Б.В. Свиридов

УДК 579.61
Б.В. Свиридов
Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия
ГосНИИГенетика, Москва, Россия
СОЗДАНИЕ
ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА
АЛЬГИНАЗЫ
ОБРАБОТКИ БИОПЛЁНОК PSEUDOMONAS AERUGINOSA
ДЛЯ
The problem of development of alternative prevention and treatment of nosocomial infections caused by antibiotic-resistant pathogenic bacteria is important nowadays. At GosNIIgenetika
research is carried out to create strains producing recombinant bacteriophage lysozymes and find
ways to effectively use lysozymes against pathogenic bacteria.
В настоящее время существует проблема поиска альтернативных путей лечения и
профилактики внутрибольничных инфекций, вызываемых штаммами патогенных бактерий,
обладающих устойчивостью к антибиотикам. В ГосНИИгенетика проводятся работы по
созданию продуцентов лизоцимов бактериофагов и способов эффективного использования
лизоцимов против патогенных бактерий.
В последние годы проблема возникновения устойчивых к действию
антибиотиков штаммов патогенных микроорганизмов становится всё более
острой, особенно при лечении внутрибольничных инфекций. В связи с этим
актуальной является разработка альтернативных методов борьбы с резистентными к антибиотикам бактериями, одним из которых является лечение
с помощью бактериофагов. В качестве развитие этого направления ведётся
поиск пептидогликанлизирующих ферментов (ПЛФ) бактериофагов (лизоцимов или лизинов), используемых бактериофагами для гидролиза пептидогликана в клеточной стенке бактерий для выхода фагового потомства из
инфицированной клетки.
В частности, в ГосНИИгенетика был создан штамм-продуцент лизоцима бактериофага FMV, активно лизирующего бактерии видов Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas putida [1] и являющийся перспективным для
лечения и профилактики инфицирования Pseudomonas aeruginosa ран на коже пациентов, особенно ожогов. Показано, что этот лизоцим способен лизировать бактериальные клетки, которые предварительно выдержанные в парах хлороформа, но не оказывает воздействия на необработанные клетки.
Известно, что ПЛФ способны лизировать грам-положительные бактерии, но не грамотрицательные. Доступу лизоцима к пептидогликану грамотрицательных бактерий препятствует внешняя мембрана. Грамотрицательная бактерия Pseudomonas aeruginosa, являющаяся одним из самых распространённых возбудителей внутрибольничных инфекций и при этом во
многих случаях резистентной к антибиотикам, имеет ещё один барьер на
пути лизоцима – бактерии образуют защитную биоплёнку, в основном состоящую из экзополисахаридом альгинатом.
Альгинат – это неразветвлённый полисахарид, составленный из двух
мономеров – D-маннуроната и L-гулуроната, которые располагаются без какого-либо определённого порядка. В природе альгинат присутствует в клеточных стенках бурых водорослей или как их внутриклеточный материал.
39
Альгинат также синтезируется бактериями семейств Pseudomonadaceae и
Azotobacteriaceae.
Целью данной работы является поиск белка (альгиназы), деградирующего альгинат Pseudomonas aeruginosa и создание штамма-продуцента
данного фермента.
Материалы и методы. Для манипуляций с плазмидами в ходе работы использовался штамм Escherichia coli TG1, а в качестве продуцентов –
штаммы Escherichia coli BL21(DE3) и Saccharomyces cerevisiae 4. Для
культивирования штаммов Escherichia coli использовалась среда LB (отбор
клеток, несущих плазмиды, осуществлялся по антибиотикоустойчивости –
добавлением 100 мкг/мл ампициллина в среду). Для культивирования штаммов Saccharomyces cerevisiae использовалась среда YPD (отбор клеток, несущих плазмиды осуществлялся по маркеру URA3, позволяющему клеткам
используемого штамма расти на среде SD + 100 мкг/мл Leu, 20 мкг/мл His,
20 мкг/мл Trp без добавления урацила). Индукция экспрессии проводилась
а) для Escherichia coli – добавлением IPTG до концентрации 0,5 мМ к суспензии клеток в экспоненциальной фазе роста и культивированием в течение 3 часов при 300С; б) для Saccharomyces cerevisiae – культивированием в
течение 40-44 часов при 300С в среде YPD с добавлением 2% (w/vol) галактозы. Экспрессируемый белок получали ультразвуковым лизисом клеток
Escherichia coli либо центрифугированием культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae и последующим осаждением белка из супернатанта
метанолом. Наличие активности образцов проверялось по изменению оптической плотности при длине волны 235 нм (OD235) на спектрофотометре
UVmini1240 (Shimadzu) в растворе водорослевого альгината с концентрацией 2,5 г/л при 370С.
Результаты и обсуждение. На основании анализа литературных
данных в качестве объекта исследования был выбран белок Aly1-III, вырабатываемый бактериями Sphingomonas sp., обладающий высокой активностью
деградации альгината бактериального происхождения [2]. Соответствующий
ген был синтезирован и клонирован в экспрессионные вектора для Escherichia coli (модифицированный вектор pET под контролем промотора Т7
РНК-полимеразы) и Saccharomyces cerevisiae (вектор под контролем промотора GAL1).
Анализ экспрессии с помощью электрофореза в 15% SDS-полиакриламидном геле показал, что белок продуцируется в концентрации примерно
200 мг/л для Escherichia coli и 5-10 мг/л для Saccharomyces cerevisiae, а его
размер соответствует ожидаемому – 40 кДа.
Активность образцов определялась, как описано выше. Альгиназа
разрушает субстрат с образованием ненасыщенной связи у одного из остатков альгиновой кислоты в альгинате [3]. В результате повышается оптическая плотность при длине волны 235 нм. Как удалось показать секретируемая альгиназа, выделенная из культуральной жидкости Saccharomyces cerevisiae, разрушает альгинат при концентрации около 5-10 мг/л, причём (белок
был сконцентрирован из 1 мл культуральной жидкости, и тест на активность
альгиназы поводился в общем объёме 1 мл), причём скорость деградации
40
остаётся примерно постоянной за время проведения опыта (Рис. 1). Для образцов, полученных лизисом клеток Escherichia coli, достоверно обнаружить
активность таким методом не удалось, т.к. клеточные лизаты содержали вещества слишком большое количество веществ, препятствущих нормальному
измерению OD235.
3,5
3
OD235
2,5
2
Aly1-III
контроль
1,5
1
0,5
0
0
10
20
30
40
Время, мин
Рис. 1. Определение активности альгиназы Aly1-III
Таким образом в ходе исследований установлено, что альгиназа Aly1III, секретируемая дрожжами Saccharomyces cerevisiae, способна разрушать
водорослевый альгинат. Но альгинат, синтезируемый водорослями, отличается по структуре от бактериального: в нём встречаются более протяжённые
блоки, составленные только из одного мономера – маннуроната или гулуроната, тогда как в бактериальном они чаще чередуются друг с другом. Также
бактериальный альгинат О-ацетилирован по положениям 2 или 3 маннуроната. Подверженность альгината деградации определяется как последовательностью мономеров, так и степенью ацетилирования макромолекулы.
В связи с этим в дальнейших исследованиях предусматривается изучение активности белка по отношению к альгинату, выделенному из Pseudomonas aeruginosa, а также на живых бактериальных культурах.
Библиографические ссылки
1. Клонирование и экспрессия гена лизоцима бактериофага FMV в клетках
дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris./ Д.Г. Козлов, С.Э. Чеперегин, А.В. Честков, В.Н. Крылов, Ю.Д. Цыганков // Генетика,2010. Т. 46.
С. 340-348.
2. Alginate lyase: review of major sources and enzyme characteristics, structurefunction analysis, biological roles, and applications. / T.Y. Wong, L.A. Preston,
N.L. Schiller // Annu. Rev. Micribiol, 2000. V. 54. Р. 289-340.
3. Alginic acid metabolism in bacteria./ J. Preiss, G. Ashwell // J. Biol. Chem.,
1962. V. 237. Р. 309-316.
41