ПЦР-диагностика в России: современное - ДНК

ПЦР-диагностика в России: современное состояние и перспективы развития
Лаптинов И.А.1, Болдырева М.Н.2
1
- ЗАО "НПФ ДНК-Технология"
115478 Москва, Каширское ш. д.24 корп. 2, к.222
тел. 116-4902
e-mail: igor@dna-technology.ru
2
- ГНЦ РФ – Институт Иммунологии МЗ РФ
115478 Москва, Каширское ш. д.24
В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое
применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства.
Один из таких методов - полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая быстро
нарабатывать в пробирке определенный фрагмент ДНК до концентрации, при которой его
легко детектировать.
В медицине ПЦР применяют при диагностике инфекционных заболеваний,
наследственных заболеваний, различных видах генотипирования, определении отцовства
и т.д. Санитарно-эпидемиологические службы используют ПЦР для контроля за
микробиологическим загрязнением окружающей среды и продуктов питания, а также для
выявления генетически модифицированных источников пищи (ГМИ).
Наиболее важные параметры любых методов, используемых в диагностических
лабораториях можно сформулировать следующим образом: надежность (в том числе
чувствительность и специфичность), простота выполнения, время анализа и цена.
Переход любого метода из научно-исследовательской лаборатории в лабораторию
диагностическую сопряжен с рядом возникающих на этом пути проблем. Несмотря на
высокую технологичность ПЦР и относительную простоту выполнения анализа, можно
назвать ряд моментов, требующих специальной адаптации для практического
использования метода в медицинской диагностике. Во первых, уровень специальной
подготовки сотрудников диагностической лаборатории принципиально отличается от
подготовки сотрудников научно-исследовательского института. Поэтому выполнение всех
процедур должно быть максимально стандартизовано и упрощено, а трактовка
результатов должна быть однозначной и по возможности не требовать субъективной
оценки лаборантом. Во вторых, в отличие от НИИ, где олигонуклеотидные затравки
(праймеры) для ПЦР чаще всего используют один или небольшое число раз для
получения результатов в конкретном эксперименте, при проведении ПЦР-диагностики
относительно небольшой набор ПЦР-тест-систем используют постоянно на протяжении
многих лет. Такая работа с чрезвычайно чувствительной методикой, какой является ПЦР,
при использовании методов детекции, требующих извлечения амплифицированного
материала из пробирки, неизбежно ведет к загрязнению лаборатории продуктами реакции
и, как следствие, получению ложных результатов исследования. Поэтому правильная
организация диагностической ПЦР-лаборатории имеет принципиальное значение для
получения достоверных результатов при проведении тестирования.
В этой связи можно сформулировать основные направления развития ПЦР-диагностики в
ближайшем будущем:
а) повышение общей надежности метода;
б) дальнейшее упрощение процедуры анализа;
в) сокращение времени исследования;
г) широкое внедрение количественной ПЦР.
В свою очередь, эти тенденции будут реализованы за счет использования флуоресцентных
методов детекции продуктов амплификации, автоматизации и применения компьютерных
методов регистрации и трактовки результатов исследования.
Уже сейчас техника выполнения процедур при проведении ПЦР-диагностики довольно
проста. Весь анализ можно подразделить на три этапа: пробоподготовка (очистка ДНК
или РНК исследуемого объекта от примесей), амплификация определенного фрагмента
ДНК и регистрация результатов амплификации.
Пробоподготовка: в настоящее время на отечественном рынке представлено большое
разнообразие наборов реактивов для пробоподготовки (очистки нуклеиновых кислот).
Поскольку ПЦР не требует высокой степени очистки ДНК, существуют методики,
состоящие всего из одного-двух шагов, но достаточно хорошо удаляющие из раствора
компоненты, снижающие эффективность ПЦР (ингибиторы). В среднем, упрощенный
вариант пробоподготовки занимает 30 минут на обработку 20-30 образцов. Дальнейшее
развитие методик пробоподготовки можно прогнозировать в направлении повышения
эффективности удаления ингибиторов и удобства автоматизации процесса. Некоторые
образцы биоматериала содержат агенты, существенно снижающие эффективность
реакции. При проведении количественного ПЦР-анализа такое отличие в эффективности
амплификации может внести существенную ошибку, поэтому с распространением
количественного анализа требования к чистоте получаемой ДНК повышаются.
Амплификация: поскольку амплификационная часть большинства диагностических
ПЦР-тест-систем предлагается пользователю в виде предварительно смешанных и
разнесенных по реакционным пробиркам реактивов (как правило это запечатанный
парафином на дне пробирки раствор или сухая (лиофилизированная) смесь компонентов
реакции), подготовка реакций на этапе амплификации состоит из добавления в пробирку
очищенной ДНК и полимеразы (или только ДНК, если полимераза уже присутствует в
смеси). Сколько-нибудь заметное упрощение или ускорение этого этапа практически
невозможно. Стоит отметить только существующую тенденцию к переходу от
использования отдельных реакционных пробирок к стандартным форматам скрепленных
пробирок (8 или 12-луночные стрипы и 96 или 384-луночные планшеты). При этом
возможность использования многоканальных пипеток и дозаторов ускоряет процедуру
приготовления реакционной смеси. Крупные диагностические центры, при использовании
планшетных форматов, могут использовать роботизированные дозирующие станции,
снижающие вероятность ошибки лаборанта.
Регистрация результатов амплификации: достоверность исследования в значительной
мере связана со способом детекции и интерпретации результатов ПЦР. В настоящее время
можно выделить четыре системы детекции результатов ПЦР, наиболее часто
применяемых в диагностических лабораториях: гель-электрофорез, гибридизационноферментный анализ (ГиФА), флуоресцентная детекция результатов после ПЦР (FLASH) и
флуоресцентная детекция во время ПЦР (Real-Time PCR). Последние два метода
отличаются тем, что продукт амплификации для определения не извлекается из пробирки,
а регистрация результатов (измерение флуоресценции) идет в закрытой пробирке через
прозрачный пластик.
Одной из основных проблем, возникающих в ходе проведения ПЦР-диагностики является
загрязнение (контаминация) ампликонами, накапливающимися в лаборатории при
проведении электрофореза в агарозном геле или гибридизации в планшетах. Исключение
стадии электрофореза за счет применения систем регистрации результатов в закрытой
пробирке позволяет полностью решить проблему контаминации ампликонами.
Очевидно, что методики FLASH и Real-Time PCR обладают целым рядом преимуществ в
сравнении с электрофоретическими методами анализа и ГиФА и будут стремительно
занимать все большее место на рынке диагностических услуг (см. таблицу 1).
Таблица 1. Сравнение методов детекции результатов ПЦР.
Электрофорез ГиФА
Система
Система
«FLASH»
и детекции
флуориметр
результатов
«Джин»
ПЦР в режиме
реального
времени (Real
Time PCR)
60 мин
3 мин
0 мин
Приблизительное 40 мин
время детекции
для 30 образцов
Высокая
Высокая
Отсутствует*
Отсутствует*
Контаминация
продуктами ПЦР
Вручную
Автоматическое Автоматическое Автоматическое
Фиксирование
данных
Возможность
Повышение
Повышение
Возможность
Особенности
увидеть
достоверности
достоверности
оценки
результат ПЦР исследования за исследования за исходного
в
виде счет
счет
количества
полоски
на специфичности специфичности копий ДНК в
геле, оценить пробы
к пробы
к образце
количество и целевому
целевому
качество
амплификату
амплификату
амплификата
по нескольким
параметрам
*-если соблюдаются все рекомендации разработчика по работе с наборами.
Применение системы детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени», наряду с
ответом на вопрос о наличии или отсутствии патогена, позволяет оценить его количество
в исследуемом образце, что в ряде случаев позволяет уточнить диагноз и выбрать более
адекватный метод лечения.
Для оценки ПЦР в режиме «реального времени» реакцию проводят в специальном
детектирующем амплификаторе со встроенной системой регистрации флуоресценции
внутри реакционных пробирок непосредственно во время протекания реакции.
Повышение надежности тест-систем за счет использования внутреннего
контрольного образца: для повышения надежности результатов исследования и их
однозначной трактовки, в лабораторной диагностике, так же, как и в научных
экспериментах, используют ряд контрольных экспериментов (реакций). Помимо
стандартных положительной и отрицательной контрольных реакций, в ПЦР-диагностике
используют внутренний контрольный образец (ВКО). Использование ВКО основано на
возможности проведения в одной реакционной пробирке нескольких практически
независимых реакций амплификации для разных фрагментов ДНК. В частности, для
контроля за эффективностью ПЦР можно использовать одновременное протекание двух
реакций амплификации в одной пробирке. В одной из таких реакций происходит
накопление целевого фрагмента ДНК (участок генома инфекционного агента,
трансгенного растения и т.д.), а в другой амплифицируется специально добавленная в
реакцию ДНК (обычно это фрагмент плазмидной ДНК). С помощью ВКО, добавляемого в
образец перед этапом пробоподготовки (очистки ДНК от примесей), можно
проконтролировать эффективность всех этапов анализа.
Повышение надежности документирования, интерпретации и хранения результатов
анализа: использование электрофореза для детекции результатов ПЦР, как правило,
связано с визуальным анализом полученных данных и фиксированием результатов в
лабораторном журнале вручную, что может вызывать целый ряд ошибок при
документировании и интерпретации результатов исследования. Современные
компьютерные программы в комбинации с применением гибридизационных
олигонуклеотидных зондов для проявки результатов ПЦР (методы FLASH или Real-Time
PCR) позволяют практически полностью исключить неверную трактовку результатов.
Автоматизированная система фиксирования данных с детектирующего амплификатора
или специализированного флуориметра в памяти персонального компьютера позволяет
вести эффективную документацию и хранение информации с возможностью выведения
отчета о проведенном анализе на принтер.
Обучение лаборантов, повышение квалификации врачей: одним из направлений,
требующих существенного развития, остается система обучения сотрудников
диагностических ПЦР-лабораторий основам метода ПЦР, возможным ошибкам,
выявлению ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования.
Незнание лаборантами основ нового метода приводит зачастую к грубейшим ошибкам и
неправильной трактовке результатов исследования.
Не менее, а возможно и более важной задачей является повышение уровня подготовки
врачей, использующих результаты ПЦР для постановки диагноза и выбора курса лечения.
Возможность быстрого и чрезвычайно точного обнаружения широкого спектра
инфекционных методом ПЦР является мощнейшим инструментом, неумелое
использование которого может более навредить пациенту, чем помочь. Исключительная
чувствительность ПЦР позволяет обнаружить в исследуемом образце единичные копии
ДНК, и далеко не всегда присутствие условно-патогенных микроорганизмов должно
трактоваться врачом как причина наблюдаемого заболевания. Повышение подготовки
лечащих врачей в области трактовки результатов ПЦР-исследования позволит правильно
поставить диагноз и выбрать оптимальный курс лечения.
Подводя итог можно сказать, что на данный момент в России лабораторная ПЦРдиагностика проходит этап бурного развития. Соответствующим оборудованием
оснащают санитарно-эпидемиологическую службу, станции переливания крови,
инфекционные больницы, КВД и т.д. Сотрудники этих учреждений проходят обучение в
специализированных государственных центрах (таких, как Российская медицинская
академия последипломного образования МЗ СР РФ, ГУ НИИ питания РАМН). На
отечественном рынке представлено большое количество официально зарегистрированных
тест-систем для широкого спектра инфекционных агентов и задач генотипирования,
причем как с детекцией методом гель-электрофореза, так и с флуоресцентной детекцией.
Существует современное оборудование российского производства для оснащения ПЦРлабораторий, включая оборудование для количественной оценки нуклеиновых кислот с
использованием детектирующих амплификаторов.
Можно надеяться, что в ближайшем будущем лабораторная ПЦР-диагностика займет в
нашей стране столь же существенное место в системе здравоохранения, какое этот метод
уже занимает в большинстве ведущих стран мира.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
N.J.Walker. A Technique Whose Time Has Come. SCIENCE VOL 296 19 APRIL 2002
2.
Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription
polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000 Oct;25(2):169-93. Review.
3.
Schmittgen TD. Real-time quantitative PCR. Methods. 2001 Dec;25(4):383-5.
4.
Giulietti A, Overbergh L, Valckx D, Decallonne B, Bouillon R, Mathieu C. An overview
of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods. 2001
Dec;25(4):386-401. Review.
5.
Lay M.J. Wittwer C.T., Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during
rapid-cycle PCR//Clin Chem. 1997 Dec;43(12):2262-7.
6.
Charalampos Aslanidis, Markus Nauck1 and Gerd Schmitz High-Speed Prothrombin GA 20210 and Methylenetetrahydrofolate Reductase C-T 677 Mutation Detection Using RealTime Fluorescence PCR and Melting Curves//BioTechniques 27: 234-238 (August 1999)
7.
Feinberg M, Fernandez S, Cassard S, Bertheau Y. Quantitation of 35S promoter in maize
DNA extracts from genetically modified organisms using real-time polymerase chain reaction,
part 2: interlaboratory study. J AOAC Int. 2005 Mar-Apr;88(2):558-73.