Протокол выявления методом ОТ

Протокол выявления методом ОТ-ПЦР в реальном времени вируса птичьего гриппа A(H7N9)
8 апреля 2013 г.
Обновлен 15 апреля 2013 г.
Сотрудничающий центр ВОЗ по референс-диагностике и изучению гриппа при Национальном
центре Китая по гриппу в Пекине предоставил прилагаемый протокол выявления в реальном
времени с помощью ОТ-ПЦР вируса птичьего гриппа A(H7N9).
Настоятельно рекомендуется незамедлительно направлять все не поддающиеся
субтипированию образцы гриппа А в один из шести Сотрудничающих центров ВОЗ по гриппу
в рамках Глобальной системы эпиднадзора за гриппом и ответных мер (ГСЭГОМ)1 для
тестирования и анализа.
Для получения дополнительной информации просьба связаться с нами по адресу: gisrswhohq@who.int
Сотрудничающий центр ВОЗ по референс-диагностике и изучению гриппа
Национальный центр Китая по гриппу
Национальный институт по борьбе с вирусными заболеваниями и их профилактике, ЦБЗ Китая
1/5
Протокол выявления методом ОТ ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦРрв) вируса птичьего
гриппа A(H7N9)
(15 апреля 2013 г.)
Настоящий протокол разработан Сотрудничающим центром ВОЗ в Пекине, который
является его собственником. Он предоставлен для использования в чрезвычайной ситуации
в качестве услуги для общественного здравоохранения. Он не предназначен для
коммерческой разработки или получения прибыли.
1.
Цель
Для конкретного выявления вируса птичьего гриппа A(H7N9) с использованием в
реальном времени ОТ-ПЦР с конкретными праймерами и зондами, мишенями которых
являются матрица, гены H7 и N9.
2.
Материалы и оборудование
2.1 Система для флуоресцентного количественного ПЦР-анализа в реальном времени
2.2 Настольная центрифуга для пробирок Эппендорфа на 1,5мл
1
http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/collaborating_centres/list/en/
2.3 Дозаторы на 10, 200, 1000 μL и наконечники с пробками
2.4 Встряхиватель типа Vortex
2.5 Мини-набор RNeasy фирмы «Квиаген»
2.6 Набор для одноэтапной ОТ-ПЦР по антигенным свойствам
2.7 Конкретные праймеры и зонды для генов H7 и N9 представлены в сводном виде в таблице
ниже. Кроме того, для типирования всех вирусов гриппа А и внутреннего контроля в ходе
тестов рекомендуется использовать M-ген в качестве мишени праймеров и зондов и такой ген
«домашнего хозяйства», как РНП.
Сотрудничающий центр ВОЗ по референс-диагностике и изучению гриппа
Национальный центр Китая по гриппу
Национальный институт по борьбе с вирусными заболеваниями и их профилактике, ЦБЗ Китая
2/5
Таблица праймеров и зондов для ПЦР
Идентификатор
Последовательность
Примечание
H7
CNIC-H7F
5'-AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA-3'
Праймер
CNIC-H7R
5'-GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG-3'
Праймер
CNIC-H7P
5'FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1-3'
Зонд
N9
CNIC-N9
5’ –TAGCAATGACACACACTAGTCAAT-3’
Праймер
CNIC-N9R
5’ –ATTACCTGGATAAGGGTCATTACACT-3’
Праймер
CNIC-N9P
5’FAM- AGACAATCCCCGACCGAATGACCC -BHQ1-3’
Зонд
FluA
InfA прямой
5’ GACCRATCCTGTCACCTCTGA C 3’
Праймер
InfA прямой
5’ AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA3’
Праймер
InfA зонд 1
5’ FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-BHQ1-3’
Зонд
РНКаза P
РНКаза P прямая
5’ AGATTTGGACCTGCGAGCG 3’
Праймер
РНКаза P обратная
5’ GAGCGGCTGTCTCCACAA GT3’
Праймер
РНКаза P, зонд 1
5’FAM-TTCTGACCTGAA GGCTCTGCGCG-BHQ1-3’
Зонд
Примечание: наборы праймеров/зондов FluA и РНКазы были указаны в опубликованном
протоколе ВОЗ, предоставленном Центрами борьбы с болезнями, Атланта.
2.8 Другие материалы: свободные от РНКазы пробирки Эппендорфа на 1.5мл, свободные от
РНКазы пробирки для ПЦР на 0,2мл, разовые латекстные перчатки без присыпки, защитные
очки, головной убор, бахилы для обуви, наконечники для дозаторов, β-тиогликоль, 70% спирт.
3.
Биобезопасность
Лизис образцов (рекомендуется лизисный буфер в 500 μL с клиническими образцами в
200 μL) следует проводить на объекте с уровнем биологической защиты BSL-2 и средствами
индивидуальной защиты BSL-3. Последующие манипуляции можно проводить в лаборатории
BSL-2 с отдельными помещениями, в т.ч. для приготовления реагентов, подготовки образцов и
зоной амплификации/детекции. Свободная от ДНК зона является «чистой», а зона с
амплифицированной ДНК – «грязной». Рабочий процесс осуществляется в направлении из
«чистой» зоны в «грязную».
Сотрудничающий центр ВОЗ по референс-диагностике и изучению гриппа
Национальный центр Китая по гриппу
Национальный институт по борьбе с вирусными заболеваниями и их профилактике, ЦБЗ Китая
3/5
4.
Процедуры
4.1 Экстракция нуклеиновых кислот
Эта процедура выполняется в боксе для билогически опасных веществ с уровнем защиты BSL-2
в зоне приготовления образцов в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.
Рекомендуется провести элюцию РНК с помощью конечного объема H2O в 50 μL.
4.2 Параметры контроля качества
Негативный контроль: стерильная вода экстрагируется в качестве негативного контроля
одновременно с экстрагированием нуклеиновой кислоты других образцов.
Слепой контроль реагента: свободная от РНКазы H2O.
Позитивный контроль: РНК предоставленногор вируса A(H7N9).
Внутренний позитивный контроль: рекомендуется рибонуклеопротеин (РНП).
4.3 Приготовление реакционной системы
(1) Растопить при комнатной температуре мастер-микс, праймеры и зонды для ОТ-ПЦР в зоне
приготовления реагентов в помещении с уровнем биобезопасности BSL-2.
(2) Приготовить реакционную смесь. Различные пары праймеров и зонды следует готовить,
соответственно, в различных пробирках. Для каждой реакции:
Компоненты
Объем（μL）
2× мастер-микс для ОТ-ПЦР
12.5
Прямой праймер （40μM）
0.5
Обратный праймер （40μM）
0.5
Зонд （20 μM）
0.5
25xсмесь энзимов ОТ-пцр
1
Матрица РНК
5.0
Свободная от РНКазы H2O
5
Итого
25
4.4 Аликвотировать реакционную смесь в пробирки для ПЦР по 0.2мл или в 96-луночную
плашку для ПЦР по 20μL на пробирку и ясно маркировать.
Сотрудничающий центр ВОЗ по референс-диагностике и изучению гриппа
Национальный центр Китая по гриппу
Национальный институт по борьбе с вирусными заболеваниями и их профилактике, ЦБЗ Китая
4/5
4.5 Добавить пять μL матричной РНК для негативного контроля, тестируемые образцы или
позитивный контроль в отдельные пробирки с реакционной смесью в боксе для опасных
биологических веществ BSL-2 в зоне приготовления образцов.
4.6 Поместить пробирки в ПЦР-циклер для определения в реальном времени с помощью ОТПЦР и использовать следующую прогрмму для циклирования:
(1) 45℃ 10мин
(2) 95℃ 10мин
(3) 95℃ 15с.
(4) 60℃ 45с.
Вернуться к 3-му этапу и осуществить 40 циклов
4.7 Результаты анализа:
Результаты определяются при обеспечении контроля качества.
(1) Образец является негативным, если значение Ct не поддается определению,
(2) образец является позитивным, если значение Ct≤38.0.
(3) Образцы с Ct выше 38 предлагается подвергнуть повторному исследованию. Образцы
можно считать позитивными, если повторные результаты окажутся неизменными, т.е. Ct
превышает 38. Если повторное значение Ct нельзя установить, то образец считается
негативным.
4.8 Критерии контроля качества:
(1) Результат негативного контроля должен быть негативным.
(2) Значение Ct позитивного контроля не должно превышать 28.0.
(3) В противном случае, тест является недействительным.
Сотрудничающий центр ВОЗ по референс-диагностике и изучению гриппа
Национальный центр Китая по гриппу
Национальный институт по борьбе с вирусными заболеваниями и их профилактике, ЦБЗ Китая
5/5
5.
Устранение ошибок
5.1 Ложноположительные результаты могут быть результатом загрязнения окружающей среды,
если выявляеися амплификация при негативном контроле и слепом контроле реагентов.
Следует строго соблюдать однонаправленность рабочего процесса. В случае
ложноположительных результатов следует принять следующие меры: провентилировать
лаборатории, вымыть и очистить рабочее место, обработать в автоклаве центрифужные
пробирки и наконечники и использовать свежие реагенты.
5.2 Если значение Ct позитивного контроля выше 30, то следует учитывать деградацию РНК.
Все материалы должны быть свободны от РНКазы.
6.
Предостережение
6.1 Во избежание перекрестного контаминирования нуклеиновой кислоты добавьте в
реакционную смесь сначала негативный контроль, затем образец и после этого позитивный
контроль, соответственно.
6.2 Требуется специально выделенное оборудование для каждой зоны, в том числе для
лабораторных халатов, дозаторов, наконечников с пробками и разовых латексных перчаток
без присыпки.
6.3 Соблюдайте инструкции по обслуживанию инкубатора, ПЦР-циклера и дозаторов.
Калибровку следует производить каждые 6 месяцев.
7.
Ограничения в отношении использования протокола
Эти протоколы были оптимизированы с использованием одноэтапного количественного зонда
ОТ-ПЦР (одноэтапный набор для ОТ-ПЦР AgPath), который позволяет получить сопоставимые
результаты на 96-луночных системах термоциклирования, например инструментах
количественной ПЦР «Стратажен» (MX3000® или MX3005®).