ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ МОРСКИХ
реклама
ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ PSEUDOALTEROMONAS NIGRIFASIENS НА ЭКСПРЕССИЮ МОЛЕКУЛ АДГЕЗИИ КЛЕТКАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Безбородова А.А. Дальневосточный федеральный университет, Школа естественных наук, кафедра биохимии, микробиологии и биотехнологии Владивосток, Россия INFLUENCE CELL WALL COMPONENTS OF MARINE BACTERIA PSEUDOALTEROMONAS NIGRIFASIENS ON ADHESION MOLECULE EXPRESSION IN HUMAN BLOOD CELLS Bezborodova A.A. Far Eastern Federal University, School of Natural Sciences, Department of Biochemistry, Microbiology and Biotechnology Vladivostok, Russia Содержание АКТУАЛЬНОСТЬ НАШИХ ИССЛДОВАНИЙ…………………………………...…...……3-4 Глава 1. МНОГОЭТАПНОСТЬ ИММУНОЙ ЗАЩИТЫ………………………………...……5 1.1.Врождённый иммунитет…………………………………………………………...5-9 1.1.1. Клеточные факторы врождённого иммунитета…………………………….6 1.1.2. Морфофункциональная характеристика нейтрофилов…………………..6-8 1.1.3. Морфофункциональная характеристика моноцитов……………………..8-9 1.2. Адаптивный иммунитет…………………………………………………………9-10 1.2.1. Лимфоциты и адаптивный иммунитет…………………………………..9-10 Глава 2. СТРОЕНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА………………………………………….11-14 Глава 3. ИММУНОМОДУЛИРУЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БАКТЕИЙ……………………………………………………………15-17 Глава 4. ИММУНОМОДУЛИРУЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОРСКХ БАКТЕИЙ………………………………………………..18-19 Глава 5. МОЛЕКУЛЫ МЖКЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ……………………………...……20-26 5.1. Экспрессия и индукция молекул адгезии на эндотелии …………………….21-22 5.2. Суперсемейство иммуноглобулинов……………………………………….…22-23 5.2.1. Растворимая форма молекулы межклеточной адгезии 1 (sICAM-1)....….23 5.3. Семейство селектинов…………………………………………………………….24 5.3.1. Растворимый L-селектин…………….……………………………………..24 5.4. Интегрины……………………………………………………...………………25-26 5.4.1. Интегрин альфа-M (αM, CD11b)………………………………………..25-26 5.4.2. Интегрин альфа-X (αX, CD11c)…………………………………………….26 Глава 6. ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ КАК СОВРЕМЕННЫЙ МЕТОД АНАЛИЗА В БИОЛОГИИИ МЕДИЦИНЕ…………………………………………………………….…27-29 Глава 7. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ………………………………………………………………....….30 Глава 8. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………………………………………………...31-33 Глава 9. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ……………………………….………...…....34-37 ВЫВОД……………………………………………………………………………………...….38 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………...…………...39-40 ПРИЛОЖЕНИЕ 1……………………………………………………………………….......41-43 АКТУАЛЬНОСТЬ НАШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Фармакологические исследования морских биологических объектов начаты относительно недавно (около 50 лет назад), но за это время описано много биологически активных природных соединений, выделенных из морских макро- и микроорганизмов. В последнее время появляются факты, свидетельствующие в пользу биологически активных веществ микробного происхождения, полученных из морских макроорганизмов (гидробионтов, водорослей и других объектов), поскольку бактерии, являясь симбионтными организмами, могут составлять большую часть биомассы хозяев. Морские микроорганизмы отличаются от наземных своими морфологическими признаками и физиологическими свойствами. Эти различия обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как высокая концентрация солей, гидростатическое давление, низкая температура. Многие соединения, выделенные из морских микроорганизмов, и их метаболиты уникальны по структуре и физиологическому действию. Липополисахариды бактерий являются сильными активаторами 2 врожденного иммунитета. Они содержат токсический компонент – липид А, что ограничивает их использование в качестве основы для получения лекарственных препаратов. В этом плане большой интерес представляют морские бактерии, относящиеся к роду Pseudoalteromonas, которые в силу особых условий обитания могут синтезировать необычные структурные варианты липида А с низким эндотоксическим потенциалом. Аэробные гетеротрофные грамотрицательные морские бактерии рода Pseudoalteromonas прикладных представляют исследований катаболических реакций, из-за интерес для фундаментальных и разнообразия биосинтетических и продуцирования этими микроорганизмами антимикробных метаболитов как белковой, так и небелковой природы. Кроме того, в составе антигенных полисахаридов (ПС) бактерий рода Pseudoalteromonas идентифицированы редкие и необычные N-ациламино- и кислые моносахариды, а также высшие сахара. Установлено, что ЛПС Pseudoalteromonas nigrifacien, ингибирует адгезию псевдотуберкулезных бактерий. Важную роль в снижении степени адгезии липополисахаридом играет его фрагмент О-специфический ПС, в то время как другой фрагмент-олигосахарид кора не влияет на процесс адгезии. ЛПС P. nigrifaciens и его безлипидные компоненты, изменяя уровень экспрессии молекул адгезии различных семейств на нейтрофилах, оказывают активирующее действие на клетки врожденного иммунитета (Смолина, 2005). 3 Глава 1. МНОГОЭТАПНОСТЬ ИММУНОЙ ЗАЩИТЫ Иммунная система защищает организм от инфекции в несколько этапов, при этом с каждым этапом повышается специфичность защиты. Самая простая линия защиты представляет собой физические барьеры, которые предотвращают попадание инфекции — бактерий и вирусов — в организм. Если возбудитель проникает через эти барьеры, промежуточную неспецифическую реакцию Если возбудители осуществляет врождённая иммунная система. успешно преодолевают воздействие врожденных иммунных механизмов, у позвоночных существует третий уровень защиты — приобретённая иммунная защита. Эта часть иммунной системы адаптирует свою реакцию во время инфекционного процесса, чтобы улучшить распознавание чужеродного биологического материала. Такой улучшенный ответ сохраняется после уничтожения возбудителя в виде иммунологической памяти. Она позволяет механизмам приобретённого иммунитета развивать более быструю и более сильную ответную реакцию при каждом появлении такого же возбудителя (http://ru-russ.finanzalarm.com). 4 1.1. Врождённый иммунитет Врождённая иммунная защита неспецифична, то есть её звенья распознают и реагируют на чужеродные тела независимо от их особенностей. Эта система не создает длительной невосприимчивости к конкретной инфекции. Система врождённого иммунитета осуществляет основную защиту у большинства живых многоклеточных организмов. К системе врожденного иммунитета относят 4 составляющие: • анатомические барьеры (кожа и слизистые оболочки) • физиологические барьеры (температура, низкий уровень рН в желудке, антиинфекционные растворимые белки или гуморальные факторы – лизоцим, интерфероны – ИФН, эндогенные антимикробные пептиды, компоненты системы комплемента); • фагоцитарный барьер (нейтрофилы и моноциты крови, тканевые макрофаги); • воспалительный барьер (хемокины, эйкозаноиды, ограничение воспалительных реакций в очаге поражения). 1.1.1. Клеточные факторы врождённого иммунитета К клеткам, осуществляющим неспецифическую («врождённую») иммунную реакцию, относятся фагоциты (макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки), тучные клетки, базофилы, эозинофилы и естественные киллеры. Фагоцит обхватывает своей мембраной корпускулярный объект (бактериальные или собственные поврежденные клетки), заключает его в мембранную везикулу, которая оказывается внутри фагоцита. Такие везикулы называют фагосомами. Цель фагоцитоза - полное биохимическое расщепление до мелких метаболитов содержимого фагосомы. 1.1.2. Морфофункциональная характеристика нейтрофилов Нейтрофилы – один из типов белых кровяных клеток – лейкоцитов. Это многочисленные и очень подвижные клетки. При появлении бактерий нейтрофилы начинают активный выход в ткани, где движутся в очаг воспаления, с помощью различных реакций инактивируют (поглощают и 5 разрушают) бактерии (http://ru.wikipedia.org). Нейтрофилы циркулируют в периферической крови и составляют большую часть лейкоцитов крови - 6070 %, или 2,5-7,5хl09 клеток в 1л крови. Нейтрофилы проявляют следующие функции: 1. Способность к адгезии (прилипание) и изменению формы. 2. Способность к движению: а) случайное блуждание; б) хемотаксис (направленное движение отдельных клеток под влиянием односторонне действующего стимула – химического вещества) в) хемокинез (реакция на внешний стимул, выражающиеся в изменении скорости, частоты, смены периодов движения или частоты и амплитуды поворотов во время случайного блуждания.) 3. Способность к распознаванию чужеродных агентов. Нейтрофил с помощью рецепторов распознает бактерии. 4. Способность к фагоцитозу. 5. Микробицидная активность. Продукция кислородных радикалов и секреция ферментов, содержащихся в гранулах. Нейтрофилы созревают в костном мозге в течение 6-11 дней, после чего выходят в кровяное русло, где передвигаются током крови и дозревают около 10 часов. Зрелые нейтрофилы выходят в ткань, где движутся от 24 до 48 часов. Различают 3 популяции (пула) нейтрофилов: 1. Нейтрофилы костномозгового резерва. Такие клетки отличаются меньшей адгезивностью и хемолюминесценцией на действие активатора. 2. Нейтрофилы, пассивно циркулирующие в кровяном русле (циркулирующий пул). 3. Пристеночный пул нейтрофилов, находящихся вблизи эпителия кровеносных и лимфатических сосудов. Выход нейтрофилов в ткань происходит через 2-4 часа после появления инфекции. 6 Существует 3 этапа выхода нейтрофилов в ткань: Краевое 1. стояние лейкоцитов у внутренней поверхности эндотелия сосудов воспаленной ткани. Диапедез – прохождение лейкоцитов через стенку эндотелия 2. (длится несколько минут). Движение нейтрофилов в области воспаления. 3. Выйдя в ткань, нейтрофил начинает активное движение в области воспаления (http://otherreferats.allbest.ru). Под активацией нейтрофилов подразумеваются быстро наступающие изменения их физиологической и биохимической активности при действии внешнего сигнала. Критерием активированного состояния принято считать появление респираторного взрыва и секреторной дегрануляции. Наиболее характерным ответом нейтрофилов является накопление в нейтрофилах перекиси водорода. Для того, чтобы убить бактерии, нейтрофил нарабатывает активные радикалы кислорода, уничтожая при этом не только бактерии, но и другие клетки организма-хозяина (www.mediasphera.ru). В зрелых нейтрофилах существует два основных типа гранул: азурофильные и специфические. При воздействии на нейтрофилы растворимыми агонистами происходит дегрануляция нейтрофилов. Часть гранул, расположенных вблизи плазматической мембраны, сливается с ней и содержимое гранул высвобождается во внеклеточную среду. С наружной клеточной мембраной сливаются сначала специфические гранулы и уже затем – азурофильные. Такой тип дегрануляции характерен для «несостоявшегося фагоцитоза». При состоявшемся фагоцитозе бактерия захватывается мембраной нейтрофила со всех сторон, попадает в цитоплазму в составе фагоцитарной вакуоли – фагосомы, где происходит её разрушение (http://www.braintools.ru). 1.1.3. Морфофункциональная характеристика моноцитов Моноциты - наиболее крупные клетки периферической крови, округлой или несколько неправильной формы, диаметром 12-20 мкм. Имеют 7 крупное ядро различной формы (овальной, подковообразной, грибовидной), окрашивающееся слабее, чем ядра других видов лейкоцитов. Цитоплазма моноцитов окрашивается в голубовато-серый цвет, не содержит зернистости, соотношение между ядром и цитоплазмой приблизительно 1:1. Содержание моноцитов в крови составляет 2-10%. Моноциты образуются в костном мозге, выходят не окончательно созревшие клетки, после двух-трёх дневного пребывания в крови легко проникают в ткани, где растут, окончательно созревают и превращаются в тканевые макрофаги: профессиональные и антиген представляющие. Моноциты крови и профессиональные центральным звеном макрофаги являются мононуклеарной фагоцитарной системы: обладая выраженной фагоцитарной активностью, обеспечивают неспецифическую резистентность организма (врожденный иммунитет). Обладают бактерицидным действием, в отношении фагоцитированных частиц за счёт синтеза миелопероксидазы, каталазы, лактоферрина, лизоцима, активных форм кислорода, интерферона, белков системы комплемента и др. Моноциты и макрофаги участвуют освобождению большого количества в гемостазе благодаря тромбопластина, фактора активации тромбоцитов, факторов свёртывания крови, активаторов плазминогена и др. Регулируют гемопоэз за счёт синтеза некоторых росторегулирующих факторов: эритропоэтина, колониестимулирующих факторов и др (http://trundel.ru). 1.2. Адаптивный иммунитет Адаптивный иммунитет высокоспецифичен в отношении каждого конкретного возбудителя. Повторная встреча с тем или иным патогенным микроорганизмом повышает его уровень: иммунная система как бы “запоминает” возбудителя, чтобы впоследствии предотвращать вызываемую им инфекцию. Две главные характеристики приобретенного иммунитетаспецифичность и иммунологическая память. Иммунный ответ 8 осуществляется прежде всего лейкоцитами, которые представлены несколькими разновидностями (Ройт, 2000). 1.2.1. Лимфоциты и адаптивный иммунитет Им принадлежит ведущая роль во всех реакциях адаптивного иммунитета, поскольку они специфически распознают конкретный возбудитель, где бы он ни находился, внутри или вне клеток, в тканевой жидкости или в крови. Существует различные типы лимфоцитов, но основных популяций две: Т-лимфоциты (или Т-клетки) и В-лимфоциты (или В-клетки). Последние противодействуют внеклеточным возбудителям и влиянию их продуктов, образуя антитела, молекулы которые способны специфически распознавать и связывать определенные молекулы-мишениантигены. Антигенами могут служить молекулы на поверхности клеток микроорганизмов либо образуемые ими токсины. Т-лимфоциты, точнее разные их популяции вместе, обладают широким набором активностей. Одни Т-клетки участвуют в регуляции дифференцировки В-лимфоцитов и образования антител. Другие взаимодействуют с фагоцитами, помогая им в разрушении поглощение микробных клеток. Третья группа Т-лимфоцитов распознает и разрушает клетки, инфицированные вирусами (Ройт, 2000). 9 Глава 2. СТРОЕНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА БАКТЕРИЙ ЛПС является одним из основных компонентов наружной мембраны грамотрицательных бактерий, в одной клетке E. coli содержится около 3,5 × 10 6 ЛПС (454). ЛПС является важным соединением клеточной стенки и является необходимым условием для жизнеспособности бактерий. ЛПС не является токсичным когда он заключен в наружную мембрану бактерий, но после освобождения от стенки бактерий, его токсичная часть, липид А, подвергается воздействию иммунных клеток, тем самым вызывая воспалительные реакции. ЛПС и другие компоненты клеточной стенки высвобождаются из бактериальной клетки, во время размножения и гибели бактерий. Также различные эндогенные факторы, некоторые антибиотики приводят к разрушению бактерий, в результате чего высвобождается ЛПС (Edwin, 2003). 10 Липополисахарид состоят из трех частей (рис. 1): 1) липида А; 2) центральной олигосахаридной части кора); (олигосахарид 3) О- специфического полисахарида. Липид А представляет собой ковалентно связанный с углеводной частью компонент ЛПС. У бактерий не существует свободный от полисахарида липид А. Это обусловлено тем, что при биосинтезе к молекуле предшественника липида А молекула 2-кето-3-дезоксиоктоновой (КДО) кислоты переносится раньше, чем завершится сборка структур липида А. Липид А является фосфолипидом необычного типа. В основе структуры липида А большинства исследованных бактерий и, в частности, всех энтеробактерий, а также представителей родов Haemophilus и Providencia, находится гидрофильный скелет. В составе липидов А ряда бактерий отсутствуют фосфаты. Различия в структурах липида А зависят от количества (гепта-, гекса-, пента- и тетра-) присутствующих жирных кислот и от их распределения в дисахаридном скелете: асимметричное [(4+2) (E. coli, Rhodospirillum fulvum)] или симметричное [(3+3) (Rhodobacter capsulatus, Chromobacterium violaceum)]. Как правило, первичные жирные кислоты липида А являются бета-гидроксилированными и известно только несколько исключений: 3оксо-жирные кислоты [С14:0 (3-оксо)] у Rhodopseudomonas sphaeroides и Rhodobacter capsulatus негидроксилированные (положение жирные 2 кислоты, и 2', соответственно); которые присоединяются непосредственно к дисахаридному скелету у C. Trachomatics. Улеводный скелет большинства исследованных липидов А представлен дисахаридом обусловленные глюкозамина. Однако наличием: (Rhodopseudomonas viridis, 1) R. существуют его вариации, 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-глюкозы palustris, Thiobacillus ferrooxidans, T. thiooxidans, Campylobacter jejuni, Brucella abortus, B. melitensis, Pseudomonas diminuta, Phenylobacterium immobile). Скелет липида А с диаминоглюкозой может существовать в форме как моно-, так и дисахарида; 2) D11 глюкозаминоуроновой кислоты (Rhizobium trifolii); 3) галактуроновой кислоты (R. leguminosarum bvs. phaseoli, trifolii, vicea); 4) галактуроновой кислоты и глюкозамина (R. leguminosarum). Приведенные данные свидетельствуют о вариабельности структуры липида А. Полисахаридная часть молекулы представлена связанным с липидом А олигосахаридом кора, а также ОПС. Единственным структурным элементом, который присутствует во всех ЛПС, независимо от их бактериального происхождения, является 2-кето-3дезоксиоктоновая кислота (КДО) (от одного до трех остатков) или ее производное. Бактерии с дефектом в биосинтезе КДО не являются жизнеспособными. Это указывает на то, что КДО (как и ЛПС в целом) является необходимой для структурной и функциональной целостности бактериальной клетки. Несмотря на то, что в ЛПС ряда бактерий присутствует 3 молекулы КДО, для выживания грамотрицательных бактерий достаточно только одного остатка КДО. Другим компонентом кора является гептоза. Коровые структуры могут быть отнесены к двум видам: содержащим и не содержащим гептозы. Большинство коров характеризуется присутствием L-глицеро-D- манногептопиранозы (L,D-Hep) или реже D-глицеро-D-манногептопиранозы (D,D-Hep) [66], в составе некоторых — присутствуют оба типа. Кроме того известна группа бактерий (представителей Neisseria, Vibrionaceae, Aeromonas, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae, Campylobacter, Helicobacter, Miscellaneous), которые содержат 4 остатка гептоз, однако конформация некоторых из них неизвестна. Вторую группу бактерий составляют представители Moraxellaceae, Rhizobiaceae, Chlamydia, в составе кора которых гептозы отсутствуют. Кор всегда присоединяется к липиду А через остаток КДО, за исключением двух штаммов Acinetobacter, в коре которых КДО замещена нестехиометрическими количествами Ко (Д-глицеро-Д-тало-окт-2- улопиранозоновая кислота). 12 О-специфические полисахариды (ОПС) обычно характеризуются регулярной структурой, построенной из повторяющихся олигосахаридных единиц, что определяется способом их биосинтеза, в котором ранее образованные олигосахаридные блоки переносятся в растущую полисахаридную цепь. Компоненты О-цепи включают нейтральные моносахариды в пиранозной и фуранозной форме (гексозы, пентозы, дезокси- и О-метильные производные) и заряженные моносахариды (аминогексозы и аминопентозы, гексуроновые и гексозаминоуроновые кислоты), которые несут ряд заместителей, таких как аминоацильные, фосфорильные, глицерильные, лактильные и ацетильные группы. У ряда видов бактерий ОПС представляют гомополимеры галактозы (Hafnia alvei), рамнозы (Klebsiella pneumoniae, Yersinia bercovieri, Campylobacter fetus), маннозы (Salmonella enterica, Serratia marcescens, Campylobacter fetus, Burkholderia cepacia, Acetobacter methanolicus), глюкозы (A. Methanolicus), гептозы (Burkholderia pseudomallei), таллозы (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Rhizobium loti). Однако ОПС в виде гомополимеров встречаются редко. В основном они представлены гетерополисахаридами, содержащими до восьми различных остатков моносахаридов. Из-за разнообразия компонентов и их связей возможно существование огромного количества структур ОПС, что находит свое подтверждение в природе. О-специфические цепи определяют серологическую специфичность ЛПС и содержащих их бактерий. О-иммуногенные и О-антигенные свойства ЛПС определяются так называемыми О-факторами (http://www.medved.kiev.ua). 13 Рисунок1.Структура липида А (443) (A) и целый ЛПС (B). Состав и длина некоторых серотипов ЛПС указаны. Глава 3. ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ И ИХ КОМПОНЕНТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БАКТЕРИЙ Поскольку ЛПС является уникальной молекулой, общей для всех грамотрицательных бактерий, его присутствие в клетке хозяина является сигналом для развития ответной реакции организма. Запущенный этим сигналом быстрый и сильный антибактериальный ответ может быть опосредован иммунной системой (цитокины и другие клеточные медиаторы). Высокие дозы эндотоксина или его длительное присутствие в крови, 14 обусловленное персистенцией инфекции или фрагментов лизированных бактерий, может вызывать сверхреакцию, сопровождающуюся освобождением токсических количеств цитокинов и других клеточных медиаторов. Эта сверхреакция может способность развитию септического состояния и привести к формированию гипотензии, шока, разрушению тканей и органов. СД14 являются рецепторными белками, которые узнают и связывают ЛПС из комплексов, образуемых мономерным ЛПС и циркулирующим ЛПСсвязывающим белком. Исследователи считают, что СД14 вначале образуют ЛПС-СД14 комплекс и переносят ЛПС к еще неидентифицированному рецептору(ам) ЛПС, чтобы начать трансдукцию сигнала. Предполагают, что СД14 тесно ассоциированы с сигнальным белком тирозинкиназой. Сообщалось о способности многих клеточных белков связывать ЛПС и липид А. Однако, кроме СД14, эти белки не охарактеризованы. Взаимодействие бактериального ЛПС с клетками, осуществляется ЛПСсвязывающим белком, мембранными (гликозилфофатидилинозит- содержащими) СД14 или растворимыми СД14 рецепторами. В результате этих взаимодействий происходит активация клеток и освобождение медиаторов белковой природы, таких как ИЛ-1 или ФНО, которые последовательно усиливают ЛПС-зависимые ответы хозяина, приводящие к развитию септического шока и даже смерти. Обнаружение СД14 рецепторов, взаимодействующих с ЛПС, явилось тем ключевым событием, которое определило перспективы дальнейших исследований по выбору стратегии борьбы с заболеваниями, вызванными грамотрицательными бактериями (Варбанец, 2002). Установлено, что липополисахариды грамотрицательных условнопатогенных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium являются биологически активными веществами, которые влияют на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека в условиях in vitro: 15 - Стимулируют секреторную функцию моноцитов и Т-хелперов первого типа крови человека. Под влиянием липополисахаридов повышается продукция моноцитами интерлейкинов-lß и -6, фактора некроза опухоли-а и продукция ингерлейкина-2 Т-хелперами первого типа. - Влияют на фагоцитарную активность моноцитов в условиях iri vitro. Небольшие дозы липополисахаридов (10 мкг/мл) стимулируют фагоцитоз моноцитов, большие дозы (50-100 мкг/мл) - угнетают его тем сильнее, чем выше действующая доза липополисахаридов. Наибольшим иммуно- супрессивным потенциалом обладают липополисахариды Е. fergusonii, Р. aeruginosa, Я. influenzae, наименьшим - липополисахариды В. fragilis, Р. melaninogenicus, F. necroforwn. - Стимулируют апоптоз моноцитов, T- и В-лимфоцигов, что проявляется экспрессией на данных клетках маркера апоптоза CD95. Способность липополисахаридов грамотрицательных бактерий усиливать экспрессию молекул CD95 на поверхности иммунокомпетенгных клеток возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов, и более выражена у представителей родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, чем у представителей родов Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium ( www.referun.com). Также установлено, что ЛПС Аzospirillum irakense, Аzospirillum lipoferum, Аzospirillum brasilense in vitro стимулируют процесс фагоцитоза бактерий макрофагами и способствуют его завершённости, умеренно индуцируют продукцию ИЛ-lß и ФНО-а клетками цельной крови и фагоцитирующими мононуклеарами человека. Под воздействием ЛПС азоспирилл ведущими механизмами бактерицидности в лейкоцитах являются индукция образования оксида азота и усиление активности миелопероксидазы в макрофагах, кроме того, ЛПС азоспирилл серогруппы I стимулируют активность механизмов кислород-независимого киллинга (http://www.ibppm.saratov.ru). 16 ПС Pseudoalteromonas nigrifacien снижает адгезию бактерий S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus и Acinetobacter spp. на ЭЧ и уроэпителии. Такая высокая способность к адгезии у стафилоккоков на уроэпителиоцитах свидетельствует о значимости их адгезивной активности в инфекционном процессе (Смолина, 2006). Глава 4. ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ И ИХ КОМПОНЕНТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ Род Pseudoalteromonas включает грамотрицательные морские бактерии, широко распространенных в морских водах, составляя 0,5–6 % общего бактериального планктона. Морские бактерии продуцируют внеклеточные полисахариды (EPS) и различные компоненты низкой молекулярной массы (LMM), в качестве гормона роста, адгезии к твердым 17 поверхностям и для выживания в неблагоприятных условиях, например, образуя биопленки. Морские бактерии являются богатыми источниками полезных биомолекул, таких как мембранные липиды, белки, сложные полисахариды, пигменты, нуклеиновые кислоты и биологически активные метаболиты. Липополисахариды бактерий – сильные активаторы врожденного иммунитета. Биологически активные вещества, принадлежащие к различным классам соединений, обнаружены во многих видах морских бактерий рода Pseudoalteromonas. Установлено, что в состав гликополимеров внешней мембраны грамотрицательных морских бактерий Pseudoalteromonas входят редкие и необычные N‑ациламино‑ и кислые моносахариды, а также высшие сахара. Было установлено, что кислые капсульный и клеточные полисахариды морских микроорганизмов этого рода обладают способностью блокировать адгезию патогенных микроорганизмов на клетках животных и человека, а липополисахарид (ЛПС) и его компоненты, выделенные из бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens, оказывают активирующее действие на мононуклеары клеток крови. У большинства грамотрицательных бактерий ЛПС является очень мощным вирулентным фактором, который активизирует врожденные иммунные клетки. Липид А является активным компонентом ЛПС, который стимулирует TLR4 рецепторный комплекс. Высшее ацилирование липида А, например из Escherichia coli, вызывает мощный воспалительный процесс, в то время как меньшее ацилированние липида А, является менее стимулирующющим. Например, тетра-ацилированный липид А из Yersinia pestis является слабым иммуностимулятором в человеческих макрофагах и вызывает слабый иммунный ответ. Холмстром с соавт. обнаружил, что пигментированные виды Pseudoalteromonas обладают широким спектром биологической активности, 18 связанной с секрецией внеклеточных соединений, некоторые из которых включают пигмент (John, 2007). Pseudoalteromonas заселяет tunicata различные эукариотические организмы в морской среде, в том числе Ulva australis, и продуцирует компоненты, спорами препятствующие водорослей, компаненты, обрастанию личинокками продуцируемые P. бактериями, беспозвоночных tunicata и простейшими, грибов. эффективны и Эти против грамотрицательных, и против грамположительных бактерии. P. tunicata обладает конкурентным преимуществом при колонизации поверхности. Хиль-Турнес с соавт. обнаружил, что личинки креветки покрыты бактериями Alteromonas sр., которые продуцирует противогрибковые соединения и они защищают личинки от патогенных грибов Lagenidium сallinectes. Также было установлено, что личинки омаров, были защищены от L. сallinectes грамотрицательными бактериями, которые продуцировали противогрибковый метаболит – тирозол (Franks, 2006). Глава 5. МОЛЕКУЛЫ МЕЖКЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ Молекулы межклеточной адгезии - это связанные с плазматической мембраной белки, которые обеспечивают механическое взаимодействие клеток друг с другом. Часто это молекулы, которые пронизывают мембрану и присоединены к цитоскелету. С их помощью клетки при движении мо- гут «подтягиваться» к другим клеткам или перемещаться по внеклеточному матриксу. Во многих случаях отдельная молекула межклеточной адгезии 19 способна взаимодействовать не с одним, а с несколькими лигандами, для чего служат разные участки связывания. Хотя связывание индивидуальных молекул адгезии со своими лигандами обычно происходит с низким сродством, авидность взаимодействия может быть довольно высокой, за счет того, что молекулы адгезии расположены на поверхности клеток кластерами и образуют участки многоточечного связывания. Взаимодействие двух типов клеток может изменяться в результате увеличения числа молекул адгезии на клеточной поверхности либо при изменении их аффинности и/или авидности. Существуют два механизма увеличения числа молекул адгезии на поверхности клеток: у многих клеток большие запасы этих молекул хранятся во внутриклеточных везикулах, которые способны через несколько минут после активации устремляться к поверхности цитоплазматической мембраны; другой механизм заключается в синтезе таких молекул и переносе их на поверхность (эти процессы занимают, как правило, несколько часов). Все молекулы межклеточной адгезии можно разделить на пять структурных семейств: -Интегрины - гетеродимерные молекулы, функционирующие как клеточно-субстратные, так и межклеточные адгезивные рецепторы; -Адгезивные рецепторы суперсемейства иммуноглобулинов, которые участвуют в межклеточной адгезии и особенно важны в эмбриогенезе, заживлении ран и иммунном ответе; -Селектины - адгезивные молекулы, лектинподобный домен которых обеспечивает адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам; -Кадгерины - кальцийзависимые гомофильные межклеточные адгезивные белки; -Хоминговые рецепторы - молекулы, обеспечивающие попадание лимфоцитов в специфическую лимфоидную ткань. 5.1. Экспрессия и индукция молекул адгезии на эндотелии 20 Повышение адгезивности имеет большое значение в патогенезе дисфункции эндотелия при воспалении, атеросклерозе, септическом шоке и других патологических процессах. Миграция клеток - это сложный процесс, в котором на разных стадиях принимают участие несколько наборов молекул адгезии. В физиологических условиях эндотелиальная клетка не экспрессирует молекулы адгезии. Увеличение концентрации последних на поверхности эндотелиальных клеток возникает при действии различных повреждающих факторов - увеличении напряжения линейного сдвига в определенном участке артерии, накоплении в субэндотелиальном пространстве окисленных липидов и липопротеидов (например, у больных сахарным диабетом при наличии в стенке сосуда недоокисленных гликозилированных продуктов) и т.д. Адгезия лейкоцитов проходит в две стадии: стадия роллинга (прокатывания лейкоцитов вдоль эндотелия) и стадия плотной адгезии (остановки лейкоцитов). Эти стадии связаны с различными адгезивными молекулами, последовательность и время экспрессии которых на лейкоцитах и эндотелии различно. В нормальных условиях на эндотелии представлена в небольшом количестве молекула адгезии ICAM-2, посредством которой происходит формирование пула лейкоцитов в венозных сосудах ЖКТ, легких и других органах. Нейтрофилы появляются в очаге острого воспаления на его ранней стадии, и отчасти это обусловлено индукцией цитокинами экспрессии Е-селектина на поверхности эндотелия в этой области. Стимуляция клеток эндотелия in vitro такими цитокинами, как TNF-α или IL-1 индуцирует экспрессию Е-селектина спустя 4-12 часов, а через 24 часа она прекращается. Экспрессия Р-селектина происходит в течение очень короткого времени при воздействии на эндотелий тромбина, гистамина, фактора активации тромбоцитов, компонентов системы комплемента и некоторых других стимулов. Важную роль в миграции нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов выполняют также экспрессируемые на лейкоцитах β2-интегрины LFA-1 и CR3, которые связываются с эндотелиальными молекулами межклеточной 21 адгезии из суперсемейства иммуноглобулинов. Так, LFA-1 связывается с ICAM-1 и ICAM-2 на эндотелии сосудов. Динамика экспрессии различных молекул межклеточной адгезии на клетках эндотелия после стимуляции TNF-І in vitro. В условиях in vitro индуцированная экспрессия ICAM-1 наблюдается в период 8-96 часов после стимуляции, что соответствует более позднему прибытию in vivo в очаг воспаления лимфоцитов и моноцитов. Экспрессия VCAM-1, как и ICAM-1, индуцируется в области воспаления, причем in vitro индукция этих двух молекул происходит синхронно. Вместе с тем механизмы индукции Е-селектина, ICAM-1 и VCAM-1 у разных популяций лимфоцитов и клеток эндотелия на различных участках сосудистого русла тонко различаются. Это обеспечивает точную настройку миграциилейкоцитов сквозь эндотелий при воспалении и последовательное прибытие в очаг различных клеточных популяций. Прилипание лимфоцитов к эндотелию можно подавить антителами к молекулам межклеточной адгезии лимфоцитов или эндотелия либо растворимыми препаратами самих этих молекул. Именно на таком подходе основан новый способ лечения болезней иммунологического патогенеза. 5.2. Суперсемейство иммуноглобулинов К суперсемейству иммуноглобулинов принадлежит ряд молекул адгезии эндотелиальных клеток, в том числе молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), 2 (ICAM-2) и 3 типа (ICAM-3), молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1). На эндотелиальных клетках они являются поверхностными лигандами для интегринов LFA-1 и VLA-4. Различная регуляция экспрессии ICAM-1, -2, -3 и VCAM-1 играет важную роль в адгезии лимфоцитов. Высокий уровень экспрессии ICAM-2 постоянно выявляется на покоящихся эндотелиальных клетках и эта экспрессия не усиливается при активации. Наоборот, ICAM-1 плохо выявляется на покоящемся эндотелии, а VCAM-1 просто отсутствует. При активации эндотелия экспрессия этих молекул быстро усиливается. 22 5.2.1. Растворимая форма молекулы (межклеточной адгезии 1 (sICAM-1) ICAM-1 или CD54 представляет собой одноцепочечный гликопротеин c молекулярной массой 55 kDa. Это интегральный мембранный белок, содержащий пять Ig-подобных внеклеточных доменов. Ген, кодирующий ICAM-1, локализован на 19-й хромосоме. ICAM-1 является лигандом для LFA-1, Mac-1 и CD43. ICAM-1 экспрессируется на различных типах эндотелиальных клеток, эпителиальных клетках, фибробластах, на некоторых гемопоэтических клетках - тканевых макрофагах, митогенстимулированных Т-клетках, в клетках зародышевых центров, дендритных клетках, в лимфоузлах. ICAM-1 фибробластов и эндотелиальных клеток индуцируется медиаторами воспаления, такими как IL-1, TNFα и IFNγ. Экспрессия ICAM-1 усиливается в течение 6-8 часов после стимуляции и сохраняется как минимум 48 часов. Взаимодействие лейкоцитарного β2интегрина с ICAM-1 имеет большое значение в регуляции отдельного этапа адгезии лейкоцитов и их трансэндотелиальной миграции. ICAM-1 и его рецептор LFA-1 являются дополнительными факторами активации Т-лимфоцитов. Кратковременное взаимодействие Т-клеточного рецептора и CD2 индуцирует определенное состояние LFA-1, при котором возрастает уровень его связывания с ICAM-1, причем без изменения концентрации обеих молекул. Роль ICAM-1 как маркера заболеваний доказана для большого числа различных патологических ситуаций. 5.3. Семейство селектинов Селектины - семейство адгезивных белков, которые имеют три характерные черты: вариабельное число (от 2 до 9) повторов комплементрегуляторных белков, домен эпидермального фактора роста (EGF) и Nконцевой лектиновый домен. Хорошо охарактеризованы три члена этого семейства: L-селектин, P селектин и Е-селектин. Селектины являются тканевыми лектинами, обладающими сродством к концевым остаткам 23 маннозы, для связывания которых требуется присутствие Са2+ (свойство группы селектинов). Под действием Р- и Е-селектинов осуществляется частичная задержка лейкоцитов с неполной остановкой на поверхности эндотелия - роллинг. Причем Р-селектин обеспечивает начальную стадию, быстрый роллинг лейкоцитов, скорость которого начинает замедляться при экспрессии Е-селектина. 5.3.1. Растворимый L-селектин (sL-selectin) Растворимый L-селектин, называемый также sCD62L или sLECAM-L, представляет собой гликопротеин, образующийся в результате распада мембранного предшественника L-селектина, гликопротеина с молекулярной массой 75-80 kDa. L-селектин экспрессируется на лимфоцитах и имеет прямое отношение к их миграции. Данный белок также представлен на нейтрофилах, моноцитах и других миелоидных клетках. Показано, что Lселектин опосредует эффект «катящихся» нейтрофилов вдоль сосудистой стенки микроциркулярного русла - феномен, который многие исследователи рассматривают как первый «шаг» адгезии лейкоцитов к эндотелию, что, в свою очередь, приводит к их накоплению в зоне воспаления. Металлопротеиназы клеточной поверхности расщепляют L-селектин, что может снижать регуляцию L-селектин-опосредованной адгезии. Является одним из ключевых молекул адгезии, что регулирует и миграцию лейкоцитов в местах воспаления и рециркуляции лимфоцитов между кровью и лимфоидной ткани. 5.4. Интегрины Интегрины - это молекулы межклеточной адгезии, которые присутствуют на поверхности различных клеток, в том числе и лейкоцитов. Они участвуют в адгезии лейкоцитов к внеклеточному матриксу и к эндотелию. Все белки, входящие в это крупное семейство, состоят из двух нековалентно связанных полипептидых цепей (альфа и бета). Обе цепи пронизывают клеточную мембрану. Альфа цепь содержит 3 или 4 24 тандемных повтора мотива связывающего двухвалентные ионы и нуждаются в Mg и Ca для функционирования.Альфа цепи при связывании с бета цепью дают функциональный рецептор (Giancotti, 1990). Бета цепь имеет функциональное значение и интегрины классифицируются по ним. Так интегрины с бета 1 или бета 3 цепью преимущественно вовлечены во взаимодействие клетки - ЕСМ. Интегрины с бета 2 цепью преимущественно вовлечены во взаимодействие лейкоцитов между собой. Семейство интегринов делят на три основных подсемейства по типу бета-цепи (бета1, бета2 и бета3). Тип альфа-цепи не так важен для функциональной активности. 5.4.1. Интегрин альфа-M (αM, CD11b) Интегрин альфа-M (αM, CD11b) — мембранный белок, гликопротеин из надсемейства интегринов, продукт гена ITGAM, альфа-субъединица интегрина αMβ2 (MAC-1) Интегрин альфа-M — крупный белок, состоит из 1136 аминокислот, молекулярная масса белковой части — 127,2 кДа. N-концевой участок (1088 аминокислот) является внеклеточным, далее расположен единственный трансмембранный фрагмент и небольшой внутриклеточный фрагмент (24 аминокислоты). Внеклеточный фрагмент включает 7 FG-GAP-повторов, VWFA-домен и от 3 до 19 участков N-гликозилирования. Цитозольный участок включает GFFKR-мотив. Относится к интегринам с I-доменом (VWFA домен), которые не подвергаются ограниченному протеолизу в процессе созревания (Lipscomb, 2006). CD11b экспрессируется на поверхности многих лейкоцитов в том числе моноцитов, нейтрофилов, естественных клеток-киллеров, гранулоцитов и макрофагов, а также на 8% клеток селезенки и 44% клеток костного мозга. Функционально CD11b регулирует адгезию лейкоцитов и миграцию посредником воспалительного ответа. Исследования CD11b показали, белок непосредственно участвует в клеточной адгезии. Исследования с 25 использованием CD11b антигена, определили CD11b как рецептор для фибриногена, гамма-цепи (http://www.novusbio.com). 5.4.2. Интегрин альфа-X (αX, CD11c) Интегрин альфа-X (αX, CD11c) — мембранный белок, гликопротеин из надсемейства интегринов, продукт гена ITGAX (CD11C), альфа-субъединица интегрина αXβ2, рецептора фибриногена. Ген был впервые клонирован в 1987 году (Vinay, 2010). Интегрин альфа-X — крупный белок, состоит из 1144 аминокислоты, молекулярная масса белковой части — 127,8 кДа. N-концевой участок (1088 аминокислот) является внеклеточным, далее расположен единственный трансмембранный фрагмент и внутриклеточный фрагмент (35 аминокислот). Внеклеточный фрагмент включает 7 FG-GAP-повторов, VWFA-домен и от 1 до 8 участков N-гликозилирования. Цитозольный участок включает GFFKRмотив. Интегрин альфа-X экспрессирован преимущественно на моноцитах и гранулоцитах. Является рецептором для фибриногена. Распознаёт в последнем аминокислотную последовательность глицин-пролин-аргинин (RG-D). Опосредует межклеточные взаимодействия в процессе воспалительной реакции. Играет важную роль в адгезии моноцитов и в хемотаксисе (Mazzone, 1995). Глава 6. ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ КАК СОВРЕМЕННЫЙ МЕТОД АНАЛИЗА В БИОЛОГИИИ МЕДИЦИНЕ Проточная цитометрия как современная технология быстрого измерения характеристик клеток появилась в результате естественного развития традиционных гистохимических и цитохимических методов анализа. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный 26 подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д. Две существенные особенности проточной цитометрии: 1. метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, происходящих в процессе онкогенеза. Большинство современных применений цитометрии связано в первую очередь с анализами по фенотипу; 2. это способность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е. встречающиеся с частотой 10-5-10-7, что возможно благодаря огромной производительности. Так, современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 100000 клеток в секунду. Перечисленные возможности метода проточной цитометрии определяют клинические и общебиологические области его применения. К первой относятся: иммунология, онкология, онкогематология (включая диагностику, оценку эффективности лечения и мониторинг пациентов, входящих в группу риска); трансплантология, общая гематология и др. Ко второй – клеточная кинетика, клеточная энзимология, клеточная физиология, генетика и др. Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону анализа, позволила исследователям судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). В свою очередь, это привело к возможности типировать клетки без применения флуоресцентных красителей, что особенно ценно при работе с периферической кровью. Данный подход позволяет разделить и расположить в виде гистограммы лейкоциты периферической крови на три группы клеток - лимфоциты, моноциты и гранулоциты. 27 Развитие гибридомной технологии привело к тому, что у исследователей появился в руках такой инструмент, как моноклональные антитела, которые предоставили возможность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для определенных клеток и их функционального состояния. В настоящее время известно 339 кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation, CD) клеток человека. Использование различными моноклональных флуорохромами антител, позволило напрямую значительно меченых повысить информативность цитометрического анализа за счет многоцветности. Поскольку современные цитометры, как правило, оборудованы более чем тремя фотоэлектронными умножителями (от 3 до 12 ФЭУ), это позволяет на одном образце периферической крови анализировать практически все основные субпопуляции клеток. Процесс развития иммунного ответа организма на проникновение инфекции или значительными какие-либо другие изменениями воздействия сопровождается субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток. Это относится как к изменению абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, их субпопуляционного состава, так и к появлению на клеточной поверхности определенных функциональных молекул. Под воздействием различных агентов клетки приспосабливаются и отвечают на это изменением экспрессии тех или иных мембранных и внутриклеточных маркеров. Таким образом, одним из эффективных механизмов иммунорегуляции является модуляция экспрессии функционально значимых молекул. В свою очередь, не менее важным является и изменение абсолютных количеств иммунокомпетентных клеток в периферической крови. Иммунофенотипирование позволяет судить о типе клеток и их функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров. В отличие от флуоресцентной микроскопии, метод проточной 28 цитометрии позволяет наиболее полно и наиболее корректно оценить иммунофенотип пациентов. Иммунофенотипирование с использованием многоцветного анализа особенно важно для характеристики высокоспециализированных субпопуляций лимфоцитов, таких как клетки иммунологической памяти, антиген-специфические и регуляторные T клетки и субтипы NK-клеток. Определение субпопуляционного состава или фенотипа лимфоцитов в настоящее время является важным диагностическим признаком, позволяющим судить о течении процессов, происходящих в организме. Под фенотипом следует понимать совокупность функционально значимых маркеров, характерных пролиферации, для активации определенных или стадий программируемой дифференцировки, клеточной гибели (апоптоза). Относительное и абсолютное количество клеток, имеющих тот или иной фенотип, как раз и является конечным результатом иммунофенотипирования (http://laba.my1.ru). Глава 7. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ Целью данной работы является изучение влияние ЛПС бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens (штамм КММ 156) и его фрагментов: олигосахарида кора (Cor) и О-специфического полисахарида (О-сп. ПС) на экспрессию молекул адгезии клетками врожденного и адаптивного иммунитета периферической крови человека. 29 Задачи исследования: 1. Определение влияния бактериальных компонентов наэкспрессию Lселектинов (CD62L) лимфоцитами, моноцитами и нейтрофилами. 2. бактерий, Изучение действия биогликанов, выделенных из морских на изменение экспрессии интегринов (CD11b, CD11c) лимфоцитами, моноцитами и нейтрофилами. 3. Определение уровня экспрессии мембранных иммуноглобулинов CD54, участвующих в регулировании физиологических функций клеток. 4. Установление уровня экспрессии сигнальных молекул клеток врожденной иммунной системы CD14 под действием бактериальных компонентов. Данная работа является частью исследований, проводимых в лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии по изучению свойств иммуномодуляторов природного происхождения. Глава 8. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Гликополимеры получены из штамма бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens КММ 156, выделенного из ткани желудка дальневосточного двустворчатого моллюска Crenomytilus grayanus (бухта Троица). Оспецифический полисахарид (О-сп. ПС), входящий в состав липополисахарида (ЛПС), имеет идентичное строение с капсульным 30 полисахаридом и состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка L-рамнозы, один остаток 2-ацетамидо-2-дезокси-Dглюкозы и один остаток 3-О-[(R)-1-карбоксиэтил]–D-глюкозы (глюколактиловой кислоты). В состав ЛПС, кроме О-специфического полисахарида, входит липид А в аномально низком количестве и олигосахарид кора. Выделение, изучение химического состава и структуры биополимеров из морских бактерий проведены в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН. 8.1. Определение активационных маркеров клеток крови человека Для изучения влияния гликополимеров на клетки крови человека использовали кровь здоровых доноров, взятую утром натощак из локтевой вены в пробирки с гепарином (25 БД/мл) и использовали не позднее, чем через 6 часов после получения. Исследуемые концентрации 10 гликополимеры мкг/мл. вносили Экспрессию в кровь активационных в конечной маркеров на поверхности клеток оценивали методом проточной цитометрии (BD FACS Calibur) c использованием моноклональных антител к молекулам CD45/14, CD62l/11b, CD14/11c, CD14/54 и соответствующих изотипических контролей. Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом (т.н. гидродинамическое фокусирование). Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рассеяное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и 31 полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм (http://molbiol.ru). Основной метод анализа цитометрических данных заключается в выделении какой-либо популяции клеток, и дальнейшего анализа событий, относящихся только к интересующей популяции. Гейтирование может производиться по любым регистрируемым параметрам и с использованием любых логических операторов и их комбинаций (И, ИЛИ, НЕ). На представленном примере сперва производится гейтирование по CD45 позитивным событиям выделение лейкоцитарной популяции и отсев дебриса. Следующим шагом идет выделение лимфоцитарной популяции по параметрам прямого и бокового светорассеяния. И уже после двойного гейтирования по CD45 и лимфоцитарному региону происходит заключительный этап анализа - определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов (http://www.coulterflow.com). Последовательность проведения анализа: 1. Для каждого образца крови промаркировали необходимое количество пробирок (размер12×75 мм). 32 2. Внесли по 50 мкл хорошо перемешанного образца на дно каждой пробирки, добавили 1,2 мкл моноклональных антител и перемешали 5 с на вортексе. 3. Инкубировали 15 минут в темноте при комнатной температуре. В процессе инкубации происходит реакция взаимодействия поверхностных антигенов со специфическими моноклональными антителами, мечеными соответствующими флюорохромными красителями с образованием комплекса антиген-антитело. 4. После инкубации для лизиса эритроцитов в пробирки внесли по 400 мкл рабочего лизирующего реагента(FACS lysing solution) и перемешали 5 с на вортексе. Инкубировали 15 минут при комнатной температуре в темноте и затем центрифугировали пробирки в течение 5 минут в режиме 1500 об/мин. 5. Удалив надосадочную жидкость, добавили 400-500 мкл раствора Cell WASH для отмывания образца от разрушенных клеток. Осторожно ресуспендировали и центрифугировали 5 минут в режиме 1500 об/мин. 6. Удалив надосадочную жидкость, добавили 150-200 мкл раствора Cell WASH. 7. Образец анализировали на проточном цитометре. Глава 9. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 33 В результате исследования установлено влияние ЛПС P. nigrifaciens и его структурных компонентов на экспрессию молекул адгезии, относящимся к семействам селектинов, интегринов и иммуноглобулинов нейтрофилами, моноцитами и лимфоцитами крови. Изучено влияние гликополимеров морских бактерий P. nigrifaciens на изменение уровня экспрессии CD14 на моноцитах и нейтрофилах. Молекулы адгезии, относящиеся к селектинам и интегринам, которые экспрессируются на всех интактных нейтрофилах, моноцитах, лимфоцитах крови, играют специализированную роль в процессе передвижения лейкоцитов в участок воспаления и передаче различных межклеточных сигналов. Основной функцией CD54 является обеспечение адгезии нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и участие в контактных взаимодействиях клеток в иммунных реакциях. СD14 является рецептором, опосредующим реакции на многие сигнальные вещества бактериальной клетки. Взаимодействие эндотоксина с СD14 запускает синтез и секрецию медиаторов воспаления, в частности ФНО-альфа. При этом сигнал многократно усиливается и передается другим клеткам и тканям. Свободные молекулы CD14 тоже связывают эндотоксин и переносят его к эндотелиальным клеткам, которые поверхностных СD14 не имеют. По результатам эксперимента на поверхности нейтрофилов количество CD14 (Таблица 1.) в первый час инкубации в большей степени увеличивалось под воздействием О-ПС и КОР, после 24 часов инкубации наблюдалось их снижение. ЛПС вызывал увеличение молекул CD14 на поверхности нейтрофилов после 24 часов инкубации. Количество CD14 на поверхности моноцитов (Таблица 2.) в первый час инкубации увеличивалось под воздействие О-ПС и КОР, при инкубации с ЛПС в течение первого часа инкубации их количество оставалось на уровне контроля. После 24 часов инкубации наблюдалось увеличение экспрессии молекул CD14 контроля и под воздействием ЛПС, в то время как О-ПС и КОР снижали их количество. 34 L-селектины принимают участие в процессе «роллинга», а затем быстро слущиваются с поверхности клеток для остановки лейкоцитов и миграции их в ткани, в то время как экспрессия интегринов на мембране возрастает. Интенсивность флуоресценции CD62L на мембранах клеток нейтрофилов (Таблица 3.) в первый час инкубации под действием ЛПС оставалась на уровне контроля, но снизилась под воздействием О-ПС и КОР в 2 раза по сравнению с контролем. Через 24 часа гликополимеры О-ПС и КОР продолжали снижать уровень экспрессии CD62L на мембранах нейтрофилов. КОР вызывал максимальное снижение этого показателя уже через 1 час инкубации, О-ПС оказывал максимальное эффект через 24 часа инкубации. Количество CD62L на мембранах моноцитов (Таблица 4.) в первый час инкубации (контроль – 70,56) под действием ЛПС снижалась до 52,57, влияние О-ПС и КОР вызывали снижение этого показателя соответственно до 3,5 и 2,9. После 24 часов инкубации наблюдалось снижение молекул CD62L в контроле и под воздействием ЛПС, но увеличение их количества под влиянием О-ПС и КОР. На поверхности лимфоцитов (Таблица 5.) в первый час инкубации под воздействием гликополимеров наблюдалось увеличение молекул L- селектина, через 24 часа инкубации ЛПС вызывал дальнейшее увеличение экспрессии молекул, в то время как О-ПС снижал этот показатель, а под воздействием КОР количество молекул CD62L не изменилось. Интегрины составляют большое семейство молекул, которые опосредуют адгезию, как между клетками, так и адгезию клеток к экстрацеллюлярному матриксу в иммунном и воспалительном ответах. На нейтрофилах, моноцитах, лимфоцитах экспрессируются относящиеся к интегринам CR3 (CD11b/ CD18) и CR4(CD11c/ CD18) рецепторы компонента комплемента, способные распознавать и связывать многие поверхностные молекулы бактерий. Связывание рецептора вызывает последующий фагоцитоз и деградацию чужеродной клетки. На поверхности нейтрофилов 35 количество молекул CD11b (Таблица 6.) в первый час инкубации увеличивалось под воздействием О-ПС и КОР в большей степени, чем ЛПС, который вызывал небольшое увеличение этого показателя. После 24 часов инкубации регистрировалось снижение количества молекул CD11b под воздействием О-ПС и КОР, в то время как их количество на мембране нейтрофилов под действием ЛПС увеличивалось. Увеличение экспрессии CD11c на поверхности нейтрофилов (Таблица 7.) в первый час инкубации вызывали О-ПС и КОР, ЛПС не оказывал влияния на экспрессию молекул. После 24 часов инкубации наблюдали увеличение уровня экспрессии CD11c на нейтрофилах под действием ЛПС, О-ПС и КОР вызывали снижение этого показателя. Интенсивность флюоресценции CD11b на поверхности моноцитов (Таблица 8.) в первый час инкубации под воздействием О-ПС и КОР увеличивалась наиболее эффективно, по сравнению с ЛПС. После 24 часов инкубации происходило снижение количества CD11b на мембранах моноцитов контроля, под воздействием О-ПС и КОР наблюдалось снижение уровня экспрессии CD11c, тем не менее, показатели оставались выше контроля, в то время как под влиянием ЛПС количество молекул CD11b оставалось на прежнем уровне. Экспрессия молекул CD11c на поверхности моноцитов (Таблица 9.) в первый час инкубации наиболее интенсивно увеличивалась под влиянием О-ПС и КОР, небольшое увеличение регистрировалось под воздействием ЛПС. После 24 часов инкубации наблюдалось дальнейшее увеличение количества молекул CD11c под воздействием гликополимеров. Количество интегринов CD11b на поверхности лимфоцитов (Таблица 10.) в первый час инкубации под воздействием О-ПС и КОР увеличилось, под влиянием ЛПС снизилось. После 24 часов инкубации регистрировалось снижение количества молекул CD11b под влиянием О-ПС и КОР, при этом контроль снизился в 2 раза, а показатель ЛПС снизился в 10 раз. Наибольшую эффективность в увеличении экспрессии CD11c на поверхности 36 лимфоцитов (Таблица 11.) в первый час инкубации оказал О-ПС, в то время как показатели ЛПС и КОР увеличились незначительно. После 24 часов инкубации наблюдалось снижение количества молекул CD11c контроля и под влиянием ЛПС, в то время как О-ПС и КОР продолжали оказывать стимулирующее действие на экспрессию этих молекул. Молекулы межклеточной адгезии ICAM-1(CD54) присутствуют в низкой концентрации на мембранах лейкоцитов и эндотелиальных клеток. ЛПС увеличивал уровень экспрессии СD54 на нейтрофилах (Таблица 12.) и моноцитах (Таблица 13.) через 24 часа инкубации в меньшей степени, чем ОПС и КОР, эти гликополимеры увеличивали показатель соответственно в 11 и 8 раз. На поверхности лимфоцитов количество молекул CD54 (Таблица 14.) под воздействием КОР увеличилось уже в первый час инкубации, О-ПС вызывал увеличение экспрессии молекул после 24 часов инкубации. Основной функцией ICAM-1 является обеспечение адгезии нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов к активированному сосудистому эндотелию с последующей их экстравазацией и миграцией в очаг воспаления. Также СD54 функционирует как сигнальная молекула, принимающая участие в передаче сигнала с клеточной мембраны внутрь клетки и запускающая каскад сигнальных событий, результатом чего является продукция супероксидных радикалов. 37 ВЫВОД Полученные результаты свидетельствуют о том, что ЛПС P. nigrifaciens штамма КММ156 и его безлипидные компоненты оказывали активирующее действие на клетки врожденного и адаптивного иммунитета: моноциты, нейтрофилы и лимфоциты. Действуя на клетки, ЛПС оказывал менее стимулирующие действие на экспрессию молекул адгезии, безлипидные компоненты О-ПС и КОР проявляли свою эффективность в большей степени. По результатам исследования так же установлено, что клетки врожденного иммунитета быстрее отвечают на воздействие биогликанов, изменяя экспрессию молекул адгезии, по сравнению с клетками адаптивного иммунитета. В связи с этим использование ЛПС и его представляется перспективным безлипидных компонентов в качестве иммуномодуляторов, поскольку, при воздействии на клетки врожденного иммунитета, индуцируются процессы, направленные против опухолей и инфекционных агентов. 38 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1) Варбанец Л.Д., Винарская Н.В. Структура, функция, биологическая активность эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Токсины Микрооргашзмов. 2002. - С. 1-7. 2) Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ.-М.: Мир, 2000.-592 с., ил. 3) Смолина Т. П., Горшкова Р. П., Назаренко Е. Л., Беседнова Н. Н. Ингибирование адгезии прокариотических и эукариотических клеток липополисахаридоми его фрагментами из морских протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens KMM 156 // Антибиотики и химиотерапия. 2005. - С.4-6. 4) Смолина Т.П., Черных С.В., Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л. Снижение адгезии микроорганизмов на клетках уроэпителия с помощью полисахарида, выделенного из морских протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 05/2006.Приложение к N3. - С.58-61. 5) Bowman J.P. Bioactive Compound Synthetic Capacity and Ecological Significance of Marine Bacterial Genus Pseudoalteromonas. Mar. Drugs 2007. С.220-241. 6) Edwin S., Van Amersfoort, Theo J. C., Van Berkel, Johan Kuiper. Receptors, Mediators, and Mechanisms Involved in Bacterial Sepsis and Septic Shock // Clin. Microbiol. Rev. 2003. 16(3): 379–414. 7) Franks A.E, Egan SG, Holmstrom C.G, James S.G, Lappin-Scott H. & Kjelleberg. Inhibition of fungal colonization by Pseudoalteromonas tunicata provides a competitive advantage during surface colonization // Applied and Environmental Microbiology. 2006. - С.79-87. 8) Lipscomb E.A, Mercurio A.M. Mobilization and activation of a signaling competent alpha6beta4integrin underlies its contribution to carcinoma progression // Cancer Metastasis Rev. 2006. 24 (3): 413–23. 9) Mazzone A, Ricevuti G. Leukocyte CD11/CD18 integrins: biological and clinical relevance // Haematologica. 1995. 80 (2): 161–75. 10) Vinay D.S, Kwon B.S. CD11c + CD8 + T cells: two-faced adaptive immune regulators // Cell. Immunol. 2010. 264 (1): 18–22. 39 11) http://www.coulterflow.com 12) http://cancer.grodno.by 13) http://www.referun.com 14) http://www.ibppm.saratov.ru 15) http://laba.my1.ru 16) http://www.medved.kiev.ua 17) http://molbiol.ru 18) http://www.novusbio.com 19) http://ru-russ.finanzalarm.com 40 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Таблица 1. Средняя интенсивность флюоресценции CD14 на поверхности нейтрофилов. Контроль 1 час инкубации 24 часа инкубации ЛПС О-ПС КОР 16,25 17,96 28,7 25,75 18,355 39,5 21,5 19 Таблица 2. Средняя интенсивность флюоресценции CD14 на поверхности моноцитов. Контроль 1 час инкубации 24 часа инкубации ЛПС О-ПС КОР 1204,5 1208 1851,5 1715,5 2042 1711,5 1214 1634 Таблица 3. Средняя интенсивность флюоресценции CD62L на поверхности нейтрофилов. Контроль ЛПС О-ПС КОР 1 час инкубации 167 171 45,71 15,4 24 часа инкубации 100 55 10,3 20,6 Таблица 4. Средняя интенсивность флюоресценции CD62L на поверхности моноцитов. Контроль 1 час инкубации ЛПС О-ПС КОР 70,56 52,57 3,5 2,9 10 15 17,68 20,69 24 часа инкубации Таблица 5. Средняя интенсивность флюоресценции CD62L на поверхности лимфоцитов. Контроль 1 час инкубации 24 часа инкубации ЛПС О-ПС КОР 50,24 54,83 67,09 65,43 43,4 69,33 40,54 66,31 41 Таблица 6. Средняя интенсивность флюоресценции CD11b на поверхности нейтрофилов. Контроль 1 час инкубации 24 часа инкубации ЛПС О-ПС КОР 1010 1207 4507 3788 739 1338 1652 1254 Таблица 7. Средняя интенсивность флюоресценции CD11c на поверхности нейтрофилов. Контроль ЛПС О-ПС КОР 1 час инкубации 101 98 373 327 24 часа инкубации 105 189 246 186 Таблица 8. Средняя интенсивность флюоресценции CD11b на поверхности моноцитов. Контроль 1 час инкубации 24 часа инкубации ЛПС О-ПС КОР 1506 1855 3669 3347 701 1842 2099 1823 Таблица 9. Средняя интенсивность флюоресценции CD11c на поверхности моноцитов. Контроль ЛПС О-ПС КОР 1 час инкубации 448 537 1057 937 24 часа инкубации 387 1247 1194 1253 Таблица 10. Средняя интенсивность флюоресценции CD11b на поверхности лимфоцитов. Контроль ЛПС О-ПС КОР 1 час инкубации 75,69 69,07 78,81 88,58 24 часа инкубации 37,29 6,91 70,4 51 42 Таблица 11. Средняя интенсивность флюоресценции CD11c на поверхности лимфоцитов. Контроль 1 час инкубации 24 часа инкубации ЛПС О-ПС КОР 12,14 13,8 16,6 13,53 7,88 8,99 19,5 17,37 Таблица 12. Средняя интенсивность флюоресценции CD54 на поверхности нейтрофилов. Контроль 1 час инкубации ЛПС О-ПС КОР 16,55 17,44 30,77 28,87 45 120 339 235 24 часа инкубации Таблица 13. Средняя интенсивность флюоресценции CD54 на поверхности моноцитов. Контроль ЛПС О-ПС КОР 1 час инкубации 99,8 113 208 292 24 часа инкубации 143 1276 3722 2507 Таблица 14. Средняя интенсивность флюоресценции CD54 на поверхности лимфоцитов. Контроль ЛПС О-ПС КОР 1 час инкубации 11,85 12,33 12,7 14,13 24 часа инкубации 17,06 14,51 25,17 18,09 43
