Занятие № 1 - Пятигорский медико

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ −
филиал государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего профессионального образования
«ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
Кафедра технологии лекарств
Д.В. Компанцев, З.Д. Хаджиева, Л.А. Мичник,
О.В. Мичник, А.А. Чахирова, В.А. Чахирова
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ
«БИОТЕХНОЛОГИЯ АНТИБИОТИКОВ»
Образовательная программа
«БИОТЕХНОЛОГИЯ (В ТОМ ЧИСЛЕ
БИОНАНОТЕХНОЛОГИИ)»
(подготовка научно-педагогических кадров)
НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ
06.06.01. БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Пятигорск 2015
УДК 615.012/.014(076)
ББК 82.я 829
М54
Рецензент:
И.Н. Андреева, д-р фармацевт. наук, проф. каф. ЭОЗиФ
Ю.А. Морозов, канд. фармацевт. наук, доц. каф. технологии лекарств
ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинского государственного университета
им. К.Л. Хетагурова, г. Владикавказ
Д.В. Компанцев, З.Д. Хаджиева, Л.А. Мичник,
О.В. Мичник, А.А. Чахирова, В.А. Чахирова
М 54 Методические рекомендации по освоению дисциплины
«Биотехнология
антибиотиков».
Образовательная
программа
«Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)». Направление
подготовки 06.06.01. БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ /Д.В. Компанцев,
З.Д. Хаджиева, Л.А Мичник, О.В. Мичник А.А. Чахирова, В.А.
Чахирова. – Пятигорск: ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО «Волг ГМУ»,
2015. – 37 с.
Методические рекомендации разработаны в соответствии с рабочей
программой дисциплины «Биотехнология антибиотиков» учебного
плана 140401 78-132(4)-3486 и предназначены для обучающихся по
образовательной
программе
подготовки
кадров
высшей
квалификации ««Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)»
очной и/или заочной формы обучения.
2
Занятие № 1
1. Тема: Введение. Биотехнология антибиотиков. Фармтехнология и
антибиотики. Основные этапы поиска антибиотиков.
2. Продолжительность занятия – 4 часов
3. Цель занятия:
Формирование системных знаний, умений и навыков по биосинтезу
антибиотиков и получению лекарственных препаратов с антибиотиками.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
 Историю выделения первого антибиотика, основные этапы
антибиотикотерапии
 Источники и способы получения современных антибиотиков, их
физические и химические свойства.
 Общие и специфические методы культивирования антибиотиков.
 Составы жидких питательных сред для ферментации и
синтетической агаризованной среды для выделения и
поддержания чистой культуры продуцента антибиотика.
 Основные стадии промышленного производства антибиотиков.
 Теоретические основы производства различных лекарственных
форм с антибиотиками.
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
 Пользоваться базовой терминологией, применяющейся в
биотехнологии.
 Применять на практике методы приготовления жидких,
агаризованных питательных сред в лабораторных условиях.
 Определять биологическую активность антибиотиков.
1.
2.
3.
4.
4. Выполнить следующие задания:
1. Приготовить агаризованную питательную среду.
Алгоритм действия:
Рассчитать необходимые количества компонентов для приготовления 100
мл среды
КCl, MgSO4 вносят в среду в виде растворов определенной концентрации
Заварить крахмал, налить в химический стакан ¼ рассчитанного
количества воды, добавить навеску крахмала и мела, размешать. Стакан с
содержимым поставить на кипящую водяную баню, нагреть
В крахмальный клейстер внести растворы солей и глюкозы
3
5. Рассчитанную навеску агар-агара поместить в стакан, залить холодной
водой и поместить на водяную баню
6. Раствор агара смешать с раствором крахмального клейстера,
7. Всё тщательно перемешать и довести рН до заданного параметра по
лакмусовой бумажке,
8. Простерилизовать.
2. Рассчитать необходимое количество компонентов для приготовления
жидких питательных сред
Алгоритм действия:
Рассчитать необходимое количество компонентов в соответствии с
заданием для приготовления 150 мл среды
Варианты состава ферментативных сред (%)
Компонент
1 вариант
2 вариант
Соевая мука
1,0
1,0
Кукурузная мука
2,0
1,0
Глюкоза
1,0
1,6
Натрия хлорид
0,5
0,5
Кальция карбонат
0,1
0,1
5. Информационные материалы
Введение
Антибиотики - самый большой класс фармацевтических препаратов,
которые
синтезируются
микроорганизмами.
В
настоящее
время
микроорганизмы продуцируют десятки видов соединений - аминокислот,
антибиотиков, белков, витаминов, липидов. Микробиологический синтез
различных веществ играет ключевую роль в биотехнологическом производстве.
История науки об антибиотиках началась с того момента, когда
лондонский микробиолог А.Флеминг обнаружил в 1929 году на агаровой среде
в чашке Петри, засеянной стафилококком, колонию плесневого гриба из рода
Penicillinum, образовавшуюся в результате случайно попавшей на агар из
воздуха споры этого гриба. Он заметил вокруг колонии зону прозрачного агара.
Гриб образовывал антибиотик пенициллин, который не только останавливал
размножение стафилококка, но и вызывал последующий лизис его клеток.
Начало современной промышленной микробиологии было положено в 40-х
годах, когда наладили производство пенпциллинов методами ферментации
нуклеиновых кислот, полисахаридов, пигментов, сахаров, ферментов и т. д.
После установления высоких лечебных свойств первого антибиотика —
пенициллина сразу же возникла задача организации производства его в
больших количествах. На первом этапе промышленное получение этого
препарата носило примитивный, экономически нерентабельный характер.
Выращивание продуцента антибиотика осуществлялось на средах,
находящихся в небольших сосудах при поверхностном культивировании гриба.
Процесс развития гриба продолжался 8—10 суток. Такой способ
культивирования гриба при большой затрате труда давал низкий выход
4
антибиотика, и себестоимость препарата была очень высокой. Безусловно,
такое получение антибиотика не могло удовлетворить запросы медицины. В
результате был предложен метод глубинного выращивания гриба в
ферментерах— при продувании воздуха и перемешивании культуральной
жидкости.
Основные этапы поиска антибиотиков
Несмотря на ведущийся в развитых странах широкий скрининг
антибиотиков, с каждым годом разрабатываются новые методологии поиска,
подразумевающие разработку современных тестов и создание рациональной
схемы их использования, а также изучение биологически активных соединений,
получаемых путем направленной химической трансформации генноинженерных производных антибиотиков, что существенно повышает
эффективность поисковых работ в обеспечении и
создании новых
лекарственных препаратов.
С биологической точки зрения антибиотики относятся к вторичным
метаболитам клетки. Это значит, что они синтезируются на определенной
стадии развития культуры-продуцента и их образование не является
обязательным для клетки. Представления о двухфазности микробиологического
синтеза вторичных метаболитов свидетельствуют, что в первую фазу
(ростовую, или трофофазу) происходит накопление относительно окисленных
соединений клетки, интенсивный синтез белков, нуклеиновых кислот,
углеводов, ферментов, а во время второй (продуктивной, или идиофазы) имеет
место синтез антибиотиков.
Среди других биологических особенностей образования антибиотиков
можно отметить следующие:
1) большинство антибиотиков являются вторичными метаболитами трех
главных групп организмов: эубактерий, актиномицетов, грибов. Немногие
антибиотики образуются высшими грибами, водорослями и растениями;
2) наиболее разнообразные антибиотики образуются актиномицетами (не
менее 50% из всех известных), мицелиальными грибами (около 10%), из
эубактерий наиболее часто продуцентами являются представители родов
Bacillus и Pseudomonas (около 400−600), причем большинство антибиотиков
бактериального происхождения – полипептиды;
3) очень часто определенный штамм образует семейство сходных по
структуре и одинаково синтезируемых антибиотиков, но возможно образование
одним продуцентом двух или более неродственных соединений;
4) образование антибиотиков не является видоспецифичным или
родоспецифичным свойством продуцента
Подавление антибиотиками роста других организмов включает два
понятия: бактериостатическое, при котором после удаления антибиотика из
среды рост восстанавливается, и бактерицидное – необратимое летальное
действие антибиотика на клетку. В том случае, если гибель микрооорганизма
определяется лизисом клетки, говорят о бактериолитическом действии
антибиотика.
Общие сведения о производстве антибиотиков
5
Успехи антибиотической отрасли промышленности и качество
выпускаемой продукции определяются уровнем основных
стадий
технологического процесса. Промышленное получение антибиотиков — это
сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда
последовательных стадий:
1) Стадия биосинтеза антибиотика. Это основная биологическая стадия.
Главная задача на этой стадии — создание оптимальных условий для развития
продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика. Высокая
результативность стадии зависит от уровня биосинтетической активности
продуцента антибиотика, времени его максимального накопления, стоимости
сред для культивирования организма.
2) Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток
(мицелия) микроорганизма и фильтрации. Эффективность стадии во многом
определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика,
характером его роста.
3) Стадия выделения и очистки антибиотика. На этой стадии в
зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и основного
места накопления антибиотического вещества применяются различные методы
выделения и очистки. В качестве основных методов используются следующие:
экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание,
сушка.
4) Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных
форм, расфасовка. Особенность стадии определяется очень высокими
требованиями к качеству конечного продукта. При химической очистке
антибиотических веществ необходимо соблюдать высокую чистоту
помещений, оборудования, проводить систематическую дезинфекцию их.
Для каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная
питательная среда. Среда должна соответствовать определенным требованиям
1) обеспечивать максимальное образование антибиотика
2) состоять из относительно дешевых компонентов;
3) иметь хорошую фильтрующую способность;
4) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения
и очистки антибиотиков.
Стерилизация питательных сред в промышленных условиях
осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.
В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания
микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного
культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в
толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается
стерильный воздух, и среда перемешивается.
В зависимости от того, где сосредоточено антибиотическое вещество,
применяют соответствующие методы его извлечения.
Если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют
методами экстракции, используя для этого не смешивающийся с водой
6
растворитель, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют
ионитами.
Из клеток микроорганизмов антибиотик выделяют экстрагированием
органическими растворителями. Если антибиотик содержится и в
культуральной жидкости, и в клетках продуцента, то сначала его переводят в
фазу, из которой наиболее целесообразно извлекать целевое вещество.
Отделение раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами
фильтрации или центрифугирования.
Очистка антибиотика (отделение от примесей) осуществляется методами
экстракции, ионообменной сорбции и осаждения. После химической очистки
антибиотик высушивают, для чего применяют лиофильную сушку,
высушивание в распылительной сушилке, высушивание во взвешенном слое
или в вакуум-сушильных аппаратах.
6.Задания для текущего контроля.
Вопросы по теме занятия:
1. История появления антибиотиков.
2. В каком году было налажено промышленное производстве пенициллина?
3. Что представляют собой антибиотики?
4. Каковы основные фармакологические и физико-химические свойства
антибиотиков?
5. Общая характеристика антибиотиков.
6. Биологические особенности и функции антибиотиков.
7. Классификация антибиотиков.
8. Основные стадии производства антибиотиков.
9. Чем объясняется необходимость изготовления лекарственных форм с
антибиотиками в асептических условиях?
10.Питательные среды, используемые в производстве антибиотиков.
Требования. Обязательные компоненты питательных сред.
Занятие № 2
1. Тема: Лекарственные формы с антибиотиками. Биофармация.
Основные понятии. Антибиотики в фармации.
2. Продолжительность занятия – 4 часа
3. Цель занятия:
Сформировать у аспиранта основные понятия о технологии
изготовления лекарственных форм с антибиотиками, в соответствие с
требованиями современных НД. Уметь готовить лекарственные формы с
антибиотиками и оценивать их качество.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
7
 Требования нормативной документации по изготовлению, оценке
качества и хранению лекарственных форм с антибиотиками.
 Основные свойства антибиотиков и влияние различных факторов
на их стабильность
 Классификацию антибиотиков по группам и механизму действия
 Способы биофармацевтической оценки препаратов антибиотиков
 Методы определения биологической активности препаратов
антибиотиков.
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
 Проводить мероприятия по созданию асептических условий
изготовления лекарственных форм с антибиотиками.
 Выбирать и обосновывать оптимальную технологию различных
лекарственных форм с антибиотиками.
 Определять биологическую активность антибиотиков
 Оценивать качество лекарственных форм с антибиотиками.
4. Выполнить следующие задания:
1. Приготовить мазь левомицетиновую 1%-10,0.
Алгоритм действия:
Левомицетин очень мало растворим в воде и вводится в виде суспензии в
состав мази. Левомицетин выписан в количестве до 5%, поэтому его
диспергируют с родственной к основе жидкостью. Мазь готовят в асептических
условиях, соблюдая правила асептики.
В стерильной ступке растирают левомицетин в сухом виде, по правилу
Дерягина с стерильным вазелиновым маслом (добавляют каплями). К смеси
частями примешивают основу до однородности. Мазь переносят в стерильную
баночку, оформляют «Глазная мазь».
2. Приготовить мазь бензилпенициллиновую 200000 ЕД - 10,0.
Алгоритм действия:
Готовят мази с антибиотиками на безводных мазевых основах. В качестве
безводной основы для пенициллиновых мазей используют смесь из 10%
безводного ланолина и 90% вазелина. Пенициллиновые мази на одном вазелине
не готовят, так как такие мази являются малоэффективными вследствие того,
что вазелин не всасывается кожей и плохо распределяется по влажным
слизистым оболочкам. Пенициллиновые мази, приготовленные на безводной
основе, выдерживают более длительное хранение, так как в присутствии воды
пенициллин быстро теряет свою активность.
В асептических условиях пенициллин растирают с небольшим количеством
стерильной, подогретой (до 40°С) мазевой основы. Затем при перемешивании
добавляют остальное количество мазевой основы и растирают до образования
однородной массы. Пенициллиновые мази следует хранить в сухом месте при
8
температуре не выше 10°. Срок годности пенициллиновых мазей,
приготовленных, на безводной основе, — до 4 месяцев.
5. Информационные материалы
Антибиотики занимают особое место в современной медицине. Они
являются объектом изучения различных биологических и химических
дисциплин. Наука об антибиотиках развивается бурно. За последние годы
открыты сотни антибиотиков с различным спектром действия, однако, в
клинике применяется ограниченное число препаратов. Это объясняется
главным образом тем, что большинство антибиотиков не удовлетворяют
требованиям практической медицины.
Антибиотики, в отличие от других лекарственных веществ, имеют
особенности физико-химических свойств: обладают недостаточно высокой
стабильностью при хранении; недостаточной кислотоустойчивостью; имеют
сравнительно короткий период полураспада; взаимодействуют со многими
вспомогательными веществами; плохо растворяются в воде (а водные
растворы некоторых антибиотиков недостаточно стабильны); термолабильны
(что полностью исключает их термическую стерилизацию); способны
проявлять химическую или фармакологическую несовместимость при
сочетании с другими лекарственными веществами.
Указанные свойства существенно влияют на технологию лекарственных
форм с антибиотиками.
Антибиотики классифицируют:
-- по спектру их действия: антибактериальные, антипротозойные,
противогрибковые, противовирусные, противоопухолевые и др. (антибиотики
разделяют на группы относительно их активности в отношении
грамположительных и грамотрицательных бактерий и микобактерий);
-- по механизму действия: подавляющие синтез клеточной стенки
микроорганизма;
синтез
белка;
репликацию
или
транскрипцию;
функционирование клеточной мембраны; синтез нуклеидов.
Согласно
этой
классификации
антибиотики
проявляют
бактериостатическое и бактерицидное действия.
Каждый антибиотик может подавлять ряд метаболических реакций в
зависимости от его концентрации в среде, причем с увеличением
концентрации антибиотика затрагивается все большее число метаболических
процессов микробной клетки. Блокирование одной из реакций может
привести вторично к подавлению других процессов обмена, что
обуславливает множественность точек приложения антимикробного действия
препаратов. На этой основе может быть построена классификация
антибиотиков как специфических ингибиторов некоторых биохимических
процессов, происходящих в микроорганизмах и опухолевых клетках.
1.
Специфические
ингибиторы
синтеза
клеточной
стенки
микроорганизмов: беталактамные антибиотики - пенициллины и
цефалоспорины. Циклосерин. Антибиотики группы ванкомицина.
2. Антибиотики, нарушающие молекулярную организацию и функции
клеточных мембран: Полимиксины. Полиены.
9
3. Антибиотики, подавляющие синтез белка на уровне рибосом:
Хлорамфеникол. Макролиды (эритромицин, олеандомицин). Линкомицин.
Фузидин. Тетрациклины.
4. Ингибиторы синтеза РНК на уровне РНК-полимеразы: Рифамицины.
5. Ингибиторы синтеза РНК на уровне ДНК-матрицы: Актиномицины.
Антибиотики группы ауреоловой кислоты.
6. Ингибиторы синтеза ДНК на уровне ДНК-матрицы: Митомицин С.
Антрациклины. Блеомицины.
Одним из требований, предъявляемых к препаратам антибиотического
действия, является удобная лекарственная форма для различных возрастных
групп и локализации процесса, обеспечивающая максимальный эффект и
стабильность в обычных условиях хранения.
Существует несколько лекарственных форм антибиотиков: таблетки,
сиропы, растворы, свечи, капли, аэрозоли, мази и линименты. Каждая
лекарственная форма имеет достоинства и недостатки.
Таблетки
Сиропы
Растворы
инъекций
Суппозитории
капли
для
и
Аэрозоли
Мази, линименты
Недостатки
1. Зависимость от моторики желудочно-кишечного тракта
2. Проблема точности дозировки
Достоинства
1. Безболезненно
2. Не требуется мед.персонал для введения препарата
Недостатки
1. Зависимость от моторики желудочно-кишечного тракта
2. Проблема точности дозировки
Достоинства
1. Удобны в применении в детской практике
Недостатки
1. Болезненно
2. Техническая сложность
Достоинства
1. Можно создать депо аппарата (под кожу)
2. 100% биодоступность (при в/в)
3. Быстрое создание максимальной концентрации в крови.
Недостатки
1. Применяются для местного лечения
Достоинства
1. Можно избежать системного воздействия на организм
Недостатки
1. Не все антибиотики можно превратить в аэрозоль
Достоинства
1. Быстрое всасывание
Недостатки
1. Применяются для местного лечения
Достоинства
1. Можно избежать системного воздействия на организм
Биофармация
К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, в
соответствии с Государственной фармакопеей предъявляются очень строгие
требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет
10
разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние
испытания на токсичность, пирогенность и другие жизненно важные функции
организма. Препараты изучают на разных видах животных в отношении его
острой и хронической токсичности (влияние на состав крови, центральную
нервную систему, дыхание и т. Д.).
Активность устанавливают диффузионным или турбидиметричесхим
методами. Государственная Фармакопея XI издания рекомендует для
количественного определения метод диффузии в агар, сущность которого
заключается в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и
стандартного образца антибиотика на тест-микроорганизм. Стандарты,
отвечающие
требованиям
международных
стандартов,
готовят
в
Государственном контрольном институте медицинских биологических
препаратов им. Л.А.Тарасевича, они выпускаются в запаянных ампулах
нейтрального стекла и хранятся при температуре не выше 0°С.
При определении биологической активности методом диффузии в агар
необходимо, чтобы зона задержки роста была достаточного диаметра и имела
четкие границы. После завершения инкубации измеряют диаметры зон
задержки роста тест-микроорганизма стандартным и испытуемым растворами.
Для повышения точности измерений находят среднее значение площадей зон
диффузии из трех опытов. Единица действия (ЕД) является величиной
биологической активности антибиотиков. За ЕД принимают минимальное
количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в
определенном объеме питательной среды. Количественное выражение 1 ЕД
различно у различных антибиотиков. Например, у натриевой соли
бензилпенициллина 1 ЕД соответствует 0,5988 мкг химически чистого
вещества, а у стрептомицина, тетрациклина и его производных 1 ЕД
соответствует 1 мкг химически чистого вещества. Расчет биологической
активности производят по стандартной кривой, предварительно построенной на
основании результатов определения пяти концентраций стандартного
препарата. Степень активности антибиотика в1 мг препарата вычисляют,
умножая полученную концентрации в ЕД/мл на степень разведения.
В соответствующих фармакопейных статьях приводятся значения
теоретической активности и нижний допустимый предел активности
испытуемого антибиотика в ЕД/мг. В настоящее время разработаны
ускоренные биологические методы определения антибиотиков в биологических
жидкостях. К ускоренным микробиологическим методам относят методы,
основанные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста
тест- микроорганизмов.
6.Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Что представляют собой антибиотики?
2. Каковы основные фармакологические и физико-химические свойства
антибиотиков?
3. Назовите основные группы антибиотиков, учитывая механизм их действия и
спектр влияния на клетки возбудителей инфекционных болезней.
11
4. Биологические методы анализа качества антибиотиков.
5. Какие Вам известны лекарственные формы препаратов с антибиотиками?
6. Преимущества и недостатки различных лекарственных форм с
антибиотиками.
7. Особенности изготовления мягких лекарственных форм с антибиотиками.
8. Особенности изготовления и стерилизации инъекционных лекарственных
форм с антибиотиками
9. Методы определения биологической активности лекарственных препаратов
антибиотиков.
10.Требования современных НД, предъявляемые к препаратам с антибиотиками
Занятие № 3
1. Тема: Классификация антибиотиков. Промышленное получение
антибиотиков микробиологическим способом.
2. Продолжительность занятия – 5 часов
3. Цель занятия:
Формирование системных знаний, умений и навыков по получению
лекарственных препаратов с антибиотиками битехнологическими методами
синтеза.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
 Классификацию антибиотиков по группам и механизму действия
 Источники и способы получения современных антибиотиков, их
физические и химические свойства.
 Основные сведения о сырье и питательных субстратах,
используемых для приготовления питательных сред.
 Способы промышленного получения различных антибиотиков.
 Основные стадии промышленного производства антибиотиков
микробиологическим методом.
 Методы стандартизации антибактериальных препаратов .
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
 Классифицировать препараты антибиотиков по механизму,
характеру и типу действия
 Пользоваться базовой терминологией, применяющейся в
биотехнологии.
 Применять на практике методы получения антибиотиков.
 Определять
биологическую
активность
антибиотических
препаратов.
4. Выполнить следующие задания:
12
1. Изучить технологию приготовления сыпучего субстрата для хранения
продуцента фермента.
Алгоритм действия:
1. Отбирают целые зерна перловой крупы из расчёта 15,0 на 1
коническую колбу.
2. В химический стакан насыпать 15,0 крупы и залить 20 мл холодной
воды. Поставить на водяную баню (около 30 мин) до полного удаления
воды.
3. Проваренную перловую крупу высыпать во флакон, закрыть ватномарлевой пробкой и бумажным колпачком (на колпачке указать дату и
номер группы).
4. Стерилизуют в автоклаве при 0,15 МПа в течение 30 мин 3 раза с
перерывом 18-24 часа.
2. Оценить влияние факторов на процесс ферментации (рН,
температура, аэрация)
Алгоритм действия:
1. С помощью потенциометра (рНметр типа рН-150) определить рН
питательной среды. Содержимое колбы с питательной средой перемешать
встряхиванием, ответсти столик рН-метра в сторону, в стаканчик налить
среду и подвести его под электроды. Затем столик повернуть обратно и
произвести измерения по индикаторной шкале. Результаты занести в
таблицу.
2. Провести определение температуры при ферментации. Оптимум для
пенициллинов – 26С, актиномиценты 27-29С, эритромицин 31-32С.
5. Информационные материалы
Все антибиотики можно классифицировать:
По механизму действия:
1. Нарушающие синтез биомакромолекул; циклосерин; гликопептиды;
ванкомицин; тейкоплакин).
2. Нарушающие функции цитоплазматической мембраны (циклические
полипептиды, полиеновые антибиотики).
3. Нарушающие синтез белка в рибосомах (группа левомицетина,
тетрациклина, макролиды, линкозамиды, аминогликозиды, фузидин,
анзамицины).
4. Ингибиторы синтеза РНК и ингибиторы метаболизма фолиевой
кислоты (рифампицины).
5. Ингибиторы синтеза мРНК (актиномицин).
По типу действия:
1. Антибиотики с бактерицидным действием приводят к гибели бактерий
путем влияния на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану и
приводящие к гибели бактерии.
2. Антибиотики с бактериостатическим действием влияют на синтез
макромолекул и останавливают размножение бактерий.
По спектру действия:
13
1. Антибиотики с преимущественным действием на грамположительные
микроорганизмы (линкозамиды, биосинтетические пенициллины, фузидин,
ванкомицин).
2. Антибиотики с преимущественным действием на грамотрицательные
микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды).
3. Антибиотики широкого спектра действия (аминогликозиды,
левомицетин, тетрациклины, пинемы, анзамицины, цефалоспорины).
Широкое применение антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве и
других отраслях народного хозяйства поставило задачу получения этих
биологически активных веществ в больших количествах. Решение этой задачи
стало возможным благодаря созданию мощной фармацевтической
промышленности.
В настоящее время различают три способа получения антибиотиков:
биологический, метод получения полусиитетических препаратов и синтез
химических соединений - аналогов природных антибиотиков
Синтетические антибиотики. Изучение химической структуры
антибиотиков дало возможность получать их методом химического синтеза.
Одним из первых антибиотиков, полученных таким методом, был левомицетин.
Большие успехи в развитии, химии привели к созданию антибиотиков с
направленно измененными свойствами, обладающих пролонгированным
действием, активных в отношении устойчивых к пенициллину стафилококков.
К пролонгированным препаратам относятся экмоновоциллин, бициллин 1,3,5.
Полусинтетические антибиотики. Их готовят комбинированным
способом: методом биологического синтеза получают основное ядро молекулы
нативного антибиотика, а методом химического синтеза, путем частичного
изменения химической структуры - полусинтетические препараты.
Большим достижением является разработка метода получения
полусинтетических пенициллинов. Методом биологического синтеза было
извлечено ядро молекулы пенициллина - 6-аминопенициллановая кислота (6АПК), которая обладала слабой антимикробной активностью. Путем
присоединения
к
молекуле
6-АПК
бензильной
группы
создан
бензилпенициллин, который теперь получают и методом биологического
синтеза. Широко применяемый до сих пор в медицине под названием
пенициллин, бензилпеиициллин обладает сильной химиотерапевтической
активностью, но активен лишь в отношении грамположительиых микробов и не
действует на устойчивые микроорганизмы, особенно стафилококки,
образующие фермент лактамазу.
Полусинтетические препараты получают также на основе 7аминоцефалоспориновой кислоты (7-АЦК). Производные 7-АЦК: цефалотин,
цефалоридин (цепории) не дают аллергических реакций у лиц, чувствительных
к пенициллину. Получены и другие полусинтетические антибиотики, например
рифампицип - эффективный противотуберкулезный препарат.
Микробиологический синтез. Полностью химическая структура
установлена одной трети известных антибиотиков и только половина из них
14
может быть получена химическим синтезом. Поэтому микробиологический
синтез получения антибиотических средств очень актуален.
Синтез микроорганизмами антибиотиков - одна из форм проявления
антагонизма; связан с определенным характером обмена веществ, возникшим и
закрепленным ходе его эволюции, то есть это наследственная особенность,
выражающаяся в образовании одного и более определенных, строго
специфичных для каждого вида антибиотических веществ.
Промышленное получение антибиотиков, как правило, осуществляется
путем
биосинтеза
и
включает
следующие
стадии:
получение
высокопродуктивных
штаммовпродуцентов,
разработка
наиболее
благоприятных условий культивирования продуцента антибиотика с
максимальным биосинтезом этого вещества, подбор и внедрение в практику
соответствующих методов выделения и очистки антибиотика, создание готовых
препаратов и контроль их качества.
Природные штаммы в большинстве своем малоактивны и не могут
использоваться для промышленных целей. Поэтому после отбора наиболее
активного природного штамма для повышения его продуктивности применяют
различные мутагены, вызывающие стойкие наследственные изменения.
Эффективными мутагенами являются мутагены физической природы ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, быстрые нейтроны или
химические вещества. Использование мутагенов позволяет не только повысить
продуктивность природного штамма, но и получать штаммы с новыми
неизвестными для природного микроорганизма свойствами.
Большое значение для биосинтеза антибиотика имеет подбор
рационального состава питательных сред.
Понятие «среда для культивирования» включает не только определенный
качественный и количественный состав компонентов или отдельных элементов,
необходимых для конструктивного и энергетического обмена организма
(источники азота, углерода, фосфора, источники ряда микроэлементов,
витамины и ростовые вещества), но также и физико-химические и физические
факторы (активная кислотность, окислительно-восстановительный потенциал,
температура, аэрация и др.). Все эти факторы взаимосвязаны и играют
существенную роль при развитии микроорганизмов.
Подбирая среды нужного состава, следует учитывать специфику
культивируемого организма. Это необходимо для создания оптимальных
условий, которые бы способствовали наилучшему росту микроба и биосинтезу
необходимых продуктов жизнедеятельности. Например, если организм не
может синтезировать некоторые существенные для него жизнедеятельности
соединения (как например, аминокислоты или витамины) из простых веществ
субстрата, то для его развития следует в состав ввести готовые аминокислоты
или витамины. К таким «требовательным» организмам относятся некоторые
виды бактерий (молочнокислые и др.). Актиномицеты и преимущественно
плесневые грибы, как правило, строят вещества своего тела и довольно
сложные по составу конечные продукты обмена из соединений, образуемых из
простых компонентов субстрата.
15
В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания
микроорганизмов - продуцентов антибиотиков или других биологически
активных соединений признан метод глубинного культивирования.
Очистка антибиотиков производится хроматографическими методами
(хроматография на оксиде алюминия, целлюлозе, ионитах) или противоточной
экстракцией. Очищенные антибиотики подвергают лиофильной сушке или в
вакуум-сушильных шкафах.
После выделения антибиотика проводят испытания его чистоты. Для
этого определяют его элементный состав, физико-химические константы
(температуру плавления, молекулярную массу, адсорбцию в видимой, УФ- и
ИК-областях
спектра,
удельное
вращение).
Исследуют
также
антибактериальную активность, стерильность и токсичность антибиотика.
6.Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Антибиотики. Определение. Характеристика данной группы
антибактериальных препаратов.
2. Какие Вам известны
фармакологические и физико-химические
свойства антибиотиков?
3. Классификация антибиотиков по механизму действия
4. Классификация антибиотиков по типу и спектру действия
5. Какие Вам известны способы получения антибиотиков?
6. В чем суть микробиологического способа получения антибиотиков?
7. Какие антибактериальные препараты получены полусинтетическим
методом?
8. Основные стадии промышленного способа получения антибиотиков.
9. Питательные среды, используемые для биосинтеза антибиотиков.
10.Какие требования предъявляются к питательным средам при
культивирования антибиотиков.
Занятие № 4
1.
Тема:
Биосинтез
антибиотиков.
Питательные
среды,
обеспечивающие рост и развитие продуцента, и биосинтез антибиотика.
Получение антибиотиков путем промышленного биосинтеза.
2. Продолжительность занятия – 5 часов
3. Цель занятия:
Сформировать у провизоров (аспирантов) систему знаний по методам
разработки и анализа питательных сред, обеспечивающих биосинтез
антибиотика. Изучить технологию культивирования продуцента антибиотика
в поверхностной и глубинной культуре.
16
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
 Основные сведения о процессе биосинтеза антибиотиков и
факторах, влияющих на этот процесс
 Источники и способы получения современных антибиотиков, их
физические и химические свойства.
 Питательные среды, используемые для культивирования
антибиотиков.
 Основные стадии промышленного производства антибиотиков.
 Устройство и основные конструкционные особенности
ферментеров и инокуляторов.
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
 Подбирать необходимые условия для производства антибиотиков.
 Проводить анализ качества приготовленной жидкой питательной
среды: рН, сахара, температура
 Проводить анализ содержания основных питательных веществ в
культуральной жидкости.
 Готовить агаризованную среду для посева на нее продуцента
антибиотика
4. Выполнить следующие задания:
1. Подготовить агаризованную питательную среду для посева
антибиотика.
Алгоритм действия:
Рассчитать необходимые количества компонентов для приготовления 100
мл среды. КCl, MgSO4 вносят в среду в виде растворов определенной
концентрации. Заварить крахмал, налить в химический стакан ¼ рассчитанного
количества воды, добавить навеску крахмала и мела, размешать. Стакан с
содержимым поставить на кипящую водяную баню, нагреть. В крахмальный
клейстер внести растворы солей и глюкозы
Рассчитанную навеску агар-агара поместить в стакан, залить холодной
водой и поместить на водяную баню. Раствор агара смешать с раствором
крахмального клейстера. Всё тщательно перемешать и довести рН до заданного
параметра по лакмусовой бумажке. Простерилизовать.
2. Произвести посев культуры продуцента антибиотика на
агаризованную среду в чашку Петри
Алгоритм действия:
1.Протереть поверхность стола дезрастворами.
2.Зажечь спиртовку.
4. Пробирку с продуцентом антибиотика взять в левую руку, в наклонном
горизонтальном положении.
5. В правую руку взять бактериологическую петлю и простерилизовать ее
в пламени горелки.
17
6.Ввести петлю в пробирку и захватить небольшое количество материала,
содержащего микроорганизмы, с поверхности агара. Закрыть пробирку.
7. Приподнять крышку чашки петри левой рукой и бактериологической
петлёй слегка коснуться поверхности агара и провести зигзагообразную черту.
8.Петлю обжечь, чтобы уничтожить оставшиеся на ней микроорганизмы
9.Чашку Петри подписать и поставить в термостат на 28С.
Продолжительность выращивания 10 суток.
5. Информационные материалы
Биосинтез антибиотиков - наследственная особенность организмов,
проявляющаяся в том, что каждый вид (штамм) способен образовывать один
или несколько вполне определенных, строго специфичных для него
антибиотических веществ. Образование антибиотиков будет происходить
только при развитии организма в специфической среде и при наличии особых
внешних условий. К числу наиболее существенных факторов, оказывающих
влияние на проявление антибиотических свойств микроорганизмов, относятся
состав среды, ее активная кислотность, окислительно-восстановительные
условия, температура культивирования, методы совместного выращивания
двух или большего числа микроорганизмов и другие факторы.
Натуральные (комплексные) среды, состоящие из природных соединений
и имеющие неопределенный химический состав (части зеленых растений,
животные ткани, солод, дрожжи, почва и т. д.), содержат все компоненты,
необходимые для роста и развития микроорганизмов большинства видов.
Используются следующие среды:
- мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным
экстрактом и пептоном входят хлорид натрия, фосфат калия, иногда глюкоза
или сахароза; используется обычно в лабораторной практике.
- картофельные среды с глюкозой и пептоном;
- среды с кукурузным экстрактом, соевой мукой, бардой и другими
веществами, в состав которых входят сульфат аммония, карбонат кальция,
фосфаты, глюкоза, сахароза, лактоза или иные углеводы и ряд других
соединений; среды успешно применяются в промышленности, т. к. являются
дешевыми и обеспечивают хорошее развитие микроорганизмов с высоким
выходом антибиотиков.
Поскольку натуральные среды не позволяют получать строгие
количественные данные для изучения физиологических и биохимических
особенностей организма, применяют синтетические среды, которые подбирают
для отдельных продуцентов индивидуально.
Стерилизация питательных сред в промышленных условиях
осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.
Периодический метод стерилизации применяется при использовании
небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до
определенной температуры (120—130°С) непосредственно в ферментерах или в
специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в
течение 30—60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего
охлаждается до 27—30°С.
18
Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при
использовании больших объемов среды. Непрерывный метод стерилизации
имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим: каждый элементарный
объем среды находится при высокой температуре короткое время; благодаря
более высоким температурам
стерилизации и короткой экспозиции
деструкция компонентов питательной среды минимальна; процесс легко
контролируем и управляем.
Подготовка посевного материала — процесс многоступенчатый.
Микроорганизм предварительно выращивают на агаризированной среде в
пробирке, затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной
средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в
течение 2—3 суток для каждой генерации. Из второй генерации культуры в
колбе делают посев в небольшой инокулятор, после чего хорошо развившуюся
культуру переносят в более крупный инокулятор, откуда и производят посев в
основном ферментере. Для посева в основной ферментер используют от 5 до 10
объемных процентов посевного материала (инокулята). Однако в случае
получения пенициллина споровый материал гриба, приготовленный на отрубях,
рисовых зернах или пшене, засевают сразу в инокулятор.
В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания
микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного
культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в
толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается
стерильный воздух, и среда перемешивается. Четыре основные модификации
глубинного способа выращивания микроорганизмов.
1)Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс
развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после
чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно
промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой.
Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.
2) Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется
в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной
жидкости.
3) Батарейный способ. Развитие микроорганизмов проходит в ряду
последовательно соединенных ферментеров.
4) Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от
указанных
модификаций
глубинного
культивирования
продуцентов
антибиотиков. В основе этого метода лежит то, что развитие микроорганизма
происходит в условиях непрерывного протока питательной среды, что
позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его
роста.
Для изучения условий образования антибиотиков и производства этих
биологически активных веществ в промышленных масштабах применяются
ферментеры — специальные герметически закрытые емкости, обеспечивающие
глубинное выращивание продуцентов антибиотиков. Ферментер снабжен
приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры,
19
поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными
приборами. Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста
продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиологобиохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или
системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе
стерилизации или воды для охлаждения. Наблюдение за основными
процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольноизмерительной аппаратурой. Это позволяет поддерживать на заданном уровне
температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха,
давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки,
позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу
развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса
инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для
лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб.
В зависимости от характера проводимых работ используются различного
типа ферментеры: лабораторные, полупроизводственные, производственные.
Процесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом
контроле всех его стадий, очень точно выполняется разработанный регламент
условий развития организма — продуцента антибиотика.
В процессе развития микроорганизмов образуемые ими антибиотики в
большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую
среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость выделяется лишь
часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток. У ряда
продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма. В
зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют
соответствующие методы его извлечения. Антибиотик выделяют методами
экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой, осаждают в
виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Из
клеток микроорганизмов выделение осуществляют с помощью экстракции
органическими растворителями. Для процесса фильтрации применяют
фильтрующие аппараты: фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр, центрифуги,
сепараторы.
После выделения и химической очистки антибиотика необходимо
удалить из полученного препарата свободную и связанную воду. Для этого
используют методы обезвоживания препаратов: лиофильную
сушку,
высушивание с применением распылительной сушилки, сушку в вакуумсушильных шкафах и т.д.................
6.Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Факторы, оказывающие влияние на проявление антибиотических
свойств микроорганизмовю.
2. Чем объясняется необходимость изготовления лекарственных форм с
антибиотиками в асептических условиях?
3. Питательные среды, необходимые для роста и развития продуцента, и
биосинтеза антибиотика.
20
4. Способы стерилизации питательных сред.
5. В чем суть глубинного метода культивирования продуцентов
антибиотиков?
6. Ферментеры в производстве антибиотиков. Характеристика. Основные
конструкционные особенности.
7. Методы выделения и химической очистки антибиотиков – экстракция,
сорбция, фильтрация.
8. Сушка антибиотиков. Характеристика. Оборудование.
9. Сублимационная сушка в производстве антибиотиков. Аппаратура,
используемая в производстве.
10. Распылительные сушилки в производстве антибиотиков. Аппаратура.
Занятие № 5
1.
Тема:
Биотехнология
пенициллина.
стрептомицина. Ингибиторы клеточных стенок.
Биотехнология
2. Продолжительность занятия – 4 часа
3. Цель занятия:
Ознакомиться с основами получения лекарственных препаратов с
помощью методов биотехнологии. Рассмотреть механизмы регуляции
биосинтеза
и
вторичных
метаболитов;
основные
положения
биотехнологического получения антибиотиков и их частные биотехнологии.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:

Механизмы биосинтеза вторичных метаболитов

Биотехнологию антибиотиков.

Общие и специфические методы культивирования антибиотиков.

Основные стадии промышленного производства антибиотиков.

Частные
биотехнологии
антибиотиков
(пенициллина,
стрептомицина)
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:

Пользоваться базовой терминологией, применяющейся в
биотехнологии.

Применять на практике методы приготовления жидких, и сыпучих
питательных сред в лабораторных условиях.

Определять содержание антибиотика в культуральной жидкости.
4. Выполнить следующие задания:
1. Определить содержания антибиотика в культуральной жидкости при
экстракции различными экстрагентами (ДМФА, безводным ацетоном).
21
Алгоритм действия.
В 4 сухие пробирки пипеткой с расширенным носиком налить по 1 мл
культуральной жидкости и по 9 мл различных экстрагентов (наливают с
помощью бюретки под тягой), подписывая при этом, где какой
экстрагент. Пробирки плотно закрыть резиновыми пробками и провести
экстракцию при интенсивном встряхивании в течение 30 минут.
2. Определить активность леворина спектрофотометрическим
методом
Алгоритм действия
1. Полученные экстракты отфильтровать в 4 сухие пробирки.
2. Фильтраты развести этанолом в 25 раз, для чего взять 0,2 мл фильтрата
и 4,8 мл этанола.
3. На спектрофотометре СФ-26 замерить оптическую плотность
спиртовых растворов при длине волны 380 нм. В качестве раствора сравнения
используется этанол.
Расчет содержания леворина в культуральной жидкости провести по
следующей формуле:
À  0,44 103  D  P1  P2 [ ÅÄ / ìë ],
Где 0,44 10 – коэффициент пересчёта экстинции антибиотика на его
биологическую активность,
D- оптическая плотность раствора при длине волны 380 нм,
P1 – разведение пробы при экстракции,
P2 – разведение пробы в этаноле
5. Информационные материалы
Уникальная природа клеточной стенки бактерий делает ее очевидной
мишенью для антибиотиков. В отличие от других микроорганизмов
микоплазмы, хламидии и риккетсии лишены клеточной стенки, поэтому они
обладают естественной резистентностью к антибиотикам, ингибирующим
синтез клеточной стенки. Данное свойство присуще антибиотикам двух
наиболее важных групп — бета-лактамам и гликопептидам. Группа беталактамов состоит из четырех подгрупп: пенициллины, цефалоспорины,
карбапенемы и монобактамы. Антибиотики этой группы обладают 4-членным
азотсодержащим бета-лактамным кольцом с различными замещениями в
кольце. Все они ингибируют синтез клеточной стенки бактерий, основным в
механизме действия является подавление перекрестного связывания боковых
цепей пептидов бактериальной клеточной стенки. В-Лактамы обладают
главным образом бактерицидным действием.
Схема производства пенициллина
Пенициллины относятся к β-лактамным антибиотикам, что обусловлено
наличием в их структуре общего для всей группы четырехчленного лактамного
кольца. Все пенициллины имеют одинаковое строение основной группы,
представленной тиазолидиновым кольцом, соединенным с β-лактамным
кольцом, и имеющим аминогруппы – 6-аминопенициланновая кислота (6АПК).
22
Схема биосинтеза молекулы пенициллина
Кетоглутарат + Ацетил-КоА
↓
Гомоцитрат
↓
α-кетоадипиновая кислота
↓
L-α-аминоадипиновая кислота (L-α-ААК)
↓← L-цистеин
L-α-ААК-L-цистеин (LL-дипептид)
↓← L-валин
L-α-ААК-L-цистеин-D-валин (LLD-трипептид)
↓
Моноциклический β-лактам
↓
Изопенициллин N (L-α-ААК-6-АПК)
↓ С6Н5СН2СООН
Бензилпенициллин (С6Н5СН2СО-6-АПК)
Для производства пенициллина применяют специально отобранные расы
плесневых грибов-суперпродуцентов рода Penicillum crysogenum.
Для промышленного производства пенициллина применяют биореакторы
с механическим перемешиванием. Питательная среда для производства
пенициллина содержит: кукурузный экстракт (2–3 %), глюкозу (2 %) лактозу (1
%), сульфат аммония, фосфаты (0,5–1 %), производные фенилуксусной кислоты
(0,3– 0,6 %), гидрол. В качестве углеводов часто используют сахарозу или
смесь лактозы с глюкозой (1:1). Глюкоза может снижать биосинтез
антибиотика; на средах, содержащих лактозу или сахарозу, биосинтез
антибиотика протекает активнее. Важную роль в процессе биосинтеза
пенициллина играет сера, содержащаяся в структуре антибиотика. В качестве
источников серы используются натрия сульфат и натрия тиосульфат. После
стерилизации и охлаждения питательная среды засевается проросшими
спорами гриба, аэрируется путем пропускания через нее воздуха и
перемешивается с помощью мешалки. Температура в период первой фазы – 30
ºС, во вторую фазу – 20 ºС, рН роста гриба – ниже 7,0, потребление углеводов
должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, либо
дробным внесением глюкозы. Подготовка посевного материала: сначала
размножаются споры на пшене во флаконах при 24–25 ºС в течении 4–5 сут.
Полученным споровым материалом засевают инокуляторы, затем посевные
аппараты (12–18 ч). В процессе ферментации необходимо соблюдение строгой
асептики.
После окончания процесса ферментации мицелий гриба отделяют
вакуум-фильтрованием или центрифугирование. Осадок на фильтре (мицелий
гриба) промывают водой для максимального выхода пенициллина. Из
культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде кислоты,
23
выделяют экстракцией неполярными органическими растворителями
(аминоацетатом, хлороформом, бутилацетатом и др.). Очистку антибиотика
проводят путем замены растворителей. Экстрагированный пенициллин в виде
кислоты переводят в водный раствор в виде соли, добавляя щелочь. Повторяя
эти операции, пенициллин концентрируют и очищают. Большинство
пенициллинов производят в виде натриевых и калиевых солей.
Схема биотехнологического получения стрептомицина
Стрептомицин принадлежит к группе аминогликозидных антибиотиков.
Стрептомицин – антибиотик, образующийся в процессе жизнедеятельности
лучистых грибов Streptomyces globisporus, Streptomycini или др. родственных
микроорганизмов.
Антибиотик выпускается в виде сульфата. Стрептомицина сульфат
обладает широким спектром антимикробного действия. Для производства
стрептимицина применяют штамм актиномицета Streptomyces griseus,
образующего воздушный мицелий и спор.
В качестве основы питательных сред применяют гидролизаты
растительных и животных белков. Основными компонентами питательных.
сред, применяющихся при промышленном получении стрептимицина,
являются: соевая мука, гидрол и аммонийные соли.
Для стабилизации признаков, связанных с антибиотикообразованием, при
хранении и поддержании штамма в среды добавляют антимутагены (пуриновые
нуклеотиды, ионы марганца, L-метионины, гистидин, полиамины, кофеин).
Среду стерилизуют при 120 ºС, охлаждают и засевают посевным
материалом. При развитии продуцента различают 2 стадии. На первой стадии
происходит быстрый рост и развитие микроорганизма с энергичным
использованием основных компонентов субстрата, максимальное потребление
кислорода. В цитоплазме вначале высокого содержания РНК, ДНК не
наблюдается и обнаруживается лишь через 12 ч развития. На этой стадии
стрептомицин синтезируется в незначительном количестве. Через 28 ч масса
мицелия прекращает увеличиваться, начинается вторая стадия, связанная с
образованием стрептомицина. На 3 сут. рН с 7,9 уменьшается до 6,7, на 4–5 сут.
– вновь возрастет до 7,7. Вторая стадия характеризуется медленным
потреблением оставшихся в среде питательных веществ, замедлением роста
актиномицета, снижением потребления кислорода, автолизом мицелия,
максимальным образованием стрептомицина. Максимальное накопление
стрептомицина наблюдается, когда автолитические процессы начинают
преобладать над процессами роста. Культивирование проводится при 27 – 29 ºС
и сопровождается аэрацией, рН 7,5 – 8,0 и перемешиванием.
В культуральной жидкости находятся минеральные вещества, белки,
нуклеиновые кислоты, аминокислоты, полисахариды, жиры, стрептомицин и
др. Остальная часть стрептомицина выделяется в культуральную среду, но
часть его остается в мицелии и на его поверхности. С целью извлечения
стрептомицина из культуры продуцента культуральную жидкость вместе с
биомассой обрабатывают минеральной кислотой. При этом весь антибиотик
переходит
в
раствор.
Мицелий
отделяют
фильтрованием
или
24
центрифугированием. Далее ведется выделение стрептомицина в чистом виде.
Для выделения культуральной жидкости в чистом виде используются методы
адсорбции на активированном угле и метод ионообменной хроматографии. В
основу первого метода положена адсорбция стрептомицина из фильтрата на
активированном угле при нейтральном или слабощелочном рН среды (при рН
2–4 стрептомицин остается в растворе, примеси адсорбируются на сорбенте).
После удаления примесей на активированный уголь адсорбируют из
подщелоченной среды антибиотик, который десорбируют с сорбента
разбавленным спиртовым раствором соляной кислоты, после его нейтрализуют
и концентрируют путем выпаривания. Полученный концентрат обрабатывается
ацетоном, осаждающим солянокислый стрептомицин. Смесь фильтруется через
фильтр-пресс. К безводному спиртовому раствору соли стрептомицина
добавляют спиртовой раствор хлористого кальция, чтобы получить
кристаллическую соль стрептомицина.
В асептических условиях соль стрептомицина растворяют в воде,
пропускают через бактериальный фильтр для удаления микроорганизмов,
лиофильно высушивают, измельчают в порошок и фасуют.
6.Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Антибиотики. Классификация по механизму действия.
2. Основные фармакологические и физико-химические свойства беталактамов.
3. Пенициллины. Определение. Характеристика данной группы
антибиотиков.
4. Условия,
необходимые
для
промышленного
производства
пенициллина.
5. Факторы, влияющие на стабильность препаратов антибиотиков.
6. Лекарственные
формы
препаратов
группы
пенициллина.
Фармакокинетика.
7. Стрептомицин. Определение. Характеристика .
8. Основные фармакологические и физико-химические свойства группы
аминогликозидных антибиотиков.
9. Промышленное производство стрептомицина.
10. Питательные среды, используемые в производстве стрептомицина.
Условия культивирования.
Занятие № 6
1. Тема: Специфические ингибиторы синтеза клеточной стенки
микроорганизмов. Ингибиторы синтеза РНК.
2. Продолжительность занятия – 4 часа
3. Цель занятия:
25
Ознакомиться с основами получения лекарственных препаратов с
помощью методов биотехнологии. Познакомить аспирантов с механизмами
действия антибиотиков. Дать теоретические знания об использовании
антибиотиков с целью ингибирования клеточной стенки и синтеза РНК.
Обеспечить приобретение студентами практических навыков применения
антибиотиков при различных бактериальных инфекциях.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:

Механизмы биосинтеза вторичных метаболитов

Классификацию антибиотиков по механизму действия.

Ингибиторы клеточной стенки микроорганизмов.

Ингибиторы синтеза РНК.

Основные свойства антибиотиков и влияние различных факторов
на их стабильность.
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:

Пользоваться базовой терминологией, применяющейся в
биотехнологии.

Проводить мероприятия по созданию асептических условий
изготовления лекарственных форм с антибиотиками.

Рассчитывать количества антибиотиков с учетом их активности в
ЕД.

Готовить различные лекарственные формы с антибиотиками с
выполнением основных технологических операций.

Выполнять письменные и тестовые задания по теме занятия.
4. Выполнить следующие задания:
1. Приготовить капли для носа, по следующей прописи:
Бензилпенициллина натриевой соли 500000 ЕД
Раствора натрия хлорида изотонического 20 мл
1. Капли для носа с антибиотиком готовят в асептических условиях.
2. В подставке приготовить изотонический раствор натрия хлорида.
3. В полученном стерильном растворе растворить бензилпенициллина
натриевую соль.
4. Профильтровать.
2. Приготовить глазные капли с левомицитином 2% по прописи:
Laevomycetini 0,02
Solutionis Novocaini 0,1
Acidi borici 2 %-10 мл
Алгоритм действия:
Пропись совместима благодаря присутствию кислоты борной, которая
улучшает растворимость левомицетина и повышает стойкость новокаина.
Борную кислоту и левомицетин (термостабильное вещество) растворяют в
теплой воде для инъекций, раствор охлаждают и в нем растворяют новокаин.
26
Раствор стерилизуют текучим паром при 100 °С 30 минут. Для повышения
стойкости раствора добавить в качестве стабилизатора 1 каплю 0,1М раствора
кислоты хлористоводородной.
5. Информационные материалы
Классификация механизмов действия антибиотиков
Изучение механизмов действия таких высокоактивных и, вместе с тем,
избирательных ингибиторов метаболизма, как антибиотики, связано с
определенными проблемами, так как помимо первичного нарушения метаболизма,
вызываемого непосредственно реагированием антибиотика с его внутриклеточной
мишенью,
наступает
множество
вторичных
реакций,
ведущих
к
бактериостатическому или бактерицидному, а иногда и литическому эффектам.
Применяемые в фармакотерапии антибиотики по механизму действия
дифференцируются на следующие основные группы:
 ингибиторы образования клеточной стенки бактерий;
 ингибиторы белкового синтеза из бактерий;
 ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот;
 ингибиторы функций цитоплазматической мембраны микробной клетки.
Ингибиторы образования клеточной стенки микроорганизмов
Ингибирование происходит вследствие избирательного подавления
активности тех или иных ферментов, включенных в многоэтапный синтез
основного полимера клеточной стенки - пептидогликана. В число ингибиторов
синтеза пептидогликана входят цефалоспорины и другие вещества беталактамной
структуры.
Пептидогликан, в соответствии со своим названием, состоит из
принципиально разных частей. Его длинные параллельные гликановые нити
построены из перемежающихся остатков двух сахаров: N-ацетилглюкозамина и
мурамовой кислоты. Мурамовая кислота (ее название - от греч. μυρυζ - стена, так
как впервые она была обнаружена в клеточной стенке бактерий) является эфиром
N-ацетилглюкозамина и молочной кислоты. Пептидная часть полимера состоит из
коротких пептидных цепочек (трех-пяти аминокислотных остатков), отходящих от
остатков мурамовой кислоты в гликане.
Пептидные цепочки, ответвляющиеся таким образом от параллельных
гликановых нитей, замыкаются пептидной связью. Между параллельными нитями
гликана образуются поперечные пептидные мостики и формируется завершенный
или целостный пептидогликан, который жесткой «сетью» охватывает всю
бактериальную клетку.
Беталактамные антибиотики во время биосинтеза пептидогликана подавляют
катализируемое ферментами замыкание пептидных цепочек в пептидные мостики.
Гликановые нити остаются разъединенными и формирования непрерывной сети
пептидогликана, охватывающей клетку, не происходит. Это означает, что
пептидогликан теряет свои свойства, жизненно необходимые бактериальной
клетке.
Бактериальные клетки делятся, увеличиваются в размерах, вновь делятся и
т.д., а это требует постоянного синтеза пептидогликана и вставки вновь
27
синтезированных фрагментов в полимер, который для этого разрезается
специфическими гидролазами пептидогликана.
В нормальных условиях в клетке сохраняется баланс между действием
ферментов, гидролизующих пептидогликан и синтезирующих его.
В присутствии беталактамных антибиотиков этот баланс нарушается.
Прекращается синтез пептидогликана, но его ферментативный гидролиз
продолжается и даже усиливается из-за того, что клеточная стенка теряет
некоторые компоненты, сдерживающие их активность путем обратимого
блокирования гидролаз.
Механизм антибиотической активности беталактамов связан с теми
ферментами - мишенями, которые не имеют аналогов в животной клетке. В ней нет
ни жесткой клеточной стенки, ни пептидогликана, ни ферментов его синтеза.
Таким образом, беталактамы не могут быть токсичны для организма человека, а
если у некоторых из них при определенных условиях выявляются токсические
свойства или аллергенностъ, то это не связано с механизмом их
антибактериального действия.
Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот
К этой группе антибиотиков (антрациклины, блеомицин, оливомицин и др.)
относится ряд ДНК-тропных противоопухолевых веществ. Они подавляют синтез
РНК, а некоторые из них - синтез и ДНК, и РНК, поскольку связываются с ДНК.
Такие антибиотики всегда более токсичны, потому что связываются с ДНК
любого происхождения - бактериального, вирусного, растительного, животного.
Возможность их применения как цитостатиков в онкологической практике
обусловлена тем, что клетки опухолей растут (размножаются) быстрее клеток
нормальной ткани, и антибиотический эффект на опухоли выражается сильнее.
Ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот могут быть не только ДНКтропные антибиотики. Антибиотик рифампицин - ингибитор синтеза РНК,
связывается не с ДНК-матрицей, а с ферментом - РНК-полимеразой, причем
связывается избирательно: только с ферментом из бактерий, а не из животных
клеток. Рифампицин применяется для лечения ряда инфекций, в том числе
туберкулеза, так как может длительно вводиться человеку без проявления
токсичности.
К числу ингибиторов ферментов, участвующих в синтезе и превращениях
нуклеиновых кислот, относятся и новые синтетические антибактериальные
вещества - фторхинолоны, внедряемые в настоящее время в лечебную практику.
В литературе встречаются данные о влиянии фторхинолонов на развитие
хрящевой ткани (в связи с этим применение фторхинолонов в детской клинике не
рекомендуется). Они не являются продуктами биотехнологического производства.
Однако учитывая их практическую важность, а также возможность получения
ковалентно связанных цефалоспоринов с фторхинолонами, кратко рассмотрим
механизм их действия.
Фторхинолоны являются ингибиторами фермента ДНК-гиразы. Функция этого
фермента - введение в кольцевую ДНК «супервитков» или «скручивание» ее
молекулы. Молекула ДНК становится более компактной, а также приобретает
«внутреннее напряжение»: при разрезании ее рестриктазами комплементарные
28
нити быстро расходятся, чем облегчается действие ДНК- и РНК-полимераз при
репликации ДНК или транскрипции (синтезе РНК на ДНК-матрице).
Фторхинолоны подавляют функции так называемой субъединицы А.
Бактериальная ДНК-гираза относится по классификации ферментов к ДНКтопоизомеразам. В реакции с ДНК-топоизомеразами животной клетки
фторхинолоны не вступают.
Ингибиторы беталактамаз.
Учитывая сходство многих беталактамаз с ферментамн-мишениями для
беталактамов, обясняемое происхождением беталактамаз от этих ферментов, был
предпринят поиск специфических ингибиторов беталактамаз. Предполагалось, что
определенные беталактамные структуры могут быть или очень медленно
используемыми субстратами, фактически блокирующими активный центр
беталактамаз, или аналогами субстратов, необратимо реагирующими с активным
центром беталактамаз.
Действительно, среди природных беталактамов и продуктов их химической
трансформации, среди синтетических беталактамных структур были отобраны
ингибиторы беталактамаз. Некоторые из них действуют и на беталактамазы, и на
транспептидазы пептидогликанов, то есть обладают антибактериальной
активностью. Другие реагируют только с беталактамазами и, таким образом,
антибактериальной активностью не обладают или почти не обладают.
Практическая ценность ингибиторов беталактамаз обусловлена там, что их
используют вместе с беталактамными антибиотиками, которые чувствительны к
беталактамазам. Ингибиторы беталактамаз защищают эти антибиотики от
ферментативной инактивации.
Широкую известность получили такие ингибиторы как клавулановая кислота,
сульбактам и другие. Однако необходимо учитывать то обстоятельство, что
конкретный ингибитор не может воздействовать на все многочисленные типы
беталактамаз. Спектр действия каждого ингибитора ограничен лишь частью типов
беталактамаз, распространенных среди бактерий.
За рубежом выпускается смесь полусинтетмческого пенициллина
(ампициллина) с сульбактамом под фирменным названием «Уназин», а также
препарат
"Сультамициллин",
представляющий
химическое
соединение
ампициллина с сульбактамом. Получили практическое применение и препараты,
являющиеся смесью полусинтетического пенициллина - амоксициллина с
клавулановой кислотой - «Огментин» и «Амоксиклав», в которых клавулановая
кислота применяется в виде солей, в частности, калиевой.
6.Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1.Что представляют собой антибиотики?
2.Каковы основные фармакологические и физико-химические свойства
антибиотиков?
3.Классификация антибиотиков по механизму действия
4.Чем объясняется необходимость изготовления лекарственных форм с
антибиотиками в асептических условиях?
29
5.Факторы, влияющие на стабильность лекарственных препаратов с
антибиотиками
6.Беталактамы. Определение. Характеристика группы.
7. С чем связан механизм антибиотической активности беталактамов?
8.Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот. Характеристика группы
антибиотиков.
9.Фторхинолоны. Характеристика. Побочное действие препаратов данной
группы.
10.Клавулоновая кислота. Сульбактан. Механизм ингибирования.
1. Задание для рубежного контроля.
1.В роли биообъектов могут выступать
а) растения, культивируемые в искусственных условиях
б) выращиваемые в особых стерильных условиях животные-гнотобионты
в) клетки микро- и макроорганизмов и ферменты
г) продукты жизнедеятельности микроорганизмов
2.При росте клеток на питательной среде выделяют
последовательные стадии
а) лаг-фаза, фаза отмирания, лог-фаза
б) лог-фаза, идиофаза, стационарная фаза, фаза отмирания
в) трофофаза, идиофаза
г) лаг-фаза, трофофаза
следующие
3.Укажите способ выделения БАВ из клеток организма-продуцента.
а) высаливание
б) центрифугирование
в) фильтрация
г) экстракция органическим растворителем
4.Введение углеводов в состав питательных сред для культивирования
растительных клеток обусловлено необходимостью обеспечения
а) энергетического питания клеток
б) осмотического давления среды
в) электролитного состава среды
г) стабильности клеточных мембран
5. При производстве антибиотиков катаболитная репрессия заключается в
а) стимуляции синтеза целевого продукта при наличии в среде
легкоусвояемых источников энергии
б) угнетении синтеза целевого продукта при отсутствии в среде
легкоусвояемых источников энергии
в) угнетении синтеза целевого продукта при наличии в среде легкоусвояемых
источников энергии
30
г)стимуляции синтеза целевого
легкоусвояемых источников энергии
продукта
при
отсутствии
в
среде
6. Причины высокой эффективности антибиотических препаратов «уназин» и
«аугментин» заключаются:
а) в невысокой токсичности (по сравнению с ампициллином и
амоксациллином);
б) в невысокой стоимости;
в) в действии на резистентные к бета-лактамам штаммы бактерий;
г) в пролонгации эффекта.
7. Какое свойство нового беталактамного антибиотика наиболее ценно при лечении бактериальных осложнений у больных с ВИЧ-инфекцией?
а) устойчивость к беталактамазам;
б) слабая токсичность;
в) связывание с ПСБ 2;
г) пролонгированная циркуляция.
8. Для проверки какого качества серийного инъекционного препарата пенициллина используется в медицинской промышленности пенициллиназа (беталактамаза)?
а) токсичность;
б) прозрачность;
в) стерильность;
г) пирогенность.
9. Антибиотикотолерантность патогена обусловлена:
а) разрушением антибиотика;
б) активным выбросом;
в) низким содержанием автолизинов;
г) отсутствием мишени для антибиотика.
10. Комплексный компонент питательной среды, резко повысивший производительность ферментации в случае пенициллина:
а) соевая мука;
б) гороховая мука;
в) кукурузный экстракт;
г) хлопковая мука.
11. В питательных средах в качестве источника азота используются:
а) соевая мука;
б) крахмал,
в) сахароза;
г) аммоний фосфорнокислый
31
12.В питательных средах рН устанавливают:
а) добавлением воды;
б) растворов витаминов;
в) растворов антибиотиков;
г) концентрированных растворов кислот и щелочей
13. С какой целью проводится предварительная обработка культуральной
жидкости?
а) увеличение выхода целевого продукта
б) удаление белково- коллоидных структур
в) увеличение скорости фильтрации
14. Какие питательные среды
характеристики?
а) грибного происхождения
б) актиномицетного происхождения
в) бактериального происхождения
имеют
наихудшие
фильтрационные
15. Какой из методов предварительной обработки культуральной жидкости
является наиболее мягким и эффективным.
а) тепловая коагуляция;
б) кислотная коагуляция)
в) обработка полиэлектролитами
в) обработка неорганическими электролитами
16. Культуральная жидкость после окончания процесса ферментации
содержит;
а) клетки биообъекта;
б) растворы кислот и щелочей;
в) полиэлектролиты;
г) коллагеновые иониты
17. Процесс экстрагирования из твердой фазы растворителем проводят:
а) в теплообменниках;
б) в аппаратах, работающих по принципу делительной воронки;
в) в цилиндроконических аппаратах;
г) в простых реакторах с мешалкой
18. Процесс экстракции из жидкой фазы растворителем проводят:
а) в теплообменниках;
б) в аппаратах, работающих по принципу делительной воронки;
в) в цилиндроконических аппаратах;
г) в простых реакторах с мешалкой
32
19. Источниками азотного питания для продуцентов БАВ служат:
а) кукурузный экстракт;
б) зеленая патока;
в) крахмал;
г) меласса
20. Источниками минерального питания для продуцентов БАВ служат:
а) кукурузный экстракт;
б) сахароза;
в) фосфорная кислота
г) аммониевые соли неорганических кислот
21. Питательные среды для выращивания микроорганизмов отличаются от
питательных сред для роста клеток растений:
а) наличием в среде углеводов;
б) компонентным составом;
в) наличием в среде источников азота;
г) рН среды
22. Биосинтез антибиотиков, используемых в качестве лекарственных
веществ, эффективен только на средах:
а) богатых источниками азота;
б) богатых источниками углерода;
в) богатых источниками фосфора;
г) обогащенных аминокислотами
23. Антибиотиками называются:
а) высокомолекулярные вещества, вырабатываемые
процессе их жизнедеятельности, способные задерживать
других микроорганизмов
б) низкомолекулярные вещества, вырабатываемые
процессе их жизнедеятельности, способные задерживать
других микроорганизмов
микроорганизмами в
или подавлять рост
микроорганизмами в
или подавлять рост
24.При производстве антибиотиков катаболитная репрессия заключается в
а) стимуляции синтеза целевого продукта при наличии в среде
легкоусвояемых источников энергии
б) угнетении синтеза целевого продукта при отсутствии в среде
легкоусвояемых источников энергии
в) угнетении синтеза целевого продукта при наличии в среде легкоусвояемых
источников энергии
г)стимуляции синтеза целевого продукта при отсутствии в среде
легкоусвояемых источников энергии
33
25. Основное преимущество полусинтетических производных эритромицина азитро-, рокситро-, кларитромицина перед природным антибиотиком обусловлено
а) меньшей токсичностью
б) бактерицидностью
в) активностью против внутриклеточно локализованных паразитов
г) действием на грибы
д) бактериостатичностью
26. Антибиотики с самопромотированным проникновенным в клетку
патогенна
а) бета-лактамы
б) аминогликозиды
в) макролиды
г) гликопептиды
д) пептиды
27. Защита продуцентов аминогликозидов от собственного антибиотика
а) низкое сродство рибосом
б) активный выброс
в) временная ферментативная инактивация
г) компартментация
д) наличие белка «ловушки»
28. Из вторичных метаболитов микроорганизмов ингибитором сигнальной
трансдукции является
а) стрептомицин
б) нистатин
в) циклоспорин А
г) эритромицин
д) канамицин
29. Пенициллинацилаза используется при
а) проверке заводских серий пенициллина на стерильность
б) оценке эффективности пенициллиновых структур против резистентных
бактерий
в) получении полусинтетических пенициллинов
г) снятии аллергических реакций на пенициллин
д) снятии пирогенных реакций
30. Пенициллинацилаза катализирует
а) расщепление беталактамного кольца
б) расщепление тиазолидинового кольца
в) отщепление бокового радикала при С6
г) деметилирование тиазолидинового кольца
д) метилирование тиазолидинового кольца
34
31. Свойство беталактамов, из-за которого их следует, согласно GMP,
нарабатывать в отдельных помещениях
а) общая токсичность
б) хроническая токсичность
в) эмбриотоксичность
г) аллергенность
д) пирогенность
32. Комплексный компонент питательной среды,
производительность ферментации в случае пенициллина
а) соевая мука
б) гороховая мука
в) кукурузный экстракт
г) хлопковая мука
д) рисовая мука
резко
повысивший
33. Антибиотикотолерантность патогена обусловлена
а) разрушением антибиотика
б) активным выбросом
в) низким содержанием автолизинов
г) отсутствием мишени для антибиотика
д) конформацией мишени
34. Причина распространения беталактамаз среди возбудителей в клинике это частота применения
а) беталактамных антибиотиков
б) аминогликозидов
в) тетрациклиновых антибиотиков
г) макролидов
д) фторхинолонов
35. Антибиотики, способные
грамотрицательных бактерий
а) бензилпенициллин
б) эритромицин
в) ампициллин
г) фузидин
д) нистатин
проникать
через
внешнюю
мембрану
36. В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания
микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан:
а) метод глубинного культивирования
б) метод поверхностного культивирования
в) метод покровного культивирования
35
37. Активность антибиотиков устанавливают:
а) диффузионным методом
б) дифферениальной спектрофотометрией
в) гравиметрически
38. За ЕД антибиотика принимают:
а) минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тестмикроорганизма в определенном объеме питательной среды
б) максимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тестмикроорганизма в определенном объеме питательной среды
в) количество антибиотика, обладающее бактериолитическим действием
39. К антибиотикам- ингибиторам синтеза нуклеиновых кислот относится
а) бициллин
б) блеомицин
в) тетрациклин
г) оксицилин
40. К антибиотикам – ингибиторам бетталактамаз относится
а) амоксиклав
б) цефтриаксон
в) левомицетин
г) бицилин
1-в
2-в
3-г
4-а
5-в
6-в
7-в
8-в
9-в
10-в
11-г
12-а
13-в
14-б
15-в
16-а
17-г
18-б
19-а
20-в
ОТВЕТЫ НА ТЕСТЫ
21-б
22-б
23-б
24-в
25-в
26-б
27-в
28-в
29-в
30-в
31-г
32-а
33-а
34-а
35-в
36-а
37-а
38-а
39-б
40-а
Ситуационные задачи
1.Установите правильную последовательность стадий и операций
технологического процесса, представленных на схеме, заполните недостающие
операции и стадии «Культивирование биообъекта». Предложите варианты и
аппаратурное оснащение для культивирования биообъекта в периодическом
режиме.
1. подготовка и стерилизация оборудования
36
2. подготовка и стерилизация газового потока
3. подача газового потока в реактор
4. подготовка и стерилизация субстрата
5. внесение питательной среды в биореактор
6. рост биомассы биообъекта
7. биосинтез целевого продукта
8. подготовка биообъекта
9. культивирование биообъекта
10.анализ целевого продукта
11.концентрирование и сушка целевого продукта
12.фасовка, упаковка и маркировка лекарственной субстанции
13.выделение целевого продукта
14.биологическая очистка отходов
Ответ: 8, 1, 4, 2, 9, 13, операции: 5, внесение культуры в биореактор, 3, 6, 7,
11,10, 12, 14.
Периодическое культивирование биообъекта предполагает периодическое
внесение в ферментер увеличивающегося количества питательных веществ. Состав
культуральной среды, концентрация микроорганизмов (биомассы) количество
белкового продукта или метаболита зависят от фазы роста, клеточного
метаболизма, наличия питательных веществ.
Периодическое культивирование с добавлением субстрата – периодическое
внесение увеличивающегося количества питательных веществ. Периодическое
внесение субстрата приводит к удлинению экспоненциальной и стационарной фаз,
к увеличению биомассы, и количества метаболитов.
Ферментаторы периодического действия из групп (ФЖГ) - газовой и жидкой
фазы применяются для получения антибиотиков. Конструкция этого ферментатора
обеспечивает стерильность ферментации длительное время. Это цилиндрический
вертикальный аппарат со сферическим днищем, имеющий аэрирующий,
перемешивающий и теплопередающий устройства. Воздух для аэрации поступает в
ферментатор через барботер. Отверстия в барботере направлены вниз, барботер
должен соответствовать диаметру мешалки. Эффективность работы ферментатора
определяется интенсивностью перемешивания. Перемешивающие устройства
служат для сохранения температуры во всем объеме аппарата, своевременному
подводу продуктов питания к клеткам и вывода продуктов метаболизма. Для
культуральных жидкостей с высокой степенью вязкости эффективными являются
открытые турбинные мешалки с шестью лопастями.
2. При биосинтезе пенициллина стал изменяться рН среды в кислую сторону.
Перечислите явления, наблюдаемые вследствие изменения рН среды в процессе
ферментации и возможные пути регулирования рН в питательных средах.
Ответ: для биосинтеза большинства антибиотиков оптимальный рН близок к
нейтральному. При значительном закислении или защелачивании среды процесс
биосинтеза тормозится. Кроме того многие антибиотики в щелочных или кислых
средах неустойчивы и быстро инактивируются. Изменение рН среды зависит в
основном от состава питательной среды и характера процесса метаболизма.
37
Для регулирования рН в питательные среды добавляют некоторое количество
мела. Мел реагирует с возникающими в процессе метаболизма кислотами, образуя
нейтральные соли и углекислый газ, который удаляется из среды.
2. Задание для промежуточной аттестации
1. История возникновения, становления и развития биотехнологии как
самостоятельной науки.
2. Объект и методы биотехнологии. Специфика использования
биологического объекта.
3. Задачи современной биотехнологии, тенденции и перспективы ее
развития.
4. Предмет и задачи генетической инженерии. История возникновения и
развития методов работы с рекомбинантными ДНК.
5. Ферменты, используемые при создании рекомбинантных ДНК.
Способы конструирования рекомбинантных ДНК.
6. Способы получения гена.
7. Прямые методы переноса чужеродной генетической информации в
клетки про- и эукариот.
8. Векторные молекулы ДНК. Требования, предъявляемые к векторам для
клонирования. Плазмидные векторы.
9. Векторы на основе бактериофагов. Гибридные векторы (космиды и
фазмиды).
10. Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень. Методы,
основанные на идентификации признака, кодируемого геном.
11. Ферментные препараты медицинского назначения.
12. По лучение инсулина генно-инженерными методами.
13. Получение гормона роста (соматотропина) человека путем
комбинации методов химического синтеза ДНК и ферментативного синтеза
кДНК.
14. Характеристика интерферонов, их применение и получение генноинженерными методами.
15. Характеристика интерлейкинов, их применение и получение генноинженерными методами.
16. Биологические датчики.
17. Подходы к конструированию генно-инженерных вакцин. Вакцины
первого, второго и третьего поколений.
18. Создание безопасных вакцин против вируса гепатита В.
19. Создание безопасных вакцин против вируса ящура.
20.Создание безопасных вакцин против вирусов полиомиелита, гриппа.
21. Подходы к конструированию вакцины против вируса
иммунодефицита человека.
22. Задачи и проблемы генетической инженерии растений.
Магистральные пути развития генетической инженерии растений.
38
23. Создание векторов для введения чужеродных генов в протопласты
растений. Векторы на основе плазмид бактерий, заражающих растения в
естественных условиях.
24. Создание векторов на основе ДНК-содержащих вирусов растений.
Конструирование челночных векторов из прокариотических плазмид и
фрагментов хлоропластных или митохондриальных ДНК растений.
25. Биологическая фиксация азота. Генно-инженерные работы в области
биологической фиксации азота.
26. Пути повышения эффективности фотосинтетических систем генноинженерными методами.
27. Выведение растений с увеличенным содержанием незаменимых
аминокислот генно-инженерными методами.
28. Выведение растений устойчивых к неблагоприятным внешним
факторам (рН почвы, ранние заморозки, засолению и т.д.) генно-инженерными
методами.
29. Выведение растений устойчивых к гербицидам (глифосату) генноинженерными методами.
30. Генная инженерия человека. Основные направления и перспективы
использования для терапии генетических заболеваний, для получения органов
для трансплантации, для конструирования человека de novo.
31. Соматическая генная терапия как способ лечения, включающий
генетические изменения клеток-мишеней. Векторные системы доставки и
экспрессии терапевтических генов.
32. Трансгенные сельскохозяйственные животные. Принципиальные
возможности генетической инженерии в животноводстве. Методы получения
трансгенных животных.
33. Векторы, используемые в генетической инженерии животных (на
основе литических вирусов, ретровирусов).
34. Генно-инженерные работы с геном гормона роста животных.
Получение животных с ускоренным ростом и увеличенной массой.
35. Главные направления генно-инженерных работ со структурными
белками молока. Получение фармакологических белков в молоке трансгенных
животных.
36. Создание новых белков методами химической модификации белковой
молекулы, сайт - направленного мутагенеза, молекулярной эволюции и
переноса отдельных доменов.
37. Применение белковой инженерии.
38. Основная терминология и история развития клеточной инженерии
растений и животных.
39. Виды культур клеток и питательные среды, используемые для
культивирования.
40. Получение клеточных культур.
41. Методы культивирования клеток и тканей растений и животных.
42. Клонирование животных и растений.
39
43. Получение биологически-активных веществ из культивируемых
клеток и тканей.
44. Использование клеточных культур для оздоровления и сохранения
редких генофондов.
45. Получение моноклональных антител.
46. Практическое применение моноклональных антител.
47. Кинетика роста микроорганизмов в периодических и проточных
процессах.
48. Классификация ферментационных процессов.
49. Количественные параметры ферментационных процессов.
50. Значение углекислого газа в ферментационных процессах.
51. Классификация биореакторов по функциям и типу.
52. Принципы масштабирования в биотехнологическом производстве.
53. Сырье и среды для биотехнологических производств.
54. Выделение продукта в биотехнологических производствах.
55. Общая характеристика спиртового брожения. Физиологобиохимические основы брожения.
56.
Общая
морфофизиологическая
характеристика
дрожжей,
используемых в промышленности.
57. Получение этилового спирта.
58. Общая характеристика пропионовокислого брожения.
59. Применение пропионовокислых бактерий.
60. Ацетонобутиловое брожение: биохимизм процесса брожения.
61. Среды и культуры бактерий, используемых в производстве ацетона и
бутанола.
62. Общая характеристика полисахаридов микроорганизмов.
63. Биосинтез полисахаридов.
64. Получение полисахаридов в промышленности.
65. Практическое применение полисахаридов.
40
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Основная литература:
1. Биотехнология. Учебное пособие: В 8-и кн. /Под. Ред. Егорова Н.С.,
Самуилова В.Д.-М.: Высш. шк.-1987.
2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и
применение.-М.: Мир.-2002.
3. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии.М.: Академия.-2003.
4. Орехов С.Н. Фармацевтическая биотехнология. Руководство к практ.
занятиям: учеб. пособие.- М.: ГЭОТАР-Медиа.- 2012.
Дополнительная литература:
1. Прищеп Т.П., Чучалин В.С., Зайков К.Л и др. Основы
фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие.- Ростов н/Д.: Феникс;
Томск: Изд. НТЛ, 2006.
2. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Биотехнология.- М.: изд.
центр «Академия», 2006.
3. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. Учебник.-М.: Изд-во
МГУ, Наука.-2004.
41
УДК 615.012/.014(076)
ББК 82.я 829
Печатается по решению ЦМК ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ
Минздрава РФ
© Пятигорский медико-фармацевтический
институт - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ
Минздрава Российской Федерации, 2015
УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ
Д.В. Компанцев, З.Д. Хаджиева, Л.А. Мичник,
О.В. Мичник А.А. Чахирова, В.А. Чахирова
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ
«БИОТЕХНОЛОГИЯ АНТИБИОТИКОВ»
Образовательная программа
«БИОТЕХНОЛОГИЯ (В ТОМ ЧИСЛЕ БИОНАНОТЕХНОЛОГИИ)»
(подготовка научно-педагогических кадров)
НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ
06.06.01. БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Подписано в печать ________________
Формат 60×84/16, бумага писчая белая. Усл. печ. л. ___
Уч. изд.л. ____. Тираж _____ экз. Заказ №___________
Пятигорский медико-фармацевтический институт
- филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава Российской Федерации, 357532, г.
Пятигорск, пр. Калинина, 11
42