РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ

реклама
УДК 579.66:547.94
Д.В. Митрофанов, Н.И. Петухова, Э.Р. Мухитдинов,
Ф.З. Галин, В.В. Зорин
Разработка метода получения бетулиновой кислоты
региоселективным окислением бетулина растущими
культурами микроорганизмов
Уфимский государственный нефтяной технический университет
450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 431935; Еmail: bio@rusoil.net
Èññëåäîâàíà òðàíñôîðìàöèÿ áåòóëèíà ðàñòóùèìè êóëüòóðàìè ìèêðîîðãàíèçìîâ. Ïðåäëîæåí
ìåòîä ïîëó÷åíèÿ áåòóëèíîâîé êèñëîòû èç áåòóëèíà ñ ïîìîùüþ áàêòåðèé Mycobacterium sp.
1-4-1 ñ âûõîäîì 45–50 % â òå÷åíèå 24–36 ÷.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: òðèòåðïåíîèäû, áåòóëèí, áåòóëèíîâàÿ êèñëîòà, áèîòðàíñôîðìàöèÿ, ìèêðîîðãàíèçìû
Áåòóëèíîâàÿ (3β-ãèäðîêñè-20(29)-ëóïàåí28-îâàÿ) êèñëîòà – ïåíòàöèêëè÷åñêàÿ òðèòåðïåíîâàÿ îêñèêèñëîòà ëóïàíîâîãî ðÿäà, à òàêæå
åå ïðèðîäíûå èëè ïîëóñèíòåòè÷åñêèå ïðîèçâîäíûå, ïîëó÷åííûå õèìè÷åñêîé, ôåðìåíòàòèâíîé èëè ìèêðîáèîëîãè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèåé, îáëàäàþò øèðîêèì ñïåêòðîì áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè (ïðîòèâîâîñïàëèòåëüíîé,
ïðîòèâîðàêîâîé, ïðîòèâîâèðóñíîé, èíñåêòèöèäíîé, àíòèïëàçìîäèàëüíàÿ, ïðîòèâîãåëüìèíòíàÿ, ðîñòðåãóëèðóþùåé è äð.) 1–7. Ýòî
ñòàâèò áåòóëèíîâóþ êèñëîòó â ðÿä öåííûõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ è àëëåëîõèìèêàëèé.
Ðàíåå íàìè áûë ïðåäëîæåí áèîêàòàëèòè÷åñêèé ìåòîä ðåãèîñåëåêòèâíîãî îêèñëåíèÿ áåòóëèíà â õëîðîôîðìå, ïîçâîëÿþùèé ïîëó÷àòü
áåòóëèíîâóþ êèñëîòó ñ âûõîäîì 38% 8.
 íàñòîÿùåé ðàáîòå èññëåäîâàí íîâûé
ìåòîä ðåãèîñåëåêòèâíîãî îêèñëåíèÿ áåòóëèíà
â áåòóëèíîâóþ êèñëîòó ñ ïîìîùüþ ðàñòóùèõ
êóëüòóð ìèêðîîðãàíèçìîâ.
 êà÷åñòâå ïîòåíöèàëüíûõ áèîêàòàëèçàòîðîâ áûëè èñïîëüçîâàíû ðàíåå íàéäåííûå
øòàììû ïî÷âåííûõ áàêòåðèé (Pseudomonas
sp. H-43, Mycobacterium sp. 1-4-1 è íåèäåíòèôèöèðîâàííûå øòàììû Ò-12 è ÓÇ-2á).
Áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî ïîêîÿùèåñÿ êëåòêè ýòèõ ìèêðîîðãàíèçìîâ, âûðàùåííûå íà
ñðåäå áåç áåòóëèíà 1, îñóùåñòâëÿþò ðåãèîñåëåêòèâíîå îêèñëåíèå ýòîãî ñîåäèíåíèÿ â áåòóëèíîâóþ êèñëîòó 3 c îáðàçîâàíèåì â êà÷åñòâå
ïðîìåæóòî÷íîãî ïðîäóêòà áåòóëèíîâîãî àëüäåãèäà 2 (ðèñ. 1, ïóòü 1).
CH2OH
HO
CHO
HO
1
3
CHO
O
путь 1;
HO
2
CH2OH
O
COOH
4
COOH
O
5
путь 2
Ðèñ. 1 - Ãèïîòåòè÷åñêèå ïóòè îêèñëåíèÿ áåòóëèíà ìèêðîîðãàíèçìàìè: 1 – áåòóëèí; 2 – áåòóëèíîâûé àëüäåãèä; 3 – áåòóëèíîâàÿ êèñëîòà; 4 – áåòóëîíîâûé àëüäåãèä; 5 – áåòóëîíîâàÿ êèñëîòà
Äàòà ïîñòóïëåíèÿ 20.02.06
Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 1
89
Таблица
Образование побочных продуктов
микроорганизмами в ростовых условиях
Штаммы
Т12
Mycobacterium sp. 141
УЗ2б
Побочные продукты
А
Б
К
+
+
+
+
+
+
Íàèìåíåå àêòèâíî â ðîñòîâûõ óñëîâèÿõ
îáðàçîâûâàë ïîáî÷íûå ïðîäóêòû øòàìì
Mycobacterium sp. 1-4-1, ÷òî äåëàåò åãî íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûì äëÿ ïîëó÷åíèÿ áåòóëèíîâîé êèñëîòû.
Áûëî óñòàíîâëåíî, ÷òî äëÿ èíòåíñèâíîé
òðàíñôîðìàöèè áåòóëèíà ýòèì øòàììîì â öåëåâîé ïðîäóêò íåîáõîäèìî èñïîëüçîâàòü òðåõñóòî÷íóþ êóëüòóðó, õàðàêòåðèçóþùóþñÿ âûñîêîé êîíöåíòðàöèåé áèîìàññû (îêîëî 5 ã/ë)
è íàèáîëåå âûñîêîé òðàíñôîðìèðóþùåé àêòèâíîñòüþ (ðèñ. 2 è 3).
Ñóòî÷íûå è äâóõñóòî÷íûå êóëüòóðû, èìåþùèå áîëåå íèçêèå êîíöåíòðàöèè ìåíåå àêòèâíîé áèîìàññû, ðàáîòàþò çíà÷èòåëüíî ìåäëåííåå. Ïðè èñïîëüçîâàíèè ÷åòûðåõñóòî÷íîé áèî90
ìàññû òàêæå èìååò ìåñòî ñíèæåíèå ñêîðîñòè
òðàíñôîðìàöèè ñóáñòðàòà âñëåäñòâèå óìåíüøåíèÿ òðàíñôîðìèðóþùåé àêòèâíîñòè áèîìàññû ïî ñðàâíåíèþ ñ òðåõñóòî÷íîé êóëüòóðîé.
Биомасса, мг(асв)/мл
6
5
4
3
2
1
0
0
24
48
72
96
Время, ч
Ðèñ. 2. Äèíàìèêà ðîñòà áèîìàññû øòàììà
Mycobacterium sp. 1-4-1: Óñëîâèÿ ðîñòà: æèäêàÿ ïèòàòåëüíàÿ ñðåäà íà îñíîâå ïàíêðåàòè÷åñêîãî ãèäðîëèçàòà ðûáíîé ìóêè, 30 îÑ, àýðàöèÿ ïåðåìåøèâàíèåì
íà êà÷àëêå 150 îá/ìèí
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
24
48
72
Время, ч
скорость конверсии
Относительная
удельная активность,
%
100
скорость
трансформации
бетулина, %
100
96
удельная активность
Ðèñ. 3. Èçìåíåíèå îòíîñèòåëüíîé ñêîðîñòè êîíâåðñèè áåòóëèíà è îòíîñèòåëüíîé óäåëüíîé òðàíñôîðìèðóþùåé àêòèâíîñòè â çàâèñèìîñòè îò âîçðàñòà êóëüòóðû Mycobacterium sp. 1-4-1: Óñëîâèÿ òðàíñôîðìàöèè: êóëüòóðà ìèêðîîðãàíèçìîâ – 20 ìë; àöåòîí –
8%; áåòóëèí – 0,75 ìã/ìë; 30 îÑ; 150 îá/ìèí
Концентрация субстрата
(продуктов),
% (от наибольшего значения)
Òàêæå
ïðè
èññëåäîâàíèè
øòàììà
Pseudomonas sp. H-43 áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî
ðåãèîñåëåêòèâíîñòü îêèñëåíèÿ òðèòåðïåíîèäà
çàâèñèò îò óñëîâèé âûðàùèâàíèÿ ìèêðîîðãàíèçìà, à èìåííî îò íàëè÷èÿ èëè îòñóòñòâèÿ
áåòóëèíà â ðîñòîâîé ñðåäå. Ïðè èñïîëüçîâàíèè äëÿ òðàíñôîðìàöèè òðèòåðïåíîèäà ïîêîÿùèõñÿ êëåòîê ýòèõ áàêòåðèé, âûðàùåííûõ â
ïðèñóòñòâèè â ñðåäå áåòóëèíà, â êà÷åñòâå äîïîëíèòåëüíûõ ïðîäóêòîâ îêèñëåíèÿ îáðàçóþòñÿ 3-êåòîñîäåðæàùèå òðèòåðïåíîèäû – áåòóëîíîâûé àëüäåãèä 4 è áåòóëîíîâàÿ êèñëîòà (5)
(ðèñ. 1, ïóòü 2). Ýòî óêàçûâàåò íà èíäóöèáåëüíûé õàðàêòåð ñèíòåçà ñïåöèôè÷åñêîé äåãèäðîãåíàçû, îòâåòñòâåííîé çà îêèñëåíèå 3-îêñèãðóïïû áåòóëèíà, ó äàííîãî øòàììà.
Ñïîñîáíîñòü øòàììà Pseudomonas sp. Í43 îêèñëÿòü 3-îêñèãðóïïó òðèòåðïåíîèäîâ îãðàíè÷èâàåò âîçìîæíîñòü åãî èñïîëüçîâàíèÿ
äëÿ ïîëó÷åíèÿ áåòóëèíîâîé êèñëîòû â ðîñòîâûõ óñëîâèÿõ. Äëÿ ðåàëèçàöèè äàííîãî ïðîöåññà òðåáóþòñÿ ìèêðîîðãàíèçìû, îêèñëÿþùèå áåòóëèí ðåãèîñåëåêòèâíî.
Ïðè èññëåäîâàíèè òðàíñôîðìàöèè áåòóëèíà â íåðîñòîâûõ óñëîâèÿõ ñ ïîìîùüþ áèîìàññû äðóãèõ ìèêðîîðãàíèçìîâ, ïîëó÷åííîé
íà ñðåäå ñ ýòèì ñîåäèíåíèåì, áûëî îáíàðóæåíî, ÷òî Mycobacterium sp.1-4-1 è øòàììû Ò-12
è ÓÇ-2á ñîõðàíÿþò ñâîè ðåãèîñåëåêòèâíûå
ñâîéñòâà. Îäíàêî, â ðåàêöèîííûõ ñìåñÿõ ýòèõ
øòàììîâ íàêàïëèâàþòñÿ ïîáî÷íûå ïðîäóêòû
À, Á è Ê (òàáë.).
100
80
60
40
20
0
0
12
24
бетулин
бетулиновый альдегид
36
48
60
72
Время, ч
бетулиновая кисло
продукт К
Ðèñ. 4. Òðàíñôîðìàöèÿ áåòóëèíà øòàììîì
Mycobacterium sp. 1-4-1 â ðîñòîâîé ñðåäå. Óñëîâèÿ
ðåàêöèè: ïèòàòåëüíàÿ ñðåäà – 20 ìë; áèîìàññà 5,0
ìã(àñâ)/ìë; áåòóëèí – 0,75 ìã/ìë; 30 îÑ; 150 îá/ìèí
Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 1
Ìàêñèìàëüíûé âûõîä áåòóëèíîâîé êèñëîòû äîñòèãàëñÿ ìåæäó 24 è 36 ÷àñàìè òðàíñôîðìàöèè è ñîñòàâëÿåò 45–50 %.  ýòîò ïåðèîä
òðàíñôîðìàöèè ïîáî÷íûå ïðîäóêòû (áåòóëèíîâûé àëüäåãèä è ïðîäóêò Ê) ïðèñóòñòâóþò â
íàèìåíüøåì êîëè÷åñòâå.
Ýêñïåðèìåíòàëüíàÿ ÷àñòü
Êóëüòóðû ìèêðîîðãàíèçìîâ äëÿ èññëåäîâàíèé òðàíñôîðìàöèè â ðîñòîâûõ óñëîâèÿõ
âûðàùèâàëè íà ñðåäå ñëåäóþùåãî ñîñòàâà
(ã/ë): ïàíêðåàòè÷åñêèé ãèäðîëèçàò ðûáíîé
ìóêè – 15; ãëþêîçà – 1; KH 2PO 4 – 0.8;
Na2HPO4⋅12H2O – 1.2; MgSO4⋅7H2O; – 0.2,
(NH 4)SO 4 – 1.0; FeSO 4⋅7H 2 O – 0.01;
MnSO4⋅7H2O – 0.002; (NH4)2MoO4⋅2Í2Î –
0.001; âîäà âîäîïðîâîäíàÿ – 1000 ìë; ðÍ 7.0.
Âûðàùèâàíèå ìèêðîîðãàíèçìîâ è òðàíñôîðìàöèþ áåòóëèíà îñóùåñòâëÿëè â êîëáàõ
îáúåìîì 250 ìë íà òåðìîñòàòèðóåìûõ êà÷àëêàõ â òå÷åíèå 1–4 ñóò. ïðè 150 îá/ìèí è òåìïåðàòóðå 30 îÑ. Áåòóëèí ââîäèëè â ñðåäó â
âèäå àöåòîíîâîãî ðàñòâîðà äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 0.75 ìã/ìë ïîñëå òîãî, êàê êîíöåíòðàöèÿ áèîìàññû äîñòèãíåò âåëè÷èíû
4.5–5 ã (àñâ)/ë.
Êîíöåíòðàöèþ áèîìàññû ìèêðîîðãàíèçìîâ îöåíèâàëè èçìåðåíèåì îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè êëåòî÷íûõ ñóñïåíçèé íà ñïåêòðîôîòîìåòðå
«Specol-221» ñ íåôåëîìåòðè÷åñêîé ïðèñòàâêîé
ïðè l = 520 íì (äëèíà îïòè÷åñêîãî øàãà êþâåòû – 10 ìì).
Ïðîäóêòû òðàíñôîðìàöèè è îñòàòî÷íûé
ñóáñòðàò ýêñòðàãèðîâàëè õëîðîôîðìîì (1:1)
èç ðåàêöèîííîé ñìåñè, ïðåäâàðèòåëüíî ïîäêèñëåííîé 5%-íûì ðàñòâîðîì ñîëÿíîé êèñëîòû äî ðÍ 1–2. Êà÷åñòâåííûé àíàëèç õëîðîôîðìíûõ ýêñòðàêòîâ âûïîëíÿëè ìåòîäîì òîíêîñëîéíîé õðîìàòîãðàôèè ñ èñïîëüçîâàíèåì â
êà÷åñòâå ñòàíäàðòíûõ ìåòîê òðèòåðïåíîèäîâ
(áåòóëèíà, áåòóëèíîâîãî è áåòóëîíîâîãî àëüäåãèäîâ, áåòóëèíîâîé è áåòóëîíîâîé êèñëîò).
Òîíêîñëîéíóþ õðîìàòîãðàôèþ ïðîâîäèëè íà
ïëàñòèíêàõ «Sorbfil» ÀÔ-Ô-ÓÔ, èñïîëüçóÿ
ñèñòåìó ðàñòâîðèòåëåé õëîðîôîðì-ìåòàíîë â
ñîîòíîøåíèè 100:2–1 (v/v). Õðîìàòîãðàììû
ïðîÿâëÿëè ñâåæåïðèãîòîâëåííûì ðàñòâîðîì ïàíèñîâîãî àëüäåãèäà (100 ìë ëåäÿíîé óêñóñíîé
êèñëîòû, 2 ìë êîíöåíòðèðîâàííîé ñåðíîé êèñëîòû, 1 ìë àíèñîâîãî àëüäåãèäà) ïðè 90–110
î
Ñ â òå÷åíèå 3–5 ìèí.
Äëÿ êîëè÷åñòâåííîãî àíàëèçà òðèòåðïåíîèäîâ õëîðîôîðìåííûå ýêñòðàêòû, ñîäåðæàùèå
ïðîäóêòû òðàíñôîðìàöèè è îñòàòî÷íûé ñóáñòðàò, ðàçäåëÿëè íà ïëàñòèíàõ â ñëîå ñèëèêàãåëÿ â òîé æå ñèñòåìå ðàñòâîðèòåëÿ. Ðàçäåëåííûå òðèòåðïåíîèäû ýëþèðîâàëè õëîðîôîðìîì, ïîñëå ÷åãî îöåíèâàëè ñîäåðæàíèå ýòèõ
ñîåäèíåíèé â ýëþàòàõ ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè
íà ïðèáîðå «ÑÔ-26» ïðè 254 íì 8.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Kim, Darrick, S. H. L.; Chen, Zhidong; Nguyen,
van Tuyen; Pezzuto, John M.; Qiu, Shengxiang;
Lu, Zhi-Zhen. // Synth.Commun.– 1997.– V.
27.– P. 1607.
Pisha E, Chai H, Lee IS, Chagwedera TE,
Farnsworth NR, Cordell GA, Beecher CW, Fong
HH, Kinghorn AD, Brown DM, et al. // Nat.
Med.– 1995.– V. 10.– P. 1046.
De Clercq E. // Mini Rev Med Chem.– 2002.–
V. 2.– P. 163.
Holz-Smith SL, Sun IC, Jin L, Matthews TJ, Lee
KH, Chen CH. // Antimicrob. Agents
Chemother.– 2001.– V. 45.– P. 60.
Zhang Z, ElSohly HN, Jacob MR, Pasco DS,
Walker LA, Clark AM. // Planta Med.– 2002.–
V. 68.– P. 49.
Enwerem NM, Okogun JI, Wambebe CO, Okorie
DA, Akah PA. // Phytomedicine.– 2001.–
V. 8.– P. 112.
Kouzi SA, Chatterjee P, Pezzuto JM, Hamann
MT. // J. Nat. Prod.– 2000.– V. 63.– P. 1653.
Ìèòðîôàíîâ Ä.Â., Ïåòóõîâà Í.È., Ôëåõòåð
Î.Á., Ãàëèí Ô.Ç., Çîðèí Â.Â. // Áàø. õèì. æ.2004.– Ò. 11, ¹ 1.– Ñ. 42.
Àõðåì À.À., Êóçíåöîâà À.È. Òîíêîñëîéíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ.– Ì.: «Íàóêà», 1965.
Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. № 1
91
Скачать