(1) - Российский онкологический научный центр им. Н. Н
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМЕНИ Н.Н. БЛОХИНА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК На правах рукописи Бармашов Александр Евгеньевич ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН 14.01.12 – «онкология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников МОСКВА – 2013 ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений..............................................................................................4 Введение...................................................................................................................5 Глава 1. Обзор литературы.................................................................................9 1.1. Иммунотерапия онкологических заболеваний..............................................9 1.2. Клеточный противоопухолевый иммунитет................................................16 1.3. Гуморальный противоопухолевый иммунитет...........................................22 1.4. Методы исследования иммунного ответа....................................................25 1.4.1. Иммуноцитохимическая реакция.............................................................29 1.4.2. Проточная цитометрия...............................................................................33 1.4.3. Метод ELISPOT..........................................................................................35 Глава 2. Материалы и методы исследования................................................39 2.1. Материалы и реактивы...................................................................................39 2.2. Оборудование.................................................................................................40 2.3. Методы исследования....................................................................................41 Глава 3. Результаты исследований..................................................................49 3.1. Оценка Т-клеточного иммунного ответа методом ELISPOT у больных меланомой, получающих противоопухолевую вакцину Мелавак................................................................................................................. 49 3.2. Оценка Т-клеточного иммунного ответа методом ELISPOT у больных меланомой, получающих дендритноклеточную противоопухолевую вакцину.............................................................................................65 3.3. Оценка гуморального иммунного ответа у больных меланомой, получающих противоопухолевые вакцины........................................................78 3.4. Сравнение Т-клеточного иммунного ответа у больных, получа- 2 ющих дендритноклеточную вакцину, с некоторыми клиническими показателями..........................................................................................................90 Глава 4.Обсуждение результатов исследований...........................................97 ВЫВОДЫ............................................................................................................104 Список литературы...........................................................................................105 3 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АПК АТ БЦЖ ГЗТ ГМ-КСФ Антиген-презентирующая клетка Антитело Аттенуированные микобактерии Кальметта–Жерена Гиперчувствительность замедленного типа Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ДК Дендритная клетка ИЛ Интерлейкин ИФН-γ Интерферон-гамма МКА Моноклональное антитело МПК Мононуклеарные клетки периферической крови ОАА Опухолеассоциированные антигены ОЛ ФГА Опухолевый лизат Фитогемагглютинин ФИЦХ Флуоресцентный иммуноцитохимический анализ ФНО-α Фактор некроза опухоли альфа ЦТЛ Цитотоксический Т-лимфоцит ADCC CD ELISPOT Антителозависимая клеточная цитотоксичность Кластер дифференцировки Enzyme-Linked ImmunoSpot — твердофазная модификация метода иммуноферментного анализа FITC Флуоресцеинизотиоцианат HLA Человеческий лейкоцитарный антиген ITAM Активационная последовательность иммунных рецепторов МНС Главный комплекс гистосовместимости PBS Phosphate buffered saline – фосфатно-солевой буфер PE Фикоэритрин TGF Трансформирующий фактор роста 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Важной проблемой медицины является разработка новых методов борьбы со злокачественными новообразованиями у людей. Одно из направлений этой работы – биотерапия, где при лечении больных используются различные цитокины, интерфероны, моноклональные антитела, а также разные противоопухолевые вакцины. В онкологической клинике проходят испытания цельноклеточные, пептидные, генномодифицированные и дентритноклеточные вакцины. Первоначально в вакцинотерапии рака применяли цельноклеточную вакцину. Однако не было получено воспроизводимого терапевтического эффекта при лечении больных данными препаратами [94, 128, 165]. Методы генной инженерии позволяют вводить в опухолевые клетки гены, отвечающие за синтез антигенов или цитокинов, что повышает их иммуногенность [71, 134, 103]. Аналогичные показатели клинического ответа наблюдаются при использовании вакцин на основе дендритных клеток [131, 135, 151]. В ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН созданы и прошли I и II фазы клинических испытаний генномодифицированная и дендритноклеточная вакцины. Цель создания подобного рода препаратов заключается в том, чтобы путем активации клеточного и в меньшей степени гуморального иммунных злокачественных ответов новообразований. повысить Эти эффективность вакцины были лечения оценены по объективным клиническим результатам, тогда как оценка иммунологических ответов проводилась не в полном объеме. По данным литературы клинический и иммунологический ответы на вакцинотерапию неоднозначны [69]. Иммунологические ответы проявляются в большем проценте случаев, чем ответы клинические. В основном определяют Т-клеточный ответ на вакцинотерапию, а гуморальный ответ не исследуется. Однако вакцинотерапия может вызывать как активацию Т5 хелперов 1 типа, ответственных за Т-клеточный иммунный ответ, так и 2 типа, отвечающих за гуморальный ответ. Эти вопросы не были решены во время проведения I и II фаз клинического исследования вакцин. По этой причине необходимо раскрыть степень выраженности иммунного ответа на фоне вакцинации. Есть исследования, которые отдельно изучают цитокиновый профиль, клеточный и гуморальный противоопухолевые иммунные ответы. Но на данный момент в России не представлено ни одной работы, сопоставляющей с помощью разных методов вышеуказанные звенья иммунитета у онкологических больных в процессе иммунизации. Целью работы является изучить иммунологическую эффективность двух противоопухолевых вакцин (Мелавак и дендритноклеточную) с помощью нескольких методов, касающихся как клеточного, так и гуморального иммунных ответов. Вакцины на основе нагруженных опухолевым лизатом дендритных клеток и облученных опухолевых предназначены для активации эффекторного звена иммунитета для уничтожения опухоли. Идея создания данной вакцины основана на сведениях о взаимодействии клеток иммунной системы и антиген-презентации. Дендритная клетка представляет фрагмент антигена в комплексе с молекулами HLA-ABC и HLA-DR как Т-хэлперам, так и Т-киллерам, чем запускает каскад реакций, направленных на уничтожение клеток-мишеней. Предполагается, что и презентация опухолевых пептидов в иммуногенном комплексе будет способствовать специфической активации Т-лимфоцитов и, в конечном счете, реализации их цитотоксического действия на опухоль [5, 13, 19]. Это, впрочем, не исключает активации и неспецифического противоопухолевого иммунного ответа [2, 6, 14, 22, 43, 51]. Определение взаимосвязи между звеньями иммунитета и клиническими показателями, равно как и степени выраженности иммунного ответа при использовании цельноклеточных противоопухолевых вакцин является актуальной проблемой онкологии. 6 Цель работы Оценить иммунологическую эффективность дендритноклеточной вакцины и вакцины Мелавак. Задачи исследования Оценить 1. Т-клеточный противоопухолевый иммунитет методом ELISPOT у больных меланомой, получающих вакцинотерапию. Оценить гуморальный противоопухолевый иммунитет у больных 2. меланомой по образованию антител к опухолеассоциированным антигенам в процессе вакцинотерапии. Изучить корреляцию между степенью иммунного ответа и 3. клиническими параметрами у вакцинированных больных меланомой. Определить прогностическую значимость иммунологического 4. ответа у больных меланомой, получающих вакцинотерапию, на течение заболевания. Научная новизна Впервые одновременно оценены гуморальный и клеточный иммунный ответы у больных меланомой, получивших дендритноклеточную вакцину и вакцину Мелавак. Т-клеточный изучен противоопухолевый иммунитет методом ELISPOT, а гуморальный противоопухолевый иммунитет – по образованию антител к опухолеассоциированным антигенам. Изучена корреляция между степенью иммунного ответа и клиническими параметрами у вакцинированных больных меланомой. Определена прогностическая значимость иммунологического ответа у вакинированных больных меланомой. Научно-практическая значимость Полученные результаты являются основанием для применения противоопухолевых цельноклеточных вакцин в клинической практике. 7 Применение метода ELISPOT позволяет прогнозировать течение онкологических заболеваний на фоне вакцинотерапии. Публикации По теме диссертации опубликовано 7 научных работ в журналах рекомендованных ВАК РФ: 3 статьи и 4 тезисов конференций. Объем и структура работы Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, включая библиографию и иллюстрации. Состоит из введения, литературного обзора, общей характеристики материалов и методов исследования, главы описания собственных исследований, главы обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 200 источников, в том числе 169 публикаций зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и сопровождается 11 таблицами. 8 Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ИММУНОТЕРАПИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Актуальной проблемой медицины является разработка новых терапевтических методов борьбы с злокачественными новообразованиями у людей. Одним из направлений этой работы является биотерапия [4, 5]. Спектр используемых в биотерапии препаратов и способов их применения широк. В настоящий момент в клинике применяют препараты на основе моноклональных антител (МКА) (Герцептин и др.) [108, 139], цитокины (разные семейства интерлейкинов, интерфероны и др.) [11, 12, 167]. Проходят разные стадии клинических испытаний противоопухолевые вакцины [117, 135, 172]. Важной составной частью биотерапии является иммунотерапия. Главным ее отличием от других биотерапевтических подходов является направленость на стимуляцию противоопухолевого иммунитета пациентов [6, 7]. К иммунотерапии относят применение противоопухолевых вакцин, иммуностимуляторов и цитокинов [11, 73, 116, 193]. К противоопухолевым вакцинам принадлежат вакцины на основе цельных или лизированных опухолевых клеток [22, 122], дендритные клетки, нагруженные опухолевыми антигенами [2, 145], дендритомы (слитые дендритные/опухолевые клетки) [8, 37], лимфокинактивированные лимфоциты [104], а также лимфоциты, выделенные из опухолевого инфильтрата (TIL-терапия) [109] и др. Классифицируют противоопухолевые вакцины по разным категориям: по способу доставки антигена, по диапозону применения, по природе антигена. По способу доставки вакцинотерапию разделяют на четыре основных типа. 9 1. Иммунизация проводится посредством генной конструкции, кодирующей тот или иной опухолевый антиген. 2. Для введения используют сам антиген (пептиды, белок или лизат из опухолевых клеток). 3. Вводят облученные опухолевые клетки (главным образом, модифицированные). 4. В качестве вакцины применяют дендритные клетки, нагруженные антигенами опухоли. Довольно редко в клинической практике применяется генетическая конструкция, кодирующая опухолевый антиген [68]. Суть данного подхода заключается во внедрении гена с помощью вирусного вектора в клетку, после чего происходит синтез соответствующего опухолевого белка, его переработка до отдельных пептидных фрагментов и представление их в комплексе с молекулами MHC I класса. После этого он распознается иммунокомпетентными клетками. После того, как антиген введен в организм, он захватывается антигенпрезентирующими клетками (АПК), процессируется и затем представляется в виде пептидов, находящихся в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). Особенность применения опухолевых пептидов заключается в том, что они способны напрямую взаимодействовать с аллельными MHC на поверхности клеток пациента без предварительного захвата и переработки АПК (с последующим представлением Т-лимфоцитам) [184]. По своей синтетические Синтетическим природе [147], путем применяемые антигены нативные получают [122] или пептиды подразделяют рекомбинантные на [106]. опухолеассоциированных антигенов. Под «нативными антигенами» понимают, как правило, лизат (ОЛ), полученный из клеток опухоли больного [52]. Рекомбинантные антигены получают при трансфекции гена, кодирующего соответствующий белок, в бактерию с последующей наработкой данного белка и очисткой. Вакцины на основе цельных опухолевых клеток представляют собой 10 аутологичные или аллогенные опухолевые клетки, которые облучают и вводят вместе с иммунологическим адъювантом(ами) для привлечения антиген-презентирующих клеток хозяина [14, 87, 91]. Традиционным адъювантом, который положительно зарекомендовал себя в такого рода исследованиях, являются живые аттенуированные микобактерии Кальметта–Жерена (вакцина БЦЖ) [91]. Кроме того, используют геномодифицированные вакцины [17, 20, 54]. Геномодифицированные вакцины на основе аутологичных или аллогенных опухолевых клеток получают путем трансфекции этих клеток различными генами (последовательностями экспрессию или синтез экзогенной молекул ДНК), цитокинов которые или других вызывают белков, активирующих иммунный ответ или обладающих токсическим действием в отношении клеток опухоли. Например, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) вызывает положительный хемотаксис и активацию моноцитов и гранулоцитов крови, а также тканевых макрофагов [75, 159]. Трансфекция опухолевых клеток геном, кодирующим данный цитокин, производится при приготовлениии вакцин Gvax [186], Мелавак [3, 18] и ряда других. Разрушенные клеточные фрагменты цельноклеточной вакцины (образующиеся после естественной гибели) захватываются макрофагами, незрелыми дендритными клетками и происходит презентации опухолевых пептидов с молекулами HLA-ABC и HLA-DR Т-киллерам и Т-хэлперам для реализации противоопухолевого иммуного ответа [158]. Таким образом, достигается двоякое действие: к опухолевым клеткам привлекаются антиген-презентирующие клетки, а в результате захвата разрушенных клеточных фрагментов и процессирования пептидов происходит активация иммунного ответа против данных антигенов опухоли. Вакцинация облученными опухолевыми клетками изучалась на нескольких животных моделей начиная с 70-х гг XX века. Ученые Hanna et al. (1978) изучали действие данной вакцины на гепатоцеллюлярной 11 карциноме гвинейских свинок в сочетании с адъювантом БЦЖ. В этом исследовании был зафиксирован протективный эффект вакцины против последующего введения необлученных сингенных опухолевых клеток [82, 83]. Hoover et al. (1993) проводил клинические испытания с пациентами II/III стадии колоректального рака, которым также вводились аутологичные облученные опухолевые клетки [91]. Среди пациентов получающих иммунизацию процент смертности составлял 34,1% против 48,7% в контрольной группе. Подобное исследование проводилось Baars et al. (2000) при лечение больных с метастатической меланомой кожи [38]. 5-летняя выживаемость больных, получающих вакцину, составила 45% против 35 и 20% (в зависимости от стадии заболевания) у пациентов, которым проводилось только хирургическое лечение. Использование аутологичной цельноклеточной вакцины на основе опухолевых клеток имеет ряд недостатков. Во-первых, не во всех случаях удается получить стабильную клеточную линию из опухолевого материала больных. Во-вторых, обычно время ее получение достигает несколько месяцев с сопутствующими трудностями трансфекции и получения клонов с высоким уровнем секреции цитокина. В случае применения аллогенной вакцины устраняется проблема, связанная с трудностью и длительностью получения клеточной линии, однако возникает опасность отторжения трансплантата. Всех указанных недостатков лишены аллогенные опухолевые клетки, лишенные молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов, так как трансплантационного в этом случае иммунитета и не происходит активации предполагается наличие противоопухолевого в результате захвата клеточных фрагментов опухоли макрофагами и незрелыми дендритными клетками. Такой подход осуществлен при изготовлении вакцин Gvax и Мелавак [3, 21]. Другой способ устранения сложностей при введении аллогенной вакцины – это введение пациентам разных опухолевых линий. Данный подход был 12 реализован, в частности, при создании вакцины Canvaxin [129], представляющая собой 3 клеточные линии меланомы. Культуральные клетки меланомы используют и при создании отечественных противоопухолевых вакцин [18]. Клиническая эффективность аллогенных геномодифицированных цельноклеточных вакцин находится в диапозоне от 12% до 20% [112]. В одной из работ при введении данной вакцины наблюдалось развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), что говорит о стимуляции специфического противоопухолевого иммунитета [75]. В этом же исследовании показано увеличение титра IgG и IgM на определенных этапах вакцинации у больных, получающих ГМ-КСФ-секретирующую цельноклеточную вакцину по сравнению с больными, получающих вакцину без экспрессии данного цитокина. При этом было зафиксировано увеличение эозинофилов и базофилов в периферической крови, а также уменьшение числа моноцитов. Полученные данные свидетельствуют о развитии гуморального, но не клеточного иммунитета. Открытие дендритных клеток относится к 1973 году, где в научной работе Steinman они были описаны и охарактеризованы [168]. Несмотря на это, их особенности и функциональные свойства стали изучаться только в 90х гг. XX века [40, 148]. Дендритные клетки – профессиональные, наиболее мощные антиген-презентирующие клетки, благодаря которым запускается целенаправленный иммунологический ответ [65, 152]. сведений об их функциональной активности, На основании разработке метода культивирования in vitro, дендритные клетки стали рассматривать в качестве перспективной противоопухолевой вакцины [43, 72, 146]. При создании вакцины на основе дендритных клеток, как правило, выделяют моноциты периферической крови, добавлют к ним ИЛ-4 и ГМ-КСФ для получения незрелых ДК; далее инкубируют с опухолевым антигеном (так называемая «нагрузка») и добавляют ФНО-α и простогландин Е2 для терминальной дифференцировки в зрелые ДК. Существуют разные способы «нагрузки» 13 опухолевыми антигенами дендритных клеток. 1. Содержание дендритных клеток с нативными или синтетическими пептидами, непосредственно взаимодействующих с молекулами главного комплекса гистосовместимости [191]. 2. Инкубация дендритных клеток с опухолевым лизатом, который представляет собой смесь белков, полученных при разрушении, лизировании опухолевых клеток [85]. 3. «Нагрузка» рекомбинантными опухолевыми антигенами дендритных клеток [174]. 4. Трансфицирование дендритных клеток ДНК и РНК, содержащими гены опухолевых антигенов [44]. 5. Захват и переработка убитых опухолевых клеток дендритными клетками [60]. 6. Получение дендритом – слитых дендритных клеток с опухолевыми [37]. Действие дендритноклеточных вакцин изучается при разных нозологиях: раке мочевого пузыря, колоректальном раке, меланоме, нейроглиоме и др. [2, 13, 16, 30] В исследовании дендритноклеточной Wheeler вакцины et у al. (2008) больных изучалось действие глиобластомой. У иммунизированных пациентов было большим время до прогрессирования, чем у неполучавших вакцину. Значения составили 308 ± 55 дней и 167 ± 22 дней соответственно. Время общей выживаемости данных пациентов также было выше у группы, которой вводилась вакцина: 642 ± 61 дней против 430 ± 50 дней. Показано увеличение эндогенной выработки ИФН-γ в процессе иммунизации [188]. В работе Ansary et al. (2013) был отмечен частичный ответ на дендритноклеточную вакцину у 2 пациентов из 15 (13,3%), стабильное течение заболевания – у 9 пациентов (60%) и прогрессирование зафиксировано у 4 пациентов (26,7%). В процессе иммунотерапии было 14 установлено статистически значимое увеличение CD8+ клеток в периферической крови, что говорит об активации Т-клеточного иммунного ответа [33]. В клиническое исследование Markowicz (2012) et al. были включены 24 больных III стадии меланомы. 3-х летняя общая выживаемость составила 68,2% в группе больных, иммунизированных вакциной дендритных клеток, против 25,7% в группе контроля. на основе Разница значений безрецидивной выживаемости в этих группах не достигла статистической значимости. Увеличение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток было отмечено в процессе вакцинотерапии у 13 из 19 больных [121]. Van Tendeloo et al. (2010) также было установлено увеличение ИФН-γсекретирующих клеток (сразу двумя методами) у больных острым миелоидным лейкозом в процессе иммунотерапии дендритноклеточной вакциной при сопутствующем клиническом ответе [181]. В работе Oshita et al. (2012) было изучено действие дендритноклеточной вакцины у 24 пациентов с метастатической меланомой. Отмечен 1 случай с частичной ремиссией; 7 случаев стабильного течения заболевания и 16 случаев прогрессирования. У 18 больных (75% пациентов) показано методом ELISPOT увеличение ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе терапии данной вакциной [135]. В некоторых других клинических испытаниях I и II cтадии опухолевого процесса, вакцины на основе дендритных клеток продемонстировали от 20 до 60% общего клинического ответа с повышением ряда иммунологических параметров [197]. Несмотря на большое количество исследований клинической и иммунологической эффективности противоопухолевых вакцин в научных центрах мира, до сих пор не представлено ни одной работы касающейся комплексной оценки иммунологической эффективности отечественных цельноклеточных вакцин, противоопухолевой направленности. 15 1.2. КЛЕТОЧНЫЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ИММУНИТЕТ Возникшая опухоль постоянно находится во взаимодействии с разными системами организма, не исключая и иммунную систему. Почти все клетки как врожденного, так и приобретенного иммунитета реагируют на опухоль, что вызывает иногда прямо противоположные последствия, которые варьируют в разных случаях от полного уничтожения опухоли до значительного усиления ее метастазирования. Достойно внимания то, что те же самые клетки, которые подавляют рост опухоли, иногда способствуют ее дальнейшему развитию. Судя по всему, не существует таких типов клеток, которые реализовывали бы только один из вариантов указанных действий. С другой стороны, касаясь опухоли, невозможно однозначно утверждать о ее чувствительности к противоопухолевой активности клеток иммунной системы или, наоборот, об ее полной резистентности. Важное значение во взаимодействии иммунокомпетентных клеток с опухолью имеют стресс-индуцированные молекулы, к которым относятся MICA и MICB, принадлежащие гистосовместимости [187]. к неканоничесим молекулам MICA и MICB представлены на поверхности опухолевых клеток и распознаются NKG2D, рецептором всех NK-клеток, части цитотоксических αβT-лимфоцитов и ряда γδT-лимфоцитов [39]. В результате связывания рецептора NKG2d, эксперессированного на поверхности лимфоцитов, со стресс-индуцированными молекулами клетокмишеней возникает импульс, улавливаемый адаптерными молекулами. Затем происходит последующая передача сигнала, конечным итогом которой является индукция эффекторного действия Т-клеток [187]. Вторым сигналом для осуществления лизиса клетки-мишени цитотоксическим Т-лимфоцитом является наличие молекул MHC I класса на ее поверхности в комплексе с характерными для опухоли пептидами (опухолеспецифическими или опухолеассоциированными). В случае осуществления киллерной функции NK-клетками необходимо отсутствие 16 молекул МНС (или пониженная их экспрессия) и присутствие опухолевых антигенов [138]. Первоначальная реакция иммунокомпетентных клеток на распознавание опухолевых включает в себя секрецию цитокинов воспаления, главным образом интерферона-γ [107] и фактора некроза опухолей (ФНО) альфа [119]. Макрофаги при распознавании опухоли выделяют ФНО-α, а γδTлимфоциты и NK-клетки секретирует по большей части γ-интерферон [163]. Вырабатываемые цитокины привлекают значительную часть клеток иммунной системы в опухоль. При начальных стадиях роста опухоли в ней обнаруживают инфильтрат, включающий в себя макрофаги, NK-клетки и NKT-лимфоциты Здесь [79]. посредством их действия происходит элиминация большого числа опухолевых клеток при сохранении, в силу разных причин, части клеток, избежавших лизиса и фагоцитоза. Несмотря на явное противоопухолевое действие иммунной системы на ранних стадиях ее взаимодействия со злокачественными клеткамиодновременно вырабатывается устойчивость опухолевых клеток к иммунологическим реакциям, направленных против них. Основополагающим признаком запуска данного процесса служит появление в клетках опухоли мРНК трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) [141]. Этот цитокин участвует в одном из определяющих механизмов, за счет которых опухолевые клетки подавляют активность иммунных реакций [42]. TGF-β, секретируемый клетками опухоли, снижает активность и фагоцитоз находящихся в опухоли макрофагов и производит их трансформацию в фенотип М2. В этом функциональном состоянии клетки ориентированы на поддержание развития опухоли [141]. На следующем этапе в опухоль направляются предшественники ДК, незрелые CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты [200]. Мигрировав в опухоль, незрелые предшественники ДК осуществляют пиноцитоз и фагоцитоз разных молекул и клеточных фрагментов, находящихся во внеклеточном пространстве [156]. 17 Процесс созревания АПК подразумевает два параллельно происходящих события – увеличение презентирующей способности клеток и миграцию в регионарные лимфоузлы. Миграция АПК осуществляется за счет экспрессирующегося на поверхности клеток рецептора CCR8, улавливающего хемокин CCL1, который осуществляет таксис АПК в лимфатический узел. NF-κB, относящийся к транскрипционным факторам, активируется в клетках после передачи сигналов с рецепторов ФНО-α, что обеспечивает экспрессию генов, посредством которых осуществляется миграция и усиление презентирующей способности клеток [120]. В процессе кросс-презентации пептиды опухолевых антигенов представляются в комплексе с молекулами MHC I и II классов, в результате чего АПК, мигрировавшие в лимфатические узлы, способны праймировать как CD4+ Т-лимфоциты, так и Т-киллеры (ЦТЛ) [53]. После прайминга из Т-клеток формируются две популяции Тлимфоцитов (CD4+ клетки-хэлперы и цитотоксические Т-лимфоциты), несущие на своей поверхности молекулу-корецептор CD8. Каждая популяция Т-лимфоцитов обладает противоопухолевым действием. Относящиеся к CD4+ клеткам Th2-клетки обладают опосредованным противоопухолевым эффектом за счет стимуляции созревания и формирования эффекторных клеток (в том числе путем секреции ИЛ-2) (рис. 1) [29]. Другая часть клеток (CD8+ ЦТЛ и CD4+ Th1) осуществляет процессы непосредственно в области опухолевой ткани. Таким образом, для реализации противоопухолевого действия этим клеткам существенно важна миграция в опухоль. Цитотоксические Т-лимфоциты, экспрессирующие корецептор CD8, служат главными эффекторами приобретенного противоопухолевого иммунитета [155]. Функция Th1 заключается в обучении Т-киллеров для реализации последними их цитотолитического действия [31]. Вторым способом реализации противоопухолевого действия CD4+ Th1 18 Рисунок 1 [31]. IL-2-зависимая пролиферация СD8+ Т-клеток клона, вовлекаемого в иммунный ответ. На примере CD8+ Т-клеток проиллюстрированы механизмы пролиферативной экспансии антигенспецифического клона. Презентация приводит к активации распознавших антиген CD4+ и CD8+ Т-клеток. Основной продукт активации (IL-2) в большем количестве выделяют CD4+ Т-клетки. CD8+ Т-лимфоциты используют его для размножения до численности, необходимой для обеспечения эффективного иммунного ответа. является инициация гиперчувствительности замедленного типа, что приводит к активации макрофагов в очагах опухолевого роста. Процесс базируется на том, что инфильтрирующие опухоль макрофаги, поглощают некоторые опухолевые антигены и представляют их фрагменты в контексте с молекулами MHC II класса. После проникновения Th1 клеток в опухоль, происходит распознавание Т-клеточным рецептором иммуногенного комплекса на поверхности макрофагов, после чего начинается синтез хэлперными клетками 1 типа интерферона-γ и других цитокинов, способствующих стимуляции активности макрофагов [177]. Активированные макрофаги более динамично и целенаправленно поглощают злокачественные клетки. CD8+ Т-лимфоциты осуществляют непосредственный лизис опухолевых клеток, а также клеток эндотелия, располагающихся в опухолевой строме 19 после распознавания антигенов, экспонированных в комплексе с молекулами MHC I класса (рис.2). Для полноценного противоопухолевого действия необходима выработка интерферона-γ [107]. Под влиянием данного цитокина усиливается экспрессия молекул MHC I класса на опухолевых клетках и клетках стромы опухоли, что приводит к повышению эффективности распознавания и силы активационного сигнала, что, в конечном счете, дает возможность Т-клетке индуцировать апоптоз в клеткахмишенях: секретируемый ЦТЛ перфорин образует поры в мембране атакуемых клеток. Через поры в опухолевые клетки проникают молекулы гранзима В, который запускает каскад процессов, приводящих к программированной клеточной гибели. Существуют и другие механизмы и способы уничтожения злокачественных клеток не только Т-лимфоцитами, но и другими клеточными популяциями. В частности, известна способность клеток натуральных киллеров и NKT-клеток к ликвидации опухоли. Кроме того, установлено, что активированные макрофаги и гранулоциты также вызывают гибель злокачественных клеток. Генерация цитотоксических Т-лимфоцитов требует присутствия 3-х сигналов. Первым из них служит взаимодействие между Т-клеточным рецептором и иммуногенным комплексом (молекулы MHC I класса с антигеном). Вторым – контакт между стресс-индуцированными молекулами MICA и MICB на опухолевых клетках и рецптором NKG2D, представленном на лимфоцитах. Третьим сигналом является секреция ИЛ-2, а также других цитокинов Т-хэлперами двух типов. Последние клетки активируются в результате распознавания их рецепторами антигенов опухоли в контексте с молекулами MHC класса. II После комплексной активизации цитотоксические Т-лимфоциты вызывают лизис опухолевых клеток посредством секреции перфоринов или способствуют запуску программированной гибели злокачественных клеток за счет Fas/FasL пути [190]. Важную роль в ограничении иммунологических реакций, направленных против опухоли, играют регуляторные Т-клетки (Treg) [50]. 20 Рисунок 2 [171]. Взаимодействие между ДК и Т-клетками. Несколько маркеров Treg, особенно два из них (GITR и CTLA-4), вовлечены в иммуносупрессорное действие этих клеток [96]. Treg подавляют активность CD4+ и CD8+ Т-клеток, ДК, В-лимфоцитов, макрофагов и клеток натуральных киллеров (НК-клеток). Свои функции регуляторные Т-лимфоциты осуществляют посредством нескольких механизмов. ИЛ-2 может увеличивать их активность путем повышения экспрессии FOXP3 и STAT5. Активированные Treg секретируют перфорин и гранзим А, чем оказывают цитотоксическое действие на CD4+ и CD8+ Тклетки и другие клетки иммунной системы [123]. Кроме того, Treg могут осуществлять уничтожение клеток непосредственно через взаимодействие Fas/FasL [80]. Взаимодействие между CTLA-4, конститутивной молекулой Treg, с лигандами CD80 и CD86 на поверхности ДК – важный сигнальный путь, с помощью которого регуляторные Т-клетки блокируют ко- стимуляторные функции дендритных клеток и последующую активацию Тлимфоцитов [124]. Lag-3, представленный на поверхности Treg, также подавляет активность незрелых ДК путем связывания с молекулами МНС II 21 класса и индуцирует ITAM-опосредованный сигнал препятствующий дифференцировки данных АПК [115]. Таким образом, эффективность противоопухолевого иммунного ответа в том числе зависит от активности Т-регуляторных клеток. 1.3. ГУМОРАЛЬНЫЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ИММУНИТЕТ Гуморальное звено иммунитета также участвует в реализации противоопухолевого иммунного ответа. Т-хэлперы 2 типа обеспечивают дифференцировку В-лимфоцитов в плазматические клетки, которые являются продуцентами противоопухолевых антител. На первом этапе развития гуморального иммунного ответа, направленного против опухоли, происходит попадание растворимого антигена опухоли в крово- и лимфоток и далее в лимфатические узлы, где находятся резидентные В-клетки [31]. В-клетки распознают антиген с помощью В-клеточного рецептора, затем происходит интернализация возникшего комплекса с последующей лизосомальной переработкой антигена и его высвобождением [31]. Одновременно интернализация комплекса В-клеточного рецептора с антигеном вызывает экспрессию белковой молекулы CD40, которая является костимулирующим рецептором. После внутриклеточной переработки антигена он доставляется в комплексе с молекулами MHC II класса на поверхность В-лимфоцита, где способен распознаваться CD4+ Т-лимфоцитами. Дальнейшая цепь событий зависит от наличия в организме Т-хэлперов, обладающих специфичностью к данному антигену: если эти клетки отсутствуют, то спустя некоторое время Влимфоцит погибает или переходит в состояние функционального покоя. В случае активации Th2 клеток антиген-презентирующими клетками они способны распознать иммуногенный комплекс с опухолевым антигеном на поверхности В-лимфоцита. При этом Тh2 обеспечивают костимуляцию В22 клетки за счет взаимодействия рецептора CD40 на поверхности В-клеток c CD40L. ИЛ-4 и ИЛ-10, выделяемые Т-лимфоцитами, поддерживают костимуляцию. Далее происходит терминальная дифференцировка активированных В-клеток в плазмоциты (плазматические клетки), которые продуцируют иммуноглобулины, специфичные к антигену опухоли. IgM являются первичными из образующихся плазмацитами антител (обычно обнаруживают в крови на 5 сутки). Когда Тh2 начинают секретировать ИЛ-6, происходит переключение иммуноглобулиновых генов В-лимфоцитов на синтез IgG (на 7-е сутки) [31]. Противоопухолевые антитела могут связываться с поверхностью опухолевой клетки и блокировать мембранные молекулы, необходимые для ее жизнедеятельности [150], либо же направлять на опухолевую клетку цитотоксическое действие фагоцитов или NK-клеток [143]. Клеточная цитотоксичность, вызванная антителами (ADCC), является для некоторых опухолей главным механизмом осуществления противоопухолевого иммунитета. ADCC запускается после связывания иммуноглобулинов определенного изотипа с комплементарными антигенами на поверхности злокачественных клеток. NK-клетки обладают специфическим для иммуноглобулинов IgG1 и IgG3 рецептором - FcγRIII (CD16). Его функция заключается в связывании Fc-фрагмента антител и индукции цитолиза клетки-мишени после присоединения F(ab)-фрагмента этого иммуноглобулина к ней. Антитела также могут направлять на клетки опухоли не только NK-клетки, но также и гранулоциты, макрофаги, способные экспрессировать рецепторы специфичные для антител [98]. ИЛ-4, или фактор роста В-лимфоцитов, стимулирует антителообразование, продукцию формированию IgE, ИЛ-5 и активирует ИЛ-10, Th2-лимфоциты, подавляющих способствует активность Thl и, следовательно, формирование клеточных реакций иммунитета [29]. 23 ИЛ-5 близок по способности стимулировать гуморальный ответ к ИЛ4. Он получил название «Т-замещающий фактор», так как способствует продукции антител без участия Т-хэлперов. ИЛ-6 и -7 также участвуют в гуморальных иммунных реакциях [29]. Изучение гуморального иммунного ответа к опухолеассоциированным антигенам (ОАА) привлекло внимание ученых еще сорок лет назад [1, 25, 26]. Многочисленные антигены на клеточной поверхности, включая муцин, онкопротеины, индуцировали развитие гуморального иммунного ответа, в некоторых случаях появление циркулирующих иммунных комплексов. Появление методов анализа с применением количественных и полуколичественных аналитических систем позволило идентифицировать специфические антитела ко многим внутриклеточным и поверхностным опухолевым белкам. Роль антител в противоопухолевом иммунитете неоднозначна. С одной стороны, как описано выше, они способствуют гибели опухолевых клеток либо за счет активации системы комплимента, либо путем ADCC. С другой стороны, иммуноглобулины могут оказывать защитный эффект по отношению к опухоли [24]. Зачастую атитела класса IgG, помимо протективного воздействия, могут даже усиливать рост злокачественных клеток. Данное явление связывают с тем, что антитела блокируют опухолевые антигены на клеточной мембране, которые исчезают с поверхности путем эндоцитоза. Защитное действие антител относят к одному из способов, позволяющих опухоли уходить от иммунологического надзора. К другим вариантам ускользания опухоли от действия иммунокомпетентных клеток относятся понижение экспрессии на мембране клеток молекул главного комплекса гистосовместимости I класса, неспособность опухолевых клеток вызывать активацию наивных Т-лимфоцитов, выработку протеинов, подавляющих иммунный ответ в отношении опухоли, тактику «контратаки» и др. [24] 24 Поскольку цель создания противоопухолевых вакцин заключается в выработке иммунного ответа, направленного на злокачественные клетки, то представляется важным установить степень его выраженности на фоне иммунизации. В настоящей работе впервые использован комплексный подход к решению обозначенной задачи у пациентов, получающих отечественные противоопухолевые вакцины. 1.4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА К методам, позволяющим оценивать иммунный ответ, относят количественные и качественные подходы к определению IgG, IgA и IgM и других белковых молекул в пробах (например, в сыворотке) или на клеточной поверхности, определение взвешенных частиц и веществ с высокой молекулярной массой в растворе, а также функциональной активности иммунокомпетентных клеток (главным образом Т- и Влимфоцитов, NK-клеток). Одним из методов оценки иммунных реакций является радиоиммунный анализ (РИА) [180]. Данный метод, обладающий высокой чувствительностью был разработан более 30 лет назад и первоначально применялся для определения концентрации как инсулина, так и других гормонов. В настоящее время он используется и для определения антител и антигенов [46]. Существуют разные модификации данного метода. Одна из них базируется на конкурентном связывании с антителами антигена, меченного и немеченного радиоактивным изотопом. Суть метода состоит в следующем. Определенное количество антител добавляют к известному количеству антигена с радиоактивной меткой и к исследуемой пробе (где количественное содержание антигена неизвестно. Антиген, находящийся в пробе, и меченный антиген в контроле связываются с антителами. Чем больше содержание немеченого антигена, тем меньше антигена с радиоактивной меткой свяжется с антителами. Концентрацию антигена в 25 опытной пробе определяют по уровню радиоактивности сформировавшихся комплексов антиген-антитело [46]. Главными недостатками метода являются дорогостоющее оборудование, необходимое для его проведения, а также обеспечение условий, безопасных для работы с радиоактивными изотопами. В другом методе, твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) [74], в качестве твердой фазы наиболее часто используются полистироловые плашки с сорбированными на них иммуноглобулинами или антигенами. Антитела к тому или иному антигену определяют следующим образом. Жидкость, предназначенную для исследования, вносят в лунки планшета с сорбированым антигеном. В процессе инкубации антитела связываются с антигеном. Планшет отмывают от несвязавшихся с антигеном антител и добавляют так называемые вторые антитела (меченные ферментом) к иммуноглобулинам, соединенным с антигеном. Планшет еще раз отмывают, добавляют субстрат, который расщепляется ферментом, и хромоген (вещество, меняющее свою окраску в результате химической реакции). Продукт, образовавшийся в ферментативной реакции, вызывает изменение окраски хромогена. Количество вторых антител, связавшихся с комплексами антиген-антитело, прямо пропорционально активности фермента и как следствие – интенсивности окраски раствора. Концентрация антител в опытной пробе определяется спектрофотометрически – на основании оптической плотности конечного раствора [88]. Аналогичный подход реализуется при определении антигена в исследуемой пробе [149]. При этом используются плашки с сорбированными иммуноглобулинами, обладающими комплементарностью к данному антигену. Вторые антитела с ферментной меткой также имеют направленность к нему. ELISA применяется для оценки количества антител и антигенов в изучаемой пробе. По чувствительности данный метод схож с РИА, однако имеет преимущество по стоимости оборудования и реактивов, а также свободен от использования радиоактивных изотопов. В настоящее время многие лаборатории мира 26 применяют ELISA как стандартный метод определения цитокинов и антител [192, 198]. Иммуноблотинг – качественный метод, выявляющий антигены и антитела в пробе [92]. Постановка данной методики осуществляется следующим образом. Смесь определенных антигенов разделяют при электрофорезе в нитроцеллюлозную полиакриламидном мембрану. геле Проводят и перемещают инкубацию мембраны на в исследуемой пробе, например, сыворотке, а после – с меченными иммуноглобулинами к тем антителам, которые комплементарны исследуемому антигену. При определении антигенов разделению при электрофорезе подвергаются белки, содержащиеся в исследуемой пробе, которые далее перемещают на мембрану с последующим добавлением имеющих метку антител к известным антигенам. К оценке функциональной активности Т-лимфоцитов относятся, в том числе тесты на цитотоксичность [118]. Оценку киллерной функции лимфоцитов проводят, например, следующим образом. Клетки-мишени метят радиоактивным изотопом. Меченые клетки инкубируют с исследумой пробой лимфоцитов. После гибели клеток-мишеней, радиоактивная метка выходит в раствор. Полученные результаты сопоставляют с нормальными показателями. К методам исследования активности Т-клеток также относится тетрамерный анализ [32], внутриклеточное окрашивание на цитокины [99] и модификация твердофазного иммуноферментного анализа – ELISPOT [153]. Каждый из них направлен на оценку числа клеток, секретирующих и потенциально способных секретировать тот или иной цитокин. В частности, для определения противоопухолевой активности обычно исследуют ИФН-γ и/или ФНО-α [101]. Изучение ИЛ-2, ИЛ-4 и ряда других цитокинов проводят для определения, по какому пути осуществляется развитие иммунного ответа на фоне того или иного лечения [100]. Окрашивание внтутриклеточных цитокинов осуществляют следующим 27 образом [113]. После стимуляции антигеном культуру клеток инкубируют с брефелдином А, ингибирующим выход внутриклеточного цитокина. Это приводит к накоплению большого количества секретируемого цитокина внутри клетки. Осуществляют окрашивание поверхности клетки (например, окрашивание на параформальдегидом CD4 или (ПФА). СD8), В а затем результате клетку последующей фиксируют обработки детергентом сапонином клеточная мембрана становится проницаемой для антител, связывающихся с внутриклеточными цитокинами. Количество клеток, имеющих исследуемые внутриклеточные цитокины, определяют на проточном цитофлуориметре. При тетрамерном анализе [89] тяжелые цепи молекул MHC I класса (например, HLA-A2) связываются в тетрамер, меченный флуорохромом (ФЭ). Затем в связывающие карманы молекул MHC класса I помещают синтетический пептид. Этот метод можно использовать для окрашивания только тех Т-клеток (CD8+), которые узнают соответствующий пептид в комплексе с HLA-A2. Меченые клетки затем можно отделить с помощью FACS для получения антиген-специфичных Т-клеточных линий. Тетрамерный анализ имеет самую высокую чувствительность по сравнению с методом внутриклеточного окрашивания на цитокины и ELISPOT, но не имеет специфичности последних [189]. Кроме того, и тетрамерный анализ и определение внутриклеточных цитокинов не являются во многих случаях точной функциональной характеристикой Т-лимфоцитов, поскольку определение тех клеток, в которых содержится цитокин, еще не говорит о дальнейшей его секреции (которой может и не быть). Вместе с тем связывание тетрамера с Т-клеточным рецептором может быть сопряжено с патологией отдельных клеток, что случается у онкологических больных [189]. К вышеперечисленным особенностям указанных методов относится также высокая стоимость реактивов и необходимого оснащения для проведения тетрамерного анализа и метода внутриклеточного окрашивания цитокинов [132]. Таким образом, постановка этих двух реакций и объем 28 экспериментальной базы в большей мере ограничивается финансовыми возможностями лаборатории, чем метод ELISPOT. Последний метод существенно дешевле, в чем и заключается одно из его преимуществ. К недостаткам методики внутриклеточного окрашивания цитокинов относят также большее количество биологического материала для его проведения, чем для других рассматриваемых методов [132]. Следует также отметить, что реакция ELISPOT носит универсальный характер, так как используется и для выявления В-лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела, то есть для исследования гуморального иммунного ответа. Указанные достоинства метода позволили использовать его в настоящей работе. Для оценки гуморального звена иммунитета применяют также иммуноцитохимическую реакцию (см. гл. 1.4.1) и реацию иммунофлуоресцении, которая используется, в частности, в проточной цитометрии (см. гл. 1.4.2). Каждую применяют для определения наличия антител к внутриклеточным и поверхностным антигенам (например, опухолевым). Именно эти 2 метода и ELISPOT как наиболее подходящие для решения задач настоящей работы и были использованы для постановки экспериментов по оценке противоопухолевого Т-клеточного и гуморального иммунных ответов. 1.4.1. Иммуноцитохимическая реакция Антитела, окрашенные флуоресцентными маркерами используются в иммуноцитохимии свыше 60 лет. Хотя ранние исследования были сфокусированы на определении антигенов микроорганизмов в тканях, в настоящее время применение иммуноцитохимических методов включает в себя работу с широким спектром антигенов, в том числе белками, углеводами, липидами практически любого организма. Иммуногисто- и цитохимия используются для идентификации различных компонентов клеток и тканей в состоянии нормы и патологии. Преимущество метода заключается в высокой чувствительности взаимодействия между специфическим 29 антителом и антигеном. Как следует из самого названия, в описываемой реакции фигурируют антитела (корень «иммунно») и клетки («цито»). Таким образом, важной составляющей постановки реакции являются иммуноглобулины. Как известно, иммуноглобулины – это гликопротеины, которые подразделяют на 5 основных классов. Их молекулярная масса и характеристика представлены в табл. 1 [133]. IgG, составляющий 75% от всех иммуноглобулинов в человеческой сыворотке, наиболее часто используется при иммунологическом окрашивании. IgG подразделяется на 4 подкласса [157]. Кроме того, различают поликлональные и моноклональные антитела. Поликлональные антитела получают при иммунизации животных антигеном, в результате чего множество клонов В-клеток активируется и начинает продуцировать антитела к различным эпитопам исследуемого антигена. Эти антитела можно вырабатывать у любых видов животных. Но как правило их получают в организме кролика, козла и осла. Моноклональные антитела продуцируются гибридомами (слитыми Влимфоцитами и иммортализированными клетками). Обычно для слияния используют В-клетки селезенки и клетки миеломы. Техника конъюгации антител с флюорохромом впервые была разработана A. H. Coons с соавторами, который впервые использовал иммунофлуоресцентный микроскоп в 1940-х гг. В начале конъюгацию антител с флуоресцентной меткой проводили прямым способом, т.е. непосредстенно окрашивали иммуноглобулин с желаемой антигенной специфичностью [57]. Затем был разработан непрямой способ окраски [58], который оказался более удобным для создания меченных антител в повседневной практике. Данный вариант имеет ту особенность, что антитела определенной специфичности (первичные) используют вначале без флуоресцентной метки, затем, после удаления несвязавшихся, вносят вторичные (меченные антитела), а точнее окрашенные флуоресцентным маркером Fabфрагменты. Наиболее широко используются в исследованиях такие флуоро30 Таблица 1 Молекулярная масса и характеристика основных классов человеческих иммуноглобулинов. Класс иммуноглобулина IgA Подклас с Тяжела я цепь Легкая цепь Ig A1 Ig A2 α1 α2 λ или κ Ig D δ λ или κ 150 000 Ig E ε λ или κ 150 000 γ1 γ2 γ3 γ4 γ5 λ или κ 150 000 λ или κ 970 000 Ig G Ig G1 Ig G2а Ig G2b Ig G3 Ig G4 Ig M μ Молекулярная масса 100 000 – 600 000 Характеристика первичный иммуноглобулин слизистых оболочек присутствует на поверхности циркулирующих В-клеток экспрессирован на поверхности базофилов и тучных клеток основной иммуноглобулин, присутствующий в сыворотке и цитоплазме пентамер, ассоциирован с внутрисосудистым пулом хромы как флуоресцеинизотиоцианат (FITC), родамин, и фикоэритрин (РЕ) [199, 137]. Первоначальным этапом реакции является создание образца [160]. Для этих целей может быть использованы мазок крови и нанесення на стекло клеточная суспензия (как культуральная, так и выделенная из ткани). Затем следует фиксация. Ее цель – сохранить клетки в жизнеспособном состоянии для получения, в конечном итоге, достоверных результатов [48]. Для этого опытные образцы погружают в соответствующий раствор [140]. 31 Обычно для фиксации используют формальдегид, глутаральдегид и этанол [133]. После этого производят процедуру, направленную на формирование пор в клеточной мембране [154]. Посредством ее обеспечивается доступ антител для взаимодействия с антигенами цитоплазмы и органелл. Для данной задачи применяют органические растворители метанол, ацетон и детергенты. Их действие направлено на разрушение мембранных липидов клетки. После отмывки в фосфатно-солевом буфере и высушивания опытный образец инкубирют в 1% растворе альбумина, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител. Далее, после отмывки клетки содержат с первичными антителами при 4оС в течение ночи. После удаления несвязавшихся первичных иммуноглобулинов добавляют вторичные антитела, и после 30 мин инкубации исследуемые клетки просматривают с помощью люминисцентного микроскопа [154]. Определяют интенсивность окраски клеток в 3-5 полях зрения и их процент от общего числа. Яркость свечения может быть оценена от «+» до «++++» [48]. Иммуноцитохимический например, отличия аденокарциномы анализ мезотелиальной [64]. По используют для пролиферации от цитоморфологии диагностики, пролиферации мезотелиальные клетки изменчивы. Их идентификация и отделение от клеток аденокарциномы является невыполнимой задачей для одной лишь цитологии. К этим маркерам относятся калретинин [195], HBME-1 [35], D2-40 [41] и др. Клеточная пролиферация разных типов лимфом измеряется по маркеру MIB1 [179] и антигенам ядра, таким как ALK1 [164] и LMP-1[142]. Также с помощью иммуноцитохимического метода определяют эффективность того или иного лечения. Например, при раке молочной железы для этих целей изучают экспрессию маркеров ER, Pg, Her2 ⁄ neu и др. [70], тем самым проводя мониторинг антигормональной терапии [160]. Для оценки гуморального иммунного ответа также применяют иммуноцитохимическую реакцию. Если речь идет о В-клеточном ответе на фоне вакцинотерапии рака, то методом иммуноцитохимии определяется 32 наличие специфических антител к опухолевым антигенам. В обзорной статье Draube et al. (2011) [69] были проанализированы 17 клинических испытаний дендритоклетночной вакцины у больных раком простаты и 12 клинических испытаниий у больных раком почки. Число антител к опухолеспецифическим антигенам на фоне вакцинотерапии повышалось у 55% больных раком простаты и оставалось на том же уровне у больных раком почки. Впрочем, как отмечалось в гл.1.3., повышение или уменьшение данного показателя не является однозначным признаком стимуляции противоопухолевого иммунитета. 1.4.2. Проточная цитометрия Метод проточной цитометрии также, как и иммуноцитохимическое исследование, основан на принципе иммунофлуоресценции. Здесь также основой является взаимодействие меченых флуорохромом антител и комплементарного антигена. Отличие двух методов заключается в том, что иммуноцитохимический анализ проводят на стекле с соответствующими особенностями (фиксация образца, создание пор в мембране и т.д) и результаты оценивают с помощью люминесцентного микроскопа, а при проточной цитофлуориметрии (цитометрии) образцы клеток подготавливают в пробирках и результаты анализируют на проточном цитометре. Последний из указанных методов применяется как при оценке числа клеток, несущих на своей поверхности исследуемый антиген, так и для характеристики клеточной суспензии. Клеточную суспензию с флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями подают в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку [86]. Фотоэлектронные умножители, фиксирующие флуоресценцию, позволяют определить многие параметры (размеры клеток, субпопуляционный состав клеточной суспензии). Первый проточный цитометр был описан Andrew Moldavan в 1934 [126]. Он представлял собой трубку на платформе, в которой поток клеток 33 мог люминисцировать в луче света, проходящего через него. Последующие работы Coulter с соавторами усовершенствовали инструментарий вплоть до возможности считать на приборе отдельные частицы в суспензии [59]. Их замысел был осуществлен Kamentsky и Melamed в 1965 г. [102] для детекции световых сигналов аномальных клеток в образцах рака шейки матки. Подобно ныне существующим цитометрам он иллюминировал клетки, проходящие в потоке против источника cвета, и улавливал сигнал от отдельных клеток с помощью фотодетекторов. В большинстве проточных цитометров флуоресцирующие клетки высвечиваются лазером. Достоинство лазеров заключается в испускании ими интенсивного луча света узкой направленности. Частицы в потоке жидкости могут быстро перемещаться сквозь луч света, в результате чего исходящая флуоресценция детектируется прибором. Существуют прямое (переднее, малоугловое) и боковое светорассеяния [86]. При прямом – детектор улавливает излучение лазера, которое рассеивается в диапозоне 2-19о. Интенсивность рассеянного света связана с размером клетки в прямой пропорции. Чем клетка крупнее, тем сильнее светорассеяние. Исходя из этого, данная характеристика применяется для идентификации размеров клеток. При боковом светорассеянии луч лазера пропускается через клетку и после преломления направляется во все стороны. Детекция данного излучения позволяет судить о деталях строения клетки (пропорции ядра и цитоплазмы, наличия тех или иных органелл и остальных внутриклеточных включений). При сочетании прямого и бокового светорассеяния можно судить о морфологических особенностях клетки в целом, разделять разные клеточные популяции (моноциты, лимфоциты, а также гранулоциты) для дальнейшего исследования. Процедура подготовки образца для оценки тех или иных параметров на проточном цитометре заключается в следующем [97]. Кровь или суспензию клеток помещают в пробирки в растворе фосфатно-солевого буфера. Далее к ним добавляют меченные или немеченные антитела. Инкубируют 30 мин. 34 при +4оС. Добавляют лизирующий буфер (если проводиться работа с кровью) или фосфатно-солевой раствор. Далее центрифугируют при 1000 об/мин 7 мин. Сливают супернатант. Добавляют окрашенные флуоресцентной меткой Fab-фрагменты к пробам с немеченными антителами и инкубируют 30 мин при +4оС в темноте. После отмывок добавляют 1% раствор формалина и оценивают результаты на проточном цитофлуориметре. Метод проточной цитофлуориметрии находит широкое применение для разных направлений характеризация научных изучаемой исследований. клеточной К популяции ним [93], относятся мониторинг пролиферации клеток [182] и их функциональной активности [76], в том числе внутриклеточная окраска для определения цитокинов (см. гл. 1.4), обнаружение различных сигнальных путей [81] клеток, вступающих в апоптоз [162] и др. В частности, для прогноза развития хронической лимфоцитарной лейкемии рассматриваются такие клеточные маркеры, как CD38, ZAP70 и CD49d [178]. В зависимости от уровня их экспрессии клетками данной нозологии судят о степени прогрессирования заболевания. Метод проточной цитометрии был использован в настоящем труде и фигурирует под более общим наименованием – непрямая реакция иммунофлуоресценции. 1.4.3. Метод ELISPOT Метод ELISPOT был открыт в 1983 Sedgwick с соавторами первоначально для выявления В-лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела [153]. Другими авторами в том же году была описана подобная технология детекции В-лимфоцитов по выработки иммуноглобулинов [61]. В этой же статье и дано было название - ELISPOT (от «Enzyme-linked immunosorbent spot»). Позже оригинальная методология ELISPOT была модифицирована: на твердой фазе сорбировали антитела для 35 связи с комплементарными антигенами (в том числе цитокинами) исследуемых клеток [63]. Высокая чувствительность метода позволяет использовать его в регистрации спонтанной или антиген-индуцированной секреции цитокинов (интерферона-γ, ФНО-α, ИЛ-2, ИЛ-4 и др.) [36, 100]. ELISPOT нашел применение при онкологических вакцинотерапии заболеваний как [101], инфекционных при мониторинге [161], так и аллергических заболеваний и в трансплантологии [66, 110]. Суть данного метода состоит в оценке функциональной активности Ти В-клеток по продукции того или иного цитокина. Иными словами, ELISPOT позволяет установить, сколько клеток секретируют исследуемый цитокин, например, в динамике у больных на разных этапах вакцинотерапии. Описываемай метод представляет собой модификацию «сэндвич»-варианта тведофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Их отличие заключается в том, что ELISA измеряет реальную концентрацию цитокина в то время, как ELISPOT, как уже было сказано ранее, регистрирует число клеток, высвобождающих цитокин [101]. Иными словами, в первом случае дается ответ на вопрос: «сколько секретировалось?», а во втором: «какова частота продуцирующих цитокин клеток?». Постановка ELISPOT зависит от качества 4 главных компонентов [101]: антител (как покровных, так и детектирующих), фермента, хромогенного субстрата и планшетов с белок-связывающей мембраной. Cуществует 2 типа мебран дна 96-луночных планшетов, которые обычно используют для реакции: на основе нитроцеллюлозы (NC) и поливинилидена флуорида (PVDF) [100]. Однако принцип связывания макромолекул (в том числе белков) один – за счет гидрофобных взаимодействий (Ван-дерваальсовых сил). Помимо указанных главных компонентов, важное значение имеет корректное получение и использование клеток, на которых ставится реакция. Наиболее часто в работе используются МПК [176]. Также в зависимости от 36 целей экспериментаторов при постановки метода используются резличные популяции Т-лимфоцитов, полученных, например, с помощью иммуномагнитной сепарации [111]. Хотя при некоторых функциональных тестах на Т-клетках допустимо работать с цельной кровью, этот способ не применяется при постановки ELISPOT. При гемолизе эритроцитов в среду выходят ингибирующие факторы, модулирующие функцию Т-клеток, в результате чего возникает сложность при интерпретации полученных результатов [101]. Существуют разные подходы для стимуляции исследуемых на продукцию цитокина клеток. Как правило, для этих целей используют нагруженные антигеном ДК [135], рекомбинантные белки [176], химические соединения растений (например, фитогемагглютинин) [196], отдельные пептиды [194]. На первом этапе в лунки планшета вносят покровные антитела к исследуемому цитокину. Затем после отмывок и блокировки поверхности лунок специальной средой в планшет помещают клетки. После инкубации, длительность которой зависит от выбора экспериментатора, планшет отмывают и последовательно добавляют окрашенные биотином антитела к заданному цитокину, фермент (например, щелочную фосфатазу) и его субстрат (например, NBT/BCIP). Каждый реагент инкубируется определенное время и перед добавлением последующего несвязавшийся предыдущий отмывают. секретирующие В цитокин, тех местах, где находились образовались клетки, комплексы (иммуноглобулин:цитокин:иммуноглобулин с биотином:фермент). Субстрат расщепляется в участках комплекса, и в результате реакции образуется пятно на мембране, соответствующее одной цитокин-продуцирующей клетке. В обзорной статье Draube et al. (2011) [69] были проанализированы 17 клинических испытаний дендритноклеточной вакцины у больных раком простаты и 12 клинических испытаний у больных раком почки. Для оценки эффекторного звена иммунитета на фоне вакцинации преимущественно 37 использовался ELISPOT (в 10/17 и 10/12 исследованиях соответственно). У 77% больных раком простаты и у 61% больных раком почки было зафиксировано увеличение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток. При этом полный клинический ответ был зафиксирован у 7,7% больных раком простаты и 12,7% пациентов с раком почки. Стабильное течение заболевания было у 54% и 48% соответственно. Поскольку в отличие от других аналогов метод ELISPOT отличается рядом преимуществ (экономичностью реагентов, возможностью использовать небольшое количество биологического материала [132, 189]) при сохранении высокой чувствительности и точности, представляется целесообразным использовать его в качестве метода оценки такого показателя, как число ИФН-γ-секретирующих клеток у пациентов на фоне противоопухолевой вакцинации. 38 Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и реактивы Питательная среда RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) L-глутамин (ПанЭко, Россия) Гентамицин (ПанЭко, Россия) Витамины для среды RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) Аминокислоты для среды RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (Shering-Plough, США) Интерлейкин-4 (ИЛ-4) (R&D Systems, США) Фактор некроза опухоли- (ФНО-) (MP Biomedicals, США) Простагландин Е2 (ПГЕ2) (MP Biomedicals, США) Натрий-фосфатный буфер (PBS) (рН 7,2-7,4) (ПанЭко, Россия) Фиколл-урографин (ПанЭко, Россия) Опухолевые клетки линии меланомы человека mel Kor Опухолевые клетки линии Mel Ibr Человеческий альбумин (Sigma, США) Телячья эмбриональная сыворотка (Gibco, США) HEPES (ПанЭко, Россия) Раствор Версена (ПанЭко, Россия) Диагностическая тест-система для определения уровня маркера S100 (CanAg Diagnostics, Швеция) 39 Антитела к ИФН-γ (Thermo Scientific, США), Tween 20 (Sigma, США) Антитела к ИФН-γ, меченные биотином (Thermo Scientific, США) Щелочная фосфатаза (ExtrАvidin/AP) (Sigma, США) Субстрат щелочной фосфатазы NBT/BCIP (Thermo Scientific, США) Полиглюкин (Биохимик, Россия) Мононуклеары периферической крови больных Сыворотка периферической крови больных Сыворотка человека IV группы крови Антитела IgG, конъюгированные с FITC (Goat F(ab)2 ANTI HUMAN IgG:FITC) («Serotec») Антитела IgM, конъюгированных с PE (Goat F(ab)2 ANTI HUMAN IgM:PE) («Serotec») 96-луночные планшеты MultiScreen (Millipore, США) 2.2. Оборудование Ламинарный шкаф (NuAire, США) Микроцентрифуга (Eppendorf, Германия) Лабораторная центрифуга ОПН-3 (СССР) Проточный цитофлуориметр FACScan (Becton Dickinson, США) СО2 – инкубатор (Heraeus, Германия) Холодильник с морозильной камерой на –200С (Стинол, Россия) Морозильник на –800С (NuAire, США) Инвертированный микроскоп (Leica, Германия) Флуоресцентный микроскоп (Nikon, Япония) 40 ELISPOT Reader System Standard Resolution (AID Diagnostika GmbH, Германия) 2.3. Методы исследования Получение периферической крови для выделения мононуклеаров и сыворотки Периферическую кровь больных меланомой, иммунизированных противоопухолевыми вакцинами, получали после пункции вены. Забор крови из локтевой вены каждого пациента проводился с помощью стандартной вакуумной системы «BD VACUTAINER» в пробирки без антикоагулянта, предназначенные для получения сыворотки крови. Полученные образцы хранили при температуре -20оС до начала исследований. В случае получения мононуклеаров периферической крови были использованы пробирки той же фирмы с содержащимся в них ЭДТА или гепарином. Выделение мононуклеарных лейкоцитарной массы клеток из периферической крови и Периферическую кровь пациентов, больных меланомой наносили на фиколл-урографин в соотношении кровь:фиколл-урографин ~3:1. Центрифугировали в течение 25 минут со скоростью 1500 об/мин. Затем отбирали интерфазное кольцо (содержащее лейкоциты) пипеткой. Для последующих отмывок лейкоциты разводили до 14 мл физиологическим раствором, центрифугировали 5 минут при скорости 1000 об/мин. Отмывку проводили 3 раза. После выделенные МПК в зависимости от дальнейшего применения либо замораживали (в случае последующей постановки ELISPOT), либо получали из них дендритные клетки. Получение дендритных клеток и создание дендритноклеточной вакцины Полученные МПК в объеме 10 мл полной среды помещали в чашки Петри (d=100 мм) и инкубировали в CO2-инкубаторе (с содержанием 5% СO2 и 37оС). Через 1,5 часа неприкрепившиеся клетки (преимущественно 41 лимфоциты) отбирали. (преимущественно К адгезированным моноцитам) добавляли на пластике свежую полную клеткам среду, содержащую ИЛ-4 (конечная концентрация 10 нг/мл) и ГМ-КСФ (конечная концентрация 80 нг/мл). Далее на 2, 4 и 6 сутки в процессе культивирования добавляли по 1 мл свежей полной среды, содержещей 100 нг ИЛ-4 и 800 нг ГМ-КСФ. В процессе культивирования клетки приобретали суспензионные свойства, открепляясь от пластика, увеличиваясь в размерах, на их поверхности появлялись отростки. На 7 сутки культивирования для терминальной дифференцировки дендритных клеток производили замену среды на 10 мл свежей полной среды, содержащей 200 нг ФНО-α и 2500 нг простогландина E2. Спустя 48 часов находящиеся в растворе клетки собирали и иммунофенотипировали. Далее проводили нагрузку дендритных клеток антигенами путем замены культуральной среды и добавления опухолевого лизата с последующей 2-х часовой инкубацией. Затем в культуру клеток добавляли простогландин E2 и ФНО-α для дифференцировки дендритных клеток. Через 48 часов нагруженные зрелые дендритные клетки собирали, проводили отмывки и ресуспендировали в 2 мл PBS, содержащей 1% человеческого сывороточного дендритноклеточная вакцина, альбумина. Полученная смесь, вносилась в ампулы и доставлялась в клиническое отделение для введения больному. Культивация опухолевых клеток линии mel Kor Линия mel Kor была получена в РОНЦ им. Н.Н. Блохина коллективом авторов (Бурова О.С., Михайлова И.Н., Морозова Л.Ф. и соавт.) [21], регистрационный номер РККК (П) 687-D. Данная клеточная линия применяется в РОНЦ им. Н.Н. Блохина при создании противоопухолевых вакцин по причине быстрого роста, возможности трансфекции разными генами, экспрессией на клеточной поверхности широкого спектра ОАА. Линия mel Kor получена из образца опухоли, метастаза меланомы, в районе бедренного треугольника. Линия характеризуется присутствием множества 42 плотных центров роста клеток меланомы вытянутой, округлой, а также неправильной формы, что отражено в паспорте линии. В клетках обнаруживаются гипер- и нормохромные ядра овальной и округлой формы, содержащие одиночные нуклеолы, и базофильная негомогенная, иногда вакуолизированная цитоплазма. Имеются гигантские многоядерные клетки, митозы. Клеточная линия mel Kor была выбрана в качестве стимулятора противоопухолевого иммунитета по причине экспрессии широкого спектра меланомных ОАА по сравнению с другими имеющимися опухолевыми линиями. Подобное свойство позволяет предполагать наибольшее развитие «перекрестной» реакции между специфическими против ОАА Т- лимфоцитами пациентов и ОАА, представленных у клеток линии mel Kor. Отличительной особенностью данной клеточной линии является отсутствие экспрессии на их поверхности молекул МHC I и II классов. Клеточную линию mel Kor культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2Мм L-глутамина (ПанЭко, Россия), 10Мм HEPES (ПанЭко, Россия), 40 нг/мл гентамицина (ПанЭко, Россия), витамины (ПанЭко, Россия), аминокислоты (ПанЭко, Россия). Клетки сохраняли в логарифмической фазе роста, пересевая культуру через 3-4 дня. Клетки снимали с пластика раствором Версена. Получение вакцины Мелавак из клеточной линии МelKor Клетки линии mel Kor трансфицировали геном ГМ-КСФ. Для трансфекции использовали созданную в Институте биологии гена РАН генетическую конструкцию на основе вектора Рвк-СМV (ClonTech), содержащую кДНК человеческого ГМ-КСФ [178]. В течение культивирования данной клеточной линии после трансфекции периодически определяли количество продуцируемого ГМ-КСФ. Затем клетки облучали в специальных флаконах на кобальтовом источнике в дозе 100 Грей. Расчет времени облучения проводили при учете нескольких параметров, таких как 43 расстояние от источника до верхнего и нижнего краев флакона, высота стола, размер окружающей флаконы освещенной зоны. Приготовленную таким образом вакцину после ресуспендирования в PBS вводили пациентам. Криоконсервация мононуклеарных клеток периферической крови для постановки ELISPOT Полученные МПК (выделенные по методике описанной выше) после серии отмывок ресуспендировали в среде заморозки (10% DMSO, 50% телячьей эмбриональной сыворотки, 40% чистой RPMI 1640) и переносили в криопробирки. Затем криопробирки помещали в пенопластовый штатив (комнатной температуры) и убирали в морозильник на -800С. Размораживание мононуклеарных клеток периферической крови Ампулы с замороженными мононуклеарами на второй день постановки реакции ELISPOT помещали в водяную баню при 37-38оС. После оттаивания жидкости в криопробирках клетки последовательно отмывали от DMSO в теплой питательной среде RPMI 1640. Исследование уровня белка S-100 Уровень белка S-100 (S-100BB и S-100A1B формы) оценивали в сыворотке крови при помощи диагностической системы CanAg Diagnostics. Этот неконкурентный твердофазный метод основан на «сэндвич»- технологии. Стандартные и опытные образцы объемом 50 мкл инкубировали с биотинилированными анти-S-100 МКА мыши в ячейках, покрытых стрептавидином в течение 2 часов при постоянной встряске при комнатной температуре. После этого лунки микропланшета отмывали 3 раза специальным промывочным раствором, инкубировали с пероксидазой хрена меченой анти-S-100 МКА. После завершения промывки добавляли смесь субстрат/хромогенный реагент (3,3,5,5-тетраметилбензидин и перекись 44 водорода) в количестве 100 мкл. Смесь инкубировали в течение 30 минут на шейкере (200 об/мин) при комнатной температуре. Останавливали реакцию добавлением 100 мкл 0,12 М соляной кислоты. Абсорбцию измеряли при длине волны 405 нм. Оценка числа ИФН-γ-продуцирующих лимфоцитов методом ELISPOT Схема постановки реакции ELISPOT представлена на рис. 3. На первом этапе проведения оценки противоопухолевой активности лимфоцитов раскапывали покровные АТ к ИФН-γ на белок связывающую мембрану планшета (по 50 мкл). Инкубировали ночь при +4оС. Отмывали от несвязавшихся АТ стерильным раствором PBS. Блокировали белоксвязывающую мембрану средой, содержащей 5% ТЭС. Инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Блокирующую среду сливали. Раскапывали размороженные МПК, затем добавляли ФГА, опухолевый лизат или опухолевые клетки, и часть мононуклеаров оставляли без стимулятора. Планшет с клетками инкубировали 18 часов в СО 2-инкубаторе при 37оС и 5% СО2. В течение данного периода времени часть клеток продуцирует цитокины (в том числе интерферон-γ). Молекулы интерферона связываются с АТ. После инкубации производили отмывку от клеток буферным раствором (нестерильный PBS с 0.1% Tween 20) по 200 мкл в каждую лунку. Затем добавляли биотинилированные ИФН-γ-АТ, разведенные 1:1000 в стерильном PBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0.1% Tween 20 (в объёме 100 мкл на лунку), которые прикрепляются к комплексу покровные АТ:интерферон-γ. Инкубировали 2 часа. Отмывали от несвязавшихся АТ. Далее добавляли фермент – щелочную фосфатазу (разведенную 1:10 000) по 100 мкл на лунку, которая прикрепляется к комплексу покровные АТ:интерферон-γ:биотинилированные АТ. Инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. Отмывали от неприкрепившейся щелочной фосфатазы. Добавляли субстрат к щелочной фосфатазе по 100 мкл на лунку, который после взаимодействия с щелочной фосфатазой образует 45 продукт, окрашивающий мембрану планшета в местах образования комплекса. Инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. В тех местах, где фермент прореагировал с субстратом, образуются пятна. Для остановки реакции помещали панель под проточную (дистиллированную) воду на 2 минуты. Отсоединяли панель от подложки. Отмывали плашку. После высыхания планшета количество пятен в лунках определяли на приборе ELISPOT-reader. По количеству пятен на мембране плашки можно говорить о количестве ИФН-γ-продуцирующих клеток. Продукция ИФН-γ прямо пропорциональна противоопухолевой активности Т-лимфоцитов. Реакция непрямой поверхностной иммунофлуоресценции Клетки линий меланомы mel Kor и mel Ibr в количестве 5х105, инкубировали с 20 мкл образцов сыворотки крови больных и здоровых доноров (разведенных 1:50) на протяжении 30 мин. Затем отмывали в 1 мл фосфатно-солевого буфера. К клеточному осадку добавляли 10 мкл антител против человеческих IgM (разведенных 1:40), конъюгированных с фикоэритрином или 20 мкл поликлональных антител против IgG, меченных FITC (в разведении 1:50). Инкубацию проводили в течение 30 мин. при 4оС. 2 раза проводили отмывку в фосфатно-солевом буфере, к осадку клеток добавляли 300 мкл 1% раствора формалина. Полученные результаты были проанализированы на проточных цитометрах FACSCalibur и FACScan (Beckton Dickinson, США). Флуоресцентный иммуноцитохимический анализ Для постановки реакции были использованы линии меланомы mel Kor и mel Ibr и рака молочной железы SK-BR-3. Данные клетки культивировали по описанной выше методике. Клетки промывали 2 раза в растворе PBS и осаждали на стекла посредством центрифугирования. Стекла с прикрепившимися на них клетками хранили в морозильнике при -20оС. Далее 46 образец фиксировали в этиловом спирте 5 минут, затем помещали в ацетон на 3 минуты. Далее стекла инкубировали 10 минут в фосфатно-солевом 47 буфере, содержащем 5% бычьего сывороточного альбумина, предназначенного для предотвращения неспецифического связывания. Затем к клеткам добавляли образцы сыворотки крови пациентов в разведении 1:10. Инкубировали в течение 18 часов при температуре 4оС. Вторичными антителами служили иммуноглобулины против IgG и IgM человека, меченные FITC и PE соответственно. Ядра клеток окрашивали реактивом Hoechst-33258 (конечная концентрация 2 мкг/мл). Результаты реакции анализировали на флуоресцентном микроскопе Nikon-801 при увеличении 400х. Методы статистического анализа результатов работы Статистический анализ данных проводили с помощью пакета программ SPSS 20.0. Изменения в числе клеток, активирующихся в ответ на стимуляцию опухолевым антигеном у больных, получавших вакцинацию, анализировали с помощью t-критерия Стьюдента. Связь между наличием иммунного ответа и реакцией ГЗТ, режимом вакцинации, а также между наличием иммунного ответа при активации лимфоцитов с помощью ФГА и опухолевого лизата анализировали с помощью углового преобразования Фишера. Связь между наличием иммунного ответа и изменением маркера меланомы S-100 анализировали с помощью критерия χ2. Расчет времени до прогрессирования заболевания проводили методом Каплана-Мейера. Сравнение двух кривых времени до прогрессирования проводили с помощью логрангового критерия. Результаты считались статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05 48 Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. ОЦЕНКА Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА МЕТОДОМ ELISPOT У БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ, ПОЛУЧАЮЩИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ ВАКЦИНУ МЕЛАВАК В Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН проходит клинические испытания вакцина Мелавак на основе цельных клеток меланомы человека линии mel Kor. Для создания вакцины клетки были трансфицированы геном ГМ-КСФ и облучены на кобальтовом источнике излучения в дозе 100Гр [32, 176]. Особенностью клеток mel Kor является отсутствие молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов при наличии ряда общих антигенов меланомы (Melan A, CD63 и др.). Данное свойство имеет то преимущество, что при введении не развивается трансплантационный иммунитет, реакции отторжения клетками иммунной системы по причине отсутствия взаимодействия между аллелями HLA и рецепторами иммунокомпетентных клеток. Облучение блокирует пролиферацию клеток, а секреция клетками ГМ-КСФ, обеспечивает положительный хемотаксис моноцитов и дендритных клеток в место нахождения вакцины (см. главу 1.1.). Вакцина Мелавак вводилась внутрикожно пациентам в дозе от 10 до 30х106 клеток; интервалы между вакцинациями составляли 2 недели первые 3 иммунизации, далее – 1 раз в месяц. В исследование были включены 12 больных – 4 мужчин (33,3%) и 8 женщин (66,6%). Возраст пациентов составлял от 28 до 72 лет. Все больные на момент начала вакцинации не имели признаков заболевания после хирургического удаления опухоли. То есть, вакцина вводилась в адъювантном режиме. У больных на разных этапах вакцинации (условно обозначенных «точками») проводился забор крови, из которой получали МПК. 49 Из-за особенностей и удобства предоставления крови отделением биотерапии опухолей НИИ Клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, у разных больных набор точек различался. Во всех случаях 1-ой точкой обозначался забор крови перед первой вакцинацией, «точкой 2» обозначался забор крови перед 3 вакцинацией, «точкой 3» – перед 5-ой, «точкой 4» – перед 10-ой. Активаторами для лимфоцитов при постановке ELISPOT служили опухолевый лизат (у всех больных) и сама вакцина (у части больных) в разных соотношениях (1:5; 1:10 и 1:20 опухолевых клеток к лимфоцитам соответственно). Число интерферон-γ-продуцирующих клеток на разных этапах вакцинации у больных представлены в табл. 2 – 3. Как видно из представленных результатов, разница между исследуемым показателем в пробах с нестимулированными лимфоцитами и лимфоцитами, активированными опухолевыми клетками в соотношении 1:5 к лимфоцитам статистически не достоверна, кроме 1-ой точки у Д.А.А. При активации опухолевыми клетками в доле 1:10 к лимфоцитам различие присутствовало только в 2 из 9 точек (22,2%): во 2-ой и 3-ей точках у больной Д.А.А. В первом случае эта разница (число в опытной пробе за вычетом клеток в пробе без активатора) составила 10 клеток, продуцирующих интерферон-γ (по средним значениям), во втором случае – 3,75 клеток. Иными словами, на данном этапе вакцинации у вышеуказанной больной есть повышение Т-клеточного ответа. При активации опухолевыми клетками в доле 1:20 к лимфоцитам статистической достоверности между пробами не было выявлено. Как следует из таблицы 3, достоверное различие в сравниваемых пробах присутствовало в 13 из 32 точек (40,6%). В 12 случаях опухолевый лизат оказывал супрессирующее действие, что может говорить о анергичном состоянии Т-лифоцитов на момент вакцинации, в который забиралась кровь для получения мононуклеаров. 50 Таблица 2 Изучение влияния различных соотношений лимфоцитов и опухолевых клеток на число ИФН-γпродуцирующих клеток у больных, получающих вакцину Мелавак (по значению медиан). Точка 1 Точка 2 Точка 3 Боль- Nн/ст N1:5 N1:10 N1:20 Nн/ст N1:5 N1:10 N1:20 Nн/ст N1:5 N1:10 N1:20 ные (мин- (мин- (мин- (мин- (мин- (мин- (мин- (мин- (мин- (мин- (мин- (мин- макс) макс) макс) макс) макс) макс) макс) макс) макс) макс) макс) макс) 11 11 5 6,5 2 3 1,5 2,5 5,5 (3 -11) (1 -5) (0 – 5) (3 – 7) ― (2 -19) (2 – 5) ― (6 -14) (1 – 3) ― (7 - 18) ― ― ― ― ― ― 5 3 3,5 2,5 (2 – 7) (1 – 9) (2 – 4) (1 – 5) 2 4,5 1 1,5 3 4 4,5 2,5 4 3,5 4 2 (1 – 3) (2 – 6) (0 – 2) (1 – 3) (1 – 5) (1 – 8) (4 – 10) (0 – 5) (1 – 7) (0 – 4) (3 – 5) (1 – 7) 4 12* 6 4,5 5 8,5 16,5* 6,5 4,5 7 8* (3 – 9) (7 – 13) (2 – 10) (1 – 5) (2 – 9) (7 – 17) (10 – 18) (5 – 10) (3 – 5) (5 – 15) (7 – 9) К.М.В. Ф.Р.С. Х.Л.И. Д.А.А. 4,5 (0 – 6) 3,5 (3 – 5) ― Nн/ст – число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе без активатора; N1:5 – число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе с опухолевыми клетами в пропорции 1:5 (по отношению к лимфоцитам); N1:10 - число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе с опухолевыми клетами в пропорции 1:10 (по отношению к лимфоцитам); N1:20 - число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе с опухолевыми клетами в пропорции 1:20 (по отношению к лимфоцитам); * - статистическая достоверность по сравнению с пробой без активатора. 51 Таблица 3 (начало) Число лимфоцитов, секретирующих ИФН-γ в ответ на стимуляцию опухолевым лизатом и в отсутствии стимуляции, у больных, получающих вакцину Мелавак (по значению медиан). Больные К.М.В. С.Е.В. Ф.Р.С. Х.Л.И. Д.А.А. Б.Г.А. К.Е.В. Точка 1 Nн/ст Nлизат 11 10 (7 - 18) (6 – 12) ― ― 4,5 9,5 (0 – 6) (6 – 11) 2 0,5 (1 – 3) (0 – 2) 4 4,5 (3 – 9) (3 – 6) 6 5 (3 – 10) (1 – 7) 12 2 (7 – 12) (1 – 5) Точка 2 Р Р > 0,05 ― Р < 0,05 Р > 0,05 Р > 0,05 Р > 0,05 Р < 0,05 Nн/ст Nлизат 2 3,5 (1 – 3) (2 – 7) 9,5 17 (8 – 12) (10 – 26) 3,5 15 (3 – 5) (7 – 25) 3 5 (1 – 5) (0 – 10) 5 9,5 (2 – 9) (6 – 16) 6,5 2,5 (3 – 13) (0 – 10) 10 3 (8 – 12) (1 – 3) Точка 3 Р Р > 0,05 Р > 0,05 Nн/ст Nлизат 5,5 2 (3 – 7) (1 – 3) 17 48,5 (16 – 22) (45 – 51) 5 2,5 (2 – 7) (1 – 3) 4 3 (1 – 7) (1 – 4) 4,5 2 (3 – 5) (0 – 3) Р > 0,05 ― ― P < 0.05 11 1 (1 – 11) (0 – 2) Р > 0,05 Р > 0,05 Р > 0,05 Точка 4 Р Р Nн/ст Nлизат 8 4 (3 – 20) (2 – 10) P < 0.05 ― ― ― Р > 0,05 ― ― ― Р > 0,05 ― ― ― P < 0.05 ― ― ― ― ― ― ― Р > 0,05 ― ― P < 0.05 Р > 0,05 ― 52 Таблица 3 (окончание) Число лимфоцитов, секретирующих ИФН-γ в ответ на стимуляцию опухолевым лизатом и в отсутствии стимуляции, у больных, получающих вакцину Мелавак (по значению медиан). Больные У.О.В. П.А.С. И.Е.Г. Точка 1 Точка 2 С.А.В. Точка 4 Nн/ст Nлизат Р Nн/ст Nлизат Р Nн/ст Nлизат Р Nн/ст Nлизат Р 16 1 P < 0.05 47 0 Р < 0,05 28 0 Р < 0,05 ― ― ― (11 – 19) (0 – 1) (20 – 72) (0 – 2) (17 – 44) (0 – 1) 32 2 13 0 4 0 Р > 0,05 ― ― ― (17 – 33) (0 – 2) (12 – 14) (0 – 1) (1 – 13) (0 – 1) ― 3 ― 2 39 3 P < 0.05 12 8 Р > 0,05 (30 – 41) (3 – 4) (9 – 16) (7 – 8) Р > 0,05 ― ― ― ― ― ― Р > 0,05 ― ― ― ― ― ― P < 0.05 ― (2 – 6) З.И.Б. Точка 3 11 10 (11 – 12) (6 – 10) 12 6 (8 – 14) (3 – 6) P < 0.05 ― (1 – 3) Р > 0,05 Р <0,05 30 29 (23 – 40) (21 – 34) 8 5 (2 – 10) (1 – 6) Nн/ст – число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе без активатора; Nлизат - число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе с опухолевым лизатом; Р - статистическая достоверность между пробой с лизатом и пробой без активатора (в каждой из точек). В скобках указан разброс значений от минимального до максимального. 53 В целом, сопоставление двух проб свидетельствует о том, что ответ на опухолевый антиген не превышает значений в пробе нестимулированных клеток. Данный факт говорит также о том, что проба лимфоцитов без активатора не может быть отрицательным контролем. На рис. 4 показано изменение числа интерферон-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации в пробе с нестимулированными лимфоцитами (по средним значениям). Достоверные различия в сторону уменьшения исследуемого показателя отмечены у К.М.В. и И.Е.Г (на 9,8 и на 24,3 единицы соответственно). Увеличение в числе интерферон-γ- продуцирующих клеток зафиксировано у С.Е.В. (на 7,8). Подтверждаемое статистикой изменение спонтанной секреции интерферона-γ, наблюдается у 3 пациентов из 12 (25%): К.М.В, С.Е.В. и И.Е.Г. У одной больной (8,3%) – увеличение изучаемого показателя; у двух (16,7%) – уменьшение в процессе иммунизации. Однако у С.Е.В. и И.Е.Г. изменение зафиксировано не по сравнению с 1-ой точкой, а с последующими. На рис. 5 изображено изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с опухолевым лизатом (по средним значениям). У 3-х больных (25%) имеется уменьшение исследуемого показателя либо по сравнению с первой точкой, либо с предшествующей (пациенты К.М.В., Ф.Р.С., Д.А.А.), у одной (8,3%) – увеличение (больная З.И.Б.). В таблице 4 представлено число клеток, секретирующих интерферон-γ в ответ на ФГА у разных больных в процессе иммунизации. Было зафиксировано отличие от пробы с нестимулированными лимфоцитами, кроме 3 точки у У.О.В., 1-ой точки у К.Е.В. и в двух точках у П.А.С. Как следует из рисунка 6, у 9 пациентов (75%) исследуемый показатель в ответ на стимуляцию ФГА изменяется в процессе вакцинотерапии. У К.М.В. и И.Е.Г. число изучаемых клеток сначала уменьшается (на 54 * Рис. 4. Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров без активатора (по средним значениям) у больных, получающих Мелавак. * достоверное различие по сравнению с 1-ой точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-ой и предшествующей точками. 55 Число интерферон-γ-продуцирующих клеток 30 25 20 Точка 1 15 Точка 2 Точка 3 10 * 5 * * *** 0 К.М.В. Ф.Р.С. Д.А.А. К.Е.В. Х.Л.И. У.О.В. Пациенты Рис. 5 (начало). Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с опухолевым лизатом (по средним значениям) у больных, получающих Мелавак. * достоверность по сравнению с 1-ой точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-ой и предшествующей точками. 56 Число интерферон-γ-продуцирующих клеток 40 35 * 30 25 20 Точка 1 Точка 2 15 Точка 3 10 5 0 И.Е.Г. П.А.С. Б.Г.А. З.И.Б. С.А.В. Пациенты Рис. 5 (окончание). Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с опухолевым лизатом (по средним значениям) у больных, получающих Мелавак. 57 Таблица 4 (начало). Число лимфоцитов, секретирующих ИФН-γ, в ответ на стимуляцию ФГА и в отсутствии стимуляции, у больных, получающих вакцину Мелавак (по значению медиан). NФГА – число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе с ФГА; Nн/ст – число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе без активатора Больные Точка 1 Nн/ст К.М.В. С.Е.В. Ф.Р.С. Х.Л.И. Д.А.А. Б.Г.А. Точка 2 NФГА Nн/ст Точка 3 NФГА Nн/ст Точка 4 NФГА Nн/ст NФГА 11 153,5 2 170 5,5 131 8 305 (7 - 18) (129-190) (1 – 3) (144-191) (3 – 7) (130-132) (3 – 20) (292-335) ― ― 9,5 181,5 17 158 (8 – 12) (124-216) (16 – 22) (145-167) ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― ― 4,5 190,5 3,5 219 5 228 (0 – 6) (162-213) (3 – 5) (211-244) (2 – 7) (185-245) 2 90,5 3 131 4 144,5 (1 – 3) (67-133) (1 – 5) (120-170) (1 – 7) (130-157) 4 189 5 139 4,5 (3 – 9) (134-210) (2 – 9) (87-168) (3 – 5) 6 69 6,5 149 (3 – 10) (51-74) (3 – 13) (143-155) ― 58 Таблица 4 (окончание). Число лимфоцитов, секретирующих ИФН-γ, в ответ на стимуляцию ФГА и в отсутствии стимуляции, у больных, получающих вакцину Мелавак (по значению медиан). Р – нет статистически значимого отличия от пробы без активатора в этой точке у данного больного Точка 1 Больные К.Е.В. У.О.В. П.А.С. И.Е.Г. Точка 2 С.А.В. Точка 4 Nн/ст NФГА Nн/ст NФГА Nн/ст NФГА 12 9P 10 58 11 186 (7 – 12) (7-18) (8 – 12) (57-59) (1 – 11) (167-196) 16 71 47 92 28 29Р (11 – 19) (70-76) (20 – 72) (89-106) (17 – 44) (26 -31) 32 41Р 13 16Р 4 153 (17 – 33) (39-48) (12 – 14) (10-21) (1 – 13) (137-166) 42 39 (33-59) ― 91 ― (76-96) З.И.Б. Точка 3 11 163 30 287 (11 – 12) (130-185) (23 – 40) (266-319) 12 147 8 129 (8 – 14) (138-165) (2 – 10) (128-159) Nн/ст NФГА ― ― ― ― ― ― 155 12 123 (30 – 41) (124-158) (9 – 16) (116-142) ― ― ― ― ― ― ― ― 59 Рис. 6 (начало). Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с ФГА (по средним значениям) у больных, получающих Мелавак. * достоверное различие по сравнению с 1-ой точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-ой и предшествующей точками. 60 Рис. 6 (окончание). Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с ФГА (по средним значениям) у больных, получающих Мелавак. 61 12,5 (n=11) 13 10,4 (n=10) 12 Число интерферон-γпродуцирующих клеток Р>0,05 (Тест Фридмана) 11,3 (n=2) 9,9 (n=8) 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 Точки Рис. 7. Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров без активатора (в среднем по точкам). 8,3 (n=11) Число интерферон-γпродуцирующих клеток 9 8 7 Р>0,05 (Тест Фридмана) 6,9 (n=9) 6,3 (n=2) 4,6 (n=11) 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 Точки Рис. 8. Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с опухолевым лизатом (в среднем по точкам). 62 Число интерферон-γ-продуцирующих клеток Р>0,05 (Тест Фридмана) 250 200 110 (n=11) 150 218,8 (n=2) 145,3 (n=8) 135,9 (n=12) 100 50 0 1 2 3 4 Точки Рис. 9. Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с ФГА (в среднем по точкам). 3-ей и 2-ой точках соответственно), а затем достоверно увеличивается (на 4 и 3 точках соответственно). У больных Б.Г.А., З.И.Б., Ф.Р.С., Х.Л.И., К.Е.В., П.А.С. замечено статистически значимое увеличение интерферон-γ- продуцирующих клеток; у У.О.В. – уменьшение. На рисунках 7-9 приведены объединенные гистограммы значений клеток, вырабатывающих исследуемый цитокин, на разных точках при разных активаторах по всем больным. Статистически значимых изменений от точки к точке ни в одной из проб выявить не удалось. Таким образом, как видно из исследования по активации лимфоцитов ФГА, вакцина Мелавак стимулирует лишь неспецифический иммунитет. Но, поскольку не выявлено целенаправленного увеличения интерферон-γпродуцирующих клеток от точки к точке, и при объединенном сравнении 63 точек по всем больным нет статистически значимого различия, данная стимуляция может рассматриваться только на уровне тенденции. 64 3.2. ОЦЕНКА Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА МЕТОДОМ ELISPOT У БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ, ПОЛУЧАЮЩИХ ДЕНДРИТНОКЛЕТОЧНУЮ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ ВАКЦИНУ В РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН проводятся клинические испытания противоопухолевой вакцины на основе аутологичных дендритных клеток, нагруженных аллогенным опухолевым лизатом. В исследование были включены пациенты с диссеминированной меланомой кожи и пациенты без признаков заболевания после хирургического лечения. Последняя группа пациентов получала также цитостатик циклофосфамид. Противоопухолевая вакцина на основе ДК вводилась больным внутрикожно в дозе 1-3106 ДК. Интервалы между введениями составляли 2 недели первые 3 вакцинации, далее 1 раз в месяц. Иммунизация продолжалась вплоть до прогрессирования заболевания. У больных на разных этапах вакцинации (условно обозначенных «точками») проводился забор крови, из которой получали МПК. В дальнейшем эти клетки применялись при оценке Т-клеточного иммунитета методом ELISPOT. Из-за особенностей и удобства предоставления крови отделением биотерапии опухолей НИИ Клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, у разных больных набор точек различался. По этой причине у одной группы пациентов 2-ой точкой (следующей после первой) служил забор крови перед 3-ей вакцинацией, у другой группы – перед 5-ой. Аналогичным образом, 3-ей точкой служил забор крови либо перед 5-ой, либо перед 10-ой вакцинацией (у разных пациентов). Это же относится и к 4ой точке. Во всех случаях 1-ой обозначалась точка, соответствующая забору крови перед первой вакцинацией. При оценке спонтанной секреции интерферона-γ клетками МПК инкубировались без стимулятора в полной среде. В качестве опытной пробы использовался лизат опухолевой линии mel Kor. Для оценки неспецифического иммунного ответа в процессе иммунизации в качестве активатора применялся фитогемагглютинин (ФГА), 65 являющийся одновременно и индикатором успешной постановки реакции. Всего в исследование было включено 18 больных — 7 (38,9%) мужчин и 11 (61,1%) женщин. Средний возраст больных составил 59 лет (от 26 до 76). У части больных в качестве активатора в опытной пробе использовался опухолевый лизат, полученный методом замораживания-оттаивания без осаждения путем центрифугирования крупных фрагментов клеток. Опухолевый лизат с осаждением крупных фрагментов клеток служил стимулятором лимфоцитов у всех больных. Идея использования лизата, полученного разными способами, заключалась в попытке сделать данный активатор более иммуногенным для лимфоцитов и, как следствие, получить более детальную картину иммунологического ответа на вакцинацию. Способ получения лизата без центрифугирования был условно назван I способом, способ получения лизата после центрифугирования был назван – II способом. Сравнение числа клеток в опытной пробе и при отсутствии стимуляции для некоторых точек приведены в табл. 5. В 20 точках из 36 не удалось выявить статистически значимой разницы. Из оставшихся 16 точек в 6-ти изучаемый показатель был больше в пробе с нестимулированными клетками (что не позволяет рассматривать ее в качестве отрицательного контроля), в 10-ти – меньше. Таким образом, говорить о возможной взаимосвязи между данными пробами затруднительно. По этой причине видится целесообразным рассматривать клетки, активируемые опухолевым лизатом, отдельно, без сопоставления с нестимулированными. Как следует из этой же табл. 5, число клеток, вырабатывающих интерферон-γ в пробах с разными опухолевыми лизатами различаются только в 3-х случаях (из 24). В них число исследуемых клеток в пробе с лизатом, полученным I способом, выше, чем в пробе с опухолевым лизатом, полученным после центрифугирования. Данный факт, свидетельствует, по сути о совпадении влияний данных активаторов на число клеток, секретирующих интерферон-γ. Таким образом, принципиально возможно 66 Таблица 5 (начало) Число ИФН-γ-продуцирующих клеток в ответ на стимуляцию опухолевым лизатом (полученым двумя способами), у больных, иммунизированных дендритноклеточной вакциной (по значению медиан). Nн/ст – число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе без активатора; Nб/от лизат - число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе с опухолевым лизатом, полученным I способом; Nот лизат - число ИФН-γ-продуцирующих клеток в пробе с опухолевым лизатом, полученным II способом; Р – достоверность между пробами с двумя разновидностями лизата; * - различия статистически значимы по сравнению с пробой без активатора. Больные Точки Nн/ст (мин-макс) В.Е.В 2 ― 1 П.Н.А. 2 М.А.В. 3 1 2 Т.А.В. 3 4 К.Е.С. 1 69 (61 – 74) 68 (66 – 97) 61 (47 – 71) 63 (61 – 85) 11 (10 – 13) 2 (1 – 6) 4 (2 – 4) 39 (36 – 46) Nб/от лизат (мин-макс) 4 (3 – 4) 89 (72 – 97) 16* (16 – 22) 27* (23 – 33) 56 (49 – 70) 83* (58 – 83) ― ― 6* (5 – 6) Nот лизат (мин-макс) 2 (2 – 3) 65 (55 – 67) 18* (13 – 20) 24* (21 – 26) 30* (25 – 35) 61* (55 – 73) 31* (21 – 34) 44,5* (40 – 57) ― Р Р<0,05 Р<0,05 Р>0,05 Р>0,05 Р<0,05 Р>0,05 ― ― ― 67 Таблица 5 (окончание) Число ИФН-γ-продуцирующих клеток в ответ на стимуляцию опухолевым лизатом (полученым двумя способами), у больных, иммунизированных дендритноклеточной вакциной (по значению медиан). Больные Точки Nн/ст (мин-макс) Nб/от лизат (мин-макс) Nот лизат (мин-макс) Р Г.С.Д. 2 10 (8 – 11) 6 (5 – 9) 3 (1 – 8) 7 (4 – 10) 6 (2 – 10) 12 (10 – 14) 11 (7 – 12) 8 (5 – 9) 19 (17 – 33) 29* (25 – 30) ― ― ― 17* (14 – 17) 13,5* (8 – 16) 21,5* (16 – 25) 18* (14 – 24) ― ― ― ― 16* (13 – 21) 7,5* (6 – 11) ― 3 Т.О.В. 3 4 Д.Ф.А. 4 Г.С.Л. 1 2 Ш.Е.Н. 2 С.А.Б. 1 ― ― ― 3* (1 – 6) 33* (30 – 45) ― ― ― ― ― ― ― 68 Число интерферон-γ-продуцирующих клеток 80 70 * 60 *** 50 40 *** *** ** Точка 1 Точка 2 30 *** * Точка 3 *** Точка 4 20 * * ** 10 ** 0 Т.А.В. Т.О.В. У.Р.В. С.А.Б. Б.А.В. С.Н.М. С.Л.В. Пациенты Рис. 10 (начало). Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с опухолевым лизатом, полученным II способом (по средним значениям) у больных, иммунизированных дендритноклеточной вакциной. * достоверное различие по сравнению с 1-ой точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-ой и предшествующей точками. 69 Число интерферон-γ-продуцирующих клеток 80 70 ** 60 50 40 Точка 1 * 30 *** * 20 10 ** * Точка 2 * Точка 3 * ** * Точка 4 * 0 М.А.В. Г.С.Л. Ш.Е.Н. Д.Ф.А. П.Н.А. С.Р.В. Г.С.Д. Пациенты Рис. 10 (окончание). Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с опухолевым лизатом, полученным II способом (по средним значениям) у больных, иммунизированных дендритноклеточной вакциной. 70 Число интерферон-γ-продуцирующих клеток 500 *** 450 * * *** * 400 * ** * * * 350 * *** 300 *** ** Точка 1 *** 250 Точка 2 200 Точка 3 Точка 4 150 100 50 0 С.Н.М. С.Л.В. М.А.В. Г.С.Л. П.А.В. Т.О.В. Д.Ф.А. Б.А.В. Пациенты Рис. 11 (начало). Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с ФГА (по средним значениям) у больных, получающих дендритноклеточную вакцину. * достоверное различие по сравнению с 1-ой точкой; ** достоверное различие по сравнению с предшествующей точкой; *** достоверное различие по сравнению с 1-ой и предшествующей точками. 71 Число интерферон-γ-продуцирующих клеток 550 500 *** 450 400 * *** * 350 300 Точка 1 ** ** * 250 * *** 200 150 Точка 3 * Точка 4 *** *** 100 Точка 2 * 50 0 У.Р.В. Т.А.В. П.Н.А. С.Р.В. Г.С.Д. С.А.Б. Ш.Е.Н. К.М.Н. Пациенты Рис. 11 (окончание). Изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с ФГА (по средним значениям) у больных, получающих дендритноклеточную вакцину. 72 Есть повышение иммунного ответа Нет повышения и понижения иммунного ответа 22,2% (4) 55,6% (10) Есть понижение иммунного ответа 22,2% (4) Рис. 12. Частота иммунного ответа у больных, получающих дендритноклеточную вакцину, при инкубации лейкоцитов с опухолевым лизатом. Есть повышение иммунного ответа Нет повышения и понижения иммунного ответа 44,4% (8) 44,4% (8) Есть понижение иммунного ответа 11,1% (2) Рис. 13. Частота иммунного ответа у больных, получающих дендритноклеточную вакцину, при инкубации лейкоцитов с ФГА. 73 75 80 70 Положите+ льный Иммунный ответ на ФГА иммунный ответ на ФГА - ОтрицаИммунный ответ на ФГА тельный 60 60 % Больных 40 50 иммунный ответ на ФГА 40 25 30 20 10 0 + Иммунный ответ на Положительный иммунопухолевый лизат ный ответ на лизат -Отрицательный Иммунный ответ на иммунопухолевый лизат ный ответ на лизат Рис. 14. Различие в иммунном ответе на опухолевый лизат в зависимости от ответа на ФГА у больных в процессе иммунизации дендритноклеточной вакциной. использовать любой из них для стимуляции лейкоцитов. На основании этого в дальнейшем применялся опухолевый лизат после центрифугирования, который и был использован для активации лимфоцитов больных во всех точках. По этой причине оценку противоопухолевой активности дендритноклеточной вакцины проводили на основании изменения числа исследуемых клеток при инкубации с данным противоопухолевым лизатом. На рис.10 показано изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в 74 66,7 70 50 60 50 Наличие реакции ГЗТ 50 33,3 % Больных 40 Отсутствие реакции ГЗТ 30 20 10 0 +Иммунный ответ на Положительный иммунопухолевый лизат ный ответ на лизат -Иммунный ответ на Отрицательный иммунопухолевый лизат ный ответ на лизат Рис. 15. Различие в иммунном ответе на опухолевый лизат в зависимости от реакции ГЗТ у больных в процессе иммунизации дендритноклеточной вакциной. процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с опухолевым лизатом, полученным II способом (по средним значениям), у больных, иммунизированных дендритноклеточной вакциной. Из представленных на рисунке результатов видно, что число исследуемых клеток увеличивается у 10 пациентов (по сравнению с 1 точкой): Т.А.В., Т.О.В., У.Р.В., С.А.Б., Б.А.В., С.Н.М., С.Л.В., М.А.В., Г.С.Л. и Ш.Е.Н. У четырех (С.Р.В., П.Н.А., Д.Ф.А. и Г.С.Д.) – достоверно понижается. У остальных четырех остается на 75 том же уровне. Минимальное увеличение в числе ИФН-γ-продуцирующих клеток зафиксировано у пациента М.А.В. (ко 2-ой точке) и составило 2,6 клеток. Максимальное - 39 клеток (у больной С.Л.В. к 3-ей точкой). В наибольшее количество раз (в 23,7) исследуемый показатель увеличился у больного М.А.В. (к 3-ей точке). Таким образом, дендритноклеточная вакцина вызывает стимуляцию противоопухолевого иммунитета у 55,6% пациентов и только у 22,2% - ингибирование (см. рис. 12) На рис. 11 представлено изменение числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в процессе вакцинации при инкубации мононуклеаров с ФГА (по средним значениям) у больных, получающих дендритноклеточную вакцину. Число исследуемых клеток при стимуляции лейкоцитов ФГА увеличивается у 8 пациентов (по сравнению с 1 точкой): С.Н.М., С.Л.В., М.А.В., Г.С.Л., П.А.В., Д.Ф.А., Б.А.В. и У.Р.В. Также у восьми (Т.О.В., Т.А.В., П.Н.А., С.Р.В., Г.С.Д., С.А.Б., Ш.Е.Н. и К.М.Н.) – достоверно понижается. У оставшихся двух – не меняется по отношению к 1-ой точке в процессе вакцинации. Минимальное увеличение в числе ИФН-γ-продуцирующих клеток зафиксировано у пациента П.А.В. и составило 60,7 клеток. Максимальное – 387,3 клеток (у больной С.Н.М. к 3-ей точке). Таким образом, о неспецифической активации Т-клеточного иммунитета в процессе иммунизации дендритноклеточной вакциной можно говорить у 44,4% пациентов и у стольких же больных замечено ингибирование активности Тклеток по изучаемому показателю (см. рис. 13). При сопоставлении иммунного ответа в процессе вакцинации при стимуляции лимфоцитов опухолевым лизатом и ФГА (рис. 14) взаимосвязи выявить не удалось (Р>0,05): иммунный ответ при активации лейкоцитов опухолевым лизатом, как правило, наблюдался у одних пациентов, а при активации лейкоцитов ФГА – у других. Это может быть вызвано как активацией специфического (в ответ на опухолевый лизат, который содержит 76 антигены опухоли), так и неспецифического (на ФГА) иммунитета при лечении дендритноклеточной вакциной. Было сопоставлено наличие иммунного ответа и реакции ГЗТ у больных (рис. 15). Взаимосвязи между этими двумя показателями обнаружено не было (Р>0,05). 77 3.3. ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ, ПОЛУЧАЮЩИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ВАКЦИНЫ В процессе вакцинации больных, помимо Т-клеточного иммунного ответа, также исследовали наличие гуморального иммунитета. Для выполнения этой задачи на разных этапах вакцинации у больных забиралась кровь, сыворотка которой замораживалась при -20оС. Затем с помощью проточной цитометрии и иммуноцитохимического метода анализировали наличие антител к опухолеассоциированным или трансплантационным антигенам в процессе иммунизации той или иной вакциной. Для этого были использованы 2 меланомные линии (mel Kor и mel Ibr) и линия рака молочной железы SK-BR-3, служившая отрицательным контролем. Отличительным свойством линии mel Kor является отсутствие молекул главного комплекса гистосовместимости I и II класса при наличии общих антигенов меланомы (CD63, HMB45, HMV, Melan A, тирозиназы, а также раково-тестикулярного маркера MAGE-3). Линия mel Ibr характеризуется наличием не только ряда меланомных антигенов, но и наличием молекул главного комплекса гистосовместимости обоих классов. Клетки линии SK-BR-3 не несут на своей поверхности антигенов меланомы. По этой причине при оценке гуморального ответа у больных меланомой, они служили отрицательным контролем. В исследование было включено 34 больных диссеминированной меланомой, получавших аутологичную дендритную вакцину и 9 больных, получавших аллогенную вакцину Мелавак. В качестве контроля использовались образцы сыворотки крови 6 здоровых доноров. Была проведена оценка наличия IgM- и IgG-антител к опухолеассоциированным антигенам меланомы сыворотки крови больных и здоровых доноров методом непрямой реакции иммунофлуоресценции 78 (РИФ). Экспрессию антигенов на поверхности клеток определяли на проточных цитометрах Анализируемый FACScan гейт и FACSCalibur настраивали на (Becton основании Dickinson). комбинации светорассеивания и размера клеток. Результаты данного исследования представлены в табл. 6 и табл. 7. IgM и IgG-антитела против поверхностных антигенов меланомы в образцах сыворотки крови вакцинированных больных диссеминированной меланомой методом непрямой РИФ были выявлены у ряда пациентов. Однако их уровень в процессе иммунизации не менялся. Таблица 6 Определение специфических IgM в крови больных методом непрямой реакции иммунофлуоресценции меланомой в процессе вакцинотерапии. Группы пациентов 1.Дендритноклеточная вакцина (n=34) 2.Вакцина Мелавак (n=9) 3. Контрольная группа больных меланомой без вакцинотерапии (n=9) 4. Контрольная группа здоровых доноров (n=6) Количество антиген-положительных клеток в клеточной линии меланомы человека mel Kor, (%) Количество антиген-положительных клеток в клеточной линии меланомы человека mel Ibr, (%) до лечения в процессе лечения до лечения в процессе лечения 15 ± 3 16,2 ± 2,6 4,5 ± 2,3 4,4 ± 2,1 6,0 ± 1,6 5,7 ± 2,3 7,0 ± 3,0 6,8 ± 2,2 9,6 ± 2,9 5,6 ± 1,2 4,1 ± 0,7 3,5 ± 0,5 79 Таблица 7 Определение специфических IgG в крови больных меланомой методом непрямой реакции иммунофлуоресценции в процессе вакцинотерапии. Группы пациентов 1.Дендритноклеточная вакцина (n=34) 2.Вакцина Мелавак (n=9) Количество антиген-положительных клеток в клетках линии меланомы человека mel Kor, (%) до лечения в ходе лечения до лечения в ходе лечения 2,5 ± 2,3 3,7 ± 2,4 4 ± 2,5 4,9 ± 3 1,1 ± 0,6 1,8 ± 0,9 1,1 ± 0,9 1,2 ± 0,7 3. Контрольная группа больных меланомой без вакцинотерапии (n=9) 4. Контрольная группа здоровых доноров (n=6) Кроме Количество антиген-положительных клеток в клетках линии меланомы человека mel Ibr, (%) того, 2,8 ± 0,5 6,1 ± 1,4 0,8 ± 0,5 0,9 ± 0,6 данные результаты следует оценивать как неспецифические, поскольку как клетки mel Kor, так и клетки mel Ibr обладают одинаковой морфологией внутри своей линии и для того, чтобы говорить о специфической реакции, необходимо обнаружение 90% (и выше) экспрессии исследуемых антигенов. Таким образом, не выявлено наличие специфических антител к поверхностным антигенам меланомы у больных, получающих вакцину Мелавак и дендритноклеточную. 80 Гистограммы экспрессии поверхностных антигенов клеток линии mel Kor против IgM в контроле и после инкубации клеток с сывороткой крови пациента Д.Ф.А. представлены на рис. рис. 16 – 18. Рис. 16. Гистограмма распределения клеток линии mel Kor, инкубируемых с IgM в контроле. Рис. 17. Гистограмма распределения клеток линии mel Kor, инкубируемых с сывороткой крови пациента Д.Ф.А. до иммунизации и антителами против IgM человека. 81 Рис. 18. Гистограмма распределения клеток линии mel Kor, инкубируемых с сывороткой крови пациента Д.Ф.А. на 2-ой точке и антителами против IgM человека. Было проведено определение IgM- и IgG-антител к опухолеассоциированным антигенам меланомы в сыворотке крови больных и здоровых доноров ме- тодом флуоресцентного иммуноцитохимического анализа (ФИЦХ) (табл. 8, табл.9). Как видно из представленных таблиц, иммуноглобулины класса IgG и IgМ к опухолеассоциированным антигенам у больных, получающих дендритноклеточную вакцину, отсутствовали. При этом у больных, получающих вакцину Мелавак реакция оказалась положительной. Кроме того изучаемый показатель увеличивался в процессе иммунизации сразу по двум классам иммуноглобулинов на двух клеточных линиях. Поскольку непрямой реакцией флуоресценции антител к поверхностным антигенам меланомных клеток выявлено не было, а флуоресцентным иммуноцитохимическим анализом было показано их присутствие (окраска с IgM) у пациентов, получающих Мелавак, то однозначно говорить о содержании их в сыворотке крови у данной группы больных не представляется возможным. На линии SK-BR-3 не было реакции ни при 82 Таблица 8 Результаты определения специфических IgМ в сыворотке крови больных меланомой методом флуоресцентного иммуноцитохимического анализа в процессе вакцинотерапии. «+++» - высокая интенсивность окрашивания клеток; «++» - средняя интенсивность окрашивания клеток; «+» – низкая интенсивность окрашивания клеток; «―» – отсутствие окрашивания. Интенсивность окрашивания и % Интенсивность антиген-положительных клеток в окрашивания и % Группы клетках линии меланомы антиген-положительных пациентов человека mel Kor клеток в клетках линии меланомы человека mel Ibr до лечения в ходе лечения до лечения в ходе лечения 1.Дендритноклеточная ― ― ― ― вакцина (0/34) (0/34) (0/34) (0/34) Мелавак ++, 40% ++, 70% ++, 40% ++, 60% (n=9) (7/9) (7/9) (7/9) (7/9) (n=34) 2.Вакцина 3. Контрольная группа больных ― ― меланомой без (0/9) (0/9) 4. Контрольная ― ― группа (0/6) (0/6) вакцинотерапии (n=9) здоровых доноров (n=6) 83 Таблица 9 Результаты определения специфических IgG в сыворотке крови больных меланомой методом флуоресцентного иммуноцитохимического анализа в процессе вакцинотерапии. «+++» - высокая интенсивность окрашивания клеток; «++» - средняя интенсивность окрашивания клеток; «+» – низкая интенсивность окрашивания клеток; «―» – отсутствие окрашивания. Группы Интенсивность окрашивания и % Интенсивность пациентов антиген-положительных клеток в окрашивания и % клетках линии меланомы человека антиген-положительных mel Kor, (%) клеток в клетках линии меланомы человека mel Ibr, (%) до лечения в ходе лечения до лечения в ходе лечения 1.Дендритноклеточная ― ― ― ― вакцина (0/34) (0/34) (0/34) (0/34) Мелавак +, 20% +, 40% ― +, 30% (n=9) (4/9) (4/9) (0/9) (1/9) (n=34) 2.Вакцина 3. Контрольная группа больных меланомой без +, 20% ― вакцинотерапии (2/9) (0/9) группа здоровых ― ― доноров (0/6) (0/6) (n=9) 4. Контрольная (n=6) 84 А. Б. В. Г. Рис. 19. Иммуноцитохимическая реакция на клетках линии mel Kor. А – отрицательная реакция с IgM в контроле (сыворотка крови здорового донора); Б – отрицательная реакция с IgG в контроле (сыворотка крови здорового донора); В – отрицательная реакция с IgM в сыворотке крови больного меланомой, получавшего дендритную вакцину; Г – отрицательная реакция с IgG в сыворотке крови больного меланомой, получавшего дендритную вакцину. Окрашивание ядер по Hoechst, увеличение х400. 85 А. В. Б. Г. Рис. 20. Иммуноцитохимическая реакция на клетках линии mel Kor. А – положительная реакция (специфическое окрашивание) с IgM в сыворотке крови больных, иммунизированных вакциной Мелавак, полученная на клетках mel Kor; Б – положительная реакция (специфическое окрашивание) с IgG в сыворотке крови больных, иммунизированных вакциной Мелавак, полученная на клетках mel Kor; В – отрицательная реакция с IgM в сыворотке крови больных, иммунизированных вакциной Мелавак, полученная на клетках SK-BR-3; Г – отрицательная реакция с IgG в сыворотке крови больных, иммунизированных вакциной Мелавак, полученная на клетках SKBR-3. Ядра окрашивали Hoechst, увеличение х400. 86 А. Б. В. Г. Рис. 21. Иммуноцитохимическая реакция на клетках линии mel Ibr. А – отрицательная реакция с IgM в контроле (сыворотка крови здорового донора); Б – отрицательная реакция с IgG в контроле (сыворотка крови здорового донора); В – отрицательная реакция с IgM в сыворотке крови больного меланомой, получавшего дендритную вакцину; Г – отрицательная реакция с IgG в сыворотке крови больного меланомой, получавшего дендритную вакцину. Окрашивание ядер по Hoechst, увеличение х400. 87 А. Б. В. Рис. 20. Иммуноцитохимическая реакция на клетках линии mel Ibr и SK-BR3. А – положительная реакция (специфическое окрашивание) с IgM в сыворотке крови больных, иммунизированных вакциной Мелавак, полученная на клетках mel Ibr; Б – положительная реакция (специфическое окрашивание) с IgG в сыворотке крови больных, иммунизированных вакциной Мелавак, полученная на клетках mel Ibr; В – отрицательная реакция с IgG в сыворотке крови больных, иммунизированных дендритноклеточной вакциной, полученная на клетках SK-BR-3. Окрашивание ядер по Hoechst, увеличение х400. 88 вакцинотерапии Мелавак, ни при иммунизации дендритными клетками. Изображение окраски клеток приводится на рис. 17 – 20. Полученные результаты иммуноглобулинов опухолеассоциированным обоих свидетельствуют классов антигенам у об к больных, отсутствии поверхностным получающих дендритноклеточную вакцину и о наличии антител к цитоплазматическим антигенам у больных, получающих вакцину Мелавак. Факт их увеличения в процессе вакцинации у данной группы пациентов дает основание говорить о стимуляции гуморального иммунного ответа на иммунизацию вакциной Мелавак. 89 3.4. СРАВНЕНИЕ Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У БОЛЬНЫХ, ПОЛУЧАЮЩИХ ДЕНДРИТНОКЛЕТНОЧНУЮ ВАКЦИНУ, С НЕКОТОРЫМИ КЛИНИЧЕСКИМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ Для того, чтобы оценить насколько значим для выздоровления больного иммунный ответ на вакцинацию, были сопоставлены клинические и иммунологические параметры. Кроме того, немаловажным достижением при исследованиях является выявление прогностического фактора как на дальнейшее течение заболевания, так и на тактику его лечения. Вакцины на основе дендритных клеток и другие цельноклеточные вакцины, применяемые в онкологии, направлены на стимуляцию клеток иммунной системы против опухоли [43]. Исходя из этого, большое значение имеют сведения о том, насколько данный замысел реализуется в клинической практике, в какой степени данные вакцины способствуют выздоровлению больного или стабилизации заболевания. Для решения данной задачи были рассмотрены изменения прогностического маркера меланомы S-100 и времени до прогрессирования с учетом развития Т-клеточного ответа у больных в процессе вакцинации. Кроме того, представляет интерес сопоставление режима вакцинации и развитие у больного клеточного иммунитета в ответ на иммунизацию. При сопоставлении режима вакцинации и иммунного ответа у больных, взаимосвязи выявлено не было (Р>0,05). У 5 (из 11) есть повышение Тклеточного иммунного ответа в процессе вакцинации в группе адъювантного лечения. У 4 (из 7) есть стимуляция данного показателя в группе терапевтического лечения. Реакция ГЗТ в равной пропорции наблюдалась у больных в данных группах. Для сравнения иммунологических и клинических параметров был выбран также сывороточный маркер меланомы S-100. S-100 принадлежит к семейству кальций-связывающих белков, присутствующих в клетках различных тканей. Они участвуют в поддержании гомеостаза ионов Ca+2, 90 процессах клеточного деления, передачи внутриклеточного сигнала апоптоза, а также клеточной дифференцировки. По уровню S-100 в спинномозговой жидкости определяют степень повреждения головного мозга [47]. Кроме меланомы, повышение белка S-100 в крови отмечено при глиоме и нейробластоме [67]. Установлено, что средние значения белка S-100 коррелируют с степенью инвазии меланомы и размером первичного опухолевого очага [27]. Уровень S-100 также имеет взаимосвязь с числом пораженных органов, присутствием метастазов в различных органах (в том числе костном мозге) и ответом пациента на химиотерапию. При сравнении наличия иммунного ответа у больных с уровнем данного маркера (n=8) (табл. 10) была обнаружена обратная зависимость, которая, несмотря на статистическую значимость, в силу невысокой выборки может рассматриваться только на уровне тенденции. Таблица 10 Изменение маркера S-100 и иммунного ответа в процессе вакцинации у больных, получающих дендритноклеточную вакцину. Иммунный ответ S-100 Есть повышение Нет повышения Иммунный ответ есть 1 3 Иммунного ответа нет 4 0 91 Средняя продолжительность наблюдения за 17 больными, получавшими иммунотерапию, составила 6,3 ± 4,3 мес (медиана 4, от 2 до 18 мес). Прогрессирование заболевания за время наблюдения у больных, которым была проведена оценка иммунного ответа, наступило у 12 из 17 человек (табл. 11). Таблица 11 Продолжительность иммунизации и время до прогрессирования заболевания у больных, получающих дендритноклеточную вакцину. ВДП – время до прогрессирования (продолжительность жизни от начала вакцинации до наступления прогрессирования); ПЗ — прогрессирование заболевания; * - в случае, если на момент последнего обследования прогрессирование не наступило, вместо ВДП указан общий срок наблюдения. Пациенты Дата начала Дата Дата наступления ВДП* вакцинации окончания прогрессирования (мес) вакцинации В.Е.В. 07.2011 10.2011 10.2011 3 Б.А.В. 09.2011 06.2012 06.2012 9 М.А.В. 11.2011 Продолжается Без ПЗ 18 (04.2013) С.Н.М. 12.2011 04.2012 04.2012 4 С.Л.В. 01.2012 11.2012 11.2012 10 П.А.В. 02.2012 05.2012 05.2012 3 П.Н.А. 04.2012 08.2012 08.2012 4 Т.А.В. 05.2012 Продолжается Без ПЗ 10 08.2012 2 (04.2013) С.Р.В. 06.2012 08.2012 92 К.Е.С. 06.2012 09.2012 09.2012 3 Г.С.Д. 06.2012 08.2012 08.2012 2 Т.О.В. 06.2012 12.2012 12.2012 6 Д.Ф.А. 06.2012 Продолжается Без ПЗ 10 (04.2013) Г.С.Л. 06.2012 У.Р.В. 08.2012 К.М.Н. 07.2012 С.А.Б. 07.2012 08.2012 08.2012 Продолжается (04.2013) 11.2012 Продолжается Без ПЗ 8 11.2012 4 Без ПЗ (04.2013) 2 9 Было проведено исследование корреляции между иммунным ответом, оцененным методом ELISPOT, и временем до прогрессирования заболевания у пациентов иммунизированных дендритноклеточной вакциной. Для этого была рассмотрена группа пациентов, получавших вакцину в адъювантном режиме (рис. 21), и группа, иммунизированных терапевтически (рис. 22). В обоих случаях отмечено увеличение времени до прогрессирования при наличии противоопухолевого Т-клеточного иммунного ответа, однако различия внутри этих групп не достигли статистической значимости. Возможная причина – маленькая выборка в каждой из них. Тем не менее, разделение на эти две группы с точки зрения разницы времени до прогрессирования не имеет под собой основания. Для подтверждения этого, они были сопоставлены для определения различия или сходства по данному показателю (рис. 23). Как следует из представленных графиков, статистической и даже видимой разницы между ними нет. На основании этого принципиально возможно их объединить как представляющих собой 93 Р = 0,139 (логранговый критерий) ―Иммунный ответ есть ―Иммунного ответа нет Время до прогрессирования (мес.) Рис. 21. Время до прогрессирования в зависимости от противоопухолевого иммунного ответа у больных, получавших дендритноклеточную вакцину в адъювантном режиме (n=5). Р = 0,125 (логранговый критерий) ―Иммунный ответ есть ―Иммунного ответа нет Время до прогрессирования (мес.) Рис. 22. Время противоопухолевого до прогрессирования иммунного ответа у в зависимости больных, от получавших дендритноклеточную вакцину в терапевтическом режиме (n=7). 94 Р = 0,954 (логранговый критерий) ― Адъювантный режим вакцинации ― Терапевтичес- кий режим вак- цинации Время до прогрессирования (мес.) Рис. 23. Время до прогрессирования в зависимости от режима вакцинации (n=12) у больных, получавших дендритноклеточную вакцину. Р = 0,038 (логранговый критерий) ―Иммунный ответ есть ―Иммунного ответа нет Время до прогрессирования (мес.) Рис. 24. Время до прогрессирования в зависимости от противоопухолевого иммунного ответа (n=12) у больных, получавших дендритноклеточную вакцину. 95 единый набор значений времени до прогрессирования. Было проведено исследование по определению взаимосвязи между временем до прогрессирования заболевания и противоопухолевым иммунным ответом у всех рассматриваемых пациентов, получающих дендритноклеточную вакцину (совместно). Результаты представлены на рис. 24. Исходя из них, можно заключить, что при повышении Т-клеточного иммунного ответа, продуцирующих выражающегося клеток, становится увеличением более числа длительным ИФН-γвремя до прогрессирования заболевания у пациентов. 96 Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ В настоящем исследовании оценивался клеточный и гуморальный иммунные ответы у больных в процессе иммунизации противоопухолевыми вакцинами. Сведения, полученные в данном анализе, позволяют говорить о возможностях вакцинотерапии, о реализации ее предназначения. Безусловно, основным фактором оценки эффективности любой формы лечения, являются клинические показатели (например, время до прогрессирования заболевания, время устойчивой ремиссии и др.). Однако тенденцию, правильность выбранной тактики той или иной терапии вполне допустимо оценивать по специфическим маркерам, цитокиновому профилю, иммунологическому статусу, развитию тех или иных реакций на фоне лечения. При оценке эффективности препаратов, направленных на стимуляцию иммунитета против опухоли, логично использовать методы оценки иммунного ответа в динамике, т.е. на разных этапах вакцинотерапии. Одним из методов оценки Т-клеточного звена иммунитета является метод ELISPOT. Его характеризует высокая чувствительность (учитываются единицы клеток), а также возможность использовать небольшого (по сравнению с методом по внутриклеточному окрашиванию на цитокины) количества биологического материала [132, 189]. Cледует отметить, что варианты постановки данной реакции варьируют у разных исследователей [90]. В связи с этим вопрос о наилучшем активаторе в том или ином случае является открытым. Для стимуляции клеток, исследуемых на продукцию цитокина, наиболее часто используют рекомбинантные белки [176], отдельные пептиды [194], опухолевые клетки [114] и нагруженные антигеном дендритные клетки [135]. Реже для этой цели применяют лизат клеток (например, опухолевых) [105]. В нашем исследовании именно последний агент служил основным стимулятором 97 лимфоцитов в пробе, где определялся иммунный ответ в отношении антигенов злокачественных клеток. Данный подход имеет свои преимущества и недостатки. К преимуществам относятся возможность выявлять Т-клеточный ответ на разные антигены, так как, по определению, в состав лизата входят смесь белков, пептидов и клеточных фрагментов (в том числе мембранных). В то же время, таким способом невозможно выявить лимфоциты, реактивные по отношению к тому или иному антигену. Для сравнения иммуногенности активатора, помимо лизата, для стимуляции лимфоцитов больных, получающих вакцину Мелавак, в нашей работе были использованы опухолевые клетки в разных соотношениях. При этом задача заключалась в выработке более выраженного иммунного ответа на антиген с тем, чтобы более точно определить изменения в числе ИФН-γпродуцирующих клеток. Пробы с указанными активаторами по отдельности сопоставлялись с пробой лимфоцитов в отсутствии стимулятора. В отдельных точках различие между ними достигло статистической значимости. Однако частота этих различий при разных активаторах находилась примерно на одном уровне, была значительна для лимфоцитов разных точек только у одной больной. У других пациентов различия достигнуто не было, что может говорить о допустимости использования любого из представленных в работе активаторов на основе опухолевых клеток. При этом необходимо отметить что только для 9 точек были использованы в качестве стимуляции опухолевые клетки, в отличие от активации опухолевым лизатом (здесь было задействовано 32 точки). Данный факт не позволяет полностью сопоставить инкубацию лейкоцитов с опухолевыми клетками и инкубацию первых с опухолевым лизатом. Пробу лейкоцитов в отсутствие стимулятора первоначально планировалось использовать в качестве отрицательного контроля для выявления фоновой секреции интерферона-γ клетками. Однако опыт показал, 98 что нестимулированные клетки не могут рассматриваться в качестве контроля. В 37,5% случаях число ИФН-γ-продуцирующих клеток было ниже именно в опытной пробе с лизатом. По этой причине была произведена оценка изменения ИФН-γ-продуцирующих клеток в одной и той же пробе на разных этапах вакцинации. В пробе нестимулированных клеток данный показатель изменился только в одном случае (8,3%) по сравнению со временем до начала вакцинации. Во всех остальных случаях в процессе вакцинации различия не достигли статистической значимости. Изменение изучаемого показателя было отмечено в сторону уменьшения числа клеток. Таким образом, повышения активности лимфоцитов в процессе вакцинации не наблюдается. При активации мононуклеаров опухолевым аналогичные результаты. У 3-х больных лизатом получены (25%) имеется уменьшение исследуемого показателя либо по сравнению с первой точкой, либо с предшествующей. И только у одной (8,3%) – увеличение. Таким образом, посути, в процессе иммунизации вакциной Мелавак нет активации клеточного противоопухолевого иммунитета. В пробе с фитогемагглютинином у большинства больных (66,7%) замечено увеличение исследуемого показателя хотя бы в одной из точек по сравнению с первой. Данный результат свидетельствует о стимуляции неспецифического, но не противоопухолевого иммунитета на фоне вакцинации. При этом у больных, получающих Мелавак, отмечено увеличение гуморального иммунного ответа, оцененного по наличию специфических антител к опухолевым антигенам меланомы. Этот факт может объясняться тем, что введенные цельные опухолевые клетки вакцины разрушаются в организме, и их фрагменты после поглощения макрофагами и незрелыми дендритными клетками представляются на поверхности АПК в составе молекул главного комплекса гистосовместимости II класса [10]. Иммуногенный комплекс узнается Т-хэлперами (Th2) и далее после их 99 взаимодействия с В-лимфоцитами последние дифференцируются в плазмоциты, секретирующие специфичные к данному антигену антитела. Однако роль гуморальных факторов в противоопухолевом иммунитете неоднозначна [24]. Противоопухолевые антитела могут связываться с поверхностью опухолевой клетки и блокировать мембранные молекулы, необходимые для жизнедеятельности клетки [150] либо же направлять на опухолевую клетку цитотоксическое действие фагоцитов или NK-клеток [143]. Несмотря на это, существуют работы, утверждающие, что антитела могут вызывать защитный эффект по отношению к опухоли [24]. Нередко антитела класса IgG являются не только протективными для опухолей, но и могут усиливать их рост. Такой эффект связывают с блокадой антителами опухолевых антигенов на мембране клетки и с исчезновением антигенов с поверхности клетки за счет эндоцитоза [24]. При оценке дендритноклеточную Т-клеточного вакцину, ответа также у было пациентов, использовано получавших несколько активаторов. Опытной пробой служили опухолевые лизаты, полученные двумя разными способами. Как и в случае с вакциной Мелавак, цель данного подхода заключалась в выработке более выраженного иммунного ответа на антиген. При сопоставлении клеток в отсутствие стимулятора и клеток опытной пробы взаимосвязи выявить не удалось. Поэтому при дальнейшем анализе рассматривались лишь опытные пробы и активность лимфоцитов в присутствии ФГА. Установлено, что число клеток, вырабатывающих интерферон-γ, одинаково по средним значениям в одной и той же точке при активации двумя разновидностями лизата. И принципиально возможно анализировать исследуемый показатель при инкубации с любым из них. При оценке изменений числа ИФН-γ-продуцирующих клеток в динамике был использован лизат, полученный II способом, по той причине, что он применялся для стимуляции лейкоцитов во всех точках. У 10 больных из 18 (55,6%) было зафиксировано повышение изучаемого показателя в ответ на 100 опухолевый лизат. У четырех больных (22,2%) – понижение. У остальных 4 пациентов число исследуемых клеток оставалось на том же уровне. Представленные результаты говорят о стимуляции Т-клеточного иммунного ответа у отдельных больных. Поскольку вакцина представляет собой дендритные клетки, нагруженные опухолевым антигеном, то в данном случае можно говорить о достижении ее назначения – стимуляции CD4+ и CD8+ Тклеток посредством представления опухолевых пептидов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости обоих классов [138]. У 8 пациентов (44,4%) было отмечено увеличение интерферон-γ- продуцирующих клеток также в ответ на ФГА. Однако корреляции между стимуляцией лейкоцитов опухолевым лизатом и ФГА обнаружено не было (точный критерий Фишера): иммунный ответ в данных пробах наблюдается у разных пациентов, а не у одних и тех же. Данный факт может говорить о специфической составляющей в противоопухолевом иммунном ответе у пациентов, получающих дендритноклеточную вакцину. Точно установить природу иммунного ответа, учитывая полученные результаты, не представляется возможным. Для определения, какой вклад вносят те или иные иммунные реакции в общее повышение интерферон-γ-продуцирующих клеток на фоне вакцинации, требуются дополнительные методы исследования. Главным из них является иммуномагнитная сепарация отдельных популяций лимфоцитов (Т-клеток, NK-клеток) и использование помимо других активаторов – нагруженных аутологичных дендритных клеток. В сыворотке крови пациентов, получающих дендритноклеточную вакцину, не было обнаружено антител к антигенам меланомы, что говорит об отсутствии развития гуморального иммунного ответа против опухоли. Из 10 случаев повышения противоопухолевого иммунного ответа у больных в процессе иммунизации дендритноклеточной вакциной в 7 – увеличение интерферон-γ-продуцирующих клеток было достигнуто уже на 2101 ой точке, в 3-х случаях – на последующих, что согласуется с работой зарубежных авторов [175]. Сам факт повышение Т-клеточного противоопухолевого ответа в нашей работе, подтверждается и другими учеными [135, 167]. Число таких пациентов варьируется у разных авторов [49, 136] и в среднем составляет 30-40%, что согласуется с результатами нашей работы. Т-клеточный иммунный ответ, оцененный методом ELISPOT, был сопоставлен с другим иммунологическим параметром – реакцией ГЗТ. Взаимосвязи между ними выявлено не было. Поскольку реакция гиперчувствительности замедленного типа является показателем наличия специфического Т-клеточного ответа [15], то ее отсутствие у пациентов, вызывает предположение в том числе о неспецифической составляющей в иммунном ответе на вакцинацию. При этом следует учитывать, что ГЗТ не является характеристикой, количественно оценивающей иммунный ответ, в отличие от метода ELISPOT, позволяющего, кроме того, прослеживать изменение в числе исследуемых клеток в динамике. Иммунный ответ, детектируемый в результате постановки ELISPOT, был нами сопоставлен с 3-мя клиническими показателями: стадией заболевания, определяющей режим вакцинации; маркером меланомы S-100 и временем до прогрессирования заболевания. При сопоставлении режима вакцинации и иммунного ответа у больных взаимосвязи выявлено не было. Статистически значимая взаимосвязь между уровенем маркера S-100 и изменением числа секретирующих интерферон-γ-клеток не выявлена предположительно по причине маленькой выборки испытуемых, но могла бы быть установлена при наличии чуть большего количества пациентов с той же тенденцией к обратной зависимости. Впрочем, настоящие результаты подтверждаются работами других ученых [34, 169]. Обнаружена прямая взаимосвязь между изменением числа интерферонγ-продуцирующих клеток и временем до прогрессирования заболевания (Р = 102 0,038) у пациентов, получающих дендритноклеточную вакцину, что позволяет говорить о прогностической значимости метода ELISPOT на течение заболевания на фоне вакцинотерапии. В заключении следует сказать, что представленные результаты позволяют утверждать, что есть стимуляция Т-клеточного звена иммунитета у более половины пациентов, получающих дендритноклеточную вакцину и о развитии гуморального у больных получающих цельноклеточную вакцину Мелавак. Вместе с тем дендритноклеточная вакцина реализует свое предназначение – стимулирует иммунный ответ, тем самым увеличивая время до прогрессирования заболевания на несколько месяцев (по нашим данным, до полугода). 103 ВЫВОДЫ 1. Иммунизация дендритноклеточной вакциной вызывает стимуляцию Т-клеточного иммунного ответа у 55,6% больных меланомой кожи. Количество интерферон-γ-продуцирующих клеток, оцененных методом ELISPOT, увеличивалось в процессе вакцинации до 24 раз. 2. Иммунизация вакциной Мелавак вызывает стимуляцию Т-клеточного иммунного ответа у 8,3% больных меланомой кожи. 3. Вакцина Мелавак индуцирует появление антител к цитоплазматическим антигенам меланомных клеток в сыворотке крови больных меланомой. Антитела к поверхностным антигенам клеток меланомы отсутствовали. 4. В сыворотке крови дендритноклеточную больных вакцину, не меланомой, обнаружены получавших антитела к поверхностным и цитоплазматическим антигенам клеточных линий меланомы. 5. Наличие Т-клеточного противоопухолевого иммунитета у больных меланомой кожи, получавших дендритноклеточную вакцину, прямо пропорционально времени до прогрессирования заболевания (Р=0,038). 6. Применение метода ELISPOT позволяет прогнозировать течение онкологических заболеваний при вакцинотерапии. 104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Агеенко, А.И. Иммунитет и терапия экспериментальных опухолей /А.И. Агеенко, С.П. Гордиенко, О.Г. Саканделидзе. − Кишенев: Штиинца, 1982. − 310 с. 2. Бажанов, С.П. Специфическая противоопухолевая иммунотерапия в комплексном лечении больных со злокачественными супратенториальными глиомами / С.П. Бажанов, В.Е. Олюшин, А.Ю. Улитин, Б.И. Сафаров, Д.М. Ростовцев // Сибирский онкологический журнал. – 2009. – 6. – С.23-27 3. Бармашов, А.Е. Оценка специфического противоопухолевого иммунитета методом ELISPOT у больных, получающих вакцину «Мелавак» / А.Е. Бармашов, К.Д. Никитин, И.Н. Михайлова, Л.Ф. Морозова, А.Н. Иншаков, К.А. Барышников, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – 3. – С.37-40 4. Барышников А.Ю. Биотерапия злокачественных новообразований // «Экспериментальная онкология на рубеже веков». - М.: издательская группа РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, - 2003. Глава 24. С.543-549. 5. Барышников А.Ю. Вакцинотерапия // Детская онкология (национальное руководство) / М.Д. Алиев, А.Ю. Барышников, В.Г. Поляков, Г.Л. Менткевич, С.А. Маякова - Москва: Практическая медицина.- 2012. С. 251 – 261 6. Барышников, А.Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма/ А.Ю. Барышников // Практическая онкология. – 2003. – 3. С.127-130. 7. Барышников, А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака / А.Ю. Барышников // Бюллетень СО РАМН. -2004. - 2. - С.59 8. Барышников, А.Ю. Сравнительное исследование иммуногенности противоопухолевых вакцин на основе дендритных клеток и дендритом in vitro / А.Ю. Барышников, К.Д. Никитин, А.Н. Никифорова, М.В. Рубцова // Аллергология и иммунология. — 2009. — 3. — С. 361–363. 9. Бережной, А.Е. Получение стабильной линии клеток меланомы человека, секретирующей ГМ-КСФ / А.Е. Бережной, С.С. Ларин, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, С.Л. Киселев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал.-2005.-Т.4№1.С.6-7 105 10. Галактионов, В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов – Москва: Academia. - 2004 г. – 523 с. 11. Гершанович М.Л.: Применение интерлейкина-2 (Пролейкина, Алдеслейкина) в онкологической практике / М.Л. Гершанович // Вопросы онкологии. – 2003. – 49. – С.776. 12. Кадагидзе, З.Г. Цитокины / З.Г. Кадагидзе // Практическая Онкология. – 2003. – Vol. 4. – С.131. 13. Лукашина, М.И. Вакцинация больных колоректальным раком аутологичными дендритными клетками / М.И. Лукашина, В.А Алиев, А.В. Смирнова // Сборник тезисов. Дом ученых «Биотехнология и онкология». Санкт-Петербург . - 29-31 мая 2005. - С.115 14. Манина, И.В. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF / И.В. Манина, Н.М. Перетолчина, Н.С. Сапрыкина, А.М. Козлов, И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – 3. – С. 14-19. 15. Михайленко, А.А., Руководство по клинической иммунологии, аллергологии, иммуногенетике и иммунофармакологии / А.А. Михайленко, В.И. Коненков, Г.А. Базанов, В.И. Покровский – Москва: Триада, - 2005. 16. Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия метастатической меланомы с использованием дендритных клеток: клиническое исследование I/II фазы / И.Н. Михайлова, Н.Н. Петенко, Г.З. Чкадуа, Л.Ю. Вишнякова, Е.В. Огородникова, Е.А. Черемушкин, К.С. Титов, С.А. Хатырев, Т.К. Харатишвили, К.А. Парсункова, М.Д. Алиев, А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – 2. – С. 3943 17. Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия диссеминированной меланомы геномодифицированными клетками / И.Н. Михайлова, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, Л.Ф. Морозова, И.А. Утяшев, Н.Н. Петенко, К.А. Барышников,. П.В. Иванов, К.А. Парсункова, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Материалы 15-ой Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» 22-26 мая 2006. Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». – 2006. –2. – С.25. 18. Михайлова, И.Н. Клеточные линии меланомы – основа для создания противоопухолевых вакцин / И.Н. Михайлова, М.И. Лукашина, А.Ю. Барышников, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, Т.Н. Палкина, А.А. Козлов, 106 В.А. Голубева, Е.А. Черемушкин, М.Б. Дорошенко, Л.В. Демидов, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. – 2005. – 7. – С. 37-40. 19. Михайлова, И.Н. Клеточные линии меланомы / И.Н. Михайлова, Д.А. Ковалевский, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, Л.Ф. Морозова, В.А. Голубева, Н.Н. Петенко, Е.А. Черемушкин, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев, Р.Ш. Бибилашвили // Материалы V Симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2006. – 4. – С. 15. 20. Михайлова, И.Н. Клинические испытания аутологичной вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных геном tag-7 / И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников, О.С. Бурова, Л.Ф. Морозова, Г.Ю. Харкевич, Т.Н. Палкина, А.А Козлов, А.А. Вайнсон, З.Г. Кадагидзе, Т.Н. Заботина, А.А. Буркова, М.Б. Дорошенко, С.А. Хатырев, Д.А. Носов, А.М. Гарин, С.А. Тюляндин, С.Л. Киселев, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев // Сибирский онкологический журнал. – 2005. – 1. – С. 23-27. 21. Михайлова, И.Н. Патент на изобретение «клеточной линии Mel Kor» / И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, Л.В. Демидов, А.М. Козлов, С.С. Ларин, Г.П. Георгиев, Г.Н. Ворожцов, Н.В. Гнучев. № 2287578. Российский патент июнь 2006. 22. Михайлова, И.Н. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой геномодифицированой вакцины. Оценка иммунного статуса / И.Н. Михайлова, К.А. Барышников, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, А.Л. Смирнова, Н.Н. Петенко, И.А. Утяшев, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников //Российский биотерапевтический журнал. – 2006. – №3. – С. 51-54. 23. Михайлова, Л. М. Доклиническое токсикологическое изучение противоопухолевой вакцины Мелавак / Л. М. Михайлова, Н. П. Ермакова, И. Б. Меркулова, О. И. Коняева, Е. Л. Членова, Н. Ю. Кульбачевская, Т. В. Абрамова, А. И. Мишин // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции “Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал. – 2007. №1. 24. Новиков, В. В. Иммунология / В. В.Новиков, Н. А. Добротина, А. А. Бабаев.- Нижний Новгород: Изд-во ННГУ им. Н. И. Лобачевского.2004. - 212 с. 25. Петров, Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. − М.: Медицина, 1987. − 415 с. 107 26. Петров, Р.В. Контроль и регуляция иммунного ответа / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов, В.М. Манько, А.А. Михайлова − Л.: Медицина. – 1981. – 311 с. 27. Сергеева, Н.С. Значение уровня сывороточного белка S-100 при меланоме / Н.С. Сергеева, М.П. Мишунина, И.А. Силина и др. // Российский онкологический журнал. − 2007. − № 4. − С.13-16. 28. Cуровцева, М.А. Клинико-иммунологическая эффективность вакци- нотерапии при диссеминированной меланоме кожи / М.А. Cуровцева, А.А. Шишков, Г.В. Селедцова, В.А. Козлов // 2009. – № 6 (36). – С. 1218. 29. Телетаева, Г.М. Цитокины и противоопухолевый иммунитет / Г.М. Телетаева // Практическая онкология. – 2007. - № 4.- С.211-218 30. Шоуа, А.Б. Предварительные результаты использования вакцин на основе аутологичных дендритных клеток, нагруженных опухолевыми антигенами in vitro, в лечении рака мочевого пузыря / А.Б. Шоуа, Н.Ф. Сергиенко, Н.В.Ситников, Г.З. Чкадуа // Урология. – 2008. – 5. - С. 5457. 31. Ярилин, А.А. Иммунология / А.А. Ярилин. – Москва: ГЭОТАР-Медиа. – 2010. - 752 с. 32. Altman, J.D. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes / J.D. Altman, P.A. Moss, P.J. Goulder, D.H. Barouch, M.G. McHeyzer-Williams, J.I. Bell, A.J. McMichael, M.M. Davis // Science. – 1996. – Vol.274 (5284). Р.94-96. 33. Ansary E.M., Immunotherapy by autologous dendritic cell vaccine in patients with advanced HCC/ E.M. Ansary, S. Mogawer, S.A. Elhamid, S. Alwakil, F. Aboelkasem, H.E. Sabaawy, O.J. Abdelhalim // Cancer Res Clin Oncol. – 2013. - Vol.139(1). – P.39-48 34. Ardon, H. Integration of autologous dendritic cell-based immunotherapy in the primary treatment for patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme: a pilot study / H. Ardon, S. Van Gool, I.S Lopes., W. Maes et al. // J Neurooncol. - 2010. – Vol.99(2). – Р.261-72. 35. Ascoli, V. Utility of HBME-1 immunostaining in serous effusions / V. Ascoli, C. Carnovale-Scalzo, S. Taccogna, F. Nardi // Cytopathology. – 1997. – Vol.8. - Р.328–335. 108 36. Augustine, J.J. T-cell immune monitoring by the ELISPOT assay for interferon gamma / J.J. Augustine, D.E. Hricik // Clin Chim Acta. -2012. – Vol. 413(17-18). - Р.1359-1363 37. Avigan, D. Dendritic/tumor fusion cells as cancer vaccines / D. Avigan, J. Rosenblatt, D. Kufe // Semin Oncol. – 2012. – Vol.39. – Р.287-295. 38. Baars, A. Skin tests predict survival after autologous tumor cell vaccination in metastatic melanoma: experience in 81 patients / A. Baars, A.M. Claessen, A. van den Eertwegh, H.E. Gall, A.G. Stam, S. Meijer, G. Giaccone, C.J. Meijer, R.J. Scheper, V.J. Wagsta, J.B. Vermorken, H.M. Pinedo // Ann Oncol. – 2000. – Vol.11. – Р. 965–970 39. Bae, D.S. Importance of NKG2D-NKG2D ligands interaction for cytolytic activity of natural killer cell / D.S. Bae, Y.K. Hwang, J.K. Lee // Cell Immunol. -2012. – Vol.276(1-2). – Р. 122-127. 40. Banchereau, J. Dendritic cells and the control of immunity / J. Banchereau, R.M. Steinman // Nature. – 1998. – Vol.392. – Р. 245 41. Bassarova, A.V. D2-40 is not a specific marker for cells of mesothelial origin in serious effusions / A.V. Bassarova, J.M. Nesland, B. Davidson // Am J Surg Pathol. – 2006. – Vol.30. - Р.878–882. 42. Beatty, P.L. Tumor immunology: basic and clinical advances / P.L. Beatty, S. Cascio, E. Lutz // Cancer Res. – 2011. Vol.1(13). – Р.4338-4343. 43. Bender, A. Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood / A. Bender, M. Sapp, G. Schuler // J. Immunol. Methods. – 1996. – Vol.196. – Р.121 44. Benencia, F. Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells / F. Benencia, M. C. Courr`eges, G. Coukos. // Journal of Translational Medicine. – 2008. - Vol. 6. - Р. 21 45. Berd, D. Immunopharmacologcal analysis of an autologous, hapten- modified human melanoma vaccine / D. Berd, T. Sato, H.C. Maguire, J. Kairys, M.J. Mastrangelo // J Clin Oncol. – 2004. – Vol. 22. – Р.403–415. 46. Bonamico, M. Radioimmunoassay to detect antitransglutaminase autoantibodies is the most sensitive and specific screening method for celiac disease / M. Bonamico, C.Tiberti, A. Picarelli, P. Mariani, D. Rossi, E. Cipolletta, M. Greco, M.D. Tola, L. Sabbatella, B. Carabba, F.M. Magliocca, P. Strisciuglio, U. Di Mario // Am J Gastroenterol. – 2001. – Vol. 96(5). – Р.1536-1540. 109 47. Bonfrer, J.M. The luminescence immunoassay S-100: a sensitive test to measure circulating S-100: its prognostic value in malignant melanoma / J.M. Bonfrer, C.C. Korse, O.E. Nieweg et al. // British Journal of Cancer – 1998. – Vol. 77(12). – P. 2210-2214. 48. Brooks, S.A. Basic immunocytochemistry for light microscopy / S.A. Brooks // Methods Mol Med. -2001. – Vol.57. - Р.13-39. 49. Butterfield, L. Adenovirus MART-1-engineered autologous dendritic cell vaccine for metastatic melanoma / L.H. Butterfield, B. Comin-Anduix, L. Vujanovic, Y. Lee, V.B. Dissette, J.Q. Yang, H.T. Vu, E. Seja, D.K.Oseguera, D.M. Potter, J.A. Glaspy, J.S. Economou, A. Ribas // J Immunother. – 2008. – Vol. 31(3). – Р.294-309 50. Byrne, W.L. Targeting regulatory T cells in cancer / W.L. Byrne, K.H. Mills, J.A. Lederer, G.C. O'Sullivan // Cancer Res. – 2011. – Vol.15;71(22). – Р.6915 51. Camarero, J. Cancer immunotherapy products: regulatory aspects in the European Union / J. Camarero , S. Ruiz // Human Vaccines & Immunotherapeutics. – 2012. – Vol.8. – Р.1-6. 52. Chang, A.A. phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer / A.A. Chang, B. Redman, J. Whitfield, et al. // Clin. Cancer Res. – 2002. - Vol.8. – Р.1021 53. Chaplin, D.D. Overview of the immune response / D.D. Chaplin // J Allergy Clin Immunol. – 2010. – Vol.125(2 Suppl 2). – Р.3-23. 54. Chiang, C.L. Whole tumor antigen vaccines / C.L. Chiang, F. Benencia, G. Coukos // Semin Immunol. – 2010. – Vol.22(3). – Р.132-143. 55. Chung, M.H. Humoral immune response to a therapeutic polyvalent cancer vaccine after complete resection of thick primary melanoma and sentinel lymphadenectomy / M.H. Chung, R.K. Gupta, E. Hsueh, R. Essner, W. Ye et al. // J. Clin Oncol. – 2003. – 21: 313-319. 56. Colleoni, M. Neoadjuvant therapy for ER-positive breast cancers / M. Colleoni, E. Montagna // Ann Oncol. – 2012. - Suppl 10. – Р.243-248. 57. Coons, A.H. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group / A.H. Coons, H.J. Creech, R.N. Jones // Proc Soc Exp Biol. - 1941. – Vol. 47. - Р.200–202 58. Coons, A.H. Studies on antibody production I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a 110 study of the hyperimmune rabbit / A.H. Coons, E.H. Leduc, J.M. Connolly // J Exp Med. – 1955. – Vol.102. – Р.49–60 59. Coulter, W. H. High speed automatic blood cell counter and analyzer / W. H. Coulter // Proc. Natl. Electron. Conf. – 1956. – Vol. 12. – Р.1034–1040. 60. Courr`eges, M. C. Preparation of apoptotic tumor cells with replicationincompetent HSV augments the efficacy of dendritic cell vaccines / Courr`eges, M. C. Benencia, F. Conejo-Garc´ıa, J. R.L. Zhang, G. Coukos // Cancer Gene Therapy. - 2006. - Vol. 13. - Р.182–193 61. Czerkinsky C. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. / C. Czerkinsky, L. Nilsson, H. Nygren, O. Ouchterlony, A. Tarkowski // J Immunol Methods. — 1983. — 65 (1-2): 109–121 62. Czerkinsky, C. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells / G. Andersson, H.-P. Ekre, L.-A. Nilsson, L.Klareskog, O. Ouchterlony // J. Immunol. Methods. - 1988. – Vol. 110. Р. 29–36. 63. Czerkinsky, C. A novel detection of distinct types Moldoveanu, J. Mestecky, Methods. - 1988. Vol.115. - two colour ELISPOT assay. I. Simultaneous of antibody-secreting cells / C. Czerkinsky, Z. , L. A. Nilsson, O. Ouchterlony // J. Immunol. Р.31–37. 64. Davidson, B. The diagnostic and molecular characteristics of malignant mesothelioma and ovarian ⁄ peritoneal serous carcinoma / B. Davidson // Cytopathology. – 2011. – Vol.22. – Р.5–21 65. Derek, N.J. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response / N.J. Derek, Hart // Blood. – 1997. – Vol.90. – Р.3245 66. Derek, N.J. Detection of chromium allergy by cellular in vitro methods / M. Lindemann, F. Rietschel, M. Zabel, H. Grosse-Wilde // Clin Exp Allergy. – 2008. – Vol. 38(9). - Р. 1468-1475 67. Djureen-Martenson, E. Use of serum S-100 as a marker for prognosis and in the follow up of malignant melanoma / E. Djureen-Martenson, L.O. Hansson, B. Nilsson et al. // XXIX ISOBM – 2001 – Meeting. – P. 44. 68. Donnelly, J. Antigen presentation and DNA vaccines / J. Donnelly, M. Liu, J. Ulmer // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2000. - Р.162-190 111 69. Draube, A. Dendritic cell based tumor vaccination in prostate and renal cell cancer: a systematic review and meta-analysis / A. Draube, N. KleinGonzález, S. Mattheus, C. Brillant, M.Hellmich, A. Engert, M.von BergweltBaildon // PLoS One. – 2011. – Vol.6(4). - Р.18801. 70. Duffy, M.J. Tumor Markers in Clinical Practice: A Review Focusing on Common Solid Cancers / M.J. Duffy // Med Princ Pract. 2012 May 15. [Epub ahead of print] 71. Dummer, R. GVAX (Cell Genesys) // Curr Opin Investig Drugs.- 2001. – Vol. 2(6). – Р.844-848. 72. Duperrier, K. Distinct subsets of dendritic cells resembling dermal DCs can be generated in vitro from monocytes, in the presence of different serum supplements / K. Duperrier, A. Eljaafari, C. Dezutter-Dambuyant, et al. // J. Immunol. Methods. – 2000. -Vol. 238. – Р.119 73. Ellebaek, E. Immunotherapy for metastatic colorectal cancer: present status and new options / E. Ellebaek, Andersen M.H., Svane I.M., P.T. Straten // Scand J Gastroenterol. – 2012. – Vol. 47(3). – Р. 315-324. 74. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. / E.Engvall, P. Perlmann // Immunochemistry. – 1971. – Vol.8(9). – Р.871-4. 75. Faries, M. B. Impact of GM-CSF on vaccination with an allogeneic wholecell melanoma vaccine / M. B. Faries, E. C. Hsueh, X. Ye, M. Hoban, D. L. Morton // Clin Cancer Res. – 2009. - Vol. 15(22). – Р. 7029–703 76. Fuse, S. Simultaneous analysis of in vivo CD8+ T cell cytotoxicity against multiple epitopes using multicolor flow cytometry / S. Fuse, E. Underwood // Immunol Invest. – 2007. – Vol.36. – Р. 829–845. 77. Gelderman, K. A. Complement function in mAb-mediated cancer immunotherapy / K. A. Gelderman, S. Tomlinson, G. D. Ross, A. Gorter // Trends in Immunology. – 2004. - Vol. 25, no. 3, pp. 158–164 78. Gerritsen, W.R. Biochemical and immunologic correlates of clinical response in a combination trial of the GM-CSF-gene transduced allogeneic prostate cancer immunotherapy and ipilimumab in patients with metastatic hormone-refractory prostate cancer (mHRPC) / W.R. Gerritsen, van den A.Eertwegh, T.D. de Gruijl, G.Giaccone, R.J. Scheper, N. Sacks, T. Harding, I. Lowy, E. Stankevich, K. Hege // ASCO Meeting Abstr. – 2007. – Vol. 25. - Р. 5120 112 79. Glas, R. Recruitment and activation of natural killer (NK) cells in vivo determined by the target cell phenotype. An adaptive component of NK cellmediated responses / R. Glas, L. Franksson, C. Une, M.L. Eloranta, C. Ohlen, A. Orn, K. Karre // J Exp Med. – 2000. - Vol. 191. - P.129-38. 80. Grossman, W.J. Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death / W.J. Grossman, J.W. Verbsky, W. Barchet, M. Colonna, J.P. Atkinson, T.J. Ley // Immunity. – 2004. – Vol.21. – Р.589 –601 81. Hale, M. B. Stage dependent aberrant regulation of cytokine-STAT signaling in murine systemic lupus erythematosus / M. Hale, P. O. Krutzik, S.S. Samra, J. M Crane, G. P. Nolan // PLoS One. – 2009. – Vol.4, - Р.6756. 82. Hanna, M.G. Immunotherapy of established micrometastases with a bacillus Calmette-Guerin tumour cell vaccine / M.G. Hanna, L.C. Peters // Cancer Res. – 1978. – Vol. 38. – Р.204–209 83. Hanna, M.G., Active specific immunotherapy of residual micrometastases: an evaluation of sources, doses and ratios of BCG with tumour cells Brandhorst / M.G. Hanna, L.C. Peters // Cancer Immunol Immunother. 1979. – Vol. 7. – Р.165–173 84. Harriman W.D. Multiplexed ELISPOT assay / W.D. Harriman, E.J. Collarini, R.G. Cromer, A. Dutta, M. Strandh, F. Zhang, L.M. Kauvar // J Immunol Methods. – 2009. Vol. 341(1-2). – Р. 127-134 85. Hatfield, P. Optimization of dendritic cell loading with tumor cell lysates for cancer immunotherapy / P. A. Hatfield, E. Merrick, E. West et al. // Journal of Immunotherapy. – 2008. - Vol. 31. – Р. 620–632 86. Hawley, T. S. Flow Cytometry Protocols / T. S.Hawley, R. G. Hawley // Methods in Molecular Biology. – 2011. - Vol. 699. - 486 p. 87. Hege, K.M. GM-CSF gene- modified cancer cell immunotherapies: of mice and men / K.M. Hege, K. Jooss, D. Pardoll // Int Rev Immunol.– 2006 - Vol. 25. – Р.321–352 88. Heussner, A.H. Development and Characterization of a Monoclonal Antibody against Ochratoxin B and Its Application in ELISA Toxins (Basel) / A.H. Heussner, S. Ausländer, D.R. Dietrich. – 2010. – Vol.2(6). – Р.15821594. 89. Hombrink, P. High-throughput identification of potential minor histocompatibility antigens by MHC tetramer-based screening: feasibility and limitations / P. Hombrink, S.R. Hadrup, A. Bakker, M.G. Kester, J.H. 113 Falkenburg, P.A. von dem Borne, T.N. Schumacher, M.H. Heemskerk // PLoS One. – 2011. – Vol.6(8). – Р. 22523 90. Hoos, A. Improved Endpoints for Cancer Immunotherapy Trials. / A. Hoos, Eggermont, S. Janetzki, J. Wolchok, et al. // J Natl Cancer Inst. – 2010. – Vol. 102(18). – Р. 1388-1397 91. Hoover, H.C. Adjuvant active specfic immunotherapy for human colorectal cancer: 6.5-year median follow-up of a phase III prospectively randomized trial / H.C. Hoover, J.S. Brandhorst, L.C. Peters, M.G. Surdyke, Y. Takeshita, J. Madariaga, L.R. Muenz, M.G. Hanna // J Clin Oncol. -1993. – 11. – Р. 390–399. 92. Howe, J.G. A sensitive immunoblotting method for measuring protein synthesis initiation factor levels in lysates of Escherichia coli / J.G. Howe, J.W. Hershey // J Biol Chem. – 1981. - Vol.256(24). – Р.12836-12839. 93. Hristov, M. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood / M. Hristov, S. Schmitz, F. Nauwelaers, C. Weber // J Immunol Methods. -2012. – Vol.381(1-2). – Р. 9-13. 94. Hsueh, E.C., Prolonged survival after complete resection of disseminated melanoma and active immunotherapy with a therapeutic cancer vaccine / E.C.Hsueh, R. Essner, L.J.Foshag et al. // J Clin Oncol. – 2002. – Vol. 20 (23). – Р. 4549 -4554 95. Hsueh, E.C. Antigen-based immunotherapy of melanoma: Canvaxin therapeutic polyvalent cancer vaccine / E.C. Hsueh, D.L. Morton // Seminars in Cancer Biology. – 2003. – Vol. 13. Р.401–407 96. Jago, C.B. Differential expression of CTLA-4 among T cell subsets / Jago, C.B., J. Yates, N.O.Camara, R.I. Lechler, G. Lombardi // Clin Exp Immunol. -2004.- Vol.136. – Р.463 – 471 97. Jahan-Tigh, R.R. Flow cytometry / R.R. Jahan-Tigh, C.Ryan, G. Obermoser, K. Schwarzenberger // J Invest Dermatol. – 2012. – Vol.132(10) 98. Janeway, C.A. Immunobiology / C.A. Janeway, P. Travers, M. Walport, M. Shlomchik. - Garland Science. - 2001. 99. Jung, T. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry / T. Jung, U. Schauer, C. Heusser, C. Neumann, C. Rieger // J Immunol Methods. – 1993. 159(1-2). – Р.197-207. 114 100. Kalyuzhny, A. E. Handbook of ELISPOT / A. E. Kalyuzhny // Methods in Molecular Biology. – 2012. - Vol. 792. - 261 р. 101. Kalyuzhny, A. E. Handbook of ELISPOT / A. E. Kalyuzhny // Methods in Molecular Biology. - 2005.- Vol. 302-322 р. 102. Kamentsky, L. A. Spectrophotometer: New instrument for ultrarapid cell analysis / L. A. Kamentsky, M. R. Melamed // Science. – 1965. – Vol.150. – Р. 630–631. 103. Karan, D. Combination immunotherapy with prostate GVAX and ipilimumab: safety and toxicity / D. Karan, P. Van Veldhuizen // Immunotherapy. – 2012. –Vol. 4(6). - 577-580. 104. Kato, M. Lymphokine-activated killer cell therapy combined with highdose glucocorticoid showed clinical efficacy towards advanced lung carcinoma / M. Kato, S. Goto, G. Soma // Anticancer Res. – 2010. – Vol.30(8). – Р.3125-3128. 105. Khan, A.N. An epigenetic vaccine model active in the prevention and treatment of melanoma / A.N. Khan, W.J. Magner, T.B. Tomasi // J Transl Med. – 2007. – Vol.10. – Р. 5:64 106. Kruit, W.H. Phase 1/2 study of subcutaneous and intradermal immunization with a recombinant MAGE-3 protein in patients with detectable metastatic melanoma / W.H. Kruit, H.H. van Ojik, V.G. Brichard, B. Escudier, T. Dorval, B. Dreno et al. // Int J Cancer . – 2005. – Vol.117. – Р.596–604 107. Kryczek, I. Cutting edge: IFN-gamma enables APC to promote memory Th17 and abate Th1 cell development / I. Kryczek, S. Wei, W. Gong, X. Shu, W. Szeliga, L. Vatan, L.Chen, G. Wang, W. // J Immunol. - 2008. – Vol. 181(9). – Р.5842–5846 108. Kubo, M. Combination of adoptive immunotherapy with Herceptin for patients with HER2-expressing breast cancer / M. Kubo, T. Morisaki, H. Kuroki, et al. // Anticancer Res. – 2003. – Vol. 23. – Р.4443 109. Kvistborg, P. TIL therapy broadens the tumor-reactive CD8(+) T cell compartment in melanoma patients / P. Kvistborg, C.J. Shu, B. Heemskerk, M. Fankhauser, C.A. Thrue, M. Toebes, N. van Rooij, C. Linnemann, M.M. van Buuren, J.H. Urbanus, J.B. Beltman, P. Straten, Y.F. Li, P.F. Robbins, M.J. Besser, J. Schachter, G.G. Kenter, M.E. Dudley, S.A. Rosenberg, J.B. Haanen, S.R. Hadrup, T.N. Schumacher // Oncoimmunology. – 2012. - 1(4). – Р.409-418. 115 110. Lecuroux, C. Kidney transplantation in an elite HIV controller: limited impact of immunosuppressive therapy on viro-immunological status / C. Lecuroux, O. Lambotte, A. Saez-Cirion, C. Barbet, S.Y. Shin, F. Boufassa, F. Bastides, Y.J. Lebranchu // Infect. – 2012. – Vol. 64(6). Р. 630-633. 111. Lee Y.S. T lymphocytes derived from human cord blood provide effective antitumor immunotherapy against a human tumor / Y.S. Lee, T.S. Kim, D.K. Kim // BMC Cancer. – 2011. – Vol. 11. – Р. 225. 112. Lens, M. The role of vaccine therapy in the treatment of melanoma / M. Lens // Expert Opin Biol Ther. – 2008. Vol. 8(3). – Р.315-323. 113. Li, Y. The activation and dynamics of cytokine expression by CD4(+) T cells and AIDS progression in HIV-1-infected Chinese individuals / Li, Y. W. Ling, H. Xu, M. Wang, C. Wu // Microb Pathog. – 2012. [Epub ahead of print] 114. Li, H. Vaccination with allogeneic GM-CSF gene-modified lung cancer cells: antitumor activity comparing with that induced by autologous vaccine / H. Li, H.J. Jiang, M.Q. Ma, F. Wei, X.M. An, X.B Ren // Cancer Biother Radiopharm. – 2007. – Vol.22(6). – Р.790-798. 115. Liang, B. Regulatory T cells inhibit dendritic cells by lymphocyte activation gene-3 engagement of MHC class II / B. Liang, C. Workman, J. Lee, C. Chew, B.M. Dale, L. Colonna, M. Flores, N. Li, E. Schweighoffer, S. Greenberg, V. Tybulewicz, D. Vignali, R. Clynes // J Immunol. - 2008. – Vol.180. – Р.5916 – 5926 116. Lodge, P. Dendritic cell-based immunotherapy of prostate cancer: immune monitoring of a phase II clinical trial / P. Lodge, L. Jones, R. Bader, et al. // Cancer Research. - 2000. – Vol. 60. – Р.829 117. Lubaroff, D.M. Prostate cancer vaccines in clinical trials / D.M.Lubaroff // Expert Rev Vaccines. – 2012. – Vol. 11(7. – Р. 857-868. 118. Mace, T.A. Effector CD8+ T cell IFN-γ production and cytotoxicity are enhanced by mild hyperthermia / T.A. Mace, L. Zhong, K.M. Kokolus, E.A. Repasky // Int J Hyperthermia. – 2012. – Vol. 28(1). Р. 9-18 119. Mantovani, A. Cancer-related inflammation / A. Mantovani, P. Allavena, A.Sica, F. Balkwill // Nature. – 2008. – Vol.454. – Р.436-444. 120. Mantovani, A. Macrophages, innate immunity and cancer: balance, tolerance, and diversity / A. Mantovani, A .Sica // Curr Opin Immunol. – 2010. - Vol.22(2). – Р. 231-237 116 121. Markowicz, S. Adjuvant vaccination with melanoma antigen-pulsed dendritic cells in stage III melanoma patients / S. Markowicz, Z.I. Nowecki, P. Rutkowski, A.W. Lipkowski, M. Biernacka, A. Jakubowska-Mucka, T. Switaj, A. Misicka, H. Skurzak, H. Polowniak-Pracka // J.Med Oncol. – 2012. – Vol.29(4). – P.2966-2977 122. May, M. Ten-year survival analysis for renal carcinoma patients treated with an autologous tumour lysate vaccine in an adjuvant setting / May M., S. Brookman-May, B. Hoschke, C. Gilfrich, F. Kendel, S. Baxmann, S.Wittke, S.T. Kiessig, K. Miller, M. Johannsen // Cancer Immunol Immunother. – 2010. –Vol. 59(5). – Р.687-695. 123. Ménétrier-Caux, C.Targeting regulatory T cells / C. Ménétrier-Caux, T. Curiel, J. Faget, M. Manuel, C. Caux, W. Zou // Targ Oncol. – 2012. – Vol. 7. – Р. 15 – 28 124. Misra, N. Cutting edge: human CD4 + CD25+ T cells restrain the maturation and antigen-presenting function of dendritic cells / N. Misra, J. Bayry, S. Lacroix-Desmazes, M.D. Kazatchkine, S.V. Kaveri // J Immunol. – 2004. – Vol. 172. – Р. 4676 – 4680 125. Mitchell, M.S. Active specific immunotherapy for melanoma: phase I trial of allogeneic lysates and a novel adjuvant / M.S. Mitchell, J Kan-Mitchell, R.A. Kempf, W. Harel, H.Y. Shau, S. Lind // Cancer Res. – 1988. – Vol. 48. – Р.5883–5893. 126. Moldavan, A. Photo-electric technique for the counting of microscopical cells / A. Moldavan // Science. - 1934. – Vol.80. - Р.188–189. 127. Morton, D.L. Prolonged survival of patients receiving active immunotherapy with Canvaxin therapeutic polyvalent vaccine after complete resection of melanoma metastatic to regional lymph nodes / D.L. Morton, E.C.Hsueh, R.Essner, et al. // Ann Surg. – 2002. – Vol. 236 (4). – Р.438 -448 128. Morton, D.L. Prolongation of survival in metastatic melanoma after active specific immunotherapy with a new polyvalent melanoma vaccine / D.L. Morton, Foshag LJ, Hoon DS, Nizze JA,Famatiga E, Wanek LA et al. // Ann Surg. – 1992. – Vol. 216. - 463–482. 129. Motl, S.E. Technology evaluation: Canvaxin, John Wayne Cancer Institute/CancerVax / S.E. Motl // Curr Opin Mol Ther. – 2004. Vol. 6(1). Р.104-111 130. Nausch, N. NKG2D ligands in tumor immunity / N. Nausch, A. Cerwenka // Oncogene. -2008. Vol.27(45). – Р.5944-5958. 117 131. Nestle, F.O. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells / F.O. Nestle, S. Alijagic, M.Gilliet, Y. Sun, S. Grabbe, R. Dummer et al. // Nat Med. – 1998. – Vol. 4. – Р. 328–332. 132. Nilsson, C. Optimal blood mononuclear cell isolation procedures for gamma interferon enzyme-linked immunospot testing of healthy Swedish and Tanzanian subjects / C. Nilsson, S. Aboud, K. Karlén, B. Hejdeman, W. Urassa, Biberfeld // Clin Vaccine Immunol. – 2008. –Vol. 15(4). – Р.585-589 133. Oliver, C. Immunocytochemical Methods and Protocols / C. Oliver, M.C. Jamur (eds.) // Methods in Molecular Biology. – 2010. - Vol. 588. – Р.416 134. O'Rourke, M.G. Immunotherapy, including gene therapy, for metastatic melanoma / M.G. O'Rourke, C.W. Schmidt, T.R. O'Rourke, K.A. Ellem // Aust N Z J Surg. -1997. – Vol. 67(12). – Р.834-841. 135. Oshita, C. Dendritic cell-based vaccination in metastatic melanoma patients: Phase II clinical trial / C. Oshita, M. Takikawa, A. Kume, H. Miyata, T. Ashizawa, A. Iizuka, Y. Kiyohara, S. Yoshikawa, R. Tanosaki, N. Yamazaki, A. Yamamoto, K. Takesako, K. Yamaguchi, Y. Akiyama // Oncol Rep. – 2012. – Vol.28. – Р . 1-8. 136. Palmer, D.H. A phase II study of adoptive immunotherapy using dendritic cells pulsed with tumor lysate in patients with hepatocellular carcinoma/ D.H. Palmer, R.S. Midgley, N. Mirza, E.E. Torr, F. Ahmed et al. // Hepatology. — 2009. – Vol.49(1). – Р.124-32 137. Park, J. Single-color multitarget flow cytometry using monoclonal antibodies labeled with different intensities of the same fluorochrome / J. Park, K. Han // Ann Lab Med. – 2012. – Vol. 32(3). Р.171-176. 138. Patil, S. Natural killer cells—new understanding of basic biology may lead to more e ff ective allogeneic haematopoietic stem cell transplantation: Review / S. Patil, T. Schwarer // Internal Medicine Journal. - 2009. - Vol. 39. Р.639–647 139. Plosker, GL. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin's lymphoma and chronic lymphocytic leukaemia / GL. Plosker and D.P. Figgitt // Drugs. 2003. – Vol. 63. – Р. 803. 140. Polak, J.M. Introduction to Immunocytochemistry / J.M. Polak, S. VanNoorden // BIOS Scientific – UK: Oxford. – 2003. – Р.196 141. Quach, H. Mechanism of action of immunomodulatory drugs (IMiDS) in multiple myeloma / H. Quach, D. Ritchie, A. K. Stewart et al. // Leukemia. – 2010. - Vol. 24. – Р.22–32 118 142. Rasul A.E. Simultaneous detection of the two main proliferation driving EBV encoded proteins, EBNA-2 and LMP-1 in single B cells / A.E. Rasul, N. Nagy, E. Sohlberg, M. Adori, H.E. Claesson, G. Klein, E. Klein // J Immunol Methods. – 2012. – Vol. 385. – Р. 60-70 143. Reilly, R.T. The collaboration of both humoral and cellular HER-2/neutargeted immune responses is required for the complete eradication of HER2/neu-expressing tumors / R.T. Reilly, J.P. Machiels, L.A.Emens, A.M. Ercolini, F.I. Okoye, R.Y Lei, D. Weintraub, E.M. Jaffee // Cancer Research. – 2001. - Vol. 61. - P.880-883. 144. Richardson, P. G. Monoclonal antibodies in the treatment of multiple myeloma / P. G. Richardson, S. Lonial, A. J. Jakubowiak, J. L. Harousseau, K. C. Anderson // British Journal of Haematology. - 2011. 145. Ridolfi, L. Dendritic cell-based vaccine in advanced melanoma: update of clinical outcome / L. Ridolfi, M. Petrini, L. Fiammenghi, A.M. Granato, V. Ancarani, E. Pancisi, C. Brolli, M. Selva, E. Scarpi, L. Valmorri, S.V. Nicoletti, M. Guidoboni, A. Riccobon, R. Ridolfi // Melanoma Res. – 2011. Vol. 21(6). – Р.524-529. 146. Romani, N. Generation of mature dendritic cells from human blood - an improved method with special regard to clinical applicability / N. Romani, D. Reider, M. Heuer et al. // J. Immunol. Methods. – 1996. – Vol.196. – Р.137 147. Rosenberg, S.A. Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma / S.A. Rosenberg, J.C. Yang, D.J. Schwartzentruber, P. Hwu, F.M. Marincola, S.L. Topalian et al. // Nat Med. – 1998. – Vol.4. – Р.321–327 148. Sallusto, F. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products / F. Sallusto, M. Cella, C. Danieli, et al. // J. Exp. Med. – 1995. – Vol.182. – Р.389 149. Sander, I. Development and application of mold antigen-specific enzymelinked immunosorbent assays (ELISA) to quantify airborne antigen exposure / I. Sander, E. Zahradnik, V. van Kampen, S. Kespohl, H. Stubel, G. Fischer, T. Brüning, J. Bünger, M. Raulf-Heimsoth // J Toxicol Environ Health. - 2012. – Vol. 75(19-20). - 1185-1193. 150. Sanz, L. Antibody-based antiangiogenic cancer therapy / L. Sanz, L. Alvarez-Vallina // Expert Opin Ther Targets. – 2005. - Vol. 9. - P.1235-1245. 119 151. Schadendorf, D. Dacarbazine (DTIC) versus vaccination with autologous peptide-pulsed dendritic cells (DC) in first-line treatment of patients with metastatic melanoma: a randomized phase III trial of the DC study group of the DeCOG / D. Schadendorf, S. Ugurel, B. Schuler-Thurner, F.O. Nestle, A.Enk, E.B. Brocker et al. // Ann Oncol. - 2006. – Vol.17. – Р.563–570 152. Schreurs, M. Dendritic cells break tolerance and induce protective immunity against a melanocyte differentiation antigen in an autologous melanoma model / M. Schreurs, A. Eggert, A. de Boer, et al. // Cancer Res. – 2000. – Vol. 60. Р. 6995 153. Sedgwick, J. D. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells / J. D. Sedgwick, and P. G. Holt // J. Immunol. Methods. - 1983. Vol.57. –Р. 301–309. 154. Shakes, D.C. Immunofluorescence microscopy / D.C. Shakes, D.M. Miller, M.L. Nonet // Methods Cell Biol. – 2012. – Vol.107. – Р.35-66. 155. Shanker, A. Cooperativity of adaptive and innate immunity: implications for cancer therapy / A. Shanker, Marincola F.M. // Cancer Immunol Immunother. -2011. – Vol.60(8):1061-1074 156. Shurin, G.V. Loss of new chemokine CXCL14 in tumor tissue is associated with low infiltration by dendritic cells (DC), while restoration of human CXCL14 expression in tumor cells causes attraction of DC both in vitro and in vivo / G.V. Shurin, R.L. Ferris, I.L. Tourkova, L. Perez, A. Lokshin, L. Balkir, B. Collins, G.S. Chatta, M.R. Shurin. // J Immunol. – 2005. - Vol. 174. - P.5490-5498. 157. Sigal, L.H. Basic science for the clinician 58: IgG subclasses / L.H. Sigal // J Clin Rheumatol. – 2012. - Vol.18(6). – Р.316-318. 158. Simmons, A.D. Li B., GM-CSF-secreting cancer immunotherapies: preclinical analysis of the mechanism of action / A.D. Simmons, M. Gonzalez-Edick ,et al. // Cancer Immunol. Immunother. – 2007. - Vol. 56(10). – Р. 1653 -1665. 159. Simons, J. Bioactivity of autologous irradiated renal cell carcinoma vaccines generated by ex vivo granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene transfer / J. Simons, E. Jaffee, C. Weber // Cancer Res. – 1997. Vol. 57. – Р.1537–1546. 160. Skoog, L. Immunocytochemistry: an indispensable technique in routine cytology / L. Skoog, E. Tani .// Cytopathology. – 2011. - 22(4). – Р. 215-229 120 161. Smith, S. M. Human CD8+ CTL specific for the mycobacterial major secreted antigen 85A / S. M. Smith, R. Brookes, M. R. Klein, A. S. Malin, Lukey, P. T., King, A. S. et al. // J. Immunol. -2000. – Vol.165. – Р.7088– 7095. 162. Smolewski, P. Detection of caspases activation by fluorochrome-labeled inhibitors: multiparameter analysis by laser scanning cytometry / P. Smolewski, E. Bedner, L. Du, T.-C. Hsieh, W.M. Wu, D.J. Phelps, Z. Darzynkiewicz // Cytometry. – 2001. – Vol. 44. - Р.73–82. 163. Soloski, M.J. Recognition of tumor cells by the innate immune system / M.J. Soloski // Curr. Opin. Immunol. – 2001. - Vol. 13. - P.154–162 164. Somekawa, S. Tmem100, an ALK1 receptor signaling-dependent gene essential for arterial endothelium differentiation and vascular morphogenesis / S. Somekawa, K. Imagawa, H. Hayashi, M. Sakabe, T. Ioka, G.E. Sato, K. Inada, T. Iwamoto, T. Mori, S. Uemura, O. Nakagawa, Y. Saito // Proc Natl Acad Sci USA. – 2012. –Vol.109(30). – Р.12064-12069 165. Sondak, V.K. Adjuvant immunotherapy of resected, intermediate-thickness, node-negative melanoma with an allogeneic tumor vaccine: overall results of a randomized trial of the Southwest Oncology Group / V.K. Sondak, P.Y. Liu, R.J. Tuthill, R.A. Kempf, J.M. Unger, J.A. Sosman et al. // J Clin Oncol. - 2002. – Vol. 20. – Р. 2058–2066. 166. Stark, J. Interferon-alpha and chemohormonal therapy for patients with advanced melanoma: final results of a phase I-II study of the Cancer Biotherapy Research Group and the Mid-Atlantic Oncology Program Dillman / J. Stark, R. Schulof, et al. // Cancer. – 1998. – 82. – Р.1677. 167. Steele, J.C. Phase I/II trial of a dendritic cell vaccine transfected with DNA encoding melan A and gp100 for patients with metastatic melanoma / J.C. Steele, A. Rao, J.R. Marsden, C.J. Armstrong et al. // Gene Ther. – 2011. – Vol.18(6). – Р.584-93. 168. Steinman, R. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice: I. morphology, quantitation, tissue distribution / R. Steinman, Z. Cohn // J. Exp. Med. – 1973. – Vol.137. – Р.1142 169. Tada, F. Phase I/II study of immunotherapy using tumor antigen-pulsed dendritic cells in patients with hepatocellular carcinoma / F. Tada, M. Abe, M. Hirooka, Y. 170. Ikeda, Y. Hiasa, Y. Lee et al. // Int J Oncol. – 2012. – Vol. 41(5). – Р.16011609. 121 171. Thomas, A. Immunotherapies for non-small-cell lung cancer and mesothelioma / A. Thomas, R.Hassan // Lancet Oncol. – 2012. - Thomas, A. Vol.13(7). – Р.301-310. 172. Thomas, S.K. Lymphoma vaccine therapy: next steps after a positive, controlled phase III clinical trial / S.K. Thomas, L.W. Kwak // Semin Oncol. – 2012. - Vol. 39(3). – Р. 253-262. 173. Thurner, B. Vaccination with Mage-3A1 peptide–pulsed mature, monocytederived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma / B. Thurner, I. Haendle, C. Röder et al. // J. Exp. Med. – 1999. - Vol.190. – Р.1669 174. Tokunaga, N. Human monocyte-derived dendritic cells pulsed with wildtype p53 protein efficiently induce CTLs against p53 overexpressing human cancer cells / N. Tokunaga, T. Murakami, Y. Endo, et al // Clin. Cancer Res. – 2005. – Vol.11. – Р.1312 175. Trepiakas, R. Vaccination with autologous dendritic cells pulsed with multiple tumor antigens for treatment of patients with malignant melanoma: results from a phase I/II trial / R. Trepiakas, A. Berntsen, S.R. Hadrup, J. Bjørn, P.F. Geertsen, et al. // Cytotherapy. – 2010. – Vol. 12(6). Р. 721-734 176. Tripathy A.S. Cytokine profiles, CTL response and T cell frequencies in the peripheral blood of acute patients and individuals recovered from hepatitis E infection / A.S. Tripathy, R. Das, S.B. Rathod, V.A. Arankalle // PLoS One. – 2012. – Vol. 7(2):e31822 177. Tsung, K. Macrophages as effector cells in interleukin 12-induced T celldependent tumor rejection / K. Tsung, J.P. Dolan, Y.L. Tsung, J.A. Norton // Cancer Res. - 2002. - Vol. 62. - P.5069-5075. 178. Tute, R.M. Flow cytometry and its use in the diagnosis and management of mature lymphoid malignancies / R.M. Tute // Histopathology. – 2011. – Vol.58(1). – Р.90-105. 179. Uehara, K. Patterns of failure after multimodal treatments for high-grade glioma: effectiveness of MIB-1 labeling index / K. Uehara, T. Sasayama, D. Miyawaki, H. Nishimura, K. Yoshida, Y. Okamoto, N. Mukumoto, H. Akasaka, M. Nishihara, O. Fujii, T. Soejima, K. Sugimura, E. Kohmura, R. Sasaki // Radiat Oncol. – 2012. – Vol.7. – Р.104 180. Utiger, R.D. Extraction and radioimmunoassay of growth hormone in human serum / R.D. Utiger // J Clin Endocrinol Metab. – 1964. – Vol.24. – Р.60-67. 122 181. Van Tendeloo, V.F. Induction of complete and molecular remissions in acute myeloid leukemia by Wilms ’ tumor 1 antigen-targeted dendritic cell vaccination / V.F. Van Tendeloo, A.V. de Velde, A. Van Driessche, N. Cools // Proc Natl Acad Sci USA. – 2010. – Vol.107. – Р.13824 – 13829. 182. Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution / P. K. Wallace, J. D. Tario, J. L. Fisher, S. S. 183. Wallace, M. S. Ernstoff, K. A. Muirhead // Cytometry. – 2008. – Vol. - 73. – Р. 1019–1034 184. Wang, F. Phase I trial of a MART-1 peptide vaccine with incomplete Freund’s adjuvant for resected high-risk melanoma / F. Wang, E. Bade, C.Kuniyoshi, et al.: // Clin.. Cancer Res. - 1999. – Vol. 5. – Р.2756. 185. Wang, Z.P., J. Pan, Y.H. Huang // Mol Med Report. – 2011. – Vol.4(3). – Р. 425-429 186. Ward, J.E. GVAX: an allogeneic, whole-cell, GM-CSF-secreting cellular immunotherapy for the treatment of prostate cancer / J.E. Ward, D.G. McNeel // Expert Opin. Biol. Ther. – 2007. - Vol. 7(12). – Р.18931902 187. Weiss-Steider, B. Expression of MICA, MICB and NKG2D in human leukemic myelomonocytic and cervical cancer cells / B.Weiss-Steider, I. Soto-Cruz, C.A. Martinez-Campos, J.F. Mendoza-Rincon // J Exp Clin Cancer Res. - 2011. Vol.10. - Р. 30:37. 188. Wheeler, C.J. Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients / C.J. Wheeler, K.L. Black, G. Liu, M. Mazer, X.X. Zhang, S. Pepkowitz, D. Goldfinger, H. Ng, D. Irvin, J.S. Yu // Cancer Res. – 2008. – Vol.68(14). – Р.5955-5964. 189. Whiteside, T.L. Immune monitoring of clinical trials with biotherapies / Whiteside, T.L. // Adv Clin Chem. – 2008. – Vol.45. – Р. 75-97. 190. Whiteside, T.L. The role of death receptor ligands in shaping tumor microenvironment / T.L. Whiteside // Immunol Invest. – 2007. – Vol.36. – Р.25-46. 191. Yamaguchi, S. Dendritic cell-based vaccines suppress metastatic liver tumor via activation of local innate and acquired immunity / S. Yamaguchi, T. Tatsumi, T. Takehara et al. // Cancer Immunology,Immunotherapy. – 2008. - Vol. 57. – Р.1861–1869 123 192. Yang, E.J. Enzyme-linked immunosorbent assay of IL-8 production in response to silver nanoparticles / E.J. Yang, J. Jang, D.H. Lim, I.H. Choi // Methods Mol Biol. – 2012. – Vol. 926. Р. 131-139. 193. Yang, J.C. Melanoma vaccines / J.C. Yang // Cancer J. – 2011. – Vol. 17(5). – Р.277-282 194. Yoshitomi, M. Personalized peptide vaccination for advanced biliary tract cancer: IL-6, nutritional status and pre-existing antigen-specific immunity as possible biomarkers for patient prognosis / M. Yoshitomi, S. Yutani, S. Matsueda, T. Ioji, N. Komatsu, S. Shichijo, A. Yamada, K. Itoh, T. Sasada, H. Kinoshita / Exp Ther Med. – 2012. – Vol. 3(3). – Р.463-469 195. Yuan, Y. Tenascin-X is anovel diagnostic marker of malignant mesothelioma / Y. Yuan, D.A. Nymoen, T. H. Satvnes et al. // Am J Surg Pathol. – 2009. – Vol.33. – Р.1673–1682 196. Zeestraten, E.C. Addition of interferon-alpha to the p53-SLP(®) vaccine results in increased production of interferon-gamma in vaccinated colorectal cancer patients: A phase I/II clinical trial / E.C. Zeestraten, F.M. Speetjens, M.J. Welters et al. // Int J Cancer. - 2012 Sep 5.. [Epub ahead of print]. 197. Zhang, S. Review: dendritic cell-based vaccine in the treatment of patients with advanced melanoma / S. Zhang, Q. Wang, B. Miao // Cancer Biother Radiopharm. – 2007. – Vol.22 (4). – Р.501 – 507 198. Zhang, C. Establishment of reverse direct ELISA and its application in screening high-affinity monoclonal antibodies / C. Zhang, R. Li, Y. Li, C. Song, Z. Liu, Y. Zhang, Z. Xu, R. Zhuang, J. Yi, A. Yang, K. Yang, B. Jin // Hybridoma (Larchmt). – 2012. – Vol. 31(4). –Р. 284-288 199. Zhao, J.J. Double labeling and comparison of fluorescence intensity and photostability between quantum dots and FITC in oral tumors / J.J. Zhao, J. Chen, Z.P. Wang, J. Pan, Y.H. Huang // Mol Med Report. – 2011. – Vol.4(3). – Р. 425-429 200. Zijlmans, H.J. Role of tumor-derived proinflammatory cytokines GM-CSF, TNF-alpha, and IL-12 in the migration and differentiation of antigenpresenting cells in cervical carcinoma / H.J. Zijlmans, G.J. Fleuren, H.J. Baelde, P.H. Eilers, G.G. Kenter, A. Gorter // Cancer. – 2006. - Vol. 109. P.556 - 565 124
