Руководство по использованию диагностики IDEXX (104854-00)
реклама
Всегда уверенный результат!TM Тест-системы IDEXX – эффективный инструмент в диагностике, мониторинге и профилактике болезней Сомнения не приемлемы! Содержание - Возможности и применение тестов IDEXX 1 - Компоненты ИФА набора IDEXX 2 - Информация из протокола исследования IDEXX 2 1. Оценка положительных и отрицательных контролей 4 2. Характеристика отдельных титров и титрогрупп 5 3. Значения коэффициента вариации %CV, среднего титра антител 5 (AMean/GMean), стандартного отклонения (SD) 4. Результаты исследования 6 - Отбор проб и количество образцов для ИФА исследований 7 - Расчет и применение базовых линий титров антител 8 - Применение Формулы Девентер для расчета даты вакцинации 9 Возможности и применение тестов IDEXX Иммуноферментный анализ занял прочное положение и является одним из основных методов в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний и мониторинге поствакцинального иммунитета в птицеводстве. Но, как известно, результаты - результатам рознь и достаточно часто при выборе сомнительных тест-систем ИФА возникают вопросы по достоверности полученных результатов. Поэтому основополагающим моментом для получения истинных результатов является выбор тест-набора обладающего высокой специфичностью, чувствительностью и уверенной воспроизводимостью. При условии высоких характеристик теста и правильности выполнения самой процедуры исследования лаборатории и практикующие ветеринарные специалисты могут рассчитывать на получение достоверных результатов, которым можно доверять. 1 Компания IDEXX является родоначальницей и мировым лидером в разработке и производстве ИФА наборов для широкого применения как в научных учреждениях и высокотехнологичных лабораториях так и в условиях производства. Тесты IDEXX отвечают самым высоким мировым стандартам и применяются в следующих целях: • • • • • • • • Диагностика возбудителя инфекции, определение сущности и времени эпизоотологического процесса Мониторинг ответных титров после вакцинации и контроль ее качества Выявление повышенных титров после встречи с полевым вирусом Определения статуса стада (свободы от инфекции), мониторинг SPF стад Контроль уровня материнских антител у цыплят для выбора оптимального времени вакцинации Построение базовых линий для стад различного производства и направления выращивания Контроль при транспортировке и переработке птицы Определение качества и характеристик вакцин при их разработке и производстве Компоненты ИФА набора IDEXX Типичный набор компонентов IDEXX для ИФА исследований содержит инструкцию к применению и включает все необходимые реагенты для проведения теста. При этом набор очень надежен в использовании, а постановка теста проста и пошагово представлена в прилагаемой инструкции. Планшеты, покрытые антигеном/антителами Положительный и Отрицательный Контроли Раствор для Разведения Проб Конъюгат Субстрат (TMB) Стоп-Раствор Промывочный Концентрат Перед проведением исследования тест-набор нужно просто нагреть до комнатной температуры. Тест наборы IDEXX сертифицированы по международному стандарту ISO 9001:2008 и являются признанным эталоном для ИФА во всем мире. В настоящей инструкции будут рассмотрены все важные значения, на которые следует обращать внимание при чтении результатов исследований и непосредственно интерпретация полученных данных. Информация из протокола исследования IDEXX Рассмотрим пример протокола исследований на IBD. Это стандартный протокол, составляемый автоматически программами xChek и xChekPlus, предназначенными для считывания и обработки результатов исследования. Протокол включает в себя полный комплекс значений, которые можно опционально убирать или добавлять в отчет при необходимости. При этом сам протокол состоит из графической и числовой частей. 2 IDEXX Laboratories, Inc. One IDEXX Drive Westbrook, ME 04092 USA 18.11.2012 Место для Логотипа Анализ отчета о группе проб Количество ПЛОЩАДКА T03, СОВВ, CB 6-0-IBD Кол-во 23 GMean 871 АMean 1246 SD 3 738 % CV 59.2 Мин. 17 Макс. 2695 Спец. АК Дата 2 Тест Дата IBD 28-06-2010 Тест Титрогруппы Титрогруппы Кол-во Ср.ариф 23 Возр а 6-0 % CV 1246 IBD – 18.11.2012 - BS Neg Neg Pos Pos 1 Тест ID Комментарии O.D. 0.045 0.041 0.292 0.298 0.228 Nr.пробы Комментировать ПЛОЩАДКА T03, СОВВ, Здесь вносятся комментарии CB 6-0 Серия - KH 502 Срок годности 12.03.2014 59.2 ПЛОЩАДКА T03, СОВВ, CB 6-0 - 10.06.28-001 Лунка A1 A2 A3 A4 E2 18.11.2012 Вид S/P Здесь вносятся комментарии Титр Группа Log2 Результат 4 1 123 Chicken 0.684 1514 2 11 Pos E3 E4 E5 E6 E7 E8 0.148 0.311 0.122 0.302 0.046 0.065 4512 673 9874 685 23 4567 Chicken Chicken Chicken Chicken Chicken Chicken 0.388 0.991 0.292 0.957 0.011 0.081 817 2268 599 2185 17 149 1 3 1 3 0 0 10 11 9 11 4 7 Pos Pos Pos Pos Neg Neg 8 9 10 11 12 E9 E10 E11 E12 F1 0.247 0.224 0.152 0.120 0.289 8 9 10 11 12 Chicken Chicken Chicken Chicken Chicken 0.754 0.669 0.403 0.285 0.909 1684 1478 851 582 2066 2 2 1 1 3 11 11 10 9 11 Pos Pos Pos Pos Pos 13 14 15 16 17 18 F2 F3 F4 F5 F6 F7 0.131 0.065 0.244 0.117 0.189 0.161 13 14 15 16 17 18 Chicken Chicken Chicken Chicken Chicken Chicken 0.325 0.081 0.743 0.274 0.540 0.436 674 149 1657 558 1170 927 1 0 2 1 2 1 9 7 11 9 10 10 Pos Neg Pos Pos Pos Pos 19 20 21 22 23 F8 F9 F10 F11 F12 0.268 0.285 0.252 0.168 0.357 19 20 21 22 23 Chicken Chicken Chicken Chicken Chicken 0.832 0.895 0.773 0.462 1.161 1874 2029 1729 988 2695 2 3 2 1 3 11 11 11 10 11 Pos Pos Pos Pos Pos 2 3 4 5 6 7 AMean GMean SD %CV Мин. Макс. S/P 0.563 0.412 0.315 55.9 0.011 1.161 Титр 1246 871 738 59.2 17 2695 Log2 10 10 2 16.7 4 11 3 1. Первое на что после проведения теста необходимо обращать внимание - это на значения положительных и отрицательных контролей. Совпадение значений контролей с таковыми в сертификате анализа набора или нахождение их в допустимых границах говорит о правильности постановки теста с технической точки зрения и о том, что сам тест-набор сработал правильно. Сертификат анализа к соответствующей серии набора можно загрузить в любое время с сайта IDEXX или затребовать у дистрибуторов IDEXX. Сертификат к набору на IBD: Mean negative control optical density (ср. значение ОП отрицательного контроля) = 0.038 Mean positive control optical density (ср. значение ОП положительного контроля) = 0.291 Если значения контролей находятся вне допустимого диапазона, анализ считается не действительным и его нужно повторить. Перед повторной постановкой необходимо внимательно пересмотреть методику проведения теста и исключить какие-либо технические ошибки. Тест-наборы IDEXX отличаются высокой стабильностью реагентов и как следствие – отличной воспроизводимостью результатов исследований, получаемым одним и тем же набором в период всего срока его годности. На основании всего выше изложенного применение референтных контролей для рутинных исследований на производстве с использованием наборов IDEXX не является необходимостью. Это позволяет экономить средства и снижает стоимость исследований. Если имеется потребность в применении референтных контролей (например: требование законодательства, производство вакцин) всегда необходимо использовать контроли независимого и авторитетного производителя! Для загрузки сертификата анализа для набора пройдите по ссылке: 4 http://www.idexx.com/view/xhtml/en_us/livestock-poultry/certificates-of-analysis.jsf?SSOTOKEN=0 Откроется страница, на которой нужно будет выбрать «Poultry» – птица, далее в окне «Select Products» указать о каком наборе идет речь и затем в строке «Enter Lot Number» внести номер серии набора. После нажатия на кнопку «Request Certificate» сертификат можно будет сохранить или сразу прочитать. 2. Следующим важным фактором при чтении и интерпретации результатов теста является расположение титрогрупп на горизонтальной прямой графика. В зависимости от величины титра антител конкретная проба распределяется в конкретную титрогруппу. В числовой части отчета можно проследить - какая проба была распределена в какую титрогруппу. Если при исследовании на IBD величина уровня антител в исследуемой пробе находится от 0 до 397 – то проба попадает в титрогруппу «0» и считается отрицательной. Если уровень антител выше порогового значения 397, но ниже 1000, то проба попадает в титрогруппу «1» и должна рассматриваться как положительная, что указывает на вакцинацию или контакт с возбудителем IBD. Чем выше уровень антител в исследуемых пробах, тем сильнее в случае IBD титрогруппы будут сдвинуты в правую сторону. Количество проб в титрогруппе считывается по вертикальной оси графика. Распределение титров антител в титрогруппах при тестировании проб на IBD: 0 6 0 – 397 1 12 5001 – 6000 7 398 – 1000 2 6001 – 8000 8 1001 – 2000 3 8001 – 10000 2001 – 3000 20001 – 22000 15 10001 – 12000 10 3001 – 4000 5 18001 – 20000 14 9 4 16001 – 18000 13 22001 – 24000 16 12001 – 14000 11 24001 – 28000 17 4001 – 5000 14001 – 16000 28001 – 32000 Титрогруппа «0» = отрицательная; титрогруппа ≧ «1» положительная Для некоторых тестов пороговое значение несколько выше; также у некоторых тестов калькуляция и интерпретация результатов несколько отличается от основной массы. Поэтому, как и для безукоризненной постановки теста, для правильного чтения результатов исследования всегда необходимо внимательно читать инструкцию, прилагаемую к набору. Вы также можете всегда обратиться к сотруднику фирмы IDEXX или ее представителям с интересующими Вас вопросами. 3. - %CV. Большое значение при чтении результатов исследований имеет коэффициент вариации - %CV. Этот параметр рассчитывается по формуле %CV = (SD/средний титр) x 100 и указывает на однородность титров антител у исследуемого поголовья. Результаты с низким %CV (<40%) – указывают на то, что птица показывает схожий, однородный иммунный ответ. Результаты с высоким %CV (>40%) – говорят об отклонение (вариации) от нормы и требуют особенного внимания и рассмотрения. 5 Низкий %CV, например, может свидетельствовать о качественно проведенной вакцинации или о заканчивающемся эпизоотическом процессе. Напротив, высокий %CV может указывать на вспышку инфекции (когда имеется птица с различным уровнем тиров антител), на неправильно проведенную вакцинацию с техническими ошибками или на занос полевого возбудителя приблизительно в период вакцинации. При проведении тестирования поголовья для определения качества проделанной вакцинации и напряженности иммунитета низкий %CV и отсутствие титрогруппы «0» свидетельствует о том, что все 100% поголовья дали положительный иммунный ответ. Это очень важно в особенности при проведении первой вакцинации на IBD. - Средний титр антител (AMean/GMean). Следующим важным показателем, отображенным в отчете IDEXX, является средний титр антител у исследуемого поголовья и рассчитывается по формуле y = n1 + n2 + n3 + … nx / x. Этот параметр характеризует, например, уровень иммунного ответа птицы на вакцинацию и может говорить о качестве самой вакцины. При этом необходимо помнить, что величина титров антител зависит от многих факторов: от возраста птицы, типа вакцины, кратности и метода вакцинации и т.д. Так при контроле поствакцинального иммунитета уровень антител выше среднего ожидаемого значения может свидетельствовать о заносе и циркуляции в стаде возбудителя инфекции. Случай, в котором полученный средний титр антител был ниже ожидаемого значения, может свидетельствовать о том, что вакцинация была проведена с какими-либо техническими ошибками, использовалась некачественная вакцина, была не правильно проведена подготовка/разведение самой вакцины перед применением или не был правильно учтен титр материнских антител и целевой титр применяемой вакцины. Низкий %CV и высокое значение среднего титра антител (титрогруппы будут сдвинуты вправо), находящимся в ожидаемом диапазоне, говорит о высококачественной вакцинации. При помощи тестов IDEXX вы можете легко контролировать уровень материнские антител на IBD, а «Формула Девентер», встроенная в программное обеспечение IDEXX, позволяет легко высчитывать дату вакцинации с учетом использования конкретной вакцины. Необходимо отметить, что «Формула Девентер» была разработана фирмой «Девентер» на основании использования тестов IDEXX и применима только для обсчета данных, полученных в тестах IDEXX. Применение этой формулы при использовании тестов других фирм приводит к ошибочным результатам при расчете дня вакцинации и вследствие этого иммунной незащищенности птицы от возбудителя заболевания. - Стандартное отклонение (SD). SD - это статистическое измерение степени вариации от значения среднего титра. Большое SD указывает на сильную вариацию от среднего значения. Этот параметр рассчитывается по формуле SD = [ (x – y)2]½ и очень важен для расчета ожидаемых базовых значений титров антител для оценки поствакцинального иммунитета конкретного стада. Расчет собственных базовых линий и их применение будет рассмотрено позже. Также полученное значение стандартного отклонения используется при расчете %CV. 4. Далее, после обсчета программой полученных оптических плотностей, в числовой части протокола отображаются количественные результаты исследования - S/P соотношения и титры антител в пробах. Пороговые значения этих показателей всегда четко указаны в инструкции соответствующего набора и должны учитываться при чтении и интерпретации результатов. Так для теста на IBD пробы сывороток с S/P соотношением меньшим или равным 0.20 и титру антител меньшим или равным 396 считаются отрицательными. Большие значения этих показателей указывают на положительный результат. 6 Помимо этого в протоколе отображены качественные результаты (Pos/Neg) теста, опирающиеся на количественные вычисления и свидетельствующие также о наличии или отсутствии специфических антител в сыворотках. При нумерации проб можно проследить, какая конкретно сыворотка является положительной или отрицательной. Таким образом, тест-протокол IDEXX отображает все требуемые параметры и результаты, необходимые для заключения об эпизоотическом состоянии и иммунном статусе поголовья и тем самым значительно облегчает работу ветеринарных специалистов и лабораторных сотрудников. Общепризнанная практика оценки результатов серологического исследования отображается в следующем алгоритме действий: - При наличии одной положительной пробы все исследуемое стадо считается положительным. - Полученные положительные пробы необходимо тестировать повторно и если при повторе результат будет отрицательным, то все исследуемое поголовье будет также считаться отрицательным. - Если при повторе снова имеются положительные пробы, то исследование нужно повторить примерно через неделю, взяв повторно пробы крови (парные сыворотки). Отрицательный результат будет распространяться на все стадо. - Если снова была обнаружена хотя бы одна положительная проба, исследование нужно повторить, используя другой метод диагностики. Отбор проб и минимальное количество образцов для ИФА исследований Большое значение для статистической достоверности исследований имеет правильность проведения выборки и количество проб для тестирования в ИФА. При правильном проведении отбора у каждой птицы в стаде должна быть одинаковая вероятность быть выбранной для исследования. Случайность выборки усредняет эффект неконтролируемой вариации. Например, хорошо зарекомендовал себя метод конверта. Согласно этому методу отбор птицы проводят по двум диагональным линиям через весь птичник: Обычно отбирают 24 пробы, по 12 птиц на каждой диагонали через одинаковые интервалы. Если, например, диагональ равна 24 м отбирают по 1 пробе каждые 2 м. При отборе проб со стеллажей или гнезд пронумеровывают все стеллажи/гнезда и используют генератор случайных чисел для выбора 24 случайных номеров. Используя эти номера для выбора, отбирают пробу от одной птицы каждого из выбранных стеллажей/гнезд. Далее для исследования берут 23 образца, т.к. это количество является статистически обоснованным при поголовье родителей до 5,000 и бройлеров до 10,000. Краткое объяснение в следующей таблице: 7 Образцы % CV (коэф.вар.) до 20% % CV (коэф.вар.) более 20% 46 100 0 23 100 0 15 66 33 10 56 44 Исследование Др. Лестер, Государственный университет Мисисиппи Соблюдение правильности выборки птицы и исследование статистически достоверного количества проб (минимум 23 или более). Это позволяет по результатам исследования судить о состоянии всего поголовья конкретного корпуса/птичника. Расчет и применение базовых линий Программное обеспечение IDEXX xChek позволяет считывать результаты теста, обрабатывать их, выдавать в виде протокола исследований, сохранять и накапливать в памяти компьютера, а также пересылать по электронной почте в различных файловых форматах. Это дает возможность ветеринарному специалисту и лабораторному сотруднику в любое время поднять и просмотреть данные исследований, которые были сделаны в прошлом. Также xChek дает возможность обсчитать имеющиеся данные исследований на предмет напряженности поствакцинального иммунитета и вывести результаты расчетов в виде базовых линий. Это возможно сделать легко и быстро в программе как в ручном, так и в автоматическом режиме. Важным моментом является то, что сверку полученных поствакцинальных титров антител конкретного стада нужно проводить только с базовыми значениями, полученными для этого стада или хозяйства. Это объясняется тем, что ожидаемые уровни титров антител могут очень отличаться от хозяйства к хозяйству и зависят от эпизоотической ситуации на предприятии, от породы/кросса птицы, направления выращивания, возраста вакцинации, типа самой вакцины, метода и кратности вакцинации и многих других аспектов. Поэтому IDEXX всегда рекомендует обсчитывать и создавать свои собственные базовые линии для конкретного хозяйства. После того, как базовые линии были созданы, они остаются в программе и при соответствующей установке используются ею автоматически для оценки проведенной вакцинации и ситуации в поголовье в целом. Приведу повторный, но наглядный пример: если полученные уровни антител находятся ниже вычисленных базовых линий – это может говорить о неправильно проведенной вакцинаций, возможных проблемах в технике ее выполнения или о плохом качестве вакцины. Если же поствакцинальные титры антител оказались выше ожидаемого значения базовой линии – это должно настораживать и может указывать на занос и циркуляцию в стаде полевого возбудителя инфекции. Рассчитывайте свои собственные базовые линии, и если у Вас возникнут вопросы и будет нужна помощь при расчетах, сотрудники IDEXX и представители IDEXX в России готовы в этом помочь и дать необходимую информацию. Помните, что только при соблюдении всех рекомендаций и правил, полученные базовые линии будут достоверными и могут применяться для конкретного поголовья. 8 Применение Формулы Девентер для расчета даты вакцинации Нередко в отношении болезни Гамборо ставится вопрос о времени вакцинации поголовья, особенно при ухудшении эпизоотической обстановки в хозяйстве или регионе, смене вакцины, введении нового направления выращивания и т.д. При этом мероприятия специфической профилактики являются основополагающими для защиты стада от полевой инфекции. Важным моментом для вакцинирования являются ровные, приблизительно одинакового уровня титры материнских антител у цыплят. Их уровень всегда зависит и будет выше, если родительское стадо было привито правильно и использовались качественные вакцины. При этом иммунизация инактивированными вакцинами на масляной основе дает более высокие уровни антител, чем вакцинация живыми вакцинами. Когда же лучше всего (в каком возрасте?) вакцинировать птицу? Мы знаем, что действие живой вакцины против IBD будет нейтрализовано материнскими антителами, если их уровень слишком высок. В случае, если уровень материнских антител снизился, но целевой титр применяемой вакцины не соответствует этому уровню, вакцина снова будет нейтрализована материнскими антителами и ожидаемой иммунной защиты птица не приобретет. С другой стороны, если Вы будете слишком долго ждать, пока уровень материнских антител последнего цыпленка пойдет на спад, то стадо может остаться незащищенным от раннего инфицирования. К тому же, когда существует угроза заноса в стадо полевого вируса, вакцинацию следует проводить как можно быстрее. Поэтому крайне важно проводить периодические исследования для определения серопрофиля поголовья птицы и исходного уровня материнских антител. Тесты IDEXX являются прекрасным инструментом мониторинга и наилучшим выбором для этих целей. Зная закономерность снижения исходных титров материнских антител, можно установить, когда их уровни достигнут такого значения, позволяющего приступить к вакцинации. На этом основании фирма «Девентер» разработала, используя тесты IDEXX, Формулу Девентер, преимущества которой достаточно хорошо описаны в литературе. Но необходимо еще раз подчеркнуть, что применение Формулы Девентер обосновано и возможно только для тестов IDEXX! Снижение исходных титров материнских антител (период полураспада) отличается у бройлеров, родителей и несушек и зависит от уровня метаболизма и интенсивности роста птицы. Период полураспада антител: - для бройлеров составляет 3-3,5 дня, - для родительского стада – 4,5 дня, - и для несушек – 5,5 дней. Исходный титр материнских антител остается примерно таким же в течение первых четырех дней жизни за счет абсорбции желтка и поступления антител в кровь. Начиная с 4-го дня титр уменьшается вдвое, т.е. на 1log2 за один период полураспада. В Формуле Девентер учтен этот эффект 4-го дня. Большим преимуществом при применении тестов IDEXX с последующим расчетом дня вакцинации по Формуле Девентер являются гибкие сроки отбора проб. Пробы можно отбирать с 1 по 10 день после выведения. У птицы с предполагаемыми высокими титрами, а именно у несушки, рекомендуется производить отбор образцов крови на 7-14 день. 9 Формула Девентер рассчитана не на средний титр стада, а на титр, когда определенный процент стада может быть успешно провакцинирован. Нет необходимости ждать «до последнего цыпленка», поскольку вакцина будет распространяться еще несколько дней после вакцинации. Имейте в виду, что вакцины против IBD легче распространяются, когда птица находится на напольном содержании, а не в клетках. Если уровень исходных материнских антител однороден (%CV ＜30%) и эпизоотическая ситуация по заболеванию спокойная, то будет достаточна однократная вакцинация против болезни Гамборо. В этом случае по умолчанию процент охвата стада по Девентеру в программе xChek составляет 75%. К сожалению, в России IBD встречается практически повсеместно и занос полевого вируса велик. К тому же достижение однородных титров трудоемко и не всегда выполнимо. Исходя из этого и учитывая низкую однородности титров (при %CV ＞30%) рекомендуется двукратная вакцинация и при расчете дня вхождения с вакциной по Формуле Девентер указывать охват поголовья, к примеру, 20% и 70% для его успешной вакцинации. В зависимости от напряженности эпизоотической ситуации и необходимости более ранней вакцинации поголовья рекомендуется использовать вакцины с более высоким целевым титром, определяемым производителем. При этом вакцины по своему титру классифицируются следующим образом: - мягкая вакцина - титр 125, - средняя - титр 150, - и средняя плюс - титр 500. Более «горячие вакцины» чем «средние плюс» сами по себе иммуносупрессивны, так как после их применения бурса не восстанавливается в полной мере. При необратимых повреждениях бурсы как иммунного органа значительно снижается не только иммунный статус птицы, но и продуктивные показатели стада, что в условиях современного птицеводства абсолютно не приемлемо (информация «Intervet International B.V.»). Взяв во внимание все перечисленные факторы, и выбрав вакцину с необходимым целевым титром, вносим соответствующие данные в формуляр программы xChek® или xChekPlus® и обсчитываем результаты исследования. 1. Указываем расчет по Формуле Девентер 2. Указываем обсчет конкретного исследования 3. Вносим процент охвата поголовья (в данном случае двукратная вакцинация, т.к. %CV 44,8) 4. Выбираем день отбора проб (день после выведения) 5. Вносим период полураспада (в данном случае 3, т.к. исследовались бройлеры) 6. Указываем целевой титр применяемой вакцины Результаты программа выдает в виде сводной таблицы: 10 Здесь указаны все исходные данные, необходимые для обсчета, а также количество дней ожидания с момента взятия крови и до первой и второй вакцинации. Другими словами мы получаем дни ожидания, по истечению которых уровень антител упадет до нужного нам значения - для первой группы (охват 20%) = 15 дней и второй группы (охват 70%) = 19 дней, при котором вакцина сможет работать, приведет к образованию антител против возбудителя и создаст иммунную защиту. При возникновении каких-либо вопросов, связанных с использованием тестов IDEXX, прошу обращаться по указанным в самом начале телефонам или по электронной почте, а также связываться с дистрибуторами, представляющими IDEXX на территории Российской Федерации. С уважением, Алексей Колбасенко За дополнительной информацией обращайтесь к представителю IDEXX на территории России и стран СНГ по электронной почте: alexey-kolbasenko@idexx.com или по телефонам: +7-985-367-570 и +49-151-4671-9244. ©2014 IDEXX Laboratories, Inc. Все права защищены. • 104854-00 *IDEXX и Test With Confidence являются торговыми марками или зарегистрированными торговыми марками IDEXX Laboratories, Inc. или ее филиалов в США и/или других странах. 11
