точки зрения, т. е. при конструировании эффективных биораспознающих сепарационных систем, можно сделать вывод о возможности использования традиционных аффинных сорбентов с единственным иммобилизованным лигандом. 2.2.4. Разработка стратегии эффективного метода выделения и очистки вируса гриппа с использованием псевдо-аффинного варианта хроматографии на монолитах Полученные на ранних этапах исследования экспериментальные данные позволили далее осуществить сравнение адсорбционного поведения модельных вирусоподобных частиц с реальным вирусным объектом с использованием тех же методов и сорбентов. В качестве объекта исследования был выбран вирус гриппа. Построение модели вируса гриппа Одна из задач, решаемых в данном экспериментальном разделе, заключалась в изучении адсорбционного комплексообразования основного антигена вируса гриппа – гемагглютинина (HA) - с целью его выделения из гриппозной вакцины с последующим использованием чистого продукта для построения адекватной модели данного типа вируса. Известно, что сиаловая кислота (N-ацетил-нейраминовая кислота) концевых участков олигосахаридных цепей гликолипидов и гликопротеинов, расположенных на поверхности клеточных мембран, служит гемагглютинин-связывающим рецептором, провоцирующим проникновение вируса в клетку. Интенсивно исследуемая в настоящее время сиалиллактоза в виде двух изомерных форм, а именно, α-2,3- и α-2,6-сиалилпроизводные лактозы, была выбрана в качестве потенциального биоспецифического лиганда. Оптимизация методов ковалентного связывания выбранного лиганда с поверхностью ГМА-ЭДМА носителей Очевидно, что стерическая доступность для взаимодействия с вирусом небольшого по размерам лиганда - сиалиллактозы, будет иной в сравнении с крупными лигандами, каковыми являются белки. Конформация сиалового производного, необходимая для специфического связывания с антигеном вируса, может претерпевать изменения в ходе иммобилизации на поверхности жесткой матрицы. Поэтому для максимально эффективного экспонирования на поверхности сорбента данного лиганда и сохранения его биологической функции использовались различные способы иммобилизации. Предварительно, в структуру сиалиллактозы методом аминирования вводились реакционноспособные аминогруппы. В результате использования всех, приведенных на Рис. 4 а-ё, подходов к иммобилизации аминопроизводного сиалиллактозы был получен ряд аффинных носителей с различным количеством лиганда на поверхности сорбента (Таблица 6). 14 Рис. 4 а-ё. Различные способы иммобилизации аффинного лиганда (СЛА) на поверхности ГМА-ЭДМА монолитного диска. Сравнительное изучение эффективности аффинных сорбентов на примере выделения гемагглютинина из гриппозной вакцины В качестве источника основного антигена вируса гриппа гемагглютинина использовалась вакцина Грипповак, состав которой представлял собой смесь контаминантных и вирусных белков (общий белок – 2100 мкг/мл, овальбумин – 0.04 мкг/мл, гемагглютинин вируса А – 19.2 (Н1) и 18.8 (Н3) мкг/мл, гемагглютинин вируса гриппа В – 25.6 мкг/мл). Для сравнения полученных ранее носителей раствор вакцины с концентрацией 1 мг белка/мл в ацетатном буфере (pH 6.0) пропускался со скоростью подвижной фазы 2 мл/мин через каждый из шести приготовленных монолитных дисков (Таблица 6) до полного насыщения адсорбционных сайтов сорбента. Элюция раствором соли, предшествующая десорбции, осуществлялась с целью удаления неспецифически адсорбированных белков вакцины. Десорбцию специфически связанного с лигандом НА проводили путем резкого изменения рН буфера в сторону щелочных или кислых значений. Было показано, что наиболее полная десорбция достигалась при использовании натрий-боратного буфера, pH 10.7, приводя к полному разрушению комплекса и высвобождению чистого искомого продукта - гемагглютинина. Данный результат подтверждался методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле (ПААГЭ). 15 Низкая эффективность носителя (Таблица 6), напрямую модифицированного аминированной сиалиллактозой (Рис. 4 а) наиболее вероятно связана с обсуждаемыми ранее стерическими препятствиями при образовании комплекса с участием белка большого размера, каким является гемагглютинин. Этот факт указывает на то, что структурного спейсера, а именно, лактозного кольца длиной 1 нм, недостаточно для обеспечения беспрепятственного взаимодействия НА с СЛА. Кроме того, при относительно невысокой концентрации привитого прямым методом низкомолекулярного лиганда велика вероятность его локализации в малых порах, недоступных для проникновения белка. В конечном счете, максимальное связывание гемагглютинина наблюдалось на сорбенте с СЛА, иммобилизованным с участием спейсера СИТР (Рис. 4 в). Носитель СИТР-С-СЛА несколько уступал предыдущему в эффективности связывания искомого белка (Таблица 6). При равной концентрации аффинного лиганда на поверхности носителей СИТР-С-СЛА и А-СИТР-СЛА (Таблица 6) величина адсорбционной емкости последнего оказалась в три раза ниже полученной на носителе СИТР-С-СЛА. Такой результат, вероятно, связан с изменением морфологии сорбента в ходе его модификации, протекающей в достаточно агрессивных условиях. Таблица 6 Концентрация лиганда сиалиллактозы и адсорбционная емкость сорбентов, полученная при выделении гемагглютинина из гриппозной вакцины СЛА ЦП СИТРА-СИТР- СИТРБСАПоли(МАГ-ВПСЛА СЛА С-СЛА СЛА АК)-СЛА 15.7±0.8 0.8±0.05 0.6±0.05 1.4±0.1 1.4±0.1 3.5±0.2 5.1±0.3 ρ Q x 102 0.7±0.05 7.9±0.5 26.6±1.0 5.1±0.5 16.0±0.5 1.2±0.1 1.0±0.08 ρ – концентрация СЛА, мкмоль/мл сорбента; Q – адсорбционная емкость, моль HA/моль СЛА, %; СЛА – сиалиллактозиламин, ЦП – церулоплазмин, СИТР-СЛА – соевый ингибитор трипсина, модифицированный сиалиллактозиламином, А-СИТР-СЛА – соевый ингибитор трипсина, иммобилизованный на альдегидсодержащей поверхности сорбента и далее модифицированный сиалиллактозиламином, СИТР-С – сукцинилированный соевый ингибитор трипсина, модифицированный сиалиллактозиламином, БСА-СЛА – бычий сывороточный альбумин, модифицированный сиалиллактозиламином, поли(МАГ-ВП-АК)-СЛА – сополимер 2-деокси-N-метакриламино-D-глюкозы с N-винилпирролидоном и акролеином, модифицированный сиалиллактозиламином. Невысокая адсорбционную емкость БСА- и ЦП-носителей (Таблица 6) можно объяснить эффектом экранирования большей части иммобилизованных низкомолекулярных лигандов, обусловленным большими размерами спейсерных белков. В отличие от спейсеров-белков, сополимер (Рис. 4 ё), имеющий в составе боковой сахаридный остаток, проявлял собственное сродство к гемагглютинину. При этом, однако, сополимер не был инертен по отношению к другим компонентам вакцины, поэтому промежуточный шаг элюирования солевым буфером являлся обязательным в случае использования данного макромолекулярного лиганда. Таким образом, все сконструированные аффинные носители позволяли селективно выделять гемагглютинин из гриппозной вакцины. Введение промежуточного спейсера между низкомолекулярным лигандом и поверхностью жесткой полимерной матрицы продемонстрировало положительную тенденцию к увеличению адсорбционной емкости аффинных сорбентов. Сравнительный анализ адсорбционного поведения на формируемых носителях синтетических моделей вируса гриппа и реального вируса гриппа Очередная задача в данном экспериментальном разделе заключалась в конструировании модельных частиц, имитирующих вирус гриппа, а также сравнительном анализе адсорбционного поведения вируса гриппа и его модели с использованием наиболее эффективных биораспознающих систем (СИТР-СЛА и СИТР-С-СЛА). Сферический вирион вируса гриппа с диаметром 80-120 нм имеет снаружи двойной слой липидов, в котором закреплены три вирусных белка, большую часть из которых составляет гемагглютинин (HА). В качестве основы для конструирования модели такого вируса были выбраны полисти- 16 рольные монодисперсные наносферы диаметром 80 нм, содержащие на поверхности реакционноспособные аминогруппы. Данные группы полимерных частиц позволили осуществить связывание с карбоксильными группами гемагглютинина посредством их активации водорастворимым карбодиимидом. Именно такое экспонирование молекул НА на поверхности полимерных частиц, не затрагивающее сигнальный пептид белка на N-конце полипептидной цепи, являлось адекватным природной локализации гемагглютинина в составе вирусной частицы. Сравнение параметров аффинного взаимодействия вируса гриппа А (H1N1) и его функциональной модели с аффинными лигандами осуществлялось с использованием количественных результатов, полученных методом фронтального элюирования (Таблица 7). Таблица 7 Количественные данные адсорбции вируса гриппа А и его модели, полученные из результатов фронтального анализа Вирус гриппа А ПС-НА Диск СИТР-С-СЛА СИТР-СЛА СИТР-СЛА 1.4 0.6 0.6 ρ Qmax 0.141 0.109 0.030 -12 Q х 10 2.0 1.6 1.9* Титр 20 20 - (1) Q = (Q max х К/ M)/υ Q* = Q max/ Q’, где Q’= q/N Q – адсорбционная емкость сорбента, частиц/мл сорбента, рассчитанное с использованием формул (1) и (2) ; Qmax – максимальная адсорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка НА (мг/мл сорбента), рассчитанное из изотерм адсорбции; К – значение отношения количества молекул гемагглютинина в вирионе, к общему количеству молекул белка в вирионе, равное 0.74; M – молекулярная масса белка; υ - количество молей гемагглютинина на вирион; Q’– количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 наносферой; q – суммарное количество белка, иммобилизованное на поверхности всех наносфер в растворе; N - количество наносфер в растворе; ρ – концентрация аффинного лиганда (СЛА мкмоль/мл сорбента); Титр – количество гемагглютинирующих единиц в мл (гае/мл), полученное тестом на гемагглютинацию. Стандартное отклонение при трехкратном воспроизведении аффинной ВЭМДХ составило ± 7%. (2) На данном этапе также исследовалась возможность эффективного использования тестируемых аффинных матриц для селективного выделения вируса гриппа непосредственно из биологического материала, представляющего собой фильтрат аллантоисной жидкости куриных эмбрионов. Оптимизированные хроматографические условия, используемые для выделения гемагглютинина из вакцины, были перенесены на выделение вируса гриппа и его моделей. Количественная оценка белка в десорбированных фракциях осуществлялась методом Лоури. Идентичность хроматограмм (Рис. 5) и невероятная близость значений адсорбционной емкости сорбента, выраженной в частицах на мл сорбента (Таблице 7), свидетельствует о том, что созданная модель вируса на основе латекса близка к оригиналу как по геометрическим размерам, там и по функциональным свойствам. (б) (а) Условия: 1 – загрузка растворов вируса гриппа (а) с концентрацией 0.50 мг белка или полимерных наносфер (б), модифицированных гемагглютинином, с концентрацией 0.03 мг белка в мл 0.05 M натрийацетатного буфера (pH 6.2) на аффинный диск, модифицированный СИТР-СЛА; 2 – элюирование неспецифически связанных компонентов образца 0.4 M и 2.0 M NaCl в 0.01 M PBS буфере (pH 6.5), и 3 – десорбция вируса гриппа или модельных частиц с использованием 12.5 M натрий-боратного буфера (рН 10.7). Скорость элюции: 2 мл/мин. 800 UV (mAu) UV (mAu) 600 400 200 600 400 200 1 3 2 1 3 2 0 0 0 2 4 6 8 t (мин) 10 12 14 0 2 4 6 8 t (мин) 10 12 14 Рис. 5. Хроматограммы двух образцов, вируса гриппа А (а) и его модельных частиц (б), полученные на аффинном диске, модифицированным СИТР-СЛА. 17 Тест на гемагглютинирующую активность подтвердил, что в десорбируемых фракциях действительно содержался вирус гриппа, а метод культивирования вируса в клетках почки собаки (MDCK) показал, что выделенный предложенным методом вирус сохраняет свою целостность структуры и, следовательно, биологическую активность. Важным результатом хроматографии частиц на монолитных стационарных фазах является чрезвычайно малое для аффинного варианта разделения время одного пробега (Рис. 5). Разработка метода селективного выделения вирионов вируса гриппа А с использованием псевдо-аффинного варианта хроматографии на монолитах. Функционализация монолитных сорбентов Как упоминалось ранее, более высоких величин адсорбционной емкости для крупных объектов можно добиться увеличением объема сорбента и удалением низкомолекулярного лиганда от поверхности полимерной матрицы. Другим подходом, способным увеличить производительность хроматографического процесса, основанного на аффинных взаимодействиях, может являться подбор наиболее эффективных лигандов и оптимизация условий их иммобилизации. Попытка реализовать подобный способ увеличения продуктивности сепарационной системы была предпринята в серии экспериментов с вирусом гриппа. В данном случае были получены аффинные носители с различными вариациями иммобилизованных лигандов, проявляющих собственное специфическое сродство к вирусу гриппа. На Рис. 6 а-г представлены аффинные матрицы, полученные с использованием выбранных лигандов. Рис. 6. Схемы модификации поверхности ГМА-ЭДМА монолитных дисков (б) α-2,6сиалиллактозой (СЛ), (а) α-метилтрицикло[3.3.1.1\3,7]декан-1-метанамином (ремантадин), (в) гепарином, а также (г) хитозаном и сиалиллактозиламином или α-2,6-сиалиллактозой. 18 Метод зонального элюирования: скоростная псевдо-аффинная хроматография на монолитных фазах Полученные аффинные сорбенты (Таблица 8) тестировали методом зонального элюирования. Объектом исследования являлся вирусный материал (вирус гриппа А H1N1), культивируемый в клетках почки обезьяны (VERO). Проводимые эксперименты имели целью оптимизацию условий адсорбции вируса из неочищенного биологического материала и разработки оптимального метода его десорбции. Согласно данным гемагглютинирующего теста, максимальная активность вируса была зафиксирована в области рН 6.0-7.0, а изменение концентрации буфера в пределах 0.05-1.0 M не оказывало влияния на его активность. Поэтому 0.05 M ацетатный буфер (pH 6.2) использовался на этапе адсорбции вируса. Для этого фиксированный объем раствора с концентрацией 1.1 мг белка/мл в 0.05 M ацетатном буфере (pH 6.2) наносился на каждый из рассматриваемых сорбентов. Вирус, адсорбированный на монолите, функционализированным гепарином, полностью десорбировался при использовании 0.4 M NaCl (Tаблица 8) в 0.01 М PBS буфере (рН 6.5), что подтверждалось данными гемагглютинирующего теста. Для других аффинных носителей, вирус был обнаружен только во фракциях, десорбированных 0.2 M NaOH. Следует отметить, что высокое значение рН буфера, используемого для десорбции, было немедленно приведено к нейтральному значению. Таким образом, относительный анализ фракций, десорбированных с различных функционализированных поверхностей монолитных носителей по результатам теста на гемагглютинирующую активность позволил сравнить эффективность предложенных лигандов. Согласно представленным результатам (Таблица 8), наилучшие адсорбционные возможности продемонстрировали два аффинных носителя, содержащие в качестве лигандов α-2,6-сиалиллактозу, и хитозан, модифицированный α-2,6-сиалиллактозой. Таблица 8 Характеристики аффинных матриц, использованных для выделения вируса гриппа Лиганд Титр ρ ρ – концентрация аффинного лиганда Ремантадин 459.0±22.0 7 (μмоль/мл сорбента); титр – количество геХитозан 0.3±0.01 20 магглютинирующих единиц в мл (гае/мл). СЛА–сиалиллактозиламин, СЛ–α-2,6-сиаα-2,6-СЛ 17.0±0.5 27 лиллактоза. Хитозан-СЛ 2.3±0.1/13.0±0.5 27 Хитозан-СЛА 1.0 ±0.05/18.5±1.0 13 Гепарин 1.6±0.05 13 Метод фронтального элюирования Дальнейшие хроматографические эксперименты с использованием метода фронтального элюирования и оптимизированных условий адсорбции и десорбции вируса позволили количественно оценить максимальную величину адсорбционной емкости, которая может быть получена на каждой из двух выбранных аффинных матриц, модифицированных СЛ и хитозан-СЛ, соответственно. Наличие вируса в десорбируемых фракциях анализировали тестом на гемагглютинацию, а количественную оценку белка в десорбируемых фракциях осуществляли с помощью БCA-микротеста. Линеаризация экспериментальных изотерм адсорбции позволила определить максимальную адсорбционную емкость каждого носителя (Qmax), выраженную в мг белка/мл (Таблица 9). Величина титра определяется именно гемагглютинином вируса гриппа, который способен агглютинировать эритроциты, поэтому значение адсорбционной емкости было пересчитано в более адекватные единицы (частицы/мл сорбента). В отличие от результатов зонального анализа (Таблица 9), которые показали сходство адсорбционной активности дисков с сиалиллактозой, иммобилизованной напрямую на поверхности сорбента и через реакцию связывания с хитозаном, значе- 19 ния адсорбционной емкости этих же дисков, полученные методом фронтального элюирования, как и титр вируса в десорбируемых фракциях, различались в 2.5 раза (Таблица 9). Таблица 9 Количественные данные фронтального элюирования вируса гриппа А (1) Параметры ρ Qmax Q x 10-12 Титр СЛ 17.0 0.2 2.8 27 Лиганды хитозан - СЛ 13.0 0.5 6.9 67 Q = ((Q max х К)/ M)/υ Q – адсорбционная емкость сорбента, количество частиц/мл сорбента, рассчитанное с использованием формулы (1); Qmax – максимальная адсорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка (мг/мл сорбента), рассчитанное из данных фронтального анализа; К – значение отношения количества молекул гемагглютинина в вирионе к общему количеству молекул белка в вирионе, равное 0.74; M – молекулярная масса белка; υ - количество моль гемагглютинина на вирион. Cтандартное отклонение при линеаризации изотерм адсорбции 0.99800.9981 (Origin). Вероятно, в случае аффинного носителя с иммобилизованной сиалиллактозой одинаковое количество аффинных сайтов оказалось активным по отношению к вирусу гриппа вне зависимости от наносимого на носитель объема, а следовательно, количества образца. Согласно полученным данным, наибольшее количество вирионов вируса гриппа с сохранением их природной патогенности удалось выделить с использованием аффинного монолитного носителя, модифицированного последовательно хитозаном и α-2,6сиалиллактозой. 2.2.5. Диагностика вирусов гриппа А и В с использованием ГМА-ЭДМА монолитного сорбента в виде непроточных слоев (биочипов) Методология, основанная на процессах биологического распознавания, может быть использована в методе скоростной хроматографии на монолитах для очистки и выделения вирусов. Создание биораспознающих систем в формате непроточных слоев (биочипов), сохраняющих ту же химическую природу монолитного сополимера и геометрию его поровой структуры, а также природу биологических лигандов и методы их введения в структуру поверхности, предоставляет иные практические возможности (скриннинговые тесты в медицинских целях, диагностика вирусных инфекций). В условиях отсутствия потока в формате биочипа именно дизайн порового пространства полимерного носителя в случае работы с вирусами должен обеспечивать как свободное проникновение частиц внутрь трехмерного порового пространства сорбента, так и достаточную адсорбционную емкость носителя. Создание микроаналитических слоев на основе ГМА-ЭДМА монолита В отличие от описанного выше ГМА-ЭДМА макропористого монолита, синтезируемого методом термоинициируемой свободно-радикальной полимеризации и используемого для хроматографии, ультратонкие ГМА-ЭДМА слои получали фотополимеризацией. Оптимизация условий фотоинициируемой полимеризации позволила получить макропористые ГМА-ЭДМА сополимеры в виде трехмерных тонких слоев с морфологическими свойствами, близкими к свойствам ГМА-ЭДМА монолитных дисков. Согласно разработанному методу, создание биочипов на основе ГМА-ЭДМА монолитного сополимера включает в себя несколько стадий: (1) подготовка стеклянной подложки, формирование оперативной ячейки; (2) введение методом силанизации в структуру стекла двойных связей, способных участвовать в последующей сополимеризации с ГМА и ЭДМА мономерами; (3) формирование монолитного полимерного слоя методом фотоинициируемой полимеризации. 2.2.5.1. Разработка алгоритма диагностики на биочипе на примере модельных частиц Апробацию биочипов проводили с использованием двух аффинных пар: моноклональные антитела против транстиретина (МАт) - транстиретин (ТТР), и соевый ингибитор трипсина (СИТР) - трипсин (ТР). Для детектирования аффинных комплексов использова- 20 лись методы иммуноферментного и флюоресцентного анализа. Введение флуоресцентной метки в молекулу белка подразумевало реакцию связывания аминогрупп белка с флюорескамином (ФЛ). Образование конъюгата ТР (или МАт) с пероксидазой хрена (ПХ), согласно классическому методу, осуществлялось с использованием перийодатного окисления полисахаридных цепей фермента с образованием активных альдегидные групп, способных далее вступать в реакцию с аминогруппами биологических молекул. С использованием выбранных модельных белков (ТР и ТТР) или их конъюгатов (ТР-ФЛ и ТР-ПХ) были получены функционализированные наночастицы на основе полистирольных карбоксилированных наносфер размером 80 нм. Функционализация поверхности монолитного слоя (биочипа) или проточной колонки (диска) осуществлялась одним из аффинных партеров выбранных пар (МАт против ТТР и СИТР). Метод прямой иммобилизации белков, широко используемый для модификации поверхности монолитных дисков, был перенесен на формат непроточных слоев. Для этого чип, имеющий активную часть в виде слоя сорбента размером 25×18×0.2 мм, погружался в раствор лиганда (Таблица 10). Для иммобилизации СИТР и МАт против ТТР на поверхности макропористых монолитных сорбентов (дисков) использовали: 1. прямую одностадийную иммобилизацию СИТР в статических условиях; 2. иммобилизацию МАт против ТТР с использованием однократной гидравлической подачи шприцом раствора белка в поры с последующей длительной инкубацией реакционной смеси в статических условиях. Количество ковалентно связанного с поверхностью сорбента СИТР совпало с данными, полученными при иммобилизации того же лиганда на поверхности непроточного слоя биочипа (Таблица 10). Этот факт может являться косвенным подтверждением сходства морфологии монолитных сорбентов, полученных в процессе фото- и термополимеризации. В то же время, количество иммобилизованных МАт против ТТР на поверхности тонкого ГМА-ЭДМА слоя оказалась практически в три раза меньше такового, полученного при гидравлическом способе введения того же лиганда в поровое пространство диска. Очевидно, что при статическом способе иммобилизации лиганда проникновение молекул лиганда в поры сорбента и внутрипоровое движение молекул к эпоксидным группам, локализованным на стенках пор, лимитируется медленной стадией диффузии, что приводит к потере некоторой доли связываемого лиганда. Методом скоростного фронтального анализа на монолитных ГМА-ЭДМА дисках были определены характеристики связывания иммобилизованного аффинного лиганда с нативным белком-партнером и модифицированной аналогичным белком латексной частицей. Результаты динамических экспериментов, представленые далее в Таблице 10, сравнивались с аналогичными характеристиками, полученными на биочипе с использованием специально разработанного метода. С целью оптимизации процедуры анализа на чипе, а именно, оптимизации времени, необходимого для аффинного взаимодействия иммобилизованного лиганда с растворенным комплементом, проводили серию экспериментов, направленных на изучение адсорбции анализируемых веществ на поверхности модифицированного лигандом диска в статических условиях. Биоспецифическая адсорбция комплемента имела место при погружении диска с иммобилизованными МАт против ТТР на 15 и 90 минут в растворы различных концентраций ТТР или полимерных наночастиц, модифицированных ТТР. Для достижения в статических условиях величины динамической адсорбционной емкости сорбента по отношению к наночастицам потребовалось гораздо больше времени, а именно, 90 минут (Таблица 10). Этот факт можно объяснить очень медленной диффузией вирусоподобных частиц в пределах жесткого макропористого пространства в отсутствии конвективного потока. 21 Количественный анализ образования аффинных пар СИТР-ТР и МАт-ТТР, осуществляемый на биочипе Характеристики аффинного связывания (максимальная адсорбционная емкость Qmax и термодинамическая константа диссоциации аффинных комплексов Kdiss) в формате биочипа с участием нативных белков (ТТР и ТР) определялись по разработанной для этого методике и сравнивались с параметрами, полученными для наночастиц, функционализированных теми же белками. В случае аффинной пары МАт - ТТР использовался непрямой «сэндвич» метод (ИФА), тогда как СИТР - ТР комплекс оценивался прямым методом с использованием флюоресцентного (ФЛА) и ферментного маркеров (ИФА). Процесс аффинного связывания комплементов происходил в течение 15 минут как для случая прямого, так и «сэндвич» методов. Это время было рассчитано для толщины ГМА-ЭДМА слоя в биочипе (0.2 мм), которая в 7.5 раз была меньше половины толщины монолитного диска (1.5 мм), где проникновение вещества из раствора в поровое пространство в статических условиях (в течение 90 минут, см. выше) происходит в двух направлениях, т. е. как снизу, так и сверху погруженного в раствор диска. И действительно, в формате биочипа выбранное время проникновения анализируемых веществ (белков и более крупных частиц) и реализации аффинной адсорбции оказалось достаточным, что позволило получить близкие значения адсорбционной емкости в сравнении с емкостью, детектируемой в случае использования аффинных дисков (Таблица 10). Количественное определение содержания целевого компонента осуществлялось методом твердофазной денситометрии (в УФ и видимой области спектра, соответственно) относительно калибровочной прямой построенной с использованием растворов белка или наночастиц известной концентрации. Линеаризация экспериментальных изотерм адсорбции позволила получить параметры аффинного связывания (Таблица 10). Неполное соответствие величин аффинного связывания (Таблица 10), полученных для пары МАт-ТТР в двух рассматриваемых форматах биоанализа (динамической режим ВЭМДАХ и биочип), можно объяснить различием схем образования аффинного комплекса, а именно прямого способа комплексообразования в проточной системе и комплексообразования с использованием «сэндвич» метода в непроточном варианте. Таблица 10 Определение параметров связывания для модельных аффинных пар в двух форматах Аффинная пара Параметры ρх10-17, глобул белка/мл сорбента kdiss(СИТР-TР)х107, M Q’max(TР)х102, глобул белка/глобулы лиганда Q’’max (ПС-TР)х105, частиц/глобулы лиганда (1) МАт-ТТР ВЭМДАХ Динамическая Статическая 33.0 Биочип ИФА 9.0 СИТР-ТР Биочип ВЭМДАХ ФЛА ИФА 0.7 0.7 0.6 2.0 2.5 1.0 1.1 1.0 0.6 3.8 1.2 (15 мин) 2.0 (15 мин) 6.0 (90 мин) 1.6 15.0 14.0 5.0 3.0 7.2 7.3 4.5 7.0 Q’max = (Q max/ M) x NA /ρ (2) Q”max = (Q max/ Q*)/ρ, где Q*= q/N Q’ max - максимальная адсорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка (мг), рассчитанное из данных фронтального анализа; Q’’max - количество белка (мг), рассчитанное с использованием формул (1) и (2); M молекулярная масса белка; NA - число Авогадро; Q* - количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 нансферой; q – суммарное количество белка, иммобилизованное на поверхности всех наносфер в растворе; N - количество наносфер в растворе; ρ – концентрация аффинных лигандов. Стандартное отклонение при линеаризации изотерм адсорбции 0.9745-0.9987 (Origin). Предел чувствительности для пары МАт - ТТР составил 7.1х107 модифицированных ТТР наночастиц на спот. В случае другой аффинной пары (СИТР-ТР) при использовании 22 флуоресцентного маркера наблюдалось практически полное совпадение характеристик аффинного связывания, полученных в двух рассматриваемых форматах (Таблица 10). Предел чувствительности для этого варианта анализа составил 9.8х107 модифицированных конъюгатом ТР-ФЛ наночастиц на спот. Несколько более низкие значения данных параметров, а именно 2.1х107 модифицированных конъюгатом ТР-ПХ наночастиц на спот, были получены для этой же аффинной пары при использовании ферментной метки (Таблица 10), что, вероятно, может быть связано со стерическими ограничениями при образовании аффинного комплекса СИТР-ТР, которые создает молекула пероксидазы хрена, существенно превосходящая в размерах глобулу трипсина. Тем не менее, значение константы диссоциации для этой аффинной пары хорошо согласуются в проточном и непроточном форматах монолитного сорбента. Таким образом, оптимальная поровая структура монолитного слоя в непроточном формате обеспечивает возможность эффективных аффинных взаимодействий с участием крупных объектов. Полученные данные подтверждают предположение о сходстве адсорбционного поведения наночастиц в двух сравниваемых в данном разделе форматах монолитных поверхностей. Как прямой, так и непрямой - «сэндвич» - методы анализа могут быть рекомендованы для применения в диагностике вирусных инфекций. 2.2.5.2. Обнаружение вирусов гриппа в биологических образцах с использованием разработанной тест-системы на основе биочипов Разработанная стратегия анализа вирусоподобных частиц в формате биочипа легла в основу создания микротест-систем, предназначенных для ранней диагностики гриппа. Предварительные эксперименты с использованием «сэндвич» метода анализа биологических жидкостей, содержащих вирусы гриппа А или В, показали удовлетворительные результаты. Однако с целью сокращения времени анализа использовали прямой метод детектирования, а также оптимизировали процедуру анализа, в частности, время иммобилизации биологических образцов (вирусов). Отсутствие окрашивания зон с иммобилизованными контрольными образцами и достаточная чувствительность (0.2 гае), достигаемая за два часа иммобилизации, позволила перейти к решению более сложных задач, а именно к ранней диагностики вирусов гриппа. На основе результатов анализа клинического материала 83 пациентов, который параллельно тестировался классическими методами диагностики вируса гриппа, были получены следующие характеристики разработанной тестсистемы: чувствительность – 80 и 93 %; специфичность – 61 и 83 % для вирусов А и В, соответственно. Следует заметить, что данные, полученные на предлагаемом нами биочипе, соответствуют средним характеристиками известных тест-систем при значительном сокращении времени анализа. Выводы 1. Впервые получены физико-химические модели вирусов с использованием диальдегидной сшивки белка и ковалентной модификации реакционноспособной поверхности наносфер белками и другими лигандами, имитирующими компоненты вирусной оболочки. 2. Методом высокоэффективной ионообменной и аффинной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках проведен сравнительный анализ адсорбционного поведения нативных белков (овальбумина, трипсина, соевого ингибитора трипсина, транстиретина) и модельных наночастиц на их основе; показано, что адсорбция модельных частиц определяется природой и количеством привитого лиганда. 3. Впервые сконструирована модельная система, имитирующая адсорбционное взаимодействие вируса с клеткой; методом скоростной аффинной хроматографии на монолитах установлено влияние микроокружения на характеристики биоспецифического связывания вирусоподобных наночастиц с поверхностью сорбента. 23 4. Разработаны и оптимизированы оригинальные методы формирования биокомплементарной адсорбционной поверхности монолитной стационарной фазы для прямого выделения вируса гриппа из сложных биологических смесей; путем подбора наиболее эффективного лиганда, а также вариацией методов иммобилизации лиганда на поверхности сорбента предложен псевдо-аффинный скоростной вариант хроматографического выделения вируса гриппа А из биологических образцов. 5. На примере двух модельных аффинных пар белков (моноклональные антитела против транстиретина-транстиретин и соевый ингибитор трипсина-трипсин) разработан метод количественного определения вирусоподобных частиц в формате полимерных биочипов; апробирован макет биочипа, предназначенный для нанодиагностики вирусов гриппа А и В. Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях: 1. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Evseeva, A. Menshikova, E. Vlakh, T. Tennikova. Study of dynamic adsorption behavior of large-size protein-bearing particles // J. Chromatogr. A 2007. V. 1144. № 1. P. 40-47. 2. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova. Macroporous monolithic layers as efficient 3-D microarrays for quantitative detection of virus-like particles // Anal. Chem. 2007. V. 79. № 14. P. 5173-5181. 3. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova. Development of a new strategy of influenza virus separation based on pseudo-affinity chromatography on short monolithic columns // Anal. Chem. 2008, V. 80. № 6. P. 2188-2198. 4. I. Kalashnikova, E. Vlakh, T.Evseeva, A. Menshikova, T. Tennikova, Study of dynamic adsorption behavior of large-size protein bearing particles, in: Book of abstracts of the 5th International Symposium “Molecular Mobility and Order in Polymer Systems”, Saint-Petersburg, Russia, 2005, P. 116. 5. И. В. Калашникова, Н. Д. Иванова, А. Ю. Меньшикова, Т. Б. Тенникова, Изучение динамической адсорбции укрупненных белковых молекул в условиях хроматографии на монолитных сорбентах, в: Сборник тезисов II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах», Санкт-Петербург, Россия, 2006, Ч. 3, С. 89. 6. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Evseeva, A. Menshikova, T. Tennikova, Study of dynamic adsorption behavior of virus-mimiking synthetic particles bearing different protein at their outer surface, in: Book of abstracts of Monolith Summer School (MSS 2006) “Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis”, Portoroz, Slovenia, L19, P.26. 7. I. Kalashnikova, N. Ivanova, M. Slabospitskaya, T. Tennikova, Use of microarray approach for quantitative detection of virus-like particles, Monolith Summer School (MSS 2006) “Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis”, Portoroz, Slovenia, 2006, http://www.monoliths.com/library/pdf/posters/Kalashnikova_MSS_06.pdf . 8. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, New generation of bioanalytical microarrays for quantitative detection of human viruses, in: Book of abstracts of the “International Congress on Analytical Sciences”, ICAS-2006, Moscow, Russia, 2006, P. 249. 9. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, S. Ilisavsky, Development of novel approach using monolithic sorbents for quantitative isolation of influenza viruses, in: Book of abstracts of the young scientists and students international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology”, Odessa, Ukraine, 2007, P. 87. 10. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, Development of microarray approach for diagnostics of influenza viruses, in: Book of abstracts of the young scientists and students international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology”, Odessa, Ukraine, 2007, P. 102.
