УДК 579.66:547.94 Д.В. Митрофанов, Н.И. Петухова, Э.Р. Мухитдинов, Ф.З. Галин, В.В. Зорин Разработка метода получения бетулиновой кислоты региоселективным окислением бетулина растущими культурами микроорганизмов Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 431935; Еmail: bio@rusoil.net Èññëåäîâàíà òðàíñôîðìàöèÿ áåòóëèíà ðàñòóùèìè êóëüòóðàìè ìèêðîîðãàíèçìîâ. Ïðåäëîæåí ìåòîä ïîëó÷åíèÿ áåòóëèíîâîé êèñëîòû èç áåòóëèíà ñ ïîìîùüþ áàêòåðèé Mycobacterium sp. 1-4-1 ñ âûõîäîì 45–50 % â òå÷åíèå 24–36 ÷. Êëþ÷åâûå ñëîâà: òðèòåðïåíîèäû, áåòóëèí, áåòóëèíîâàÿ êèñëîòà, áèîòðàíñôîðìàöèÿ, ìèêðîîðãàíèçìû Áåòóëèíîâàÿ (3β-ãèäðîêñè-20(29)-ëóïàåí28-îâàÿ) êèñëîòà – ïåíòàöèêëè÷åñêàÿ òðèòåðïåíîâàÿ îêñèêèñëîòà ëóïàíîâîãî ðÿäà, à òàêæå åå ïðèðîäíûå èëè ïîëóñèíòåòè÷åñêèå ïðîèçâîäíûå, ïîëó÷åííûå õèìè÷åñêîé, ôåðìåíòàòèâíîé èëè ìèêðîáèîëîãè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèåé, îáëàäàþò øèðîêèì ñïåêòðîì áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè (ïðîòèâîâîñïàëèòåëüíîé, ïðîòèâîðàêîâîé, ïðîòèâîâèðóñíîé, èíñåêòèöèäíîé, àíòèïëàçìîäèàëüíàÿ, ïðîòèâîãåëüìèíòíàÿ, ðîñòðåãóëèðóþùåé è äð.) 1–7. Ýòî ñòàâèò áåòóëèíîâóþ êèñëîòó â ðÿä öåííûõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ è àëëåëîõèìèêàëèé. Ðàíåå íàìè áûë ïðåäëîæåí áèîêàòàëèòè÷åñêèé ìåòîä ðåãèîñåëåêòèâíîãî îêèñëåíèÿ áåòóëèíà â õëîðîôîðìå, ïîçâîëÿþùèé ïîëó÷àòü áåòóëèíîâóþ êèñëîòó ñ âûõîäîì 38% 8.  íàñòîÿùåé ðàáîòå èññëåäîâàí íîâûé ìåòîä ðåãèîñåëåêòèâíîãî îêèñëåíèÿ áåòóëèíà â áåòóëèíîâóþ êèñëîòó ñ ïîìîùüþ ðàñòóùèõ êóëüòóð ìèêðîîðãàíèçìîâ.  êà÷åñòâå ïîòåíöèàëüíûõ áèîêàòàëèçàòîðîâ áûëè èñïîëüçîâàíû ðàíåå íàéäåííûå øòàììû ïî÷âåííûõ áàêòåðèé (Pseudomonas sp. H-43, Mycobacterium sp. 1-4-1 è íåèäåíòèôèöèðîâàííûå øòàììû Ò-12 è ÓÇ-2á). Áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ïîêîÿùèåñÿ êëåòêè ýòèõ ìèêðîîðãàíèçìîâ, âûðàùåííûå íà ñðåäå áåç áåòóëèíà 1, îñóùåñòâëÿþò ðåãèîñåëåêòèâíîå îêèñëåíèå ýòîãî ñîåäèíåíèÿ â áåòóëèíîâóþ êèñëîòó 3 c îáðàçîâàíèåì â êà÷åñòâå ïðîìåæóòî÷íîãî ïðîäóêòà áåòóëèíîâîãî àëüäåãèäà 2 (ðèñ. 1, ïóòü 1). CH2OH HO CHO HO 1 3 CHO O путь 1; HO 2 CH2OH O COOH 4 COOH O 5 путь 2 Ðèñ. 1 - Ãèïîòåòè÷åñêèå ïóòè îêèñëåíèÿ áåòóëèíà ìèêðîîðãàíèçìàìè: 1 – áåòóëèí; 2 – áåòóëèíîâûé àëüäåãèä; 3 – áåòóëèíîâàÿ êèñëîòà; 4 – áåòóëîíîâûé àëüäåãèä; 5 – áåòóëîíîâàÿ êèñëîòà Äàòà ïîñòóïëåíèÿ 20.02.06 Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 1 89 Таблица Образование побочных продуктов микроорганизмами в ростовых условиях Штаммы Т12 Mycobacterium sp. 141 УЗ2б Побочные продукты А Б К + + + + + + Íàèìåíåå àêòèâíî â ðîñòîâûõ óñëîâèÿõ îáðàçîâûâàë ïîáî÷íûå ïðîäóêòû øòàìì Mycobacterium sp. 1-4-1, ÷òî äåëàåò åãî íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûì äëÿ ïîëó÷åíèÿ áåòóëèíîâîé êèñëîòû. Áûëî óñòàíîâëåíî, ÷òî äëÿ èíòåíñèâíîé òðàíñôîðìàöèè áåòóëèíà ýòèì øòàììîì â öåëåâîé ïðîäóêò íåîáõîäèìî èñïîëüçîâàòü òðåõñóòî÷íóþ êóëüòóðó, õàðàêòåðèçóþùóþñÿ âûñîêîé êîíöåíòðàöèåé áèîìàññû (îêîëî 5 ã/ë) è íàèáîëåå âûñîêîé òðàíñôîðìèðóþùåé àêòèâíîñòüþ (ðèñ. 2 è 3). Ñóòî÷íûå è äâóõñóòî÷íûå êóëüòóðû, èìåþùèå áîëåå íèçêèå êîíöåíòðàöèè ìåíåå àêòèâíîé áèîìàññû, ðàáîòàþò çíà÷èòåëüíî ìåäëåííåå. Ïðè èñïîëüçîâàíèè ÷åòûðåõñóòî÷íîé áèî90 ìàññû òàêæå èìååò ìåñòî ñíèæåíèå ñêîðîñòè òðàíñôîðìàöèè ñóáñòðàòà âñëåäñòâèå óìåíüøåíèÿ òðàíñôîðìèðóþùåé àêòèâíîñòè áèîìàññû ïî ñðàâíåíèþ ñ òðåõñóòî÷íîé êóëüòóðîé. Биомасса, мг(асв)/мл 6 5 4 3 2 1 0 0 24 48 72 96 Время, ч Ðèñ. 2. Äèíàìèêà ðîñòà áèîìàññû øòàììà Mycobacterium sp. 1-4-1: Óñëîâèÿ ðîñòà: æèäêàÿ ïèòàòåëüíàÿ ñðåäà íà îñíîâå ïàíêðåàòè÷åñêîãî ãèäðîëèçàòà ðûáíîé ìóêè, 30 îÑ, àýðàöèÿ ïåðåìåøèâàíèåì íà êà÷àëêå 150 îá/ìèí 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 24 48 72 Время, ч скорость конверсии Относительная удельная активность, % 100 скорость трансформации бетулина, % 100 96 удельная активность Ðèñ. 3. Èçìåíåíèå îòíîñèòåëüíîé ñêîðîñòè êîíâåðñèè áåòóëèíà è îòíîñèòåëüíîé óäåëüíîé òðàíñôîðìèðóþùåé àêòèâíîñòè â çàâèñèìîñòè îò âîçðàñòà êóëüòóðû Mycobacterium sp. 1-4-1: Óñëîâèÿ òðàíñôîðìàöèè: êóëüòóðà ìèêðîîðãàíèçìîâ – 20 ìë; àöåòîí – 8%; áåòóëèí – 0,75 ìã/ìë; 30 îÑ; 150 îá/ìèí Концентрация субстрата (продуктов), % (от наибольшего значения) Òàêæå ïðè èññëåäîâàíèè øòàììà Pseudomonas sp. H-43 áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ðåãèîñåëåêòèâíîñòü îêèñëåíèÿ òðèòåðïåíîèäà çàâèñèò îò óñëîâèé âûðàùèâàíèÿ ìèêðîîðãàíèçìà, à èìåííî îò íàëè÷èÿ èëè îòñóòñòâèÿ áåòóëèíà â ðîñòîâîé ñðåäå. Ïðè èñïîëüçîâàíèè äëÿ òðàíñôîðìàöèè òðèòåðïåíîèäà ïîêîÿùèõñÿ êëåòîê ýòèõ áàêòåðèé, âûðàùåííûõ â ïðèñóòñòâèè â ñðåäå áåòóëèíà, â êà÷åñòâå äîïîëíèòåëüíûõ ïðîäóêòîâ îêèñëåíèÿ îáðàçóþòñÿ 3-êåòîñîäåðæàùèå òðèòåðïåíîèäû – áåòóëîíîâûé àëüäåãèä 4 è áåòóëîíîâàÿ êèñëîòà (5) (ðèñ. 1, ïóòü 2). Ýòî óêàçûâàåò íà èíäóöèáåëüíûé õàðàêòåð ñèíòåçà ñïåöèôè÷åñêîé äåãèäðîãåíàçû, îòâåòñòâåííîé çà îêèñëåíèå 3-îêñèãðóïïû áåòóëèíà, ó äàííîãî øòàììà. Ñïîñîáíîñòü øòàììà Pseudomonas sp. Í43 îêèñëÿòü 3-îêñèãðóïïó òðèòåðïåíîèäîâ îãðàíè÷èâàåò âîçìîæíîñòü åãî èñïîëüçîâàíèÿ äëÿ ïîëó÷åíèÿ áåòóëèíîâîé êèñëîòû â ðîñòîâûõ óñëîâèÿõ. Äëÿ ðåàëèçàöèè äàííîãî ïðîöåññà òðåáóþòñÿ ìèêðîîðãàíèçìû, îêèñëÿþùèå áåòóëèí ðåãèîñåëåêòèâíî. Ïðè èññëåäîâàíèè òðàíñôîðìàöèè áåòóëèíà â íåðîñòîâûõ óñëîâèÿõ ñ ïîìîùüþ áèîìàññû äðóãèõ ìèêðîîðãàíèçìîâ, ïîëó÷åííîé íà ñðåäå ñ ýòèì ñîåäèíåíèåì, áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî Mycobacterium sp.1-4-1 è øòàììû Ò-12 è ÓÇ-2á ñîõðàíÿþò ñâîè ðåãèîñåëåêòèâíûå ñâîéñòâà. Îäíàêî, â ðåàêöèîííûõ ñìåñÿõ ýòèõ øòàììîâ íàêàïëèâàþòñÿ ïîáî÷íûå ïðîäóêòû À, Á è Ê (òàáë.). 100 80 60 40 20 0 0 12 24 бетулин бетулиновый альдегид 36 48 60 72 Время, ч бетулиновая кисло продукт К Ðèñ. 4. Òðàíñôîðìàöèÿ áåòóëèíà øòàììîì Mycobacterium sp. 1-4-1 â ðîñòîâîé ñðåäå. Óñëîâèÿ ðåàêöèè: ïèòàòåëüíàÿ ñðåäà – 20 ìë; áèîìàññà 5,0 ìã(àñâ)/ìë; áåòóëèí – 0,75 ìã/ìë; 30 îÑ; 150 îá/ìèí Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 1 Ìàêñèìàëüíûé âûõîä áåòóëèíîâîé êèñëîòû äîñòèãàëñÿ ìåæäó 24 è 36 ÷àñàìè òðàíñôîðìàöèè è ñîñòàâëÿåò 45–50 %.  ýòîò ïåðèîä òðàíñôîðìàöèè ïîáî÷íûå ïðîäóêòû (áåòóëèíîâûé àëüäåãèä è ïðîäóêò Ê) ïðèñóòñòâóþò â íàèìåíüøåì êîëè÷åñòâå. Ýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ÷àñòü Êóëüòóðû ìèêðîîðãàíèçìîâ äëÿ èññëåäîâàíèé òðàíñôîðìàöèè â ðîñòîâûõ óñëîâèÿõ âûðàùèâàëè íà ñðåäå ñëåäóþùåãî ñîñòàâà (ã/ë): ïàíêðåàòè÷åñêèé ãèäðîëèçàò ðûáíîé ìóêè – 15; ãëþêîçà – 1; KH 2PO 4 – 0.8; Na2HPO4⋅12H2O – 1.2; MgSO4⋅7H2O; – 0.2, (NH 4)SO 4 – 1.0; FeSO 4⋅7H 2 O – 0.01; MnSO4⋅7H2O – 0.002; (NH4)2MoO4⋅2Í2Î – 0.001; âîäà âîäîïðîâîäíàÿ – 1000 ìë; ðÍ 7.0. Âûðàùèâàíèå ìèêðîîðãàíèçìîâ è òðàíñôîðìàöèþ áåòóëèíà îñóùåñòâëÿëè â êîëáàõ îáúåìîì 250 ìë íà òåðìîñòàòèðóåìûõ êà÷àëêàõ â òå÷åíèå 1–4 ñóò. ïðè 150 îá/ìèí è òåìïåðàòóðå 30 îÑ. Áåòóëèí ââîäèëè â ñðåäó â âèäå àöåòîíîâîãî ðàñòâîðà äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 0.75 ìã/ìë ïîñëå òîãî, êàê êîíöåíòðàöèÿ áèîìàññû äîñòèãíåò âåëè÷èíû 4.5–5 ã (àñâ)/ë. Êîíöåíòðàöèþ áèîìàññû ìèêðîîðãàíèçìîâ îöåíèâàëè èçìåðåíèåì îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè êëåòî÷íûõ ñóñïåíçèé íà ñïåêòðîôîòîìåòðå «Specol-221» ñ íåôåëîìåòðè÷åñêîé ïðèñòàâêîé ïðè l = 520 íì (äëèíà îïòè÷åñêîãî øàãà êþâåòû – 10 ìì). Ïðîäóêòû òðàíñôîðìàöèè è îñòàòî÷íûé ñóáñòðàò ýêñòðàãèðîâàëè õëîðîôîðìîì (1:1) èç ðåàêöèîííîé ñìåñè, ïðåäâàðèòåëüíî ïîäêèñëåííîé 5%-íûì ðàñòâîðîì ñîëÿíîé êèñëîòû äî ðÍ 1–2. Êà÷åñòâåííûé àíàëèç õëîðîôîðìíûõ ýêñòðàêòîâ âûïîëíÿëè ìåòîäîì òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàôèè ñ èñïîëüçîâàíèåì â êà÷åñòâå ñòàíäàðòíûõ ìåòîê òðèòåðïåíîèäîâ (áåòóëèíà, áåòóëèíîâîãî è áåòóëîíîâîãî àëüäåãèäîâ, áåòóëèíîâîé è áåòóëîíîâîé êèñëîò). Òîíêîñëîéíóþ õðîìàòîãðàôèþ ïðîâîäèëè íà ïëàñòèíêàõ «Sorbfil» ÀÔ-Ô-ÓÔ, èñïîëüçóÿ ñèñòåìó ðàñòâîðèòåëåé õëîðîôîðì-ìåòàíîë â ñîîòíîøåíèè 100:2–1 (v/v). Õðîìàòîãðàììû ïðîÿâëÿëè ñâåæåïðèãîòîâëåííûì ðàñòâîðîì ïàíèñîâîãî àëüäåãèäà (100 ìë ëåäÿíîé óêñóñíîé êèñëîòû, 2 ìë êîíöåíòðèðîâàííîé ñåðíîé êèñëîòû, 1 ìë àíèñîâîãî àëüäåãèäà) ïðè 90–110 î Ñ â òå÷åíèå 3–5 ìèí. Äëÿ êîëè÷åñòâåííîãî àíàëèçà òðèòåðïåíîèäîâ õëîðîôîðìåííûå ýêñòðàêòû, ñîäåðæàùèå ïðîäóêòû òðàíñôîðìàöèè è îñòàòî÷íûé ñóáñòðàò, ðàçäåëÿëè íà ïëàñòèíàõ â ñëîå ñèëèêàãåëÿ â òîé æå ñèñòåìå ðàñòâîðèòåëÿ. Ðàçäåëåííûå òðèòåðïåíîèäû ýëþèðîâàëè õëîðîôîðìîì, ïîñëå ÷åãî îöåíèâàëè ñîäåðæàíèå ýòèõ ñîåäèíåíèé â ýëþàòàõ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè íà ïðèáîðå «ÑÔ-26» ïðè 254 íì 8. Литература 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Kim, Darrick, S. H. L.; Chen, Zhidong; Nguyen, van Tuyen; Pezzuto, John M.; Qiu, Shengxiang; Lu, Zhi-Zhen. // Synth.Commun.– 1997.– V. 27.– P. 1607. Pisha E, Chai H, Lee IS, Chagwedera TE, Farnsworth NR, Cordell GA, Beecher CW, Fong HH, Kinghorn AD, Brown DM, et al. // Nat. Med.– 1995.– V. 10.– P. 1046. De Clercq E. // Mini Rev Med Chem.– 2002.– V. 2.– P. 163. Holz-Smith SL, Sun IC, Jin L, Matthews TJ, Lee KH, Chen CH. // Antimicrob. Agents Chemother.– 2001.– V. 45.– P. 60. Zhang Z, ElSohly HN, Jacob MR, Pasco DS, Walker LA, Clark AM. // Planta Med.– 2002.– V. 68.– P. 49. Enwerem NM, Okogun JI, Wambebe CO, Okorie DA, Akah PA. // Phytomedicine.– 2001.– V. 8.– P. 112. Kouzi SA, Chatterjee P, Pezzuto JM, Hamann MT. // J. Nat. Prod.– 2000.– V. 63.– P. 1653. Ìèòðîôàíîâ Ä.Â., Ïåòóõîâà Í.È., Ôëåõòåð Î.Á., Ãàëèí Ô.Ç., Çîðèí Â.Â. // Áàø. õèì. æ.2004.– Ò. 11, ¹ 1.– Ñ. 42. Àõðåì À.À., Êóçíåöîâà À.È. Òîíêîñëîéíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ.– Ì.: «Íàóêà», 1965. Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 1 91