«Сейфуллин оқулары–11: Жастар және ғылым» атты Республикалықалық ғылыми-теориялық конференциясының материалдары = Материалы Республиканской научно-теоретической конференции «Сейфуллинские чтения–11: Молодежь и наука». – 2015. – Т.І, ч.1. – С. 152-155 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ В СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОПИСТОРХОЗА Киян В.С., Серикова Ш.С., Булашев А.К. Печеночный сосальщик Opisthorchis felineus относится к представителям семейства Opisthorchiidae класса Trematoda. Высокий уровень заболеваемости людей описторхозом, вызываемым трематодами семейства Opisthorchiidae, является важной социальной проблемой населения стран Азии и Восточной Европы. Наиболее мощный очаг описторхоза расположен в Обь-Иртышском бассейне, к которому относятся реки северных и восточных областей Казахстана [1]. Заражение описторхидами оказывает существенное влияние на здоровье людей, так как печеночные паразиты вызывают такие серьезные заболевания, как холангит, холецистит, дискинезию желчных протоков, панкреатит, цирроз печени и холангиокарциному [2]. Важную роль в борьбе с этой инвазией играют методы диагностики болезни. Достоверным методом диагностики является обнаружение яиц трематод в фекалиях или желчи, однако отрицательный результат не свидетельствует об отсутствии инвазии. В этой связи, в последнее время совершенствуются серологические методы диагностики, основанные на обнаружении антител к паразитам в сыворотке крови. Для этой цели используются антигенные препараты, полученные из гельминтов. Так, в качестве антигена для серодиагностики находят применение соматические антигены гельминта или его экскреторно-секреторные антигены (ЭС-Аг), вырабатываемые при культивировании паразита в условиях in vitro [3]. Однако, подготовка антигенов трематоды весьма трудоемкая работа в связи с малым выходом ЭС-Аг. Кроме того, качество образцов метацеркариев, необходимых для заражения лабораторных животных, непредсказуемы и разнообразны, так как зависит от состояния природных источников инвазированных рыб и от сезона года [4]. Изменчивость антигенов от партии к партии отрицательно сказывается на результатах серологической диагностики. Для решения обозначенной проблемы нами была изучена возможность использования антиидиотипических антител (АИАТ) вместо природных антигенов паразита в ИФА. Данный подход основан на общеизвестной теории идиотипических сетей, согласно которой сами антитела могут, в свою очередь, выступать как антигены. Для получения АИАТ были использованы моноклональные антитела (МКА) с авторским названием 4B3D9, имеющие специфичность к эпитопу белка ЭС-Аг с молекулярной массой 28 кД. Методом гибридомной техники были получены АИАТ к паратопу МКА, и как «внутренний образ» антигена описторхиса были испытаны в ИФА для обнаружения специфических антител. Антиидиотипы, имитируя детерминанты антигена гельминта, в непрямом варианте ИФА распознавались антителами сыворотки крови мышей, иммунизированных ЭС-Аг O. felineus. Кроме того, антиидиотипы обладали иммуногенными свойствами, т.е. вызывали образование антител, вступающих в реакцию с гомологичным антигеном паразита. Диагностическая ценность антиидиотипов была апробирована в непрямом ИФА с использованием образцов сывороток крови собак, экспериментально зараженных метацеркариями паразита, и сывороток крови людей, подозреваемых в заражении описторхозом. Результаты показали, что антитела больных описторхозом собак взаимодействуют как с ЭС-Аг взрослого паразита, так и антиидиотипами. Причем, в лунках, сенсибилизированных АИАТ антитела детектировались в более высоких титрах. При серологических исследованиях крови 60 человек на описторхоз в непрямом ИФА с использованием ЭС-Аг положительные результаты были получены у 60% пациентов. Следует отметить, что чувствительность теста в случае применения в нем АИАТ вместо ЭС-Аг была выше на 16,7%. Это, видимо, объясняется лучшей адсорбцией гомогенных антиидиотипов твердой фазой по сравнению со сложным белковым комплексом ЭС-Аг. Использование непрямого ИФА для обнаружения антител, специфичных к описторхису, требует наличия различных конъюгатов в зависимости от вида исследуемого индивидуума. В этой связи, нами испытан конкурентный ИФА, основанный на применении одного лишь конъюгата - меченных МКА 4B3D9, имеющих специфичность к ЭС-Аг описторхиса. При этом конъюгат вступал в конкуренцию с антителами исследуемой сыворотки крови за связывание с иммуносорбентом АИАТ. Результатты иммунанализа образцов крови экспериментально зараженных собак показали возможность замены антигена паразита на антиидиотипы, что, несомненно, позволит повысить специфичность тест-системы и стандартизировать основные реагенты диагностикума. Другим подходом, имеющим большую научную и практическую значимость, является использование рекомбинантного антигена в серологической диагностике описторхоза. Описаны несколько рекомбинантных белков описторхид O.viverrini и Clonorchis sinensis, полученных в прокариотической системе [5-6]. Наибольший интерес представляют работы, где авторы, используя протеомные данные и результаты скрининга библиотек кДНК, выявили гены возможных белков-иммуногенов O. viverrini и C. sinensis и провели конструирование и клонирование плазмид, несущих эти гены. Далее, были получены рекомбинантные аналоги этих белков, и методами иммуноблотта и ИФА было проведено тестирование взаимодействия позитивных сывороток от пациентов больных описторхозом с этими рекомбинантными белками. Полученные результаты указывают на возможность использования данных рекомбинантных аналогов белков этих трематод в иммунодиагностике [7]. Laha T et al. (2008) получили рекомбинантную аспарагинил эндопептидазу О. viverrini. Однако, широкомасштабное использование этого антигена для серодиагностики затруднено трудностями в рефолдинга рекомбинантный протеазы к естественной, растворимой конформации [5]. Jittiyawadee S et al. (2012) получили рекомбинантную форму протеазы катепсина В1 О. viverrini и доказали возможность использования его в ИФА для серодиагностики описторхоза [8]. Известно, что катепсин B1 O. viverrini присутствует в экскреторно-секреторном продукте, выделяемом паразитом культивируемых в условиях in vitro. Eursitthichaia V. Et al. (2010) получен рекомбинантный аналог другого белка также присутствующего в метаболите O.viverrini - рекомбинантного глутатионтрансфераза [9]. К сожалению, в литературе нет сведений о получении и использовании рекомбинантных белков O.felineus в разработке серологических методов диагностики болезни, за исключением работы Разумова И.А. и соавт.(2012) [10]. Им определена возможность использования в иммунодиагностике описторхоза рекомбинантного аналога белка легумаин. Рекомбинантный белок, клонированный и экспрессированный в E. coli, в ИФА продемонстрировал различие в иммунореактивности между сыворотками больных и здоровых индивидуумов. Авторы считают, что этот рекомбинантный аналог может быть использован для совершенствования иммунодиагностики описторхоза, вызываемого O. felineus, а также для получения специфических антител к этому паразиту и генно-инженерных вакцин. Ген легумаин C. sinensis был экспрессирован с использованием системы экспрессии QIAExpress фирмы QIAGEN [11]. При использовании в иммунодиагностике рекомбинантного аналога белка C. sinensis, полученного с помощью прокариотической системы экспрессии, была показана высокая чувствительность и специфичность взаимодействия человеческих сывороток с указанным белком: 71,4 и 100% соответственно. К настоящему времени практически нет данных об иммунном ответе организма-хозяина на отдельные белки-антигены O.felineus. Известны мажорные антигены O.viverrini и других трематод семейства Opisthorchiidae, вызывающие сильный гуморальный иммунный ответ у человека. К ним относятся вителлин [12] и катепсин F [13]. А.А.Носов и соавт. (2012) исследовали антигенные и функциональные свойства мажорных белков вителлина и катепсина F O.felineus. Авторами установлено антигенность рекомбинантных белков в отношении сывороток, полученных от людей, больных описторхозом [14].Таким образом, современные данные в области совершенствования диагностики описторхоза свидетельствуют о перспективности изучения иммуногенности отдельных белков, имеющихся в составе ЭС-Аг O. felineus, и создания высокоспецифичных и эффективных иммунологических тест-систем на основе рекомбинантных антигенов описторхиса. Список литературы 1. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2008 году».- М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.- C. 349–350. 2. Sripa B., Kaewkes S., Sithithaworn P. et al. Liver Fluke Induces Cholangiocarcinoma // PLoS Medicine. 2007. -Vol. 4.-P.1148-1155. 3. Nockler K., Dell K., Schuster R., Voigt W. P. Indirect ELISA for the detection of anti-bodies against Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) and Metorchis bilis (Braun, 1790) in foxes // Veterinary parasitology.- 2003.-Vol.110.- P.207-215; 4. Wongratanacheewin S, Sermswan RW, Sirisinha S. Immunology and molecular biology of Opisthorchis viverrini infection// Acta. Trop.- 2003.-Vol.88.-P.195–207. 5. Laha T., Sripa J., Sripa B. et al. Asparaginal endopeptidase from carcinogenetic liver fluke O.viverrini and its potential for serodiagnosis // Int. J. Infect. Dis.- 2008.- Vol. 12 (6).- P.49-59. 6.Li S., Shin J.G., Cho P.Y. et al. Multiple recombinant antigens of C.sinensis for serodiagnosis of human clonorchiasis // Parasitol. Res.- 2011.- V.108.- P.1295-1302. 7. Zhao Q.P., Moon S.U. et al. Evaluation of Clonorchis sinensis recombinant 7-kilodalton antigen for serodiagnosis of clonorchiasis // Clin. Diagn. Lab. Immunol.-2004.-Vol.11(4).- P. 814—821. 8. Jittiyawadee S., Brindley P., Sripa B., et al. Evaluation of liver fluke recombinant cathepsin B-1 protease as a serodiagnostic antigen for human opisthorchiasis// Parasitology International.- 2012.-Vol.61.-P. 191–195. 9. Eursitthichaia V., Viyananta V., Tesanab S. et al. Opisthorchis viverrini: Evaluation of 28 kDa glutathione S-transferase as diagnostic tool in human opisthorchiasis //Acta Tropica.-2010.-Vol.114.-P.76–80. 10. Разумов И.А., Львова М.Н., Пономарева Е.П. и др. Антигенные свойства рекомбинантного аналога белка легумаин трематоды Opisthorchis felineus, вызывающей описторхоз у человека//Бюллетень сибирской медицины-2012.- № 6.-С.166-172. 11. Ju J.W., Joo H.N. et al. Identification of a serodiagnostic an-tigen, legumain, by immunoproteomic analysis of excretory-secretory products of Clonorchis sinensis adult worms // Proteomics.- Vol. 9 (11).- P.3066-3144. 12. Homwutthiwong K., Meepol A., Grams R. Cloning, characterization, and expression of vitelline protein BI and its encoding gene in the liver fluke F. gigantica // Southest Asian J. Trop. Med. Public Health.- 2009.- Vol.40.- № 2.- P.199-210. 13. Pinlaor P., Kaewpitoon N., Laha T., Sripa B. et al. Cathepsin F cysteine protease of the human liver fluke, O. viverrini // PLoS Negl. Trop. Dis.- 2009.- Vol. 3.- P.398. 14. Носова А. А., Белавин П. А., Афонников Д. А. Компьютерный и экспериментальный анализ антигенных свойств вителлина и катепсина F O. felineus //Медицинский академический журнал.- 2012 г.- Т.12.- № 4.- С.33-35.