Е.Н. Россинец, А.А. Белов, Н.С. Марквичев, А.В. Васильева, Н.П. Мышенков

УДК 579.087.9+543.95
Е.Н. Россинец, А.А. Белов, Н.С. Марквичев, А.В. Васильева, Н.П. Мышенков*
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
Государственное унитарное предприятие «Тепличный», Владимир, Россия
*
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАСТВОРОВ НЕКОТОРЫХ
ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА СПОРЫ ГРИБА РОДA
PYTHIUM
Influence of solutions of trypsin, chemtrypsin, lipases, lysozyme, lizoamidazy, and proteolytic complex from hepatopancreas of a crab and their mixes on disputes and a mushroom of sort
Pythium is investigated. Concentration dependence of action of lysozyme, lizoamidazy and a proteolytic complex from hepatopancrea of a crab is established. Obtained given objasne the presence
chitinolytic activities in the given preparations of enzymes.
Исследовано воздействие растворов трипсина, химотрипсина, липазы, лизоцима,
лизоамидазы, протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба и их смесей на споры
и гриб рода Pythium. Установлена концентрационная зависимость действия лизоцима, лизоамидазы и протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба. Полученные данные
объяснены наличием хитинолитических активностей в данных препаратах ферментов.
Из числа возбудителей болезней растений грибы стоят на первом месте, далеко оставляя за собой вирусы и особенно бактерии. Эта исключительная роль грибов объясняется их высокой биологической активностью,
наличием экзоферментов, которые способны разрушать стенку растительных клеток. По существу, соответствующие ферменты можно рассматривать
как факторы агрессии и патогенности грибов. С их помощью грибы вторгаются в растения, получают от них питательные вещества и размножаются на
их тканях или на поверхности растений. У некоторых грибов во время прорастания спор образуются особые структуры, с помощью которых гриб проникает в растение, т.е. фактически инфицирует его. Этим грибы отличаются
от бактерий и вирусов, лишенных способности проникать в неповрежденные
растения по тому же механизму. Ущерб, наносимый культурным растениям
грибами, ежегодно исчисляется миллиардами рублей. Даже самые осторожные оценки свидетельствуют об уничтожении грибными болезнями 10-20%
потенциального урожая [1].
Мучнистая роса – широко распространенная и вредоносная болезнь
многих культур. Заболевание поражает растения, как в открытом, так и в
защищенном грунте во все фазы развития. Возбудители мучнистой росы –
грибы Erysiphe achoracearum D C. f cucurbitacearum Pot. и Sphaerotheca fuligenea Poll f cucurbitae Jacz. – развиваются только на живых растениях.
Мучнистый налет на пораженных участках растений состоит из поверхностной грибницы, на которой образуются органы спороношения патогенна –
конидиеносцы с цепочками конидий. Последние распространяются в период
вегетации растений, и гриб формирует более десяти генераций [2].
Применение химических препаратов для борьбы с с/х вредителями не
всегда оказывается эффективным, так как у объектов воздействия быстро
24
вырабатывается резистентность к таким препаратам, а это требует увеличение дозы препарата и постоянной ротации препарата. Кроме того, не обладая избирательным действием, химические инсектициды вызывают гибель
полезных микроорганизмов, а накопление инсектицида в природных экосистемах (воде, почве) определяет их экологическую опасность. Разработка
биологических препаратов избирательного и длительного действия является
актуальной задачей, решение которой позволит снизить экологическую
нагрузку и экономические затраты [3].
Как известно из литературы [1,4-12] клеточная стенка грибов и их
спор состоит из глюкана, количество которого у мицелиальных форм может
составлять 70-90 % массы стенки. В стенках грибов глюканы существуют
как самостоятельные структурные полимеры, а также в виде комплексов с
хитином. Исходя из представлений, что глюкан-хитиновый слой клеточной
стенки прикрыт от воздействия глюканаз комбинированным слоем протеина
и липидов, многие исследователи считают протеазу необходимым ферментом для осуществления лизиса клетки. В составе комплекса глюканаза может выполнять функцию фермента, гидролизующего ригидный глюкановый
слой клеточной стенки, а протеаза - роль фермента, воздействующего на
матриксный маннопротеиновый компонент, который препятствует проникновению глюканазы внутрь клеточной стенки и контакту с субстратом. Несмотря на противоречивые сведения о роли протеазы в лизисе клеточной
стенки, анализ литературных данных позволяет с определенной уверенностью считать, что протеолитические ферменты являются важной составной
частью литического комплекса. Изучение каталитических свойств глюканаз,
протеаз, хитиназ и иных гидролаз, позволяет говорить об их синергидном
действии при лизисе клеточных стенок микроорганизмов [4-11].
Род Pythium Pringsh.-один из крупных родов среди оомицетов. По образу жизни и морфологии представители этого рода имеют сходные черты с
грибами порядков Saprolegniales, Leptomitales, Lagenidiales и Peronosporales
(ложная мучнистая роса) [12].
Нами было изучено действие растворов гидролитических ферментов:
лизоцима (Лз), трипсина (Тр), протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба (ПК) и комплекса ферментов лизоамидаза (Ла) в различной
концентрации и при различных температурах на споры грибов рода Pythium.
О воздействии на споры гриба растворов ферментов судили по модифицированной нами методике [13].
В необходимом объеме раствора предварительно автоклавированной,
охлажденной жидкой картофельной среды готовили раствор фермента заданной концентрации. Как было установлено ранее, питательная среда не
оказывает влияние на ферментативные активности исследованных ферментов.
С косяка 5-ю мл раствора фермента заданной концентрации смывали
в пробирку споры гриба. Для каждой концентрации фермента используя
свой косяк. В качестве контроля использовали раствор питательной среды
без фермента.
Затем петлей отбирали пробу и помещали на предметное стекло в
25
чашку Петри (должно быть не менее 10-15 спор).
Пробы помещали в суховоздушный термостат типа ТС 1/80 СПУ при
требуемой температуре. Через 18-24 часа под микроскопом смотрели проросшие и не проросшие споры. (В контроле проросших спор должно быть
не менее 80%) [13].
Полученные данные представлены на рисунке 1.
1,5 -Ln(N/No)
1,4
1,3
ПК
1,2
1,1
1
0,9
ЛА
0,8
0,7
0,6
0,5
Лз
0,4
ЛА
0,3
0,2
Лз
0,1
ПК
ЛА
Лз
ЛА
ПК ПК
0
0
5
10
15
20
25
30
С, мг/мл
Рис. 1. Влияние некоторых гидролитических ферментов на выживаемости
(за 100% принято количество спор до обработки) спор гриба рода PYTHIUM
Как видно из представленных и полученных нами ранее данных
[14,15], наблюдается концентрационная зависимость действия исследованных (Ла, ПК, Лз) растворов ферментов, как на сам гриб, так и на его споры.
Наличие протеолитической и специфических хитиназной и хитозаназной
активностей в препаратах Ла и ПК способствует угнетению развития, как
самого гриба, так и его спор. Действие растворов Лз обладающего неспецифической хитиназной активностью усиливается добавками протеиназы. Растворы трипсина (5мг/мл), химотрипсина (10мг/мл) или липазы (100мг/мл) не
оказывают влияние на растущий гриб.
Как было установлено в специально проведенных опытах, растворы
исследованных (Ла, ПК, Лз) ферментов в использованных концентрациях, не
оказывают угнетающего действия на листья растущего огурца.
В дальнейшем планируется изучить влияние органических растворителей и полисахаридных добавок на процесс разрушения растворами фер-
26
ментов клеточных стенок, как самого гриба, так и его спор.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ
(Гос. контракт № 16.М04.11.0015 от 29.04.2011).
Библиографические ссылки
1. Домарадский И.В., Градова Н.Б. Очерки микологии для микологов. М.:
Истоки, 2007. С. 58-62.
2. Текст сайта // [Электронный ресурс] // URL: // htpp://www.uaseed.com/
bolezni/132.htm . (Дата обращения 13.03.2011).
3. Лысак В.В., Максимова Н.П. Теоретические прикладные аспекты создания биопрепаратов для защиты растений. // 80 лет БГУ. Биология, 2001. С.
56-64.
4. Петрова Н.Т. Разработка технологии получения препарата литических
ферментов, расщепляющих клеточные стенки дрожжей и микроскопических
грибов, с использованием мутантного штамма Streptomyces griseinus 11-84:
Дис. ... канд. техн. Наук. М., 2005. 212 с.
5. Получение и характеристика литических ферментов препарата лизофунгин. / Н.Т. Петрова, Е.А. Нестеренко, Н.М. Павлова [и др.]; //Биотехнология,
2002. №1. С.78-88.
6. Журавлева Н.В., Лукьянова П.А. Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии //Вестн ДВО РАН,
2004. №3. С.76-86.
7. Хитин-глюкановые комплексы, Уч. Пособие. / Л.А. Нудьга, И.И. Осиповская, Д.Л. Будилина, Е.Б. Тарабукина. СПб, 2010. 53 с.
8. Пептодогликанлизирующие ферменты бактериофагов – перспективные
противобактериальные агенты. / К.А. Мирошников, О.В. Чертков, П.А.
Назаров, В.В. Месянжинов // Успехи биол. хим., 2006. Т. 46. С. 65-98.
9. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. М., 1988. 230 с.
10. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука, 1983, 315 с.
11. Феофилова Е.П. Хитин грибов: распространение, биосинтез, физикохимические свойства и перспективы использования// Хитин и хитозан. М.:
Наука, 2002. С. 91-99.
12. Пыстина К.А. Род Pythium Pringsh.. СПб.: Наука, 1998. С.5.
13. Методы экспериментальной микологии: Справочник. Киев: Наукова
Думка, 1982. С.116.
14. Белов А.А., Россинец Е.А., Марквичев Н.С. Антигрибковые пролонгированные ферментативные препараты. // Биотехнология: экология крупн.
городов: Мат. Московск. межд. научно-практ. конф., 15-17 март, 2010. М.,
2010. С. 130-131.
15. Белов А.А., Россинец Е.А., Марквичев Н.С. Исследование свойств немодифицированной и иммобилизованной в хитозановый гель лизоамидазы
(ХТ-ЛА) // Наука-производство-технология-экология: Мат. Всерос. научнотехнич. конф. Киров: Изд-во ВятГУ, 2010. Т.2. С. 60-63.
27