ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИИ

реклама
С.Г. ХОМЕРИКИ, В.И. КАСЬЯНЕНКО
ЛАБОРАТОРНАЯ
ДИАГНОСТИКА
ИНФЕКЦИИ
HELICOBACTER
PYLORI
Санкт-Петербург 2011
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
УДК 004.[02+9]
ББК 22.18:73
Д 332
ОГЛАВЛЕНИЕ
Хомерики С.Г., Касьяненко В.И.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter Pylori
– С. Петербург: ООО «АМА», 2011, 110 с.
В книге на основе анализа литературы и собственных данных автором представлены
современные аспекты этиологии, патогенеза, диагностики, профилактики и
лечения спонтанного бактериального перитонита у больных циррозом печени.
В монографии изложены основные сведения о роли бактериальной транслокации
в развитии спонтанного бактериального перитонита, обоснована необходимость
выделения ранних критериев диагностики.
В работе представлены результаты исследования позволяющие выявлять спонтанный бактериальный перитонит на более ранних сроках, что позволяет своевременно
проводить адекватную терапию.
Адресовано широкому кругу врачей, включающему гепатологов, терапевтов и хирургов.
ISBN 978-5-98803-ччч-ч
3
© Хомерики С.Г., Касьяненко В.И., 2011
Введение............................................................................................................................... 5
Глава 1. Первые шаги в изучении Helicobacter pylori .......................................... 7
1.1. История открытия Helicobacter pylori ..................................................................... 7
1.2. Изучение Helicobacter pylori и разработка методов диагностики хелико­бак­терной
инфекции в Центральном НИИ гастроэнтерологии (автор – А.А. Ильченко) ......... 8
Глава 2. Helicobacter pylori – патоген или сапрофит? ......................................... 14
2.1. Патогенные факторы Helicobacter pylori .............................................................. 14
2.2. Краткая характеристика инфекции Helicobacter pylori ..................................... 21
2.3. Устойчивость Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам ................. 29
2.4. Дрожжеподобные грибы и Helicobacter pylori ........................................................ 34
Глава 3. Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori ................................ 37
3.1. Инвазивные методы выявления Helicobacter pylori ................................................. 38
3.1.1. Гистологический метод .................................................................................... 39
3.1.2. Цитологический метод ................................................................................... 42
3.1.3. Биохимический метод ..................................................................................... 48
3.1.4. Уреазные тесты .............................................................................................. 48
3.1.5. Бактериологический метод ............................................................................. 50
3.1.6. Молекулярный метод ........................................................................................ 55
3.2. Малоинвазивные (непрямые) методы диагностики инфекции Helicobacter pylori .... 56
3.2.1. Иммунологический метод ............................................................................... 56
3.2.1.1. Серологические тесты ................................................................................ 57
3.2.1.2. Экспресс-тесты ............................................................................................ 59
3.3. Неинвазивные методы диагностики инфекции Helicobacter pylori .................. 62
3.3.1. Биохимический метод ........................................................................................ 62
3.3.1.1. Дыхательный углеродный тест ................................................................... 62
3.3.1.1.1. Углеродный тест 14С ............................................................................ 63
3.3.1.1.2. Углеродный тест 13С ............................................................................ 63
3.3.1.1.3. Дыхательный аммиачный тест ........................................................... 65
3.3.2. Иммунологический метод .............................................................................. 69
3.3.2.1. Определение антигена Helicobacter pylori в кале (HPSA-тест) .................. 69
3.3.3. Молекулярный метод......................................................................................... 70
Глава 4. Подводные камни в диагностике хеликобактерной инфекции........... 72
4.1. Тесты, основанные на взятии биопсии................................................................ 73
4.2. Серологические методы.......................................................................................... 74
4.3. Дыхательные углеродные тесты............................................................................. 75
Глава 5. Рекомендации по диагностике Helicobacter pylori.................................... 78
5.1. Кому следует проводить тесты на Helicobacter pylori? ........................................ 78
5.2. Когда следует проводить тесты на Helicobacter pylori?......................................... 78
5.3. Принципы выбора метода диагностики инфекции Helicobacter pylori ............ 79
Приложения....................................................................................................................... 81
Список литературы.......................................................................................................... 93
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
5
ВВЕДЕНИЕ
Знаменательное событие состоялось в декабре 2005 года в Стокгольме. За
открытие патогенетической связи хронического гастрита и язвенной болезни
с инфекцией Helicobacter pylori (H.pylori) в желудке два всемирно известных
австралийских учёных Robin Warren и Barry Marshall были удостоены
Нобелевской премии по физиологии и медицине. Годы, прошедшие с
момента первой публикации этих учёных в 1983 году [172], были годами
напряжённой работы по изучению физиологии этого микроорганизма, его
распространения, путей заражения и патогенетических механизмов его
влияния на организм человека. Это были годы сомнений, творческого поиска
и научных достижений, ломки старых стереотипов и преодоления инертности
мышления. Исследования, посвященные H.pylori, продолжаются и в настоящее
время. На данный момент существует ряд положений, которые перестали
быть смелыми предположениями, а являются твёрдо установленными,
доказанными научными фактами. Установлена чрезвычайно широкая
распространенность инфекции H.pylori во всем мире. В развитых странах
Европы уровень инфицированности колеблется в пределах от 7 до 33%. В
странах с низким уровнем социально-экономического развития, невысокой
обеспеченностью населения полноценным питанием и столь же низкой
гигиенической культурой распространенность H.pylori-инфекции варьирует
от 48% до 88% [95].
В России в настоящее время инфицированность населения H.pylori колеблется
в пределах 60-90%, в зависимости от природных характеристик региона,
этнографических особенностей жителей и социально-экономических условий
[12].
К настоящему времени не только расшифрован геном H.pylori, но и
получены достоверные характеристики
его свойств, обуславливающих
ассоциированность бактерии с широко распространенной патологией желудка
и 12-перстной кишки. Прежде всего - это высокая уреазная активность,
обеспечивающая не только существование, но и размножение H.pylori в
условиях высокой концентрации соляной кислоты в желудке. Расщепляя
с помощью уреазы мочевину, H.pylori окружает себя аммиачным облаком,
нейтрализует соляную кислоту и обеспечивает локальное повышение рН
до 6,0, при котором он наиболее активно размножается. С другой стороны,
этим микроорганизмам крайне необходима соляная кислота (протон) для
нейтрализации аммиака, который может вызвать гибель самих бактерий.
Защелачивая среду в пристеночной слизи желудка (но не в желудке),
колония H.pylori вызывает адекватную, но не физиологическую реакцию
6
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
гастринпродуцирующих G-клеток, усиливающих секрецию гастрина и
осуществляющих стимуляцию секреции соляной кислоты. С течением
времени персистирование в желудке инфекции H.pylori может привести к
развитию гиперацидного состояния и последующему язвообразованию [3].
Установлена способность H.pylori к синтезу ряда ферментов окислительного
метаболизма. Активизация этих бактериальных ферментов в определённых
условиях микроокружения приводит к образованию высокотоксичных форм
кислорода – супероксид-аниона, гидроксильных и липидных радикалов.
Эти соединения, воздействуют на клеточные элементы слизистой оболочки,
вызывая нарушения целостности клеточных мембран, изменения структуры
ДНК стволовых клеток шеечной области желез, приводящие к мутациям
и возможному канцерогенезу. Процесс генерации токсичных соединений
наиболее активно происходит при рН окружающей бактерии среды в
интервале 6-7,5, и чем большее время H.pylori находятся в таких условиях,
тем дольше осуществляется цитотоксическое воздействие. Интенсивность
данного патогенного свойства H.pylori имеет индивидуальный характер и
зависит от характеристик конкретного штамма, инфицирующего каждого
больного. Штаммы H.pylori, активно генерирующие в условиях хронического
H.pylori-ассоциированного гастрита кислородные радикалы, потенциально
более опасны в отношении возможного канцерогенеза [44].
Все антигены H.pylori обладают слабой иммуногенной активностью, в силу чего
временный (8-10 месяцев) иммунитет при этой инфекции носит условный
характер. Через год после успешной эрадикации (уничтожения) H.pyloriинфекции, возможна реинфекция не только новым, но и тем же штаммом
(внутрисемейно). Реинфекция после эрадикации происходит у 1-2% больных
в течение одного года.
Широкая распространенность инфекции H.pylori и ее явная связь с развитием
хронического гастрита, язвенной болезни, MALT-омы и рака желудка делают
проблему изучения H.pylori-ассоциированной патологии одной из главных
в гастроэнтерологии. Важнейшими условиями решения этой проблемы
являются: точная диагностика H.pylori-ассоциированности болезни, адекватный
подбор схемы лечения больного и столь же точная верификация уничтожения
инфекта в результате проведенной терапии.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
7
ГЛАВА.1. ПЕРВЫЕ ШАГИ В ИЗУЧЕНИИ Helicobacter pylori
1.1. История открытия Helicobacter pylori
Своё выдающееся открытие Р. Уоррен (J. R. Warren) сделал, работая
больничным патологоанатомом и, впервые в истории Нобелевских премий,
получил премию, оставаясь в том же качестве практического врача. В отличие
от Б. Маршалла (В. Marshall), который сделал открытие, будучи клиническим
ординатором, а ко времени получения премии уже был профессором и
руководителем лаборатории.
Р. Уоррен изучал морфологические особенности гастрита и занимался поиском
эффективных методов окраски микроорганизмов в гистологических срезах.
Он установил, что лучше всего грамотрицательные бактерии выявляются при
импрегнации серебром по Вартину-Старри. При окраске по этому методу
в препаратах выявлялось множество спиралевидных бактерий, которые
имели сходство с бактериями рода Campylobacter [252]. Р. Уоррен находил
бактерии почти во всех биоптатах, в которых имелись признаки хронического
гастрита. Особенно много их было при активном гастрите с нейтрофильной
инфильтрацией слизистой оболочки. Бактерии отсутствовали на нормальной
слизистой оболочке и в участках кишечной метаплазии. Электронная
микроскопия биоптатов подтвердила сходство бактерий в слизистой оболочке
желудка с Campylobacter jejuni. Более 2 лет изучая срезы биоптатов окрашенные по
Вартину-Старри, полученные от больных с хроническим гастритом, Р. Уоррен
утвердился во мнении об этиологической роли бактерий. В международную
таксономию бактерий эти бактерии вошли вначале как Campylobacter pyloridis,
затем Campylobacter pylori и, наконец, как Helicobacter pylori (H.pylori). Встреча с
Б. Маршаллом состоялась в августе 1981 года. Р. Уоррен показал препараты
и рассказал о своей концепции. Знакомясь с материалами наблюдений Р.
Уоррена, Б.Маршалл с удивлением обнаружил, что бактерии выявлялись в
биоптатах всех больных дуоденальной язвой и у большинства больных язвой
желудка. Заинтересовавшись, он начал активно разрабатывать эту проблему.
Через год кропотливого труда и благодаря счастливому стечению обстоятельств
Б.Маршаллу удалось получить чистую культуру бактерии.
Идея Р. Уоррена и Б. Маршалла о роли H.pylori в этиологии и патогенезе
хронического гастрита и язвенной болезни поначалу не получила поддержки.
Тезисы с изложением основных итогов работы, которые Б. Маршалл
представил на конференцию австралийских гастроэнтерологов, были
отклонены оргкомитетом. В 1982 г. Р. Уоррен и Б. Маршалл направили статьи
с результатами исследования в журнал “Lancet”. Почти год редакция не
могла найти рецензента, который согласился бы оценить эти статьи. В 1983 г.
8
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
положительный отзыв дал лондонский микробиолог М. В. Skirrow и статьи в
виде “Писем в редакцию” были опубликованы [170]. В следующем году, проведя
на себе опыт по самозаражению, Б.Маршалл доказал этиологическую роль
выделенных бактерий в развитии хронического гастрита. На основании этих
данных была выстроена стройная схема их участия в этиопатогенезе язвенной
болезни. В последующем многочисленные исследования, выполненные в
разных странах, подтвердили правоту Р. Уоррена и Б. Маршалла.
Поначалу Р. Уоррен считал себя первым, кто обнаружил H.pylori. Его
уверенность в своем приоритете основывалась на том, что в руководствах,
которые имелись у него, в том числе в авторитетном руководстве по биопсийной
диагностике заболеваний пищеварительного тракта, ничего о таких бактериях
не говорилось [2]. Однако при более глубоком изучении научной литературы
выяснилось, что статьи с описаниями таких же микроорганизмов в слизистой
оболочке желудка периодически появлялись на протяжении почти 90 лет.
На празднование 20-летия открытия H.pylori Б. Маршалл собрал тех учёных со
всего мира, кто ещё до Р. Уоррена описывал или видел H.pylori при проведении
своих исследований. В 2002 г. статьи участников встречи были опубликованы в
виде монографии, вышедшей под редакцией Б. Маршалла [117]. Среди авторов
книги был и наш соотечественник И. А. Морозов. Занимаясь изучением
ультраструктуры париетальных клеток слизистой оболочки желудка, И.А.
Морозов неоднократно встречал спиралевидные бактерии, как на поверхности
эпителиальных клеток желудка, так и в собственной пластинке у больных с
ваготомией и синдромом приобретенного иммунодефицита еще в 1973 году.
Глава И. А. Морозова, названная в предисловии «элегантной», содержит
большое количество электронных микрофотографий с изображением H.pylori
[187]. Однако другая тематическая направленность проводимых в то время
исследований не позволила И. А. Морозову сконцентрироваться на изучении
возможной патогенетической роли бактерий в развитии хронического
гастрита, а авторитет нейро-рефлекторной теории патогенеза язвенной
болезни был непререкаем.
1.2. Вклад Центрального НИИ гастроэнтерологии в
изучение Helicobacter pylori и разработку методов
диагностики хеликобактерной инфекции
Центральный научно-исследовательский институт одним из первых в стране
начал изучение проблемы хеликобактерной инфекции. Несмотря на то, что
первые публикации в зарубежной печати появились в 1983 году и вызвали
известную долю скепсиса, Ученым Советом ЦНИИГ уже в 1986 году была
утверждена тема, посвященная изучению роли H.pylori в этиологии и
патогенезе хронического гастрита и язвенной болезни, ответственными
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
9
исполнителями которой были утверждены Л.И.Аруин и А.А.Ильченко. В 1987
году в журнале «Клиническая медицина» была опубликована первая в стране
статья, вышедшая из стен ЦНИИГ, в которой описано значение Campylobacter pyloridis (так в то время называли этот микроб) в этиологии гастрита
и язвенной болезни. Впервые было показано, что в образовании хронической
язвы наряду с другими известными факторами ульцерогенеза принимает
участие и инфекционный агент - Campylobacter pyloridis [32].
При решении вопроса о роли микроорганизмов, как возбудителя какого-либо
заболевания, принято ориентироваться на триаду Генле-Коха. Накопленный
в ЦНИИГ опыт по изучению этой проблемы позволил в 1989 году издать
методические рекомендации, утвержденные Министерством здравоохранения
СССР, в которых представлены обоснованные доказательства по каждому
постулату Коха, что позволяло говорить о важной роли Campylobacter pyloridis
(Ср) в этиологии хронического гастрита и язвенной болезни.
В методических рекомендациях на основании собственного опыта уже в то
время был дан анализ основных методов диагностики кампилобактерных
поражений желудка и двенадцатиперстной кишки, представлено подробное
описание методик, позволяющих врачу с достаточной точностью выявлять
наличие или отсутствие этих микроорганизмов. По данным гистологического
метода исследования впервые было выделено три степени обсеменения
слизистых оболочек: слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зрения при
х630; средняя (++) – до 50 микробных тел в поле зрения и высокая (+++) –
более 50 микробных тел в поле зрения. Такое деление на степени обсеменения
слизистой оболочки Ср позволяло оценить ее изменение в зависимости от
клинических особенностей течения заболевания, эффективности проводимой
терапии. В качестве экспресс-диагностики была предложена методика
определения Ср в мазках раздавленных биоптатов с последующей фиксацией
препарата в спирте и окраской по Гимза.
Длительное время серьезным препятствием в изучении проблемы
кампилобактериоза являлось выделение чистых культур пилорических
кампилобактеров. Совместно со старшим научным сотрудником В.Г.
Жуховицким была разработана транспортная среда для биопсийного материала,
что значительно повысило частоту выделения Ср в чистой культуре.
В этих же методических рекомендациях были представлены первые
результаты по санирующей эффективности различных лекарственных
средств (де-нола, ампициллина, метронидазола и др.) и сделано заключение,
что эффективная антикампилобактерная терапия приводит не только к
быстрейшему выздоровлению больных, но и способствует профилактике
ранних и отдаленных рецидивов язвенной болезни [31].
Следует отметить, что дальнейшее изучение микроорганизмов с помощью
микробиологических, иммунологических, электронно-микроскопических
10
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
методик позволило установить характерные особенности этих бактерий,
отличающие их от других кампилобактеров, и в 1989 году они были включены
в Международную таксономию бактерий под названием Helicobacter pylori.
В методических рекомендациях, изданных ЦНИИГ в 1994 году
и
утвержденных Главным медицинским управлением г.Москвы, дан более
подробный анализ методов выявления H.pylori, включая серологическую
диагностику [30]. Впервые с помощью тест-системы для определения
специфических антихеликобактерных антител было показано, что у больных
язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки в 100% случаев выявляются
антитела к H.pylori в диагностическом титре 1:100. При этом у значительной
части больных уровни антител были в несколько раз выше диагностического.
Уреазный тест – наиболее удобный способ быстрой диагностики H.pylori. ЦНИИ
гастроэнтерологии совместно с ЦНИИ эпидемиологии (В.Г.Жуховицкий)
был разработан ХЕЛИКОТЕСТ-экспресс, который по чувствительности и
специфичности не уступал зарубежным аналогам. Для унификации описания
патологических изменений в гистологических препаратах был предложен
специальный бланк (Рис.1), который и до настоящего времени используется в
клинических отделениях ЦНИИГ [11].
Результаты исследований, проведенных в ЦНИИГ и касающихся многих
аспектов проблемы пилорического хеликобактериоза, были опубликованы
в ведущих отечественных изданиях («Вестнике Российской академии
медицинских наук», «Терапевтическом архиве», «Клинической медицине»,
«Советской медицине», «Архиве патологии», «Журнале микробиологии,
эпидемиологии, иммунологии», журнале «Врачебное дело» и др.), а также за
рубежом.
В 1994 году за цикл работ «Новые подходы к патогенетической терапии
язвенной болезни»
коллектив авторов (А.С.Логинов, Л.И.Аруин,
А.А.Ильченко, В.Г.Жуховицкий) был удостоен Диплома именной премии
С.П.Боткина Российской академии медицинских наук. Хотя в научном
мире еще существовала известная доля скепсиса в отношении роли H.pylori
в этиологии и патогенезе язвенной болезни и другой хеликобактерассоциированной патологии, во многих российских и зарубежных журналах
публиковалась масса статей, которые можно было бы озаглавить под общим
названием - “H.pylori - сапрофит, сателлит или патоген?”
Накопленный в ЦНИИГ опыт по изучению проблемы пилорического
хеликобактериоза был обобщен в вышедшей в 1994 году монографии
«Язвенная болезнь и H.pylori», за которую авторы А.С.Логинов, Л.И.Аруин и
А.А.Ильченко были удостоены только что утвержденной тогда Премии мэрии
Москвы.
Клинический опыт Центрального НИИ гастроэнтерологии по диагностике
и лечению хеликобактер-ассоциированной патологии желудка и
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
Рис. 1. Бланк, разработанный в ЦНИИГ в 1990 году для оценки гистологических
изменений в слизистой оболочке желудка, вызванных хеликобактерной инфекцией
11
12
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
13
двенадцатиперстной кишки постоянно внедрялся в клиническую практику
лечебных учреждений Москвы, что положительно сказалось на уровне
заболеваемости язвенной болезнью в городе. За цикл работ по снижению
заболеваемости язвенной болезнью в городе Москве и вклад в изучение
проблемы пилорического хеликобактериоза коллектив сотрудников ЦНИИГ
(А.А.Ильченко, И.А.Морозов, Ю.В.Васильев, Б.З.Чикунова) в 2007 году был
удостоен премии города Москвы в области медицины.
Результаты исследований, полученные в ЦНИИГ по проблеме пилорического
хеликобактериоза постоянно представлялись на различных научных форумах
за рубежом, что позволяло обмениваться информацией по различным аспектам
проблемы с зарубежными учеными. Исследования фундаментальных свойств
H.pylori, проведенные С.Г. Хомерики, впервые доказали на морфологическом
уровне способность этого микроорганизма к продукции активных форм
кислорода. Это свойство микроорганизма обсуждалось еще в 1999 году с
первооткрывателем H.pylori Р. Уореном (Рис.2). В 2000 году способность H.pylori
к продукции активных форм кислорода была изучена совместно С.Г. Хомерики
и В.Г. Жуховицким на чистой культуре клинических изолятов H.pylori, и эта
работа была признана лучшей работой на конференции Европейской группы
по изучению H.pylori (EHPSG) в Риме (2000). Успехи центрального НИИ
Рис. 3. Участники симпозиума, проведенного 30 апреля 2008 года на базе ГКБ
им. С.И.Боткина в честь приезда в Москву Нобелевского лауреата по медицине
2005 г. Профессора Барри Маршалла. Слева направо первый ряд В.Г.Жуховицкий,
С.Г.Хомерики, П.Л.Щербаков, второй ряд Ю.В.Васильев, Л.Б.Лазебник, Барри
Маршалл, Н.М.Хомерики, В.А.Исаков, Д.С.Бордин, М.Ю.Щербакова, А.А.Ильченко
гастроэнтерологии в изучении проблемы пилорического хеликобактериоза не
остались незамеченными. В 2008 году в Москве в больнице им.С.П.Боткина
центральным научно-исследовательским институтом гастроэнтерологии была
проведена научно-практическая конференция, посвященная этой проблеме,
где с лекцией «Helicobacter pylori. Уроки прошлого и новые возможности» [169]
выступил Нобелевский лауреат Б. Маршалл – один из авторов современной
концепции хеликобактер-ассоциированной патологии, сделавшей революцию
в современной гастроэнтерологии (Рис.3). Одной из последних разработок
центрального НИИ гастроэнтерологии совместно с Московским инженернофизическим институтом явился газоанализатор аммиака на основе МДПсенсора (металл-диэлектрик-полупроводник). Прибор для неинвазивной
диагностики инфекции H.pylori проходил клиническую апробацию в ЦНИИГ
и продемонстрировал хорошие показатели чувствительности и специфичности
при низкой стоимости одного исследования [27].
Рис. 2. Робин Уоррен и С.Г. Хомерики: дискуссия в кулуарах XII заседания Европейской группы по изучению H.pylori в Хельсинки (1999 год)
14
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
ГЛАВА.2. HELICOBACTER PYLORI – ПАТОГЕН ИЛИ САПРОФИТ?
2.1. Патогенные факторы Helicobacter pylori
Наиболее важные факторы патогенности H.pylori, представляющие собой
компоненты его генома, приводят к синтезу белковых продуктов, которые
вносят изменения в регуляторные и защитные механизмы организма хозяина,
дезорганизуя их работу.
Патогенные факторы H.pylori:
• ureA, ureB – гены кодирующие уреазу
• CagA – белок, усиливающий секрецию цитокинов (IL-8)
эпителиальными клетками желудка
• VacA - вакуолизирующий цитотоксин
• rdxA, frxA, fdxB – гены, кодирующие ферменты окислительного
метаболизма
• sodB – ген, кодирующий супероксидисмутазу
• kat – ген, кодирующий каталазу
• BabA- мембранный белок, обеспечивающий адгезию бактерии к
эпителиальной клетке
• iceA – ген, кодирующий фермент, вырабатываемый при контакте с
эпителиальными клетками
• flaA, flaB – гены, кодирующие жгутиковые антигены
Уреаза является одним из основных конституциональных ферментов H.pylori,
с помощью которой он противостоит кислотно-пептическому фактору
желудочного сока. Гидролизуя мочевину, этот фермент приводит к образованию
аммиака и повышению уровня рН в микроокружении H.pylori. Кроме того,
уреаза усиливает воспалительную реакцию за счёт усиления хемотаксиса
лейкоцитов, активации секреции цитокинов и усиления продукции активных
форм кислорода [114].
Наличие в геноме H.pylori генов, кодирующих ферменты окислительного
метаболизма, позволяло логически постулировать возможность генерации
активных форм кислорода самим микроорганизмом. Впервые на
морфологическом уровне такая возможность была доказана в России в
1998 году [127, 128]. С помощью специальной цитохимической реакции,
позволяющей электронномикроскопически визуализировать участки
цитоплазматической мембраны, осуществляющей продукцию активных
форм кислорода. Это реакция с хлоридом церия (CeCl3), которая
использовалась ранее для выявления зон продукции активных форм
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
15
кислорода на мембране нейтрофилов при респираторном взрыве [198].
Ион церия, взаимодействуя с активными формами кислорода в месте их
образования, трансформируется в нерастворимую гидроокись церия, которая
легко определяется в трансмиссионном электронном микроскопе в виде
характерных электронноплотных депозитов. С помощью этого метода
были изучены биоптаты слизистой оболочки желудка, взятые от больных
хеликобактерным гастритом. Образование электроноплотных депозитов
наблюдалось преимущественно на наружной мембране и жгутиковых
структурах H.pylori (Рис.4.). Не было обнаружено преципитатов на мембранах
эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка. Не удалось их обнаружить
также и на мембранах нейтрофилов, в том числе и тех, которые содержали
Рис. 4. Электронноплотные депозиты гидроокиси церия на поверхности
наружной мембраны и жгутиковых
структур (стрелка) H.pylori.На мембране эпителиальных клеток желудка депозиты отсутствуют (двойные
стрелки). Трансмиссионная электронная микроскопия
16
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
17
фагоцитированные микробные тела. Последнее может рассматриваться как
морфологическое проявление специфического иммунопареза, о котором
говорилось в работе А. Норгарда с соавторами [195]. Считается, что культура
H.pylori вызывает респираторный взрыв и генерацию активных форм кислорода
в нейтрофилах, выделенных от здоровых доноров. Однако клинические
изоляты H.pylori не вызывают респираторного взрыва и генерации активных
форм кислорода в гомологичных нейтрофилах (выделенных от тех же доноров).
Другими словами, H.pylori каким-то образом блокирует генерацию активных
форм кислорода в нейтрофилах своего хозяина. Конкретные механизмы
такого специфического иммунопареза не известны.
Таким образом, проведенные нами ультраструктурные цитохимические
исследования убедительно продемонстрировали, что мембранные структуры
H.pylori являются непосредственным источником образования активных форм
кислорода в слизистой оболочке желудка при хеликобактерном гастрите.
В том же 1998 году японскими авторами с использованием метода
биохемилюминесценции впервые было показано, что бактериальная культура
H.pylori может генерировать супероксидный радикал [190]. Независимо от
этих данных, нами с В.Г.Жуховицким были разработаны методы выявления
люминолзависимой хемилюминесценции бактериальной суспензии H.pylori и
проводилось изучение продукции активных форм кислорода на референсных
штаммах H.pylori и клинических изолятах в различных условиях окружающей
среды in vitro [130, 131, 132].
Оказалось, что способность к продукции и динамика выброса активных
форм кислорода у разных штаммов существенно различаются. Есть штаммы
с высокой продукцией активных форм кислорода, а есть такие, которые их
практически не генерируют. (Рис.5.). Кстати, родственные хеликобактеру
бактерии – Campylobacter jejuni также не генерируют активные формы кислорода
[129]. Кроме того, изменение микроэкологических характеристик популяции
H.pylori в процессе роста культуры также влияют на динамику продукции
активных форм кислорода. Если брать суммарную продукцию активных форм
кислорода, то она максимальна у 72 ч культуры, а затем несколько снижается,
продолжая оставаться на высоком уровне. При этом 72 ч культура дает более
быстрый, но скоро затухающий выброс активных форм кислорода, чем 48 ч
культура. С увеличением возраста культуры амплитуда выброса активных
форм кислорода снижается, однако длительность продукции активных форм
кислорода возрастает (Рис.6.).
При сопоставлении уровня продукции активных форм кислорода с
морфологией бактерий в культуре, было обнаружено, что при старении
культуры H.pylori в ней резко уменьшается количество вегетативных форм
микроорганизма и возрастает количество кокковых форм, которые считаются
нежизнеспособными, некультивируемыми. Однако, даже у кокковых форм
H.pylori активность окислительных ферментов очень высока [130]. Более
того, самого высокого уровня продукция активных форм кислорода in vitro
достигается в ходе бациллярно-кокковой трансформации, когда в культуре
H.pylori в равных количествах представлены бациллярные и кокковые формы
микроорганизма (Рис.7). Процесс бациллярно-кокковой трасформации
in vitro инициируется истощением питательной среды и ухудшением в
связи с этим условий микроокружения в растущей культуре. Как известно,
реакции бактериальных популяций на неблагоприятные воздействия
весьма стереотипны. Поэтому можно полагать, что популяции H.pylori,
присутствующие в организме хозяина in vivo будут реагировать также – т.е.
Рис.5. Межштаммовые различия временной динамики продукции (а) и суммарного количества АФК (б) в суспензии H.pylori
Рис. 6. Временная динамика продукции АФК в культуре H.pylori различного возраста (клинический изолят 189)
18
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Рис. 7.Высокая активность окислительного метаболизма в кокковых формах клинического изолята №189 H.pylori: .
а)суммарная продукция АФК в культуре различного возраста. б)соотношение бациллярных ( ) и кокковых ( ) форм в культуре различного возраста
трансформируясь в кокковые формы. Уже доказано, что количество кокковых
форм возрастает и в ходе антибактериальной терапии [38, 45]. Это весьма
существенно, так как любое ухудшение условий обитания H.pylori в желудке
(неудачная попытка эрадикации или прием антибиотиков по поводу
интеркурентных заболеваний) создает опасность активации окислительных
ферментов микроорганизма с усилением генерации активных форм кислорода
в слизистой оболочке желудка. По данным японских авторов кокковые формы
H.pylori значительно чаще и в большем количестве встречаются при раке
желудка, чем при язвенной болезни [70].
Результатом активации окислительных ферментов H.pylori является, с
одной стороны – генерация энергетического потенциала, используемого
микроорганизмом, а с другой стороны – образование активных форм
кислорода. Энергия окислительно-восстановительных реакций используется
микроорганизмом для осуществления своих физиологических функций,
в частности, для повышения устойчивости и выживания в агрессивных
условиях внутрижелудочной среды и для нейтрализации цитотоксических
факторов защиты макроорганизма. Однако одновременно они составляют и
фактор патогенности самого микроба, так как образующиеся в этих реакциях
активные формы кислорода могут оказывать повреждающее воздействие на
структуры слизистой оболочки желудка.
Интересна взаимосвязь уреазы с системой окислительно-восстановительных
ферментов H.pylori. Взаимодействие этих двух ферментных систем
заключается в совместной регуляции электрохимического градиента для
оптимизации физиологических процессов в микроорганизмах и повышения
их адаптационных свойств. Взаимодействие этих ферментных систем
позволяет микроорганизму перекрывать большой диапазон изменений
рН в своем микроокружении. В условиях кислой среды работает уреаза,
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
19
ощелачивая среду, тогда как оксидазы не работают. Но щелочные значения
рН губительны для H.pylori, поэтому при значениях рН>6, включаются
в работу оксидазные ферменты микроорганизма. Результатом их работы
является генерация свободного протона, закисляющего микросреду (H.pylori
пытает удержать рН в области оптимальных для себя значений). С другой
стороны, при этом продуцируются активные формы кислорода, которые могут
повреждать окружающие ткани, нарушать процессы их обновления, нарушать
генетическую целостность, вызывая перестройки в ДНК соматических клеток,
и таким образом индуцировать карциногенез. Повышенный риск развития
рака желудка при увеличении внутри-желудочного рН>4 обусловлен также и
менее эффективным в таких условиях функционированием антиоксидантных
систем и более активным накоплением в слизистой оболочке желудка
пероксинитритов, образование которых катализируется бактериальными
ферментами H.pylori [260] (Рис.8). Было доказано, что продукты взаимодействия
двух этих ферментных систем – соединения типа монохлорамина (NH2Cl), в
большей степени, чем их предшественники (NH3 и HOCl) обладают свойством
повреждать ДНК [226]. Высокая токсичность хлорамина обусловлена его
способностью вызывать пероксидацию и растворение мембран.
Важным фактором патогенности H.pylori являются жгутиковые антигены FlaA и
Рис. 8. Ферментные механизмы гомеостазирования рН в микроокружении
H.pylori и патогенетическая роль АФК при хеликобактерном гастрите
20
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
FlaB, которые входят в состав жгутиков бактерии и обусловливают её высокую
подвижность. Способность активно перемещаться в слое густой пристеночной
слизи существенно повышает выживаемость бактерии в неблагоприятных
для неё условиях быстро меняющейся агрессивной среды полости желудка.
Кроме того, гены, регулирующие образование жгутиков принимают также
активное участие в процессах адгезии H.pylori к мембранам эпителиальных
клеток [75].
Адгезия H.pylori к эпителиальным клеткам слизистой оболочки желудка
является стартовым моментом для включения патогенетических цепочек в
развитии инфекционного процесса. Исходя из этого, белки Bab (blood-group
associated binding adhesion), кодируемые генами babA и babB, должны быть
отнесены к важным факторам патогенности H.pylori [99]. В качестве рецепторов
к этим компонентам внешней оболочки бактерии выступают остатки сиаловых
кислот, сульфогруппы гликопротеинов и фосфолипиды клеточных мембран
эпителиальных клеток, а также молекулы адгезии межклеточного матрикса
(коллаген, ламинин, фибронектин) [121].
Вакуолизирующий цитотоксин VacA вызывает вакуолизацию эпителиальных
клеток путём образования пор в цитоплазматической мембране (Рис.9).
Считается, что с помощью этого механизма H.pylori способствует пассивному
селективному транспорту мочевины через эпителиальные клетки желудка [179,
233]. К прямым токсическим эффектам VacA следует отнести вызываемое им
снижение устойчивости эпителиальных клеток к окислительному стрессу, что
обусловлено снижением синтеза глютатиона [134], уменьшение содержания в
клетках АТФ [135], активация апоптоза [257], повреждение внутриклеточных
микрофиламентов – основы цитоскелета клетки [81].
Наконец, самый мощный фактор патогенности H.pylori – иммунодоминантный
Рис. 9. а) Тканевая культура эпителиальных клеток желудка. б) Добавление к
клеткам культуры H.pylori в течение нескольких часов приводит к резкой вакуолизации цитоплазмы клеток
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
21
белок CagA, кодируемый геном cagA. Проникая внутрь эпителиальной клетки
с помощью секреторной системы IV типа, CagA приводит к изменениям
клеточного цитоскелета и полной перестройке внутриклеточного метаболизма,
в результате чего клетка начинает активно продуцировать сильнейший
провоспалительный цитокин – интерлейкин-8 [196]. H.pylori вызывает
воспаление в слизистой оболочке желудка почти у всех инфицированных,
однако тяжесть воспаления может существенно варьироваться, в зависимости
от вирулентности штамма и индивидуальных особенностей макроорганизма.
Инфицирование штаммами H.pylori, содержащими cagA, сопровождается
более выраженной воспалительной реакцией в слизистой оболочке желудка
и двенадцатиперстной кишки, и соответственно, увеличивает риск развития
ассоциированных с H.pylori заболеваний – язвенной болезни и рака желудка.
Жёлчный рефлюкс и пищевые раздражители могут также отягощать
воспалительные реакции, инициируемые микроорганизмом.
2.2. Краткая характеристика инфекции Helicobacter pylori
Интересно, что еще в 1975 г. (до открытия H.pylori) были опубликованы
исследования X. В. Стира (Н. W. Steer) [224], в которых на большом
фактическом материале с прекрасными трансмиссионными и сканирующими
электронограмми, описывались типичные спиралевидные бактерии и их
адгезия к эпителиальным клеткам желудка. Выявляемая на гистологических
срезах нейтрофильная инфильтрация эпителия рассматривалась автором
как доказательство того, что именно бактерии вызывают воспалительную
реакцию, а, следовательно, их надо относить не к транзиторной, а к патогенной
флоре. Впервые он обнаружил эти микробы также в участках желудочной
метаплазии двенадцатиперстной кишки у большинства больных дуоденальной
язвой и высказал предположение о связи инфекции с язвенной болезнью.
Это чрезвычайно важное наблюдение, которое объясняет детали патогенеза
дуоденальной язвы. Как известно, H.pylori не могут колонизировать слизистую
оболочку двенадцатиперстной кишки. Желудочная метаплазия в ней
возникает в результате воздействия кислого содержимого желудка. H.pylori,
поселившиеся в участках метаплазии, принимают участие в ульцерогенезе.
X. В. Стир попытался получить чистую культуру этих бактерий. Однако на
бактериологических средах росли бактерии, не имевшие никакого сходства
с бактериями, которые были видны при трансмиссионной и сканирующей
электронной микроскопии [224]. Теперь мы знаем, в чем была причина
неудачи: в то время принципы культивирования микроаэрофильных бактерий
на селективных средах ещё не были разработаны.
Слизистая оболочка желудка, функционирующая в нормальных условиях,
22
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
представляет собой сложную саморегулирующуюся систему, работа которой
направлена на создание условий для кислотного гидролиза пищи. Основной
функцией слизистой оболочки тела желудка является выработка соляной
кислоты париетальными клетками и гидролитических ферментов главными
клетками, функцией слизистой оболочки антрального отдела – выработка
слизи для защиты клеток слизистой оболочки от этих агрессивных факторов.
Нейро-гуморальные механизмы координируют согласованную работу
функционально активной ткани слизистой оболочки желудка. Одним из
компонентов этой регуляторной системы является контур паракринной
регуляции с участием клеток диффузной эндокринной системы. В антральном
отделе это гастрин-продуцирующие G-клетки, а в теле желудка – гистаминпродуцирующие ECL-клетки. В обоих отделах присутствуют также
соматостатин-продуцирующие D-клетки. Паракринная регуляция секреции
соляной кислоты, осуществляется на принципах обратной связи. Гастрин,
вырабатываемый G клетками, активирует гистаминпродуцирующие ECLклетки и вместе с гистамином воздействует на париетальные клетки, приводя
к выбросу из них кислоты. Кислота, в свою очередь подавляет активность
G-клеток, но активирует D-клетки, продуцирующие соматостатин, который
подавляет активность и G- и ECL-клеток (Рис.10).
Появление H.pylori вносит существенные изменения в этот регуляторный
контур. Уреазоиндуцированные аммонийные продукты H.pylori защелачивают
микроокружение G- и D-клеток и препятствуют реализации механизма
обратной связи (Рис.11). Кислота не подавляет активность G-клеток, что
ведет к гиперпродукции гастрина, и не активирует D-клетки, которые
Рис. 10. Механизмы паракринной регуляции секреции HCl в желудке
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
23
Рис. 11. Нарушение регуляторных механизмов секреции HCl в присутствии H.pylori
вырабатывают меньше соматостатина и хуже подавляют активность G- и ECLклеток. Избыточный уровень продукции гастрина оказывает трофическое
действие на гистамин-продуцирующие ECL-клетки и париетальные клетки,
закладывая основу для формирования гиперацидного синдрома.
При первом контакте H.pylori со слизистой оболочкой каскад последовательных
Рис. 12. Образование интерлейкина-8 в клетке покровного эпителия желудка при
адгезии H.pylori
24
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
реакций приводит к развитию в ней воспаления, т.е. к формированию
морфологической картины гастрита. Микроорганизм преимущественно
колонизирует антральный отдел. После адгезии H.pylori к эпителиальной
клетке, один из факторов патогенности H.pylori – белок CagA вызывает
реорганизацию внутриклеточного актина, что угнетает секреторную
деятельность клетки и активирует процесс синтеза и выделения эпителиальными
клетками цитокинов, а в частности – интерлейкина-8, запускающего
защитный воспалительный ответ макроорганизма (Рис.12). Обладая
хемотаксической активностью интерлейкин-8 привлекает в зону поражения
иммунокомпетентные клетки (нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты), которые
в свою очередь являются источниками провоспалительных цитокинов, включая
интерлейкин-1 и фактор некроза опухоли (Рис.13). Кроме того, эти цитокины
сами обладает способностью активировать продукцию гастрина и подавляют
активность D-клеток, снижая уровень соматостатина. Это ведёт к нарушению
механизма обратной связи – развивается кислотная гиперсекреция.
Острая фаза хеликобактерного гастрита характеризуется развитием
дистрофических изменений в клетках поверхностного эпителия. Цитоплазма
клеток вакуолизируется, в ней уменьшается содержание слизи, апикальная
поверхность теряет микроворсинчатую структуру, наблюдаются разрывы
Рис. 13. Инициация интерлейкином-8 каскадной продукции других провоспалительных цитокинов
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
25
десмосомальных контактов, отек межклеточных пространств и десквамация
клеток в просвет желудка. Среди клеток эпителия шеечных отделов желез и в
собственной пластинке часто встречаются отдельные нейтрофилы или их группы
(Рис.14). Среди клеток инфильтрата, располагающегося в поверхностных
отделах собственной пластинки, много лимфоцитов и плазмоцитов, могут
также встречаться эозинофилы и макрофаги. Наблюдается усиление
пролиферативной активности клеток в области шеечных отделов желез. Как
нейтрофилы, так и H.pylori вызывают гибель клеток поверхностного эпителия
с формированием множественных эрозий, а усиление пролиферации клеток
направлено на замещение погибших клеток и восстановление структуры
слизистой оболочки.
На начальных этапах развития хеликобактерного гастрита профиль
Рис. 14. Активный гастрит. Нейтрофильная инфильтрация собственной
пластинки и эпителия желудочных
ямок. ГЭ. а) х120, б) х250, в) х 500
26
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
иммунокомпетентных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки
желудка изменяется незначительно (имеется лишь незначительное повышение
содержания Т-супрессоров). Однако дальнейшая хронизация инфекции
связана с существенным нарастанием содержания Т-хелперов в собственной
пластинке слизистой оболочки желудка, количество которых увеличивается
в 3 раза (хотя количество Т-супрессоров не изменяется). Известно, что для
формирования защитного иммунитета необходимо определенное соотношение
типов Т-хелперов. Полноценный протективный иммунитет может быть
сформирован при преобладающем количестве Th 1 типа, синтезирующих
интерферон-γ и IL-2.
При хронизации H.pylori-инфекции в составе Т-клеточного инфильтрата
собственной пластинки слизистой оболочки начинают преобладать Т-хелперы
2 типа (Th2), секретирующие IL-4 и IL-6. Эти цитокины не только оказывают
тормозящее влияние на пролиферацию лимфоцитов в собственной пластинке
и в крови, но и обуславливают преимущественное клонирование В-лимфоцитов
Рис. 15. Изменение соотношения субпопуляций Т-хелперов в инфильтрате собственной пластинки слизистой оболочки при хронизации H.pylori -инфекции
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
27
в IgG-продуцирующие плазматические клетки (Рис.15). Как известно, IgG не
выделяются в просвет желудка и не способны обеспечить защиту поверхности
слизистой оболочки от воздействия инфекта.
Стихание активного воспаления сопровождается уменьшением присутствия
нейтрофилов среди эпителиальных клеток. В случае достижения
эрадикации H.pylori нейтрофилы очень быстро исчезают из слизистой
оболочки. Нормальная структурная организация поверхностного эпителия
восстанавливается в течение нескольких дней, хотя признаки атрофии желез,
усиленная лимфо-плазмоцитарная инфильтрация поверхностных участков
собственной пластинки и крупные лимфатические фолликулы в глубоких
отделах слизистой оболочки сохраняются длительное время (Рис.16). В случаях,
когда различные фазы хронического гастрита встречаются в разных участках
слизистой оболочки желудка у одного пациента, говорят о мультифокальном
хроническом гастрите.
Нейтрофилы, пришедшие в зону воспаления, являются источником активных
форм кислорода, которые истощают системы антиоксидантной защиты
организма, а это ведет к развитию окислительного стресса в слизистой оболочке
желудка. При этом, нейтрофилы не единственный источник активных форм
кислорода в слизистой оболочке желудка при H.pylori-гастрите.
Как говорилось выше, геном H.pylori является носителем генов, кодирующих
ферменты окислительного метаболизма. И это весьма коварный фактор
патогенности, потому что в условиях кислой среды (пока работает уреаза)
оксидазы не работают. Но вот если рН превышает 6 (например, на фоне
длительной антисекреторной терапии), оксидазы начинают работать. А
результатом их работы является не только закисление микросреды (H.pylori
пытает удержать рН в области оптимальных для себя значений), но и продукция
активных форм кислорода. Под влиянием активных форм кислорода в тканях
усиливается пероксидация липидов клеточных мембран с нарушением
их проницаемости, наблюдается повреждение межклеточного матрикса,
Рис. 16. Воспалительный лимфоплазмоцитарный инфильтрат, распространяющийся из поверхностных отделов в глубину собственной пластинки, часто содержит лимфатические
фолликулы с герминативными центрами.
Окраска гематоксилином и эозином. х120
28
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
возникают повреждения в структуре ДНК клеток. Это ведет к усилению
апоптоза клеток и появлению мутаций, ведущих в нарушению механизмов
клеточной дифференцировки и пролиферации. Погибшие клетки являются
источником субстратов (НАДН) необходимых для работы оксидаз. Возникает
порочный круг.
Клиническое значение окислительно-восстановительного метаболизма H.pylori
пока не осознается в полной мере [126]. Между тем, оно весьма существенно
и включает в себя два аспекта. Уже давно была отмечена зависимость
между восприимчивостью к метронидазолу и свойством микроаэрофилии
у штаммов H.pylori [221]. Другой аспект связан с высокой мутагенной
активностью активных форм кислорода. Образование даже небольших
количеств супроксидного аниона, гидроксильного радикала, гипохлоритов
и пероксинитритов вблизи камбиальной зоны слизистой оболочки желудка
создает микроокружение, способствующее канцерогенезу. Не исключено,
что с различиями в способности штаммов H.pylori генерировать активные
формы кислорода связаны и различия в их способности индуцировать
канцерогенез. Если перефразировать известное высказывание американского
хеликобактериолога Давида Грехема о том, что «хороший H.pylori это только
мертвый H.pylori», то с учетом уровня активности окислительных ферментов
все же есть «хороший» H.pylori (где их мало) и есть «плохой» H.pylori – с
высоким уровнем продукции активных форм кислорода. Соответственно и
риск развития рака желудка при инфицировании различными штаммами
также будет различным.
Наконец, присутствие H.pylori в слизистой оболочке желудка при H.pyloriгастрите приводит к разбалансировке процессов апоптоза и пролиферации
эпителиальных клеток. С. Вагнер в 1997 году установил, что совместное
культивирование эпителиальных клеток желудка и H.pylori in vitro приводило к
замедлению роста клеток, фрагментации ДНК и усилению апоптоза [251].
Таким образом, хронический гастрит представляет собой не только
воспаление слизистой оболочки желудка, вызванное патогенным
микроорганизмом, а сложное сочетание разбалансированности барьерных
(защитных) механизмов, механизмов регуляции кислой желудочной
секреции, окислительно-восстановительных реакций и клеточного
обновления. Длительное рецидивирующее течение хронического гастрита
создаёт иллюзию банальности этого заболевания. Существенные различия в
интенсивности воспаления и субъективных проявлениях болезни зависят от
вирулентности штамма H.pylori, «запаса прочности» защитных сил организма
(наследственные факторы), а также от факторов окружающей среды и
особенностей пищевого поведения. Серьёзность последствий хронического
воспалительного процесса в слизистой оболочке желудка осознаётся обычно
через 10-15 лет после инфицирования с развитием атрофии железистой
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
29
ткани. Поэтому знание и практическое использование эффективных методов
диагностики хеликобактерной инфекции имеет первостепенное значение
в профилактике тяжёлых осложнений H.pylori-ассоциированной язвенной
болезни и онкологической патологии желудка и двенадцатиперстной кишки.
2.3. Устойчивость Helicobacter pylori к антибактериальным
препаратам
Исследования in vitro показали, что Н.pylori имеет природную резистентность
к следующим антибиотикам: ванкомицину, триметоприму, цефсулоидину,
сульфаниламидам, налидиксовой кислоте и полимиксину В [1]. Эти
антибиотики применяются в микробиологии для создания транспортных и
селективных питательных сред.
Для лечения H.pylori-инфекции используется комплексная терапия (базисный
препарат – соли висмута или блокаторы протоновой помпы в комбинации
с антибиотиками). Блокаторы протоновой помпы, увеличивая рН среды
желудка, способствуют активации действия антибактериальных препаратов.
Использование в клинической практике схем противохеликобактерной
терапии на основе блокаторов протоновой помпы позволило существенно
увеличить уровень эрадикации H.pylori.
Следует
отметить, что количество антибактериальных препаратов,
используемых в клинической практике, для лечения H.pylori – инфекции,
всегда было ограничено из-за уникальной способности обитания этого
микроорганизма в слое пристеночной слизи. Большинство антибиотиков,
попадая в желудок, находится там короткое время, которого, как правило,
бывает недостаточно для проявления антибактериальной активности в
отношении H.pylori. Главными факторами, ограничивающими активность
антибактериальных препаратов в отношении H.pylori, являются также низкое
значение рН среды и ограниченная диффузия антибактериальных препаратов
в толстый слой желудочной слизи. Так, при исследованиях чувствительности
Н.pylori in vitro было показано, что понижение рН среды с 7,5 до 5,5
приводит к изменению минимальной ингибирующей концентрации (МИК)
антибиотиков, и только у производных нитроимидазола, тетрациклинов и
нитрофуранов показания МИК при изменении рН среды практически не
изменялись [24].
Бесконтрольное использование антибактериальных препаратов в целом
и неадекватная противохеликобактерная терапия, как в смысле доз, так
и в смысле длительности лечения, зачастую приводят к формированию
приобретенной резистентности у H.pylori, что сокращает и без того малое
количество антибактериальных препаратов, которые могут быть использованы
30
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
для лечения H.pylori-инфекции. Самый высокий уровень резистентности у
H.pylori регистрируется к производным нитроимидазола. В некоторых странах
он достигает 80% - 90% [177].
Резистентность штамма H.pylori к метронидазолу не является необратимой.
Анаэробные условия восстанавливают чувствительность к метронидазолу
у прежде резистентного штамма [242]. Видимо, в организме в своей нише
обитания H.pylori периодически попадает в анаэробную атмосферу, и это
может служить объяснением того, что у ряда больных с резистентными
штаммами терапия достигает успеха. Важную роль здесь может играть и
то, что в анаэробных условиях восстановление молекулы метронидазола
происходит ускоренными темпами, что ведет к накоплению гидроксильных
радикалов и последующей гибели штамма H.pylori, исходно даже устойчивого
к метронидазолу.
Классическая тройная терапия на основе блокаторов протонового насоса имеет
одинаковую эффективность в сравнении с более новыми схемами тройной
терапии на основе блокаторов протоновой помпы, но несколько уступает им
по числу побочных действий и по показателю соблюдения схемы лечения
больным. Схема лечения с блокатором протоновой помпы, метронидазолом
(тинидазолом) и кларитромицином проста, высокоэффективна, дает мало
побочных действий, однако ее эффективность также снижается, если штамм
H.pylori резистентен к метронидазолу или кларитромицину. Для таких случаев
предусмотрены два варианта тройной терапии на основе блокаторов протоновой
помпы, в первом случае метронидазол заменяется на амоксициллин, а во
втором кларитромицин – на метронидазол.
В целом резистентность H.pylori к антибиотикам существенно снижает
эффективность любой тройной терапии, в среднем на 15-30%. Тем не
менее, квадротерапия также не является панацеей при инфицировании
резистентными штаммами H.pylori. В настоящее время описана
резистентность H.pylori ко всем группам антибиотиков, которые используются
в схемах противохеликобактерной терапии: производным нитроимидазола
(метронидазол), макролидам (кларитромицин), β-лактамам (амоксициллин),
тетрациклинам (тетрациклина гидрохлорид) и нитрофуранам (фуразолидон).
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
проводившиеся в 1998 году показали, что среднеевропейский уровень
резистентности H.pylori к нитроимидазолам составляет 33,1%. Самый низкий
уровень резистентности H.pylori к нитроимидазолам в Бельгии – 18,9%, самый
высокий в Финляндии – 61,6% [101].
В настоящее время установлена несомненная взаимосвязь между статусом
резистентности штаммов H.pylori к метронидазолу и уровнем активности
в них НАДН оксидазы [222]. Статус резистентности штамма H.pylori к
метронидазолу оказался в обратной зависимости от уровня содержания в
нём НАДН-оксидазы. Высокий уровень НАДН-оксидазы характеризует
чувствительные штаммы, а низкий уровень — резистентные штаммы H.pylori
[119]. Активное функционирование НАДН-оксидазы связано с поглощением
внутриклеточного молекулярного кислорода и снижением его содержания в
зоне реакции
2НАДН+2Н+ +О2 = 2НАД+ +2Н2О
При высокой активности НАДН-оксидазы снижается содержание
молекулярного кислорода, происходит успешное восстановление нитрогрупп
метронидазола и проявляется его антибактериальное действие. В случае низкой
активности НАДН-оксидазы происходит избыточное накопление кислорода
в зоне реакции, что подавляет восстановление нитрогрупп метронидазола
и, следовательно, его антибактериальное действие (Рис.17). Интересно,
что воздействия, активирующие НАДН-оксидазу в H.pylori и снижающие
Резистентность H.pylori к производным нитроимидазола (метронидазол)
Наибольшую тревогу у клиницистов во всем мире вызывает резистентность
H.pylori к производным нитроимидазола (метронидазол), которая на
сегодняшний день в различных странах находится в пределах 14-70%.
Наименьший уровень резистентности отмечается в Северной Италии – 14,9%,
наибольший в Бразилии – 70% [207, 208].
Мультицентровые исследования Европейской группы по изучению H.pylori,
31
Рис. 17. Роль НАДН-оксидазы в механизмах резистентности H.pylori к метронидазолу
32
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
таким образом содержание молекулярного кислорода в его микроокружении
(например, излучение гелий-неонового лазера), создают оптимальные условия
для антибактериальной активности метронидазола [46].
Последние данные свидетельствуют о том, что это не просто случайное
выпадение функции одного фермента, а результат мутации гена rdxA,
регулирующего экспрессию целого ряда дегидрогеназных ферментов в H.pylori
[78]. Точный механизм возникновения приобретенной резистентности,
также как и сам механизм действия производных нитроимидазола на
H.pylori неизвестны. Резистентные штаммы H.pylori, вероятнее всего,
появляются в результате мутаций. Было обнаружено, что мутации в гене
rdxA, кодирующем кислород-нечувствительную нитроредуктазу, приводят к
увеличению резистентности H.pylori к 5-нитроимидазолам из-за инактивации
нитроредуктазы. Резистентность к 5-нитроимидазолам может также возникнуть
из-за вставки последовательности (мини IS605) или делеции в гене rdxA.
Резистентность Н.pylori к макролидам (кларитромицин)
Средний уровень первичной резистентности H.pylori к кларитромицину
в Европе, на сегодняшний день, составляет 9,9%. Самый низкий уровень
резистентности H.pylori к кларитромицину в Великобритании – 1,3%, самый
высокий в Италии -27,2%. Среди всех стран, участвовавших в последнем
мульцицентровом исследовании по определению антибиотикорезистентности
у H.pylori, Норвегия оказалась единственной страной, где не было выделено
штаммов H.pylori, резистентных к кларитромицину [102].
Макролиды блокируют синтез белка на рибосомальном уровне и, таким
образом осуществляют свое действие на бактериальную клетку. Генетические
исследования показали, что резистентность H.pylori к макролидам возникает в
результате точечных мутаций в позиции 2142 и 2143 гена 23S рРНК [248].
Резистентность Н.pylori к β-лактамам (амоксициллин)
Первые сообщения о выделении штаммов H.pylori, резистентных к
β-лактамам (амоксициллину), появились в 1997 году. Группа исследователей
под руководством M.P. Dore выделила штамм H.pylori, резистентный к
амоксициллину, от пациента, длительно принимавшего этот препарат. Но,
к сожалению, эта резистентность оказалась нестабильной и исчезла после
замораживания штамма при -70°С и попытки повторной рекультивации
штамма [84]. В 1998 году Российской группе по изучению H.pylori удалось
выделить от пациентов после проведенной противохеликобактерной терапии
штаммы H.pylori со стабильной резистентностью к амоксициллину, которая
может быть связана с точечными мутациями в пенициллинсвязывающем
белке (РВР-1А) [24].
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
33
Во время проведения европейского мультицентрового исследования
антибиотикорезистентности H.pylori в Италии, Германии и Великобритании
были впервые зарегистрированы уровни резистентности H.pylori к
амоксициллину 8,2%, 4,0% и 1,2% соответственно [102].
Резистентность Н.pylori к тетрациклинам (тетрациклина
гидрохлорид)
Тетрациклины являются бактериостатическими препаратами широкого
спектра и действуют путем подавления синтеза белка в результате
блокирования связывания аминоацил-транспортной РНК (аатРНК) с
комплексом информационная РНК (иРНК)-рибосома. Обратимое связывание
тетрациклина происходит с рибосомальной субъединицей 30S чувствительных
микроорганизмов.
Резистентность H.pylori к тетрациклинам также может быть обусловлена
точечной мутацией в позиции 26695 в 16S рРНК [22].
Резистентность Н.pylori к нитрофуранам (фуразолидон)
Значительный рост резистентности H.pylori к метронидазолу, который
входит в состав большинства стандартных схем противохеликобактерной
терапии, привел к резкому снижению эффективности этих схем. В
связи с этим в большинстве стран, где уровень резистентности у H.pylori
превысил критический барьер (40%), этот препарат выведен из схем
противохеликобактерной терапии. Альтернативой метронидазолу в схемах
противохеликобактерной терапии стал фуразолидон, резистентность к
которому у H.pylori развивается крайне медленно. В настоящее время уровни
резистентности у H.pylori к фуразолидону в различных странах составляют в
среднем 1 – 1,8% [9]. Фуразолидон нарушает некоторые ферментные системы
бактерий. Он также действует как ингибитор моноаминоксидазы (МАО).
Ингибиторы МАО препятствуют инактивации тирамина под действием МАО
печени.
Выбор схем противохеликобактерной терапии определяется множеством
факторов, включая индивидуальную непереносимость компонентов
терапии, наличие сопутствующих заболеваний, использование ранее
больным определенных антибиотиков, состоянием желудочной секреции
и т.д. Помимо этих факторов, следует учитывать и такие общие факторы,
как распространенность в популяции штаммов H.pylori, устойчивых к
определенным антибиотикам, и состав схемы лечения. Эффективность
конкретной схемы лечения определяется только опытным путем, опираясь
на результаты научных исследований чувствительности штаммов H.pylori к
антибиотикам.
34
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
2.4. Дрожжеподобные грибы и Helicobacter pylori
В некоторых исследованиях было обнаружено, что после недельного курса
терапии амоксициллином и кларитромицином увеличивается высеваемость
Candida albicans из стула больных [167]. Как известно, дрожжеподобные грибы
(в том числе и Candida albicans) являются классическими представителями
транзиторной флоры. Присутствуя в большом количестве в окружающей
среде, они легко попадают в ротовую полость и дыхательные пути. При
снижении иммунологической реактивности организма они легко фиксируются
на поверхности многослойного плоского эпителия ротовой полости или
слизистой пищевода. Однако кислая среда и протеолитические ферменты
желудка представляют для них трудно преодолимое препятствие. Очень
небольшому количеству клеток гриба (укрывшись в желудочной слизи) удается
проникнуть в кишечник, где существуют более благоприятные условия для их
роста и размножения.
Изучение высеваемости дрожжеподобных грибов рода кандида
из
желудочного сока показало, что после курса стандартной тройной терапии
у H.pylori-позитивных больных, когда рН желудочного сока увеличивается в
2 раза, высеваемость из него Candida spp. возрастает в 2,5 раза. Более того,
в ходе антисекреторной монотерапии ингибиторами протонной помпы у
H.pylori-негативных больных при увеличении рН желудочного сока в 3 раза,
высеваемость из него Candida spp. увеличивается в 3,5 раза. [106]. Следует
отметить, что Candida albicans составляет лишь 41% от грибов рода кандида,
высеваемых из желудочного содержимого. Из других представителей чаще
встречаются C. tropicalis (30%), C. glabrata (9%) или смешанные культуры [261].
Является ли нарастание биомассы грибковой флоры в желудке безразличным
для организма?
Как известно, при нормально функционирующем желудке, отсутствуют условия
для массового проникновения условно-патогенных грибов в кишечник через
кислотно-пептический барьер. Присутствие H.pylori в желудке усиливает
этот барьер, прежде всего за счет стимуляции секреции соляной кислоты и,
возможно, за счет активизации воспалительной реакции в слизистой оболочке
желудка. Кроме того, как установлено в последние годы, H.pylori сам обладает
фунгицидными свойствами [148]. Эти свойства обусловлены компонентом
микробной клетки - терминальным фрагментом рибосомального протеина
L1, состоящим из 19 аминокислотных остатков и названным НР(2-20).
Воздействие НР(2-20) на мембрану грибковой клетки приводит к нарушению
ее структуры с образованием крупных пор, через которые ионы калия
начинают выходить во внешнюю среду. Это заканчивается лизисом грибковой
клетки. Интересно, что фунгицидное действие НР(2-20) не сопровождается
гемолизом человеческих эритроцитов, т.е. воздействие на мембраны носит
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
35
избирательный характер [149].
Что же происходит при эрадикационной терапии? Мощные антисекреторные
средства снимают кислотно-пептический барьер, а антибиотики убирают
H.pylori с его фунгицидным компонентом. Сочетание этих воздействий
приводит к созданию в желудке среды, благоприятной для развития грибковой
флоры, которая затем в больших количествах поступает в тонкую кишку.
Следует подчеркнуть, что обнаружение дрожжеподобных форм и даже
псевдомицелия грибов в желудочной слизи еще не является критерием
для установления диагноза кандидоза желудка (т.к. в большинстве случаев
отсутствует адгезия к эпителиальным клеткам желудка, и нет инвазивного
роста). Однако нарастание биомассы дрожжеподобных грибов является
предпосылкой – реальным риск-фактором для развития кандидоза кишечника
(особенно при наличии в желудочном содержимом псевдомицелия гриба). Как
известно, мицеллярные формы Candida spp легко адгезируются к энтероцитам.
Псевдомицелий, попадая в двенадцатиперстную кишку уже из желудка, имеет
больше шансов для фиксации на клеточных структурах эпителия кишки и
быстрого начала инвазивного роста уже в начальных отделах тонкой кишки с
развитием классических проявлений кандидоза кишечника.
Как показало проведенное нами исследование, после успешного курса
Рис. 18. Внутрижелудочные барьеры для проникновения дрожжеподобных грибов
в тонкую кишку. RPL – рибосомальный протеин L, обладающий фунгицидной активностью
36
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
эрадикационной терапии (когда H.pylori отсутствует), дрожжеподобные грибы
обнаруживаются в желудочной слизи чаще и уже в значительно большем
количестве, образуя иногда целые колонии [28]. Условия для Candida spp
настолько благоприятны, что они образуют даже псевдомицелярные структуры
(ведь фунгицидные компоненты H.pylori особенно активны в отношении
мицелярных форм гриба).
Явления микробного антагонизма между дрожжеподобными грибами и H.pylori
могут существенно влиять на характер патологического процесса в слизистой
оболочке желудка и двенадцатиперстной кишки. Вероятно, присутствие
H.pylori с его фунгицидной активностью и низкие значения внутрижелудочного
рН препятствуют проникновению и развитию дрожжеподобных грибов во
внутренней среде организма, тогда как подавление этих факторов в ходе
эрадикационной терапии способствует активизации грибковой флоры
(Рис.18).
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
37
ГЛАВА.3. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ
HELICOBACTER PYLORI
Все существующие методы лабораторной диагностики H.pylori-инфекции
принято делить на три группы: инвазивные, для проведения которых
необходима
эзофагогастродуоденоскопия [77], т.к. материалом для
исследования служат биоптаты слизистой оболочки желудка, малоинвазивные,
для проведения которых необходимо получение капиллярной крови из
пальца больного, либо крови из вены, и неинвазивные, не требующие
эндоскопического исследования и взятия крови [16, 57]. Различают еще
прямые и косвенные методы определения H.pylori [8]. Прямые методы
позволяют непосредственно выявить микроорганизмы H.pylori или его
антигены (например, под микроскопом в гистологическом препарате), а
косвенные регистрируют не саму бактерию, а идентифицируют продукты её
жизнедеятельности или антитела к ней (например, с помощью серологического
метода определяются антитела к H.pylori, при дыхательном тесте с мочевиной,
меченной изотопами углерода 13С/14С – приращения углекислого газа с
меткой изотопа в выдыхаемом пациентом воздухе, что является следствием
ферментативного расщепления мочевины уреазой H.pylori. При дыхательном
аммиачном (аммонийном) тесте определяют аммиак, продуцируемый при
реакции мочевины с уреазой H.pylori). Также имеются методы, проводимые
in vitro в различных пробах (биоптате, крови, секретах) и in vivo после приема
мочевины.
По методологическим подходам методы лабораторной диагностики H.pylori
объединяются в следующие большие группы [41]:
1. Биохимические методы:
1.1. быстрый уреазный тест,
1.2. уреазный дыхательный тест с 13С - мочевиной
1.3. аммонийный дыхательный тест
2. Морфологические методы:
2.1. гистологический метод – выявление H.pylori в биоптатах слизистой
оболочки антрального отдела и тела желудка,
2.2. цитологический метод – выявление H.pylori в слое пристеночной слизи
желудка.
3.Бактериологический метод с выделением чистой культуры и определением
чувствительности к антибиотикам.
4. Иммунологические методы:
4.1. выявление антител к H.pylori в слюне, зубном налете, моче
(иммуноферментный анализ).
4.2. выявление антител к H.pylori в крови (серологические тесты).
38
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
4.3. выявление антигена H.pylori в кале.
4.4. иммуногистохимическое выявление H.pylori в ткани желудка.
5. Молекулярно-генетические методы:
5.1. полимеразная цепная реакция (ПЦР), для изучения биоптатов
слизистой оболочки желудка. В последнее время ПЦР проводится не
столько для выявления H.pylori, сколько для верификации штаммов H.pylori
(генотипирование).
Каждый из существующих методов обладает своими преимуществами
и недостатками. Поэтому в каждой конкретной ситуации выбор метода
или комплекса методов должен соответствовать поставленной задаче.
При первичной диагностике заболеваний органов пищеварения отдается
предпочтение инвазивным методам, так как главной целью обследования
больного является не только диагностика H.pylori-инфекции, но и выяснение
вида патологии, ее распространенности, выраженности и глубины поражения.
Всемирная Организация Здравоохранения относит H.pylori к канцерогенам
1 группы [120]. Канцерогенные свойства H.pylori доказаны множеством
эпидемиологических и экспериментальных исследований [64]. Нельзя
забывать, что Россия относятся к регионам с высокой частотой рака желудка.
В 2007 году по данным официальной статистики ВОЗ в России заболело
раком желудка около 44 000 человек или 30,56 на 100 тыс. населения, что
является одним из самых высоких показателей в Европе [33]. Смертность от
рака желудка составила 18,7 на 100 тыс. населения. При эпидемиологических
(скриннинговых) обследованиях населения на наличие H.pylori-инфекции
лучше использовать малоинвазивные или неинвазивные методы.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
желудочных ямок, а также выявлять участки различных типов кишечной
метаплазии [228]. Инфракрасная спектроскопическая эндоскопия выявляет
скопления H.pylori в слизистой оболочке желудка и участки кишечной
метаплазии с высокой точностью [229].
3.1.1. Гистологический метод
Гистологический метод выявления H.pylori считают “золотым стандартом”
диагностики инфекции [3, 34]. Его специфичность оценивается 97-98.9%, а
чувствительность 80-98.4% [231]. Возможность оценить состояние слизистой
оболочки желудка: характер воспаления, активность гастрита, наличие и
степень выраженности атрофии и кишечной метаплазии, а также выявить
H.pylori и определить количественно степень обсемененности им слизистой
оболочки – огромное преимущество гистологического метода [87] (Рис.19).
Сами микроорганизмы могут быть идентифицированы в гистологических
препаратах в связи с их специфической изогнутой или s-образной формой
и месторасположением относительно слизистой оболочки: чаще всего
они расположены на поверхности эпителиоцитов, в просвете желудочных
ямок и в слое слизи, покрывающей эпителий (Рис.19). Чувствительность
гистологического метода зависит от размера биоптата, их числа и правильности
их обработки [98].
Считается, что если для первичной диагностики H.pylori -инфекции достаточно
двух биоптатов (один из антрального отдела, один из тела желудка), то при
3.1. Инвазивные методы выявления Helicobacter pylori
Инвазивные методы основываются на обнаружении H.pylori в биоптатах
слизистой оболочки желудка, получаемых во время эндоскопического
исследования. Широкое проведение эндоскопического исследования для
диагностики патологии верхнего отдела желудочно-кишечного тракта
регламентировано отечественными “Стандартами диагностики и лечения
болезней органов пищеварения” (1998) [40], а также Четвёртым Московским
соглашением (2010) [41]. Согласно Международным рекомендациям также
оправдывается широкое диагностическое использование эндоскопии, как для
диагностики H.pylori, так и для выяснения состояния слизистой оболочки желудка
[165]. Следует отметить, что в последнее время всё большее распространение
получают новейшие эндоскопические технологии, способные порой заменить
гистологическое исследование. Изучение эндоскопического изображения в
узко-лучевом освещении (NBI) помогает судить об изменениях в строении
39
Рис. 19. Хронический хеликобактерный гастрит антрального отдела
желудка. Отек и диффузная лимфоплазмоцитарная инфильтрация собственной пластинки. ГЭ. х120
Рис. 20. H.pylori, адгезированный к поверхности эпителиальных клеток шеечного отдела пилорических желез.
Окраска по Гимза. х1200
40
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
проведении контроля за результатами лечения, для получения достоверного
результата следует брать не менее трех биоптатов (два из антрального отдела
и один из тела желудка) [86].
После иссечения биоптатов слизистой оболочки желудка их сразу же помещают
в фиксирующий раствор, представляющий собой 10% раствор нейтрального
формалина, являющийся стандартным тканевым фиксатором, позволяющим
впоследствии использовать любые методики окраски гистологических срезов.
Оптимальное время нахождения желудочных биоптатов в фиксирующем
растворе – 6 часов. Стандартная процедура обезвоживания материала в
спиртах возрастающей концентрации и заключения в парафин осуществляется
в условиях патогистологической лаборатории квалифицированными
лаборантами и предусматривает правильную ориентацию кусочков в
парафиновом блоке, с тем, чтобы срез ткани в процессе изготовления
гистологического препарата проходил параллельно длинной оси желудочных
желёз. Необходимо, чтобы толщина срезов не превышала 5 мкм. Стандартная
методика окраски гистологических срезов гематоксилином и эозином (см.
Приложения) при правильном соблюдении всех технических условий уже
позволяет визуализировать скопления H.pylori на поверхности желудочного
эпителия. Однако различные виды гематоксилина с различной интенсивностью
окрашивают эти микроорганизмы. Лучше всего их окрашивает гематоксилин
Майера. Если скопления микроорганизмов небольшие, а количество
окружающей слизи и десквамированных клеток на поверхности эпителия
велико, окраска гематоксилином и эозином не позволяет эффективно выявить
H.pylori.
Для элективной окраски H.pylori применяют различные методики. Наиболее
распространенными являются окраски толуидиновым синим [220],
красителем Гимзы, чувствительность которых составляет 90% по сравнению
с бактериологическим методом [145]. Серебрение по Вартин-Старри (см.
Приложения) отличается высокой специфичностью и чувствительностью
[85] (Рис.21). Стоит напомнить, что бактерия H.pylori впервые была “открыта”
Рис. 21. Выявление Н.pylori с помощью
импрегнации нитратом серебра по
Вартин-Старри
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
41
миру именно в гистологическом препарате, окрашенном этим методом [252].
При использовании бактериологического, в качестве эталонного метода,
чувствительность и специфичность гистологического метода при окраске
срезов по Граму оказалось равной 100% и 97%, а при окраске по Гименесу 100%
и 87% соответственно [124]. Другие окраски, также широко используемые
в настоящее время, имеют чувствительность, близкую с окраской по Гимзе,
по Генте [88], альциановым желтым [245], окраской крезил-виолетом (см.
Приложение) и др. Недостатком всех элективных методик окраски является
плохая визуализация в слизистой оболочке желудка общих патогистологических
изменений, которые лучше всего выявляются гематоксилином-эозином.
Очень высокой чувствительностью обладает окраска акридиновым оранжевым
с изучением в люминисцентном микроскопе. Обнадеживающие результаты
получены при усовершенствовании морфологического выявления H.pylori
методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), при которой
производят обработку срезов меченными флюоресцирующими нуклеотидами,
после чего бактерии обнаруживаются при флюоресцентной микроскопии [235].
Методика не только высокочувствительна (91%), но и высокоспецифичная
(100%). С ее помощью можно идентифицировать различные штаммы H.pylori
и выявлять природу его повторного обнаружения после успешного лечения и
инвазию смешанными штаммами [214].
Специфичность и чувствительность гистологического метода может быть
увеличена при использовании иммуногистохимии с моноклональными
антителами против H.pylori, при которой определяются даже единичные
микроорганизмы [174, 192, 218, 234].
Но в ряде случаев гистологический метод может давать ложноотрицательные
результаты, которые связаны, в основном, с рядом технологических
причин. Длительное нахождение биоптата в жидких средах (фиксаторы,
спирты при обезвоживании) приводит к почти полному отмыванию с
поверхности слизистой оболочки слоя слизи [36]. Возможно, это связано как с
особенностями самого микроба, который обитает в слое слизи, покрывающей
эпителий желудка и не всегда плотно адгезирован к эпителию, поэтому легко
вымывается при подготовке биоптатов к исследованию, так и сам слизистый
слой желудка легко отмывается в процессе подготовки биоптата. Морозов
И.А. для сохранения поверхностного слоя слизи и бактерий в нем предлагает
укрывать поверхность биоптата слоем агарового геля (0,85-1,0%) [39].
К недостаткам гистологического метода можно отнести необходимость
больших трудозатрат и длительного срока исполнения (3-5 суток), что влечет
за собой задержку назначения адекватного лечения.
42
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
43
3.1.2. Цитологический метод
Цитологический метод основан на получении полноценного биоптата
слизистой оболочки соответствующего отдела желудка (тело, антральный
отдел) с последующим его раздавливанием (crush cytology) между двумя
предметными стеклами (Рис.22), подсушиванием и фиксацией над
пламенем спиртовки, окраской по Граму и изучением в микроскопе при
увеличении 630-1000 раз. При наличии у больного H.pylori -инфекции в
поле зрения микроскопа обнаруживается большое количество микробных
тел, а их верификация не представляет никаких затруднений (Рис.22).
Подсчёт количества микробных тел в цитологических препаратах (да
и в гистологических тоже) нецелесообразен, так как распределение
микробных тел в пристеночной слизи очень неравномерное. Участки очень
высокой концентрации бактерий могут чередоваться с зонами их полного
отсутствия. Поэтому в результатах исследования достаточно ограничиться
фактом обнаружения H.pylori в виде Грам-отрицательных спиралевидных
бактерий или Грам-отрицательных кокков. Гораздо важнее отметить наличие
сопутствующей микрофлоры. Иногда в поле зрение микроскопа попадают
другие виды Helicobacter, например H.heilmannii, которые поражают чаще
домашних животных, но при определенных условиях могут быть патогенны и
для человека. Бактериоскопически они отличаются большей длинной и более
выраженной спиралевидной формой (Рис.23).
Вся процедура подготовки цитологического препарата занимает около 10 минут
и может проводиться сразу же после взятия биопсии. При приготовлении
препаратов для этого метода исключается смывание желудочной слизи, где
находятся H.pylori [35]. В зависимости от способа получения материала из
Рис. 22. Только что извлечённые биоптат укладывается на предметное стекло
(а), покрывается другим предметным стеклом и раздавливается между ними (б)
вращательными движениями. Оставшиеся нераздавленными соединительнотканные фрагменты можно удалить пинцетом
Рис. 23. Спиралевидные (а) и кокковые (б) формы H.pylori в желудочной слизи при
цитологическом исследовании. Окраска по Грамму. а) х 900, б) х1200
желудка для дальнейшего цитологического изучения различают несколько
вариантов метода: crush cytology - раздавливание биоптата, imprint или
touch cytology - прикосновение и отпечаток люминальной поверхности
биоптата к предметному стеклу и brush cytology - получение пристеночной
слизи с помощью специальной щеточки, входящей в комплект современных
эндоскопов [82, 154, 181].
Наиболее эффективным оказался способ приготовления цитологических
препаратов путем раздавливания биоптата (crush) на предметном стекле.
Цитологический препарат подсушивается на воздухе и до исследования
хранится в холодильнике. Перед исследованием препараты фиксируют над
пламенем спиртовой горелки в течение 20-30 сек. на расстоянии не менее 10
см. В практической работе удобно использовать окраску мазков слизи 0,05%
раствором акридинового оранжевого. Окраска акридиновым оранжевым
(5 мг на 10 мл дистиллированной воды или физиологического раствора)
осуществляется путем нанесения небольшой капли (15-20 мкл) на поверхность
фиксированного мазка. Капля накрывается покровным стеклом, а избыток
Рис. 24. H.heilmannii отличаются большей длиной и более выраженной спиралевидной формой. Окраска по Граму. х 900
44
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Рис. 25. а).Набор реактивов и приспособлений для окраски цитологических препаратов по Граму. б) Окрашенные цитологические препараты
раствора по его краям отбирается фильтровальной бумагой. Через 1-2 мин.
препарат изучают в темном поле люминесцентного микроскопа под объективом
с водной иммерсией. При этом бактерии специфической S-образной
формы дают оранжевую флюоресценцию, но кокковые формы бактерий
не выявляются. Этот способ очень надежен для первичной диагностики,
но мало пригоден для контроля эрадикации после антихеликобактерной
терапии. Ограничением этого способа является отсутствие у исследователя
люминесцентного микроскопа.
По всем параметрам (простоте, специфичности, надежности, доступности
реактивов и стоимости) наилучшие результаты даёт способ окраски
цитологических препаратов по Граму [185] (Рис.25). Окрашенные мазки
изучают под иммерсией в световом микроскопе при увеличении х1000.
Оптимальный режим окраски цитологического препарата по Граму для
диагностики H.pylori -инфекции изложен в приложении.
Способ показал свою надежность при дифференциальной оценке вида
кокковой микрофлоры после проведения лечения блокаторами секреции
HCl и антихеликобактерными препаратами [37].
На основании того, что этот метод позволяет выявлять не только бациллярные,
но и кокковые формы H.pylori, некоторые клиницисты критикуют его за
возможную гипердиагностику инфекции H.pylori, особенно после проведения
курса антихеликобактерной терапии [12]. Однако, теперь хорошо известно,
что в неблагоприятных условиях микроокружения (в том числе и на
фоне нерациональной антибиотикотерапии), микроб может менять свою
морфологию с формированием крупных и мелких кокков. При этом
визуализацию их относительно покровно-ямочного эпителия не следует
считать ложноположительным результатом [47]. Несовпадения же с данными
уреазного теста обусловлены скорее снижением чувствительности уреазного
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
45
теста после приёма антисекреторных или антибактериальных препаратов
[43].
Нами в Центральном НИИ гастроэнтерологии в период с 2003 по 2007 год
проводилась оценка эффективности цитологического метода диагностики
хеликобактерной инфекции при сравнении с результатами других
тестов, для которых показатели чувствительности и специфичности уже
известны (гистологического, быстрого уреазного, дыхательных уреазного и
аммонийного). За этот период обследовано 2210 больных в возрасте от 17 до
81 года, поступавших с желудочно-кишечной и гепатобилиарной патологией
в различные отделения ЦНИИГ. Общая инфицированность обследованных
больных, как видно, не превышала 42%. Такой низкий процент выявления
H.pylori объясняется широким разнообразием патологических состояний,
служивших причиной обращения больных за медицинской помощью. Данные,
приведенные в таблице 1, свидетельствуют о высокой эффективности
цитологического метода. Высокая чувствительность (89%) и специфичность
(92,7%) вполне сопоставимы с теми же показателями у гистологического
метода. Точность цитологического метода составила 91,2%. В ходе этого
исследования результаты всех пяти тестов совпадали менее, чем у половины
больных. Чаще всего данные цитологического исследования совпадали с
результатами быстрого уреазного теста (у 90% больных), реже – с данными
аммонийного дыхательного теста (у 76,2% больных). Ложноположительные
и ложноотрицательные результаты цитологического теста встречались
с одинаковой частотой. Причиной ложноотрицательных результатов
цитологического метода чаще всего было отсутствие желудочной слизи в
препарате, при неправильном приготовлении мазка (на нашем материале
встречалось в 1,2% исследований), либо при взятии биопсии из зоны
кишечной метаплазии, которую H.pylori не колонизирует. Причиной же так
называемых «ложноположительных» результатов было, как правило, снижение
чувствительности уреазных методов на фоне приёма антисекреторных
препаратов [48], а вовсе не выявление кокковых форм H.pylori, которые
встречались лишь у 2,7% обследованных.
К достоинствам цитологического метода с окраской препаратов по Граму
надо отнести возможность выявления других видов микроорганизмов в
желудочной слизи. Так у 7,5% всех обследованных были выявлены скопления
Грам-положительных палочковидных бактерий и Грам-положительных кокков
(Рис.26), а у 11,2% больных – скопления дрожжеподобных грибов. Интересно,
что если при первичном обследовании грибы выявлялись лишь у 9% больных
и, в основном, в виде дрожжевидных форм и небольших скоплений, (Рис.27)
то после курса антихеликобактерной терапии они обнаруживались уже у 13%
больных и виде крупных скоплений и отдельных псевдомицелярных форм
(Рис.28).
Цитологический метод гораздо менее трудоемок по сравнению с
46
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
47
гистологическим исследованием, что значительно сокращает время получения
результата. Получение результатов возможно в день эндоскопического
обследования больного. Это позволяет в тот же день назначить адекватное
лечение, включая профилактическое назначение фунгицидных препаратов.
Рис. 27. а) Единичные клетки дрожжеподобных грибов на фоне большого количества H.pylori. Окраска по Грамму. Увеличение х900; б) Дрожжеподобные грибы
при отсутствии H.pylori. Окраска по Грамму. Увеличение х1800
Рис. 26. а) Скопления грам-положительных
палочек и кокков в желудочной слизи.
б) Группы грам-отрицательных кокков и
отдельные грам-положительные стрептококки в желудочной слизи
Рис. 28. а) Дрожжеподобные грибы в
желудочной слизи после курса эрадикационной терапии. Окраска по Граму.
Увеличение х1200; б, в) Псевдомицелий
C.albicans в желудочной слизи после
курса эрадикационной терапии. Окраска по Граму. Увеличение х1200
48
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
49
3.1.3. Биохимический метод
Биохимический метод обнаружения H.pylori в биоптате основан на высокой
уреазной активности этого микроба, в 100 раз превышающей таковую у других
уреазопозитивных бактерий и потому носит название «уреазного теста».
В основе этого метода лежит гидролиз мочевины под действием уреазы H.pylori:
Получающийся ион аммония приводит к увеличению рН среды, что
можно увидеть с помощью индикаторов, по изменению окраски среды. В
основе разработки уреазных тестов для диагностики H.pylori лежат методы,
определяющие тканевую, а не бактериальную, уреазу при комнатной
температуре, имеющие значение рН среды близкое к 8,2 (оптимум рН для
уреазы H.pylori), содержащие бактерицидные добавки для уничтожения другой
микрофлоры в биоптате. Биохимический метод чаще других используется
в практической медицине в силу своей дешевизны, простоты исполнения и
оценки результатов.
3.1.4. Уреазные тесты
Уреазные тесты могут быть изготовлены самостоятельно с использованием
недорогих реактивов (см. Приложения). Одномоментный – быстрый
уреазный тест, готовится “ex tempore”: к 1 мл 10% р-ра мочевины в
деионизированной дистиллированной воде добавляется 2 капли 1% раствора
фенол-рот или тест, содержащий 2% мочевины и буфер, имеющий рН 6,8
[51]. Но эти тесты широкого распространения не получили, т.к. они не
дают выигрыша во времени, которое тратится на приготовление раствора,
а также необходимости вспомогательного персонала. К недостаткам этих
тестов относятся: неустойчивость растворов при хранении, необходимость в
ряде случаев термостатирования, возможность как ложноположительных, так
и ложноотрицательных результатов (при низкой степени обсемененности
слизистой оболочки H.pylori).
Наиболее удобны тесты, выпускаемые промышленным способом, поскольку
они дешевы, просты в использовании, по большей части не требуют времени
Рис. 29. Быстрый уреазный тест. Изменение цвета раствора с жёлтого на синий в течение
3 минут считается положительной реакцией на H.pylori
на приготовление. В настоящее время существуют различные модификации
уреазного теста – преимущественно на жидкостной или гелевой основе
(CLOtest, Campy-test, Pyloritek (Serim Research Corporation), Tri-Med Specialities, Osborn Park, Western Australia, HelicochecK (Institute of Immunology Co Ltd, Tochigt, Япония), H.pylori-FAST, УРЕ АШПтест и др.). В России
широко распространены тесты отечественного производства на основе сухого
индикатора (тест-системы ХЕЛПИЛ, ООО «АМА»), которые предусматривают
предельно простую (помещение биоптата на поверхность индикаторного диска
прямо в ходе эндоскопии) и быструю (до трех минут) процедуру. Благодаря
свойствам сухого индикатора, который не оказывает влияния на биоматериал,
эти тесты позволяют сохранить биоптат для вторичного использования в
диагностических целях: кусочек ткани после трехминутного пребывания
на сухом индикаторном диске может быть направлен на гистологическое
исследование или на исследование методом ПЦР в биоптате.
Все эти методы просты в использовании и позволяют с достаточно высокой
точностью идентифицировать H.pylori по изменению цвета индикатора в
результате защелачивания среды теста аммиаком, выделившимся в процессе
гидролиза мочевины теста микробной уреазой. Большинство тестов содержат
в качестве индикатора феноловый красный, который изменяет свой цвет с
желтого в кислой среде на красный в щелочной. Время срабатывания тестов
от 3 мин. до 24 часов. Тест-системы ХЕЛПИЛ предусматривают очевидный
50
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
цветовой переход окраски индикаторного диска или его участка с ярко
желтого на ярко синий (рис. 29), реакция проявляется сразу же при контакте
биоптата с поверхностью сухого индикатора, время срабатывания – не более
трех минут.
Специфичность тестов очень высокая (100%) [151], чего нельзя сказать об
их чувствительности. Чувствительность тестов варьирует в широких пределах
(75-95%) и зависит не только от фирмы производителя, сроков хранения
теста, но и от степени обсемененности исследуемого биоптата и приема
антисекреторных средств [5, 20, 173, 194, 217]. Выбор того или иного теста
определяется его стоимостью, временем, за которое может быть получен
результат, простотой изготовления и использования.
Основным недостатком всех уреазных тестов является их непрямая сущность,
то есть выявление не самих бактерий, а лишь их уреазной активности. При
невысокой обсемененности суммарная уреазная активность может быть очень
низкой, что может привести к ложноотрицательному результату. Кроме того,
существуют и уреазонегативные штаммы H.pylori, для выявления которых
уреазные тесты непригодны.
Из продаваемых в нашей стране уреазных тестов импортного производства
наиболее подходящим для практического использования по соотношению
стоимость/эффективность является УРЕ АШПтест фирмы PLIVA-Lachema
Diagnostika (Брно, Чехия). Специфичность его и чувствительность такая же,
как у других тестов, но стоимость существенно ниже и составляет около 10
рублей на одно определение. Однако, выполнение данного теста связано с
процедурой разведения субстрата в лунке, а также с созданием анаэробных
условий введением парафинового масла, что предопределяет возможность
диагностики, как правило, в условиях лаборатории и значительно увеличивает
время проведения теста. Наиболее экономичная и малозатратная по
времени процедура исполнения отмечается у отечественных тест-систем
ХЕЛПИЛ, все более популярных и за пределами России (международное
зарегистрированное название AMA RUT). Стоимость теста невысока, она
зависит от формы выпуска и варьируется от 30 рублей.
3.1.5. Бактериологический метод
Бактериологический метод дает возможность культивировать H.pylori,
используя биоптаты слизистой оболочки желудка. При этом виде исследования
возможно не только выделение чистой культуры H.pylori и ее идентификация,
но и изучение его морфологических, биохимических и биологических свойств.
Метод дает возможность проводить внутривидовое типирование штаммов,
определять антибиотикорезистентность H.pylori и проводить динамические
наблюдения за ней, позволяет изучать факторы патогенности H.pylori и
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
51
изготовлять препараты для серологической диагностики.
Этот метод включает в себя несколько этапов: транспортировка,
культивирование, изучение культуры. Ко всем этим этапам предъявляются
определенные требования. Эндоскопическое исследование и получение
биоптата должно осуществляться аппаратом со стерильным зондовым каналом
и биопсийным зондом. Поскольку H.pylori микроаэрофил и быстро гибнет в
воздушной среде, биоптат сразу после взятия должен быть помещен в одну из
специальных транспортных сред. Существует несколько видов транспортных
сред с различным сроком сохранения биоптата: физиологический раствор
[115] (не более 30 минут), 20% раствор глюкозы при температуре 4°С [105,
247] (в течение 5 часов), питательные бульоны, среды Кэрри-Блэр, Стюарта,
“Portagerm pylori” [92, 104] (в течение суток). После доставки пробы подлежат
обработке и посеву на специальные среды. Наилучшие результаты получают
при посеве в первые 2-4 часа после получения биоптата.
В стерильную фарфоровую ступку вносят 100-200 мкл стерильного
физиологического раствора; стерильной микробиологической петлей или
пастеровской пипеткой переносят в ступку биоптат из пробирки с транспортной
средой. Тщательно растирают биоптат пестиком и распределяют полученный
гомогенат по чашкам Петри, втирая его в агар шпателем. Каждый образец
биопсии высевается параллельно на две чашки Петри - одну, не содержащую
антибиотики, и вторую, содержащую антибиотики в следующих концентрациях:
ванкомицин в концентрации 6 мкг/мл, триметоприм в концентрации 2 мкг/мл
и амфотерицин-В в концентрации 2-10 мкг/мл [139].
Для культивирования микроба используют различные селективные и
неселективные питательные среды, в которые входят: основа кровяного агара
№2, основа агара Колумбиа, агар для выделения бруцелл с добавлением
цельной или лизированной крови овцы или лошади [146], среда Скирроу.
В настоящее время широко используется селективная среда “Pylori”,
выпускаемая BIOMerieux.
Для инкубации посевов необходимо соблюсти ряд условий: микроаэрофильная
атмосфера при содержании кислорода не более 5% (5-10% углекислого газа)
[178], pH среды от 5,5 до 8,5 [122], оптимальный температурный режим 37°С
(отдельные штаммы могут расти и при более высокой температуре, но не
растут при 27°С и 42°С) [68, 203], время инкубации в термостате 3-7 дней с
увеличением до 10-14 дней в случае, когда биоптат получен после проведения
противохеликобактерной терапии, длительность хранения с использованием
различных сред [253]. Чаще всего используются среды: 1% пептонная вода,
содержащая 15% глицерина [146], триптиказа соевый бульон, содержащий 15%
глицерина, позволяет сохранить жизнеспособность бактерии на протяжении
месяцев [212], дефибринированная кровь лошади, кролика или овцы способна
сохранять жизнеспособность даже несмотря на несколько размораживаний [68,
52
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
286], а сердечно-мозговой бульон, содержащий глицерин, дает высеваемость
культуры 80-90% через 6 лет хранения при температуре – 70°С [104]. Таким
образом, микробиологический метод включает в себя несколько стадий, от
качественного выполнения которых зависит конечный результат [227, 244].
На кровяной питательной среде H.pylori на 5-7-е сутки формирует мелкие,
круглые, гладкие, прозрачные, влажные колонии диаметром около 1мм. При
необходимости дальнейшего изучения такие колонии пересевают на кровяной
агар, содержащий ростовые и антибиотические добавки. Выращенная культура
подлежит идентификации, для чего приготовляют цитологический мазок с
окраской по Граму. Под микроскопом при увеличении 600-1000 раз типичные
бактерии H.pylori выглядят как Грам-отрицательные (окрашенные в красный
цвет) S-образно изогнутые палочки. Кроме того, проводятся биохимические
тесты: уреазный, оксидазный, каталазный.
Уреазный тест с чистой культурой H.pylori можно ставить в пробирках типа
эппендорф. В пробирки вносится 2% раствор мочевины по Кристенсену с
индикатором – феноловым-красным, а затем в него добавляется исследуемая
культура. Результаты реакции наблюдаются уже в первую секунду – раствор
мочевины резко изменяет свою окраску с ярко желтой на темно малиновую.
Более медленно, как правило, в этом тесте реагируют кокки, протеи и др. В
качестве отрицательного контроля используют культуру E.coli.
Тест на способность к продукции каталазы выполняют следующим образом:
материал агаровой культуры суспендируют в капле 3% раствора перекиси
водорода на поверхности предметного стекла; через 3-5 секунд во взвеси
каталазопозитивной культуры происходит образование пузырьков газа.
Позитивным контролем может служить суточная агаровая культура Escherichia
coli, негативным — любой стрептококк.
Для выявления активности цитохромоксидазы: каплю 1% водного раствора
тетраметилпарафенилендиамина гидрохлорида наносят на исследуемые
колонии непосредственно на поверхности агара в чашке Петри. Через 20-30
секунд оксидазопозитивные колонии окрашиваются в темный цвет. Этот же
тест можно выполнять на фильтровальной бумаге, на которую петлей наносят
агаровую культуру и сверху - каплю реактива. Через 5-10 секунд позитивная
культура приобретает пурпурную или черную окраску. Контролями служат
суточные агаровые культуры Escherichia coli (негативный контроль) и
псевдомонад (позитивный контроль).
Для первичной диагностики H.pylori-инфекции бактериологический метод
слишком дорог и трудоемок, но он незаменим для получения штаммов
микроорганизма для проверки на предмет резистентности к тем или иным
антибактериальным препаратам, что позволяет прогнозировать результаты
лечения [21, 23, 26].
При определении чувствительности к антибиотикам используются
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
53
классические методы с чистой культурой H.pylori или методы молекулярной
биологии.
В бактериологических тестах на антибиотикорезистентность широко
применяется методика серийных разведений, Е-тест, диско-диффузионная
методика, скрининговый тест (см. Приложения).
Методика серийных разведений
Позволяет
получить
количественные
показатели
минимальной
ингибирующей концентрации (MIC), выраженные в мкг антибиотика на 1
мл питательной среды. Определение антибиотикорезистентности H.pylori
проводится с использованием твёрдой питательной среды. Минимальная
ингибирующая концентрация определяется как наименьшая концентрация
тестируемого антибиотика, при которой отсутствует рост чистой культуры
H.pylori, содержащей в суспензии 0,5х109 колониеобразующих единиц в 1
мл. С учётом стандартного режима дозирования для каждого антибиотика,
используемого для лечения H.pylori-инфекции, определена минимальная
ингибирующая концентрация. Для амоксициллина она составляет 0,5 мкг/мл,
для кларитромицина – 1 мкг/мл, для метронидазола – 8 мкг/мл.
Несмотря на то, что эта методика сама точная, она редко используется в
клинической практике из-за длительности анализа, сложности её постановки
и высокой цены. Однако эта методика незаменима в качестве референсной
для оценки эффективности других методов.
Эпсилометрический ε-тест
Это количественный вариант диско-диффузионной методики. Основным
компонентом ε-теста является пластиковая полоска, с одной стороны
пропитанная антибиотиком (амоксициллин, кларитромицин
или
метронидазол) в нарастающей концентрации. На другой стороне полоски
нанесена шкала для количественной оценки минимальной ингибирующей
концентрации (мкг/мл). ε-тест выполняется только в тех случаях, когда
необходимо установить точное значение минимальной ингибирующей
концентрации антибиотика.
Методика серийных разведений и ε-теста в сравнительном исследовании
показали сходные результаты при анализе чувствительности к амоксициллину
и кларитромицину, но обе не были пригодны для контроля резистентности
культур H.pylori к метронидазолу. Определение чувствительности с помощью
диско-диффузионной методики оказалось более подходящим для исследования
чувствительности и к макролидам и метронидазолу [22].
54
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
55
Диско-диффузионная методика
3.1.6. Молекулярный метод
Представляет
собой
полуколичественный
метод
определения
антибиотикорезистентности, который чаще всего используется в клинической
практике для хорошо растущих микроорганизмов. Для медленно растущих
микроорганизмов, таких как H.pylori, его обычно не рекомендуют использовать,
хотя результаты его применения для оценки чувствительности H.pylori к
амоксициллину и кларитромицину дают хорошую корреляцию с методом
серийных разведений.
Штаммы H.pylori, выделенные от больного, могут быть изучены не только
морфологически и биохимически (спектр энзимов) (Таблица 2), а также
с помощью полимеразной цепной реакции. Это позволяет оценить свойства
микробов, их токсигенность по обнаружению генов CagA, VacA, IceA, BabA
и др., а также резистентность к антибиотикам (макролидам) по точечной
мутации 23S рибосомальной РНК.
Вместе с тем, бактериологический метод имеет ряд существенных недостатков,
ограничивающих его широкое применение в клинической практике. Вопервых, это ограничение сроков транспортировки биопсийного материала в
бактериологическую лабораторию. Во-вторых, большая продолжительность
исследования, не позволяющая получить заключение о наличии у больного
H.pylori -инфекции ранее, чем через неделю, что влечет за собой промедление
с началом адекватной терапии. В-третьих, метод очень трудоемкий и дорогой.
Его использование с единственной целью обнаружения H.pylori-инфекции
не целесообразно. Для этого можно использовать более быстрые, дешевые
и информативные методы. Специфичность бактериологического метода
составляет 95-100%, а чувствительность – 80-98.4% [176].
Молекулярный метод диагностики H.pylori применяется для обнаружения
фрагментов различных генов H.pylori в биоптатах СОЖ, зубном налете, кожи
[4, 10, 153, 155, 232]. Для этого обычно используют полимеразную цепную
реакцию. ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы
синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии
термостабильной
ДНК-полимеразы,
дезоксинуклеотидтрифосфатов,
соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров,
которые определяют границы амплифицируемого участка. Каждый цикл
состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой
стадии при +94°С происходит разделение цепей ДНК, затем при +56°С - +60°С
- присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям
на ДНК-мишени, и при температуре +72°С протекает синтез новых цепей
ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5‘ -3‘. В каждом
цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что
позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой
выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью
электрофореза или альтернативными ему технологиями.
Уникальность молекулярного метода не только в высокой специфичности, но
и в том, что он может использоваться как с целью диагностики [112], так и
для генотипирования H.pylori [74, 97, 182, 239]. Метод позволяет выявлять,
дифференцировать штаммы бактерии между собой по различным признакам,
в том числе по факторам патогенности, определять резистентность к
антибиотикам [58, 249]. Метод позволяет обнаруживать микроб в любой
форме, в том числе и кокковой. Праймер для ПЦР получают из нуклеотидной
последовательности гена уреазы А или В H.pylori. Эти праймеры специфичны
для всех штаммов H.pylori и не обнаруживаются в других видах бактерий, что
делает ПЦР высокоспецифичным методом. Кроме того, ПЦР,- это наиболее
чувствительный метод по сравнению с другими методами диагностики H.pylori
-инфекции и позволяет обнаружить даже 1,47 pg ДНК. Чувствительность и
специфичность этого метода составляют соответственно 95% и 100% [15, 142,
202, 230].
Требования, предъявляемые к устройству ПЦР- лаборатории
ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты), которых
должно быть не менее двух. В пре-ПЦР-помещении проводится обработка
клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси
для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа
рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В
56
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
этом помещении (помещениях) запрещается проводить все другие виды работ с
инфекционными агентами (микробиологический анализ, иммуноферментный
анализ, другие диагностические тесты), ПЦР-диагностика которых
проводится в данной лаборатории. В комнате приготовления реакционной
смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены
ультрафиолетовые лампы.
В пост-ПЦР-помещении проводится детекция продуктов амплификации.
Это помещение должно быть расположено как можно дальше от пре-ПЦРпомещений. В пост-ПЦР-помещении важно также исключить движение
воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение. Рабочие
поверхности в ПЦР-лаборатории должны обрабатываться дезинфицирующими
растворами.
В виду необходимости соответствующей технической оснащенности
лаборатории, специальной подготовки персонала, высокой стоимости, метод
ПЦР для выявления H.pylori широко не используется.
3.2. Малоинвазивные (непрямые) методы диагностики
инфекции Helicobacter pylori
3.2.1. Иммунологический метод
Иммунологический метод диагностики основан на обнаружении антител
различных классов (IgM, IgG и IgA), образовавшихся в крови больного в
ответ на инфекцию H.pylori. Определение антител проводится, как правило,
с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) сыворотки крови [80, 94,
191].
На ранних этапах инфицирования H.pylori отмечается повышение в крови
уровня иммуноглобулинов класса IgM против H.pylori [188], а с 3-4 недели
происходит сероконверсия и в крови нарастает уровень специфических IgG
и IgA [256], которые вырабатываются по отношению к антигенам клеточной
стенки жгутиков бактерий. Более информативным считается определение
IgG, который представлен преимущественно в сыворотке крови, в то время
как секреторный IgA располагается в основном в ткани слизистой оболочки.
Уровень IgG в сыворотке крови хорошо коррелируется с плотностью
обсеменения H.pylori слизистой оболочки антрального отдела желудка и
активностью гастрита [140, 258]. Титр антихеликобактерного IgA имеет
корреляцию с атрофическим гастритом и раком желудка [55, 204] и его
больше содержится в слюне, желудочном соке [107]. Повышение его в крови
имеет ограниченную чувствительность (45%), но высокую специфичность
(95-100%) [12, 258] и отражает степень повреждения СОЖ [39]. Следует
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
57
отметить, что наборы для определения IgA хуже стандартизированы, и поэтому
с их использованием диагностировать инфекцию H.pylori удается реже, по
сравнению с применением антител класса IgG [143].
Повышенный уровень IgM обнаруживается лишь у 27% H.pylori-инфицированных [65] и определение его ввиду низкой специфичности и
чувствительности в диагностике инфекции H.pylori ценности не имеет [65,
138, 258].
Таким образом, для серологической диагностики инфекции H.pylori с помощью
ИФА целесообразно пользоваться набором для определения иммуноглобулинов
класса IgG.
3.2.1.1. Серологические тесты
Серологические тесты имеют высокую специфичность, которая часто
достигает 100%, поэтому ложноположительные результаты крайне
редки и встречаются, в основном, у детей. В то же время достаточно часто
(5-10%) встречаются ложноотрицательные результаты ИФА, которые могут
быть обусловлены слабым иммунным ответом организма больного, ранней
стадией инфицирования, большой вариабельностью антигенной структуры
различных штаммов H.pylori. Различные наборы для ИФА могут иметь
различную чувствительность. Промышленно выпускаемые наборы для ИФА
определения содержания антител в сыворотке крови по разным авторам имеют
чувствительность от 57 до 100%, а специфичность от 73 до 99% [93, 143, 159].
Наиболее чувствительными являются ELISA, PyloriSet II, ImmunoCombII
Рис. 30. Тест для диагностики H.pylori -инфекции на основе иммуноферментного
анализа с выявлением IgG (ImmunoCombII, Orgenics)
58
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
(Orgenics, Израиль) (Рис.30). В России для быстрой диагностики H.pylori
зарегистрированы серологические тесты на основе латекс-агглютинации и
сэндвич-метода: FastRead H.pylori® (CQI-biomed) и Pyloriset® Dry (Orion Diagnostica). Преимуществом этих методик является простота их выполнения и
быстрота получаемого результата.
В последние годы появились наборы для определения антител против H.pylori,
которые обладали более высокой чувствительностью и специфичностью, и в
качестве критерия эрадикации H.pylori стали использовать снижение титра
антител после лечения, но в более поздние сроки, чем стандартные 4-6 недель
[152, 223].
Современное поколение ИФА-тестов, благодаря усовершенствованию
технологии сорбции антигена и модификации данного метода, позволяет
количественно оценивать степень инвазии H.pylori, а также степень эрадикации
[13, 49, 250]. Выявлено, что снижение титра специфических антител к H.pylori
на 40% от исходного позволяет констатировать эрадикацию более, чем у 90%
больных к 3 месяцу после окончания лечения [7]. Серонегативность у всех
вылеченных больных наступает через 12 месяцев [223]. Серологические тесты
незаменимы в скрининговых исследованиях, однако, длительный период,
необходимый для нормализации показателей, не позволяет рекомендовать
эти методы для контроля эрадикации H.pylori после проведенного курса
антихеликобактерной терапии. К недостаткам этих тестов следует также
отнести невысокую степень чувствительности и специфичности, а также
нестабильные результаты количественного определения антител к H.pylori.
[7].
В таблице 3 представлены данные по чувствительности, специфичности,
предсказательной ценности положительного результата (PPV) и
предсказательной ценности отрицательного результата (NPV) наиболее
используемых серологических тестов [175].
Как видно из таблицы, чувствительность и специфичность ИФА тест-систем
выше аналогичных показателей серологических тестов на основе латекс-
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
59
агглютинации и сэндвич-метода.
Комбинированный серологический тест - ГастроПанель «Biohit» (Финляндия)
стал широко внедряться в клиническую практику в начале XXI века, как метод
«серологической биопсии». При этом исследованию подвергается венозная
кровь, в которой методом ИФА определяется 4 компонента: пепсиноген I,
пепсиноген II, гастрин-17 и антитела к Hр (IgG) [238].
Нормальное соотношение пепсиногена I и II равно 4:1. При H.pylori -инфекции
уровни гастрина-17, пепсиногена I и пепсиногена II возрастают. После
успешно проведённой эрадикации уровень пепсиногена II возвращается
к норме. При атрофии тела желудка сывороточный уровень пепсиногена-I
понижается пропорционально степени атрофии, а снижение соотношения
пепсиноген I и II до 2:1 свидетельствует о развитии атрофического гастрита.
Гастрин-17 вырабатывается G - клетками в антральном отделе желудка в
ответ на стимуляцию несколькими факторами, включая белок пищи. В норме
базальный уровень гастрина-17 составляет >2,5 пмоль/л. При атрофии в
антральном отделе уровень гастрина-17 снижается пропорционально степени
атрофии.
Снижение содержания в сыворотке крови пепсиногена I ниже 55 мкг/л в
сочетании с уровнем постпрандиального гастрина-17 ниже 6 мкг/л (р<0,05)
свидетельствует о наличии у больного атрофических изменений слизистой
оболочки желудка умеренной или выраженной степени, что является
показанием для проведения эндоскопического исследования с множественной
биопсией для исключения опухолевой трансформации слизистой оболочки
желудка [219].
На метод «серологической биопсии» возлагались большие надежды, так как
он существенно упрощает диагностику состояния слизистой оболочки желудка
без проведения инвазивного исследования, что очень важно, особенно, в
педиатрической практике. Однако в целом ряде последних независимых
исследований метод показал очень низкие показатели чувствительности
и специфичности, как на взрослой [133], так и на детской популяции
обследуемых [111]. Чувствительность и специфичность у этого метода (83% и
87% соответственно) существенно ниже, чем у гистологического [150].
3.2.1.2. Экспресс-тесты
Экспресс-тесты на основе иммунопреципитации к иммунохро­
матографии. Существуют также серологические тесты, объединенные под
условным названием «докторские» тесты или тесты «у постели больного»
(“in office tests”, “near the patient tests”). Они исполняются на специальных
плашках или полосках с нанесенным антигеном и индикатором реакции
антиген-антитело, меняющим свой цвет при наличии антител в капле
капиллярной крови, полученной из пальца больного. Эти тесты достаточно
дешевы, просты в исполнении и не требуют специальной аппаратуры.
60
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Их применение в клинической практике сдерживается лишь низкой
чувствительностью (60-80%). Тесты субъективны в оценке и имеют большую
«серую» зону сомнительных результатов, что снижает их ценность. Но они
очень удобны для эпидемиологических (скрининговых) исследований, а также
в качестве ориентировочного теста в амбулаторных условиях. Они абсолютно
непригодны для контроля эрадикации H.pylori после антихеликобактерной
терапии. Промышленным способом выпускается более 10 видов. В ряде тестов
ИФА сочетается с методом иммуносорбции. В них требуется лишь добавить
капиллярную кровь больного или кровь с растворителем (Рис.31).
Экспресс-тесты имеют высокую эффективность (Таблица 4) по сравнению с
классическим набором методик и серологической диагностикой с помощью
ИФА [211]. Но в этих тестах заложено довольно высокое пороговое значение
титра антител и поэтому данными тестами будет хуже выявляться H.pylori
(ложноотрицательный результат) у тех больных, у которых титры антител
низкие, а как известно, люди инфицируются в детстве и поэтому, чем моложе
пациент, тем более вероятно выявить у него низкий титр антител к H.pylori.
Поэтому эти тесты не могут применяться у детей, а также ими нельзя
контролировать эрадикацию H.pylori в стандартные сроки (через 4-6 недель
после окончания противохеликобактерной терапии).
Рис. 31. Экспресс-тест для диагностики H.pylori-инфекции по капле цельной крови
(StatSimple, SDS)
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
61
В последние годы для определения антител активно внедряется иммуноблотинг
(Western blotting), который показывает более высокую чувствительность, чем
ИФА-тесты. Иммуноблоттинг выявляет антитела к факторам вирулентности
и патогенности H.pylori, наиболее важными и хорошо изученными из которых
являются CagA и VacA [90]. При изучении эффективности двух наборов для
ИФА наличия в сыворотке крови больных антител к CagA (“HeloriCTX-EuroSpital It” и “Radim 2”) выявлена высокая чувствительность и специфичность
(соответственно: 100%, 76% и 90%, 94%) [60]. Для иммуноблоттинга,
обладающих также высокой чувствительностью и специфичностью,
выпускаются наборы: HelicoBlot 2.0, HelicoBlot 2.1, Genelabs Diagnostics, Singapore [96, 100]
62
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
3.3. Неинвазивные методы диагностики инфекции
Helicobacter pylori
3.3.1. Биохимический метод
Биохимический метод. К неинвазивным методам диагностики H.pylori
относятся широко используемые уреазные дыхательные тесты. Это те же
самые биохимические тесты, только проводятся они in vivo, и основаны
на регистрации в выдыхаемом воздухе продуктов гидролиза мочевины
уреазными ферментами H.pylori (углекислый газ или аммиак). В зависимости
от этого дыхательные методы подразделяются на две подгруппы: углеродные
и аммиачные.
В выборе комбинации методик существуют большие расхождения, как
между странами, так и внутри стран. Многое определяется экономическими
условиями. Так, в развитых странах большое распространение получил
уреазный дыхательный тест с мочевиной, меченной 13С или 14С в виду
его неинвазивности и достаточно большой эффективности для решения
клинических задач (диагностика – лечение – контроль за лечением). Тест
даёт представление об обсеменённости всей слизистой оболочки желудка, а
не отдельного ее фрагмента [57, 80, 109, 231]. В России широко используется
аммиачный тест, имеющий в качестве нагрузки мочевину нормального
изотопного состава.
3.3.1.1. Дыхательный углеродный тест
Дыхательный углеродный тест вначале был разработан с использованием
мочевины, меченой слабо радиоактивным изотопом С14, однако в настоящее
время он практически полностью заменен на тест с мочевиной, меченной
стабильным изотопом С13. Впервые тест был предложен D.Y. Graham с
соавторами [109]. Тест основан на исследовании в выдыхаемом воздухе атомов
углерода 14С или 13С после приема мочевины, меченной этими изотопами.
Мочевина, попадая в желудок инфицированного H.pylori, подвергается
гидролизу уреазой бактерии, в результате чего образуется углекислый газ,
содержащий меченный атом углерода, который попадает в кровоток, а затем
выделяется через легкие [63, 171]. В дальнейшем с помощью хроматомассспектрометрии этот изотоп идентифицируется и, по соотношению меченой
и немеченой углекислоты осуществляется оценка наличия H.pylori и степень
обсемененности. Такой метод детекции очень дорог в силу высокой стоимости
масс-спектрометра. Однако в последние годы внедрен другой, более дешевый
способ регистрации соотношения С13/С12 в выдыхаемом воздухе на основе
инфракрасной спектроскопии. Стоимость таких приборов, в зависимости
от фирмы производителя и насыщенности компьютерной программы и
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
63
различных приспособлений, колеблется от 20 до 40 тыс.долларов. При этом
способе детекции снижается и доза меченой мочевины, что также уменьшает
затраты на одно определение. Дыхательный тест с С13-мочевиной отличается
высокой чувствительностью и специфичностью (98%) и также признан
«золотым стандартом» среди неинвазивных методов. При этом существуют
данные о том, что чувствительность и специфичность метода при тестировании
детей до 5-8 лет может существенно снижаться. Кроме того, доказано, что
результаты теста могут зависеть от физической активности пациента.
3.3.1.1.1. Углеродный тест 14С
Методика классического углеродного теста 14С проводится следующим
образом [18]: натощак пациент принимает пробный завтрак (для увеличения
времени нахождения меченной мочевины в желудке), после чего сразу
принимает 20 мл воды, содержащей 10 мкКюри мочевины, меченной 14С.
Через 10, 20, 30, 40, 60, 80, 120 мин производится забор проб выдыхаемого
воздуха, пропущенного через трубочку в сосуд, содержащий 2 ммоль хиамина
(вещество, связывающее СО2) с 2 мл спиртового раствора фенолфталеина
(обесцвечивание этого раствора свидетельствует о связывании 2 ммоль СО2).
Затем добавляется 10 мл сцинтиллята, содержащего толуол. Активность 14С
измеряется жидкостным сцинтиллятором. Получается результат измерения,
выраженный как процент от использованной дозы с поправкой на эндогенную
продукцию СО2 каждой пробы. В последнее время пользуются упрощенным
вариантом, когда отбор проб производится лишь на максимуме нарастания
на 40-60 минуте [210]. Разработаны быстрый 10-минутный углеродный 14С
дыхательный тест [53, 113, 206], при проведении которого производится
прием микродоз меченой мочевины в капсуле без предварительного завтрака
(РУtest).
Чувствительность и специфичность метода по сравнению с набором
инвазивных методов диагностики составили соответственно: 92-98% (среднее
значение 93,3%) и 87 100% (среднее значение 94,3%) [12]. Данный метод
ненадежен у больных, перенесших резекцию желудка [50], принимавших
ИПП и блокаторы Н2-рецепторов гистамина [71, 199]. Применение его у
детей и беременных женщин также должно быть ограниченно.
3.3.1.1.2. Углеродный тест 13С
Методика проведения углеродного теста с 13С проводится аналогично; разница
заключается в том, что изотоп 13С – нерадиоактивный и для его обнаружения
используется не сцинтилляционный счетчик, а масс-спектрометр [136].
(Рис.32). Процедура проведения теста состоит из фонового сбора выдыхаемого
воздуха, приема меченой С13-мочевины в растворе лимонной кислоты или
апельсиновом соке и через 15-30 минут повторном сборе выдыхаемого воздуха в
специальные герметичные емкости. Затем производится анализ выдыхаемого
64
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
воздуха и определение соотношения С13/С12 , по которому определяется
наличие инфекции H.pylori. Всё управление процедурой анализа и подсчета
осуществляется компьютерными программами приборов. С13-мочевина дается
больному в апельсиновом соке, поскольку лимонная кислота задерживает
эвакуацию раствора из желудка и позволяет жидкому содержимому дольше
контактировать со стенкой желудка и с колонией бактерий, улучшая условия
гидролиза мочевины. Отсутствие лимонной кислоты в пробном завтраке
является критичным для получения достоверных результатов С13-дыхательного
теста, приводит к появлению ложно-положительных результатов и снижает
специфичность метода до 61% [69]. Поскольку ряд пищевых продуктов
содержат стабильный изотоп С13, следует за 3-4 дня до исследования исключить
из пищи злаки и тростниковый сахар.
В 1991 году принят единый Европейский протокол дыхательного теста с
мочевиной, меченной 13С [158]. Согласно протоколу используется результат
соотношения 13С/12С, полученный до и каждые последующие 5 минут в течение
40 минут, начиная с 10 минут после приема 100 мл мочевины, меченной 13С.
Учитывая, что 13С встречается в природе, перед исследованием исключается
прием злаков и тростникового сахара, а пробный завтрак состоит из
специального пудинга или мороженого (для замедления эвакуации из желудка).
Чувствительность и специфичность углеродного теста с 13С приближаются к
таковым теста с 14С: 97-98% [108].
В дальнейшем этот протокол изменялся и усовершенствовался для
повышения степени чувствительности и специфичности: заменялись
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
65
мешки для накопления выдыхаемого воздуха на пробирки из специального
материала для пересылки по почте, снижались дозы мочевины, меченной
13С до 50-75 мл [61], сравнивали пробы до и только через 20-30 минут
после приема мочевины [259], достаточно не принимать пищу минимум за
4 часа до выполнения теста и не соблюдать режим голодания [183], вместо
стандартных завтраков с высоким содержанием жиров завтрак с лимонной
кислотой [110]. Метод признан “золотым стандартом” среди неинвазивных
методов [62, 157]. Но в раннем возрасте из-за малого объема выдыхаемого
воздуха точность метода снижается и его рекомендуется использовать у детей
старше 5 лет [213]. Также играет роль физическая активность ребенка [141].
Ложноотрицательные результаты теста бывают у больных, получавших ИПП,
Н2-блокаторы гистамина, препараты висмута, антибиотики, поэтому контроль
эрадикации H.pylori этим методом должен проводиться не ранее, чем через 4-6
недель после окончания курса антихеликобактерной терапии.
Метод пригоден не только для первичной детекции H.pylori-инфекции, для
скриннинговых исследований, но и для ранней диагностики эрадикации
инфекта после проведенного лечения. Широкое распространение уреазного
дыхательного теста с мочевиной сдерживает высокая стоимость оборудования
и реагентов [254]. С целью уменьшения его стоимости и прежде всего за счет
используемой аппаратуры предложены методики: определение соотношения
изотопов углерода в выдыхаемом воздухе с помощью лазерного излучения
(LARA) [180] (точность диагностики не уступает традиционному [243]),
метод недисперсионной изотоп-специфичной спектрометрии в инфракрасном
диапазоне (NDIRS), обладающий почти той же специфичностью, а
чувствительность только на 5% меньше традиционного [66, 118, 137].
Недостатком данного метода является невысокая производительность
оборудования и необходимость приема изотопа натощак [166]. Метод LARA
больше подходит для оценки больших количеств проб в сутки (крупные
диагностические центры), а NDIRS
для небольших по количеству
исследований [201].
3.3.1.1.3. Дыхательный аммиачный тест
Рис. 32. Внешний вид спектрометра для проведения дыхательного уреазного теста с С13-мочевиной для анализа двух проб
Дыхательный аммиачный метод определения H.pylori основан на
возможности детекции аммиака в воздухе ротовой полости больного после
приема порции мочевины обычного изотопного состава (0,5 г. мочевины
на 50 мл чистой воды без химических примесей). Тест получил название
ХЕЛИК, он разработан и внедрен компанией «АМА» (Санкт-Петербург).
Метод допускает разные способы регистрации концентрации аммиака: с
помощью индикаторных трубок, заполненных хемосорбентом или с помощью
электрохимического сенсора. Диагностика на тест-системах ХЕЛИК не
требует привлечения лаборатории, может проводиться как в кабинете врача,
так и у постели больного. Длительность проведения тестирования составляет
66
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
15 минут в случае проведения диагностики на ХЕЛИК с индикаторной
трубкой, и 9 минут, если тест проводится на ХЕЛИК с цифровым аппаратом.
Результат в обоих случаях известен сразу по окончании тестирования.
Через индикаторную трубку, заполненную селективным хемосорбентом,
прокачивается 2 л воздуха из ротовой полости с помощью электроотсоса.
По длине слоя адсорбента в трубке, изменяющего окраску, оценивается
концентрация аммиака.
Трубка устанавливается глубоко во рту ближе к небу так, чтобы не касаться
слизистой оболочки и языка. Во время проведения исследования больной
сидит с полуприкрытым ртом, удерживая руками индикаторную трубку,
периодически ее вынимая при необходимости проглотить слюну. При
поглощении сорбентом аммиака цвет его изменяется, а по высоте столбика
сорбента, изменившего цвет, оценивается интенсивность реакции. Измерение
проводится до и после приема мочевины. При нарастании концентрации
аммиака в нагрузочной пробе более, чем на референтное значение по
сравнению с базальным, результат считается положительным [17].
При использовании электросенсорного датчика, регистрация концентрации
аммиака в выдыхаемом воздухе осуществляется непрерывно с помощью
специально разработанной компьютерной программы и цифровым анализом
получаемых данных [19] (Рис.33). Аналитическая реакция происходит
во время отбора пробы, а концентрация и среднее значение базального и
нагрузочного уровней после окончания 9 минутной процедуры фиксируется
на дисплее прибора.
Подготовка к проведению обследования включает в себя несколько несложных
требований :
1. Обследование проводится натощак, не менее чем через три часа после
приема пищи (не обязательно с утра натощак, но обязательно на голодный
желудок).
2. Недопустимо чтобы больной перед тестированием употреблял или
принимал:
— антибиотики и антисекреторные средства за две недели до
обследования,
— лекарственные формы с содержанием противоспалительных средств,
антацидные препараты не принимать хотя бы сутки, а лучше 2-3 дня
(некоторые формы анальгетиков, принятые за 4-5 часов до обследования,
тоже могут подавлять активность H.pylori),
— крепкие спиртные напитки в течение трех суток до обследования,
— бобовые в течение суток перед обследованием,
— жевательную резинку, содержащую карбамид — за 3 часа до
обследования.
3. Рекомендуется не курить 2-3 часа перед началом обследования.
4. Рекомендуется перед тестированием почистить зубы и тщательно
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
67
в)
Рис. 33. а) Цифровой ХЕЛИК®-аппарат;
б) Цифровой ХЕЛИК®-аппарат, подключённый к компьютеру;
в) Проведение теста с непрерывной аппаратной регистрацией концентрации аммиака в выдыхаемом воздухе;
г) Так выглядит график H.pylori (+) пациента в программе ХЕЛИК®-софт на
персональном компьютере. Первые полторы минуты обследования показаны синей линией, которая отображает базальный уровень. Она соответствует первым двум столбцам на дисплее ХЕЛИК®-аппарата. Красная линия — это нагрузочный уровень; на дисплее аппарата он обозначен всеми оставшимися столбцами. Прирост красной линии по отношению к синей означает положительный результат тестирования
68
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
прополоскать рот.
Если больной ощущает дискомфорт или боли в животе, ему можно назначить
фосфалюгель. Это обволакивающее средство, снижающее ощущение
дискомфорта и болевые симптомы, которое не подавляет активность
микрофлоры, в том числе активность H.pylori.
Больному дают выпить раствор 0,5 г карбамида в 50 мл теплой воды, затем –
еще 50 мл воды чтобы ополоснуть рот. Затем просят поместить мундштук в
ротовую полость так, чтобы он не касался языка или нёба. Рот на протяжении
всего обследования должен быть приоткрыт. В течение 9 минут ХЕЛИК®аппарат будет анализировать состав выдыхаемого воздуха и выводить на
дисплей следующую информацию:
– время, прошедшее с начала анализа,
– текущие показания датчика «T»,
– максимальный показатель датчика «М»,
– период: базальный или нагрузочный,
– общий показатель базального уровня и общий показатель нагрузочного
уровня,
– график или гистограмма поминутного изменения показаний.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
69
Результаты аппаратной регистрации исследования очень наглядны и легко
поддаются интерпретации (Рис.34).
Сопоставление с данными гистологического, бактериологического,
серологического методов у детей выявило высокую чувствительность (95%) и
специфичность (95%) ХЕЛИК-теста с аппаратной регистрацией концентрации
аммиака [19]. Метод прост, дешев, не требует дополнительного оборудования,
а результат получается непосредственно в ходе исследования. Поэтому может
быть использован в эпидемиологических исследованиях для скрининга, а
также в качестве одного из методов комплексной оценки эрадикации H.pyloriинфекции после проведенного медикаментозного лечения.
Определение продуктов гидролиза мочевины, меченной 15N, в моче
имеет тоже высокую надежность, как и 13С дыхательный тест [141]. Поэтому
этот неинвазивный биохимический метод диагностики H.pylori in vivo можно
считать перспективным.
3.3.2. Иммунологический метод
Обнаружение антител к H.pylori в экскреторных продуктах жизнедеятельности
всегда было заманчивой перспективой для неинвазивной диагностики
хеликобактерной инфекции. Определение бактериальных антигенов в слюне
является альтернативой серологической диагностике в сыворотке крови, но
чувствительность и специфичность этих тестов оказалась невысокой [76, 160].
Если при этом использовать специальное устройство для накопления антител
из слюны, то чувствительность и специфичность возрастает (соответственно:
65% и 95%) [161]. Имеются также тесты (URiNELISA H.Pylori Antibody,
RAPIRIN test) с помощью которых можно определять антитела к антигенам
H.pylori в моче. Некоторые из них дают достаточно приемлемые результаты
специфичности (91%) и чувствительности (80%) [125, 193]. Однако
наибольшая эффективность диагностики была достигнута при разработке
тестов, использующих в качестве материала каловые массы.
3.3.2.1. Определение антигена Helicobacter pylori в кале (HPSA-тест)
Рис. 34. Варианты графического отображения результатов дыхательного аммиачного теста ХЕЛИК®-аппарат:
а) при эрозивно-язвенном поражении желудка, не ассоциированном с H.pylori-инфекцией
б) у больного с активным хеликобактерным гастритом; ; в) у больного с хеликобактерным гастритом до проведения антихеликобактерной терапии; г) у того же
больного через 4 недели после курса лечения – эрадикация не была достигнута
Десять лет назад появился неинвазивный метод определения с помощью
ИФА концентрации антигена H.pylori в кале (Helicobacter pylori stool antigen – HpSA-test) [197, 241]. Для проведения этого исследования необходима
небольшая порция стула, причем пробы могут храниться при температуре
-20°С неограниченно долго.
Существует две основные разновидности метода: а) на основе поликлональных
антител; б) на основе моноклональных антител к H.pylori, используемых
для сорбции на твердой фазе и захвата антигенов бактерии. Расширенные
независимые испытания теста с поликлональными антителами подтвердили
его высокую информативность, наравне с дыхательным тестом, при первичной
70
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
диагностике инфекции H.pylori [236, 240]. Vaira D. и° Vakil N. Обследовали
3419 пациентов и установили, что HpSA имеет чувствительность 93,2% и
специфичность также 93,2% [240]. После эрадикационной терапии эти
показатели несколько ниже [151] и могут быть улучшены использованием не
поликлональных, а моноклональных антител [52]. Уже в 2000 году – во втором
Маастрихтском консенсусе HpSA тест назывался, вместе с дыхательным
тестом, стандартом в диагностике инфекции H.pylori как у детей, так и у
взрослых, как до, так и после проведения противохеликобактерной терапии
[164].
Маастрихтские соглашения – 3 (2005) также рекомендуют использовать этот
тест в постэрадикационном периоде как альтернативу уреазному дыхательному
тесту [6, 163]. Ингибиторы протонной помпы влияют на результат, несколько
занижая его, однако ингибирующий эффект исчезает через 1-2 недели после
прекращения приема таких препаратов.
Тест для определения антигена в стуле, основанный на использовании
моноклональных антител обладает еще большей точностью при диагностике
H.pylori-инфекции [52]. В большом обзорном сообщении по материалам 89
исследований (10858 пациентов) было показано, что в период первичной
диагностики чувствительность и специфичность этого теста равны 96% и 97%
соответственно, что достоверно выше показателя теста с поликлональными
антителами: 91% и 93% соответственно. Оценка информативности теста
с моноклональными антителами при подтверждении эрадикации H.pylori
выявила его чувствительность – 86% и специфичность – 92%. При сравнении
тестов, использующих различные антитела, была установлена одинаково
высокая специфичность (98%), но более высокая чувствительность (92%)
тестов с моноклональными антителами, чем с поликлональными (87%) [83].
Подчеркивается, что эти результаты достигаются лишь спустя 4-8 недель после
завершения антибиотикотерапии. Факторы, снижающие чувствительность
HpSA-теста: кровотечение из верхних отделов желудочно-кишечного
тракта, прием ингибиторов протонной помпы, антиинфекционные средства,
состояния атрофии и метаплазии желудочного эпителия.
3.3.3. Молекулярный метод
Обнаружение фрагментов различных генов H.pylori с помощью полимеразной
цепной реакции возможно не только в биоптатах слизистой оболочки
желудка, но и в слюне, зубном налете, моче и кале [4, 10, 153, 155].
Полимеразная цепная реакция использует те же праймеры из нуклеотидной
последовательности гена уреазы (UreA, UreB) или из 16S РНК H.pylori, а также
уникальные гены H.pylori cagA и vacA, что и при работе с культурой H.pylori. Как
и в случае с культурой штаммов H.pylori у метода наивысшая специфичность
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
71
и чувствительность. Тесты способны определять от 10 до 100 клеток H.pylori.
ПЦР-диагностика H.pylori-инфекции в кале у детей с использованием 23S
rDNA показала чувствительность 83,8% и специфичность 98,4%, а выявление
резистентности штамма к кларитромицину – чувствительность 89,2% при
100% специфичности [246]. Однако в ряде исследований при применении
этого метода было отмечено большое количество ложноположительных
результатов, особенно после курса антихеликобактерной терапии [168, 237].
Кроме того, при использовании в качестве исследуемого материала слюны,
зубного налета или мочи чувствительность метода может варьировать в
очень широких пределах в зависимости от условий проведения реакции.
В зависимости от используемого праймера, ПЦР является наиболее
чувствительным методом по сравнению с другими методами диагностики
H.pylori [200], но частота обнаружения микроба в зубном налете реже, чем
в биоптате слизистой оболочки желудка [216]. Именно поэтому подобный
материал используется лишь при проведении поисковых исследований. В
эпидемиологических исследованиях и постэрадикационных наблюдениях
только методы молекулярной биологии позволяют дифференцировать
реинфекцию и рецидив заболевания и достоверно идентифицировать
источник заражения. Достоинством современных модификаций ПЦР-методов
является возможность не только детекции генома бактерии, но и определения
антибиотикорезистентности штаммов при прямом исследовании биопсийных
образцов, без выделения чистой культуры микроорганизма. Особенностью
молекулярно-биологических методов является то обстоятельство, что они не
дифференцируют жизнеспособных и убитых микроорганизмов, и это может
иногда служить ограничением для их использования в практике. Стоимость
метода в настоящее время высокая, что также сдерживает его практическое
применение.
72
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
ГЛАВА 4. «ПОДВОДНЫЕ КАМНИ» В ДИАГНОСТИКЕ
ХЕЛИКОБАКТЕРНОЙ ИНФЕКЦИИ
Ни одно из известных инфекционных заболеваний не имеет такого
многообразного арсенала диагностических средств, базирующихся на
различных принципах, как хеликобактерная инфекция. Для выявления
H.pylori используется множество разновидностей морфологических методов
и способов окраски, бактериологические, иммунологические, прямые
биохимические, методы, основанные на определении продуктов метаболизма
бактерии и выявлении особенностей её генетического аппарата. Большим
разнообразием отличается и биологический материал, который используется
для диагностики H.pylori-инфекции: биоптаты слизистой оболочки желудка,
желудочная слизь, образцы выдыхаемого воздуха, кровь, слюна, кал и моча.
Практическому врачу часто бывает затруднительно ориентироваться в
этом многообразии. В последние годы достигнут значительный прогресс в
разработке новых методов диагностики, а также в изучении и систематизации
факторов, влияющих на результаты различных тестов.
Некоторые лекарственные средства (ингибиторы протонной помпы,
препараты висмута, некоторые антибиотики) способны подавлять рост и
размножение H.pylori или снижать интенсивность продукции уреазы. Это
приводит к ложноотрицательным результатам
биохимических тестов.
Поэтому больному надо рекомендовать прекратить приём таких препаратов
перед проведением тестов на H.pylori, а при интерпретации результатов
тестирования следует учитывать вид и дозировку лекарственного средства
и длительность его приёма. Проведение контрольного исследования после
курса антихеликобактерной терапии следует назначать не ранее, чем через 4
недели после окончания приёма препаратов. Надо иметь в виду, что различные
лекарственные препараты по-разному влияют на разные тесты.
Если после лечения ингибиторами протонной помпы не прошло достаточно
времени, то высока вероятность получения ложно-отрицательных результатов
углеродного дыхательного теста, быстрого уреазного теста и теста по
определению антигена H.pylori в кале. В тоже время эти препараты не влияют
на результаты морфологического выявления H.pylori в слизистой оболочке
желудка. Но и здесь следует правильно выбрать место для взятия биопсии,
избегая зон кишечной метаплазии (в которых H.pylori не живёт) и учитывая
возможную транслокацию H.pylori из антрального отдела в тело желудка при
нерациональной антихеликобактерной терапии.
Правильно сформулированная клиническая задача определяет выбор метода
тестирования. Так у больных молодого возраста с неосложнённой желудочной
диспепсией и без отягощённого онкологического анамнеза можно ограничиться
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
73
методами неинвазивного тестирования с использованием стратегии test and
treat. В то же время в регионах с высокой частотой рака желудка в популяции
и больным старше 45 лет следует проводить эзофагогастродуоденоскопию с
обязательным взятием биопсии для гистологического исследования.
Любой из методов диагностики H.pylori
может при определённых
обстоятельствах давать неверный результат. Причины этого бывают самые
разнообразные, а возможность никогда нельзя полностью исключить.
Оптимальным решением является одновременное использование двух или
более тестов, основанных на различных принципах.
4.1. Тесты, основанные на взятии биопсии
Эта большая группа инвазивных тестов, включающих быстрый уреазный тест,
морфологическое исследование и получение чистой культуры. Возможно
получение ложноотрицательных результатов, связанных с «ошибкой
образца», если берётся один кусочек из одного отдела желудка. Это может
быть участок кишечной метаплазии или атрофии желудочных желез с низкой
степенью обсеменённости H.pylori. В ряде случаев пристеночная слизь, в
которой содержаться микроорганизмы, может вымываться при длительной и
интенсивной промывке материала различными растворами в ходе процесса
изготовления гистологических препаратов. Это приводит к появлению
ложноотрицательных результатов при гистологическом методе исследования.
Цитологический метод раздавленного биоптата лишён этого недостатка.
Для исключения этой ошибки на исследование следует брать несколько
фрагментов слизистой оболочки из различных отделов желудка и использовать
биопсийные щипцы большого размера для получения более крупных
фрагментов слизистой оболочки. При первичном обращении хорошие
показатели выявляемости H.pylori достигаются получением биопсии из
антрального отдела желудка. У больных на фоне приёма препаратов и после
курса лечения лучше брать на исследование кусочки из слизистой оболочки
тела желудка. При использовании морфологических методов надо учитывать,
что не всегда скопления микроорганизмов в слизистой оболочке желудка
являются колониями H.pylori.
Различные модификации быстрого уреазного теста отличаются по времени,
оптимальному для считывания результата (время обычно указывается в
инструкции по использованию теста). Чаще это период от 3 до 30 минут,
но в любом случае, не больше 24 часов. Время может увеличиваться,
если используются холодные растворы, хранившиеся в холодильнике.
Большинство тестов рассчитано на работу при комнатной температуре.
Ложноположительные результаты уреазного теста могут быть получены при
попадании в образец крови, некоторых лекарственных средств или уреаза-
74
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
позитивных бактерий из ротовой полости.
Возможность выделения культуры H.pylori при бактериологическом
исследовании может быть утрачена при несоблюдении правил транспортировки
биоптатов и неадекватных условий культивирования (нарушения в составе
компонентов культуральной среды, газовом составе атмосферы, несоблюдение
временных параметров культивирования).
Молекулярные методы, отличаясь высокой чувствительностью и
специфичностью, всё же несвободны от возможности получения ложно­
положительных и ложноотрицательных результатов. Ложноположительные
результаты могут быть получены, если в материале присутствуют
микроорганизмы, родственные H.pylori, например Helicobacter heilmannii или
бактерий рода Campylobacter. Получение ложно-отрицательных результатов
может наблюдаться при отсутствии у тестируемого штамма H.pylori генов,
выбранных в качестве праймера. Например, не все штаммы H.pylori содержат
ген cagA, поэтому праймеры к нему обычно не используется для выявления
этого микроорганизма. Ложноотрицательные результаты молекулярных
тестов могут быть обусловлены высокой гетерогенностью генов-мишеней,
присутствием в образцах ингибиторов полимеразных ферментов (чаще в
образцах кала), недостаточным количеством H.pylori в образце (ниже порога
чувствительности теста). Чтобы повысить чувствительность теста каждую
реакцию рекомендуется проводить параллельно в двух образцах, полученных
из одного участка слизистой оболочки желудка.
4.2. Серологические методы
Серологические методы прочно вошли в набор первоочередных
диагностических средств для выявления H.pylori инфекции с учётом таких
преимуществ, как быстрота получения результата, удобство использования,
сравнительно невысокая цена. В рекомендациях Европейской группы по
изучению H.pylori серологические методы предлагается использовать для
скрининга инфекции H.pylori, наряду с дыхательным уреазным тестом. Всё
разнообразие серологических методов можно свести к трём основным группам.
Это иммуноферментный анализ с количественной оценкой титра антител
(ELISA), экспресс-тесты с использованием цельной крови, констатирующие
факт наличия в крови антител к H.pylori, и иммуноблотинг. Как показал опыт
широкого применения серологических методов в практической диагностике
H.pylori инфекции, результаты не всегда бывают однозначными.
Существует целый ряд факторов, которые надо учитывать при интерпретации
результатов всех этих методов. Есть факторы, связанные с особенностями
самого метода: перекрёстные иммунологические реакции с другими
антителами, недостаточная напряжённость иммунитета с низкой выработкой
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
75
антител, преобладание различных типов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM),
индивидуальные особенности динамики титра специфических антител.
Естественная инерционность в развитии иммунологических реакций может
привести к ложноотрицательным результатам при остром начале заболевания.
Использование тестов, основанных на определении иммуноглобулинов класса
А и М даёт очень низкие показатели чувствительности и специфичности,
добавление их выявления к тестам, основанным на выявлении IgG не
улучшает показатели последних. Иммуноблотинг, хотя и позволяет выявлять
антитела к определённым специфическим факторам патогенности H.pylori
(CagA, VacA и другие), однако не улучшает показатели чувствительности и
специфичности выявления H.pylori, и даже может давать ложноположительные
результаты, выявляя антитела к одному фактору патогенности при отсутствии
диагностически-значимого уровня антител к другим антигенам H.pylori.
На чувствительность и специфичность серологических тестов могут
влиять также особенности эпидемиологической ситуации в популяции,
этнические и географически различия, возраст, наличие у обследуемых
других сопутствующих заболеваний и приём некоторых лекарственных
средств (НПВП) [227]. При раке желудка серологические методы чаще
дают положительный результат, чем гистология [89]. Это обусловлено
различиями в спектре антител между группами H.pylori(+) больных с раком
желудка и без этого заболевания. До 32% больных пожилого возраста дают
положительные результаты серологических проб на H.pylori при отсутствии
у них H.pylori-инфекции [156]. Причиной этому служит развитие атрофии
и кишечной метаплазии в желудке у больных старших возрастных групп и
связанная с этим естественная элиминация H.pylori. Географические различия
в составе антигенов H.pylori также очень важны для диагностики и порой
требуют специальной стандартизации серологических тестов с расчётом
на определённый географический регион. Описаны отличия штаммов,
выделенных в Китае от штаммов в странах Средиземноморья [255].
Все попытки использования серологических тестов для контроля эрадикации
H.pylori в ранние сроки после лечения неизменно давали очень низкие
показатели чувствительности и специфичности. Лишь по прошествии 1221 месяцев после успешной эрадикации выявляется 20% снижение уровня
специфических IgG и показатели чувствительности теста приближаются к
93% [79]. Поэтому серологические методы не включены в перечень методов,
рекомендуемых для контроля эрадикации H.pylori.
4.3. Дыхательные углеродные тесты.
Дыхательный уреазный тест давно зарекомендовал себя, как метод выбора
в диагностике H.pylori инфекции до и после антихеликобактерного лечения.
76
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Результаты этого теста хорошо коррелируют с данными определения
антигена H.pylori в кале. Однако правильная интерпретация результатов
теста также нуждается в учёте некоторых факторов, влияющих на его
результаты. Это факторы, связанные с различными модификациями метода,
с особенностями течения физиологических процессов в полости желудка
и влияния лекарственных препаратов. Очень много зависит от того, какой
пищевой продукт используется в качестве тестовой еды и растворения
меченой мочевины. Лучшие результаты показали тесты при достаточном
количестве лимонной кислоты в тестовом завтраке [110]. Использование для
этой цели апельсинового сока менее эффективно. Присутствие лимонной
кислоты в тестовом завтраке является критическим моментом для получения
достоверных результатов дыхательного уреазного теста, так как только она
позволяет эффективно доставлять меченую мочевину к участкам слизистой
оболочки тела и фундального отдела желудка. Именно туда смещается основная
масса бактерий H.pylori после проведения курса антихеликобактерной терапии.
Без тестового завтрака дыхательный уреазный тест выявляет лишь уреазную
активности бактерий, колонизирующих антральный отдел со сниженной
плотностью обсеменения H.pylori после приёма антисекреторных препаратов,
а это приводит к получению ложноотрицательных результатов [59].
На результаты дыхательного уреазного теста влияют также особенности
физиологических процессов в желудке. Так ускоренная эвакуация содержимого
из желудка ведёт к получению ложноотрицательных результатов дыхательного
уреазного теста [59]. Это бывает после реконструктивных операций на
желудке, либо в случаях функциональной недостаточности привратника
либо его рубцово-язвенной деформации. Получение ложноположительных
результатов возможно при колонизации кишечника или ротовой полости
другими уреазопродуцирующими бактериами.
Чаще всего ложноотрицательные результаты уреазного дыхательного
теста встречаются у больных, принимающих антисекреторные препараты
(ингибиторы протонной помпы, Н2-блокаторы), антибиотики или соли
висмута, причём даже при кратковременном применении [205]. Кстати,
такие же данные имеются и в отношении теста определения антигена H.pylori
в кале [67]. После 7-дневного приёма ланзпразола и препаратов висмута
ложно-отрицательные результаты определения антигена H.pylori в кале
наблюдались у 15% больных. Соли висмута образуют комплекс с белками
бактериальной стенки, что приводит к потере жизнеспособности бактерии.
При этом блокируется адгезия H.pylori в эпителиальным клеткам желудка,
блокируется подвижность, подавляется активность бактериальных уреаз,
каталаз и фосфолипаз (т.е. бактериальных факторов патогенности).
Установлению правильного диагноза в таких случаях способствует
комплексное использование нескольких методов с обязательным включением
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
77
гистологического исследования, причём с обязательным получением
биоптатов как из антрального отдела, так и из тела желудка. Стандартной
же рекомендацией для практических врачей должно быть назначение
контрольного обследования на H.pylori не ранее, чем через 4 недели после
окончания приёма препаратов.
Каждый тест имеет свои показания для проведения и свои ограничения.
Правильная интерпретация результатов различных тестов нуждается в
обязательном сопоставлении с данными истории течения заболевания,
лекарственного анамнеза, эпидемиологических, этнографических и других
индивидуальных особенностей.
78
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
79
ГЛАВА 5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДИАГНОСТИКЕ H.PYLORI
терапии и не менее, чем через 14 дней после отмены антисекреторной
терапии.
Даже при скрупулёзном выполнении всех инструкций по проведению
диагностических тестов и соблюдении индивидуальных показаний, приступая
к тестированию больного на H.pylori, практический врач должен получить
ответы на следующие вопросы:
1.
Каков уровень общей инфицированности популяции, в которой
проводится тестирование?
2.
Какие лекарственные препараты принимал больной перед
обращением к врачу и принимает на данный момент?
3.
Какова клиническая задача тестирования, и какие из методов
диагностики позволят наиболее эффективно её решить?
5.3. Принципы выбора метода диагностики
инфекции H.pylori
5.1. Кому следует проводить тесты на H.pylori?
Проводить тесты следует:
1. Больным язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки или желудка.
2. Больным MALT-лимфомой желудка.
3. Больным атрофическим гастритом.
4. Больным после эндоскопической резекции раннего рака желудка.
5. Больным перед назначением длительной терапии НПВС.
6. Больным перед назначением антисекреторной терапии ИПП.
7. Родственникам первой линии больных раком желудка.
8. Родственникам первой линии больных язвенной болезнью.
9. Родственникам первой линии больных с выявленной инфекцией
H.pylori.
Практикующееся иногда в амбулаторно-поликлинических учреждениях, назначение
антихеликобактерной терапии без проведения диагностических тестов на H.pylori,
безосновательно.
5.2. Когда следует проводить тесты на H.pylori?
Необходимым условием для проведения биохимических тестов является
полная отмена антисекреторных и антибактериальных препаратов не менее,
чем за 4 недели до проведения исследования. Если больной перед первичным
обращением принимал самостоятельно эти препараты, то предпочтение
следует отдавать серологическим и прямым морфологическим методам
выявления H.pylori. Оптимальные сроки для контроля эрадикации H.pylori –
период по истечении 4 недель после завершения курса антихеликобактерной
Прежде, чем назначать проведение того или иного теста для выявления
H.pylori-инфекции врач должен иметь четкий алгоритм действий на случай
получения положительных и отрицательных результатов теста.
Выбор метода диагностики H.pylori зависит от цели исследования
(скрининг, первичная диагностика, диагностика после предпринятой
антихеликобактерной терапии, контроль эрадикации) и от наличия условий
для проведения исследования (техническая оснащенность клинического
отделения и лаборатории, квалификация и опыт персонала, выполняющего
диагностический тест, стоимость и т.д.).
Никакой отдельный метод диагностики H.pylori не является оптимальным.
Только комбинация различных методов обеспечивает высокую степень
достоверности диагностического исследования.
Принципиальное значение для практики имеет проведение первичной
диагностики H.pylori -инфекции, а после проведения противохеликобактерной
терапии – определение эрадикации H.pylori.
Для скрининга H.pylori – быстрого предварительного отбора возможных
носителей H.pylori-инфекции, незаменимы серологические и экспресстесты.
Первичная диагностика H.pylori-инфекции должна осуществляться методами,
непосредственно выявляющими бактерию или продукты ее жизнедеятельности, и для
этого подходят все методы диагностики, т.к. H.pylori находится в желудке, как
правило, в большом количестве. Предпочтение можно отдавать методам, не
требующим больших экономических затрат: цитологическому и дыхательному
аммиачному.
В России при всех заболеваниях желудка и двенадцатиперстной
кишки предусмотрено проведение эзофагогастродуоденоскопии, что
регламентируется государственными стандартами обследования, выпущен­
ными Минздравом России [40]. В этом случае диагностика H.pylori инфе­­
кции должна проводиться быстрым уреазным тестом и гистологическим (или
цитологическим) методами. До лечения H.pylori чаще выявляется в антральном
отделе желудка [18, 34]. В случае самостоятельного приема больным
антисекреторных препаратов или антибиотиков, происходит перемещение
H.pylori в проксимальном направлении и в этом случае обнаружение H.pylori
становится более вероятным в биоптатах, взятых из фундального отдела
желудка [14, 162].
80
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Диагностика эрадикации H.pylori (контроль лечения) – оценка адекватности
проведенной противохеликобактерной терапии, ввиду резкого уменьшения
популяции H.pylori в желудке, направлена на выявление малого количества
вегетативных и кокковых форм H.pylori. В международных и национальных
рекомендациях [41, 165] даны строгие правила по проведению этого этапа
диагностики:
1. Сроки ее проведения – не ранее, чем через 4-6 недель после окончания курса
антихеликобактерной терапии, либо после окончания лечения любыми
антибиотиками или антисекреторными средствами сопутствующих
заболеваний (в случае неудачной терапии этого срока достаточно для того,
чтобы H.pylori размножились, и их присутствие можно было определить
существующими методами).
2. Диагностика эрадикации осуществляется, как минимум, двумя диагности­
ческими методами. Причем один из методов должен быть прямым инвазивным
– т.е. методом непосредственного обнаружения бактерии в биопсийном
материале (бактериологический, гистологический, уреазный). Необходимо
исследование двух биоптатов из тела желудка и одного биоптата из антрального
отдела. Второй метод может быть неинвазивным: предпочтительны тесты,
основанные на определении антигена H.pylori в кале с помощью HpSA или
ПЦР, а также дыхательные тесты ( с меченой 13С мочевиной или аммиачный).
Их выбор зависит от возможностей медицинского учреждения.
3. При неудачной попытке эрадикации H.pylori, после терапии второй
линии показано использование молекулярных методов диагностики с
генетическим типированием штамма H.pylori для выявления характера
антибиотикорезистентности, а также бактериологическое исследование
с определением чувствительности штамма H.pylori к антибиотикам для
построения индивидуальной схемы лечения.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
81
ПРИЛОЖЕНИЯ
Методы окраски гистологических препаратов [209]
Гематоксилин-эозин
Необходимые растворы:
Гематоксилин Коля:
Гематоксилин – 1,5 г
Насыщенный раствор алюмо-калиевых квасцов – 700 мл
1% йод на 95° спирте – 50 мл
Дистиллированная вода - 250 мл
• Растворить гематоксилин в дистиллированной воде, нагревая раствор
до 56°С
• Добавить раствор йода, довести до кипения и быстро охладить
• Профильтровать перед использованием
Дифференцирующий раствор – солянокислый спирт
1% соляная кислота в 70° спирте
Ополаскивающий раствор Скотта:
MgSO4 - 80 г
NaHCO2 – 14 г
• Довести до 4 литров дистиллированной водой
Эозин
1% водный раствор эозина
Методика окраски:
• Депарафинировать срезы и довести их до воды
• Красить в гематоксилине Коля 10 мин
• Промыть водопроводной водой
• Дифференцировать в солянокислом спирте
• Сполоснуть в растворе Скотта
• Промыть водопроводной водой
• Красить в 0,5% растворе эозина 5 мин
• Промыть водопроводной водой
• Обезводить в спиртах, просветлить в ксилоле и заключить в канадский
бальзам
82
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Серебрение по Вартину-Старри
Условия:
• Фиксация ткани в 10% нейтральном формалине (избегать ртутьсодержащих фиксаторов)
• Свежие парафиновые срезы ткани (в старых среза возможно
образование преципитатов серебра)
Альциановый синий
• 0,5% раствор альцианового синего в 3% уксусной кислоте при рН 2,5
Ацетатный буферный раствор
• 1,64% раствор безводного ацетата натрия – 1,5 мл
• 1,18% уксусная кислота – 18,5 мл
• Дистиллированная вода - 480 мл
• Установить рН 3,6
Проявитель (готовится на ацетатном буфере)
• Свежеприготовленный 3% гидрохинон – 2 мл
• 3% желатин, нагретый до 45°С – 30 мл
• 2% нитрат серебра, нагреты до 45°С – 6 мл
Все смешать непосредственно перед использованием и держать при 40°С
Методика окраски
• Депарафинировать срезы, довести их до воды
• Красить альциановым синим 2 мин
• Промыть ацетатным буфером
• Инкубировать в 1% растворе нитрата серебра (на ацетатном буфере) –
90 мин
• Приготовить проявитель и удалить раствор нитрата серебра со стёкол
вокруг срезов
• Поместить стёкла в тёплый проявитель, постоянно его помешивая
• Держать в проявителе 3 минуты до появления светло-коричневого
окрашивания срезов
• Промыть теплой водопроводной водой – 2 мин
• Обезводить в спиртах, просветлить в ксилоле и заключить в канадский
бальзам
Результат
• H.pylori – окрашиваются в чёрный цвет
• Кислая слизь окрашивается в голубой цвет
• Окружающие ткани окрашиваются в желтовато-коричневый цвет
Окраска прочным крезил-виолетом
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
83
Методика окраски
• Депарафинировать срезы, довести их до воды
• Инкубировать в 0,1% водном растворе прочного крезил-виолет-ацетата
– 5 мин
• Промыть водопроводной водой
• Обезводить в спиртах, просветлить в ксилоле и заключить в канадский
бальзам
Результат
• H.pylori и окружающая ткань – окрашиваются в фиолетовый цвет
Методы окраски цитологических препаратов
Окраска по Граму
В процессе окраски микроорганизмов по Граму происходят сложные
химические реакции между веществами, составляющими тело микробной
клетки, и красителями. Если окрашенные мазки погрузить в спирт, ацетон,
ксилол или иные органические растворители, то тела одних микроорганизмов
будут обесцвечиваться, а других - нет.
Микроорганизмы, удерживающие окраску по Граму после обработки
препаратов в указанных выше растворителях, называют грам положительными.
Микроорганизмы, теряющие при этом окраску по Граму, называются
грамотрицательными.
Необходимые растворы:
• 0,1% раствор генцианвиолета или кристаллвиолета
• водный раствор Люголя
• 0,1% водный раствор сафранина О
• Смесь 95° спирта и ацетона (1:1)
Необходимое оборудование:
• Емкость для окрашивания мазков
• Стекла предметные
• Бумага фильтровальная
• Микроскоп
• Спиртовка или горелка
• Часы песочные на 1 мин.
• Пипетки
• Масло иммерсионное
Методика окрашивания
84
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
• фиксировать препарат над пламенем спиртовой горелки в течение 2030 сек. на расстоянии не менее 10 см.
• покрыть зону окрашивания фильтровальной бумагой и нанести на нее
несколько капель 0,1% раствора генцианвиолета на 20-30 сек.,
• снять фильтровальную бумагу и не промывая водой, налить на препарат
раствор Люголя на 1 мин - до полного почернения мазка.
• Раствор Люголя слить в емкость для окрашивания и в течение 0,5-1
мин обесцветить мазок в смеси спирт-ацетон, несколько раз наливая
его на предметное стекло и покачивая стекло. Процесс обесцвечивания
считается завершенным, когда от мазка перестают отделятся окрашенные
в фиолетовый цвет струйки жидкости.
• Препарат промыть дистиллированной водой.
• На препарат нанести раствор сафранина на 1 мин.
• смыть краску проточной водой и окончательно высушить препарат.
• микроскопировать с иммерсионной системой (объектив х90, окуляр х7
или х10).
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
85
длительно храниться в темной упаковке при температуре +2°С - +6°С.
Процедура выполнения теста (с 2% мочевиной):
1. Поместить 2 капли реагента в пробирки типа эппендорф.
2. Поместить биопсийный материал в первую пробирку, вторая пробирка
используется в качестве контрольной.
3. Плотно закрыть пробирки.
4. Записать время начала выполнения теста.
5. Микропробирки инкубируют при температуре +37°С.
6. Учитывать результат через 20 мин, 1 ч, 3 ч, 24ч.
При проведении контроля лечения возможно увеличение интервалов времени
изменения цвета реактива или получение ложноотрицательных результатов,
поэтому тест в данном случае считается неспецифичным.
Результат
Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в сине-фиолетовый
цвет, грамотрицательные - в красный.
Примечание. Высокое качество окраски обеспечивается своевременным прекращением
обесцвечивания мазков. При недообесцвечивании мазков грамотрицательные
микроорганизмы могут сохранять фиолетовую окраску, а в переобесцвеченных мазках
грамположительные микробы могут быть окрашены в оранжево-красный цвет.
Уреазный тест
Реактивы:
• Мочевина - 2 г
• Феноловый красный 0,5% - 10 г
• Азид натрия - 20 мг
• 0,01М фосфатный буфер рН 6,5 - 100 мл
Методика приготовления рабочего раствора:
0,01М фосфатный буфер рН 6,5 разливают по флаконам, стерилизуют при
+121°С 15 мин. К охлажденному буферу добавляют мочевину – 2 г, раствор
фенолового красного и азид натрия (обладающий свойствами консерванта).
Цвет реактива должен быть желто-розовым. При подкислении реактива его
цвет меняется на соломенно-желтый, при подщелачивании – на малиновый.
Приготовленный реактив должен быть соломенно-желтого цвета и может
Примечание. При использовании незабуферного раствора мочевины положительный
результат регистрируют в течение 1 мин у 90% больных хеликобактериозом,
подтвержденным бактериологически. Однако этот метод может давать
ложноположительные результаты, если результат оценивается позже 1 минуты. В связи
с этим, было предложено использовать 6% раствор мочевины. В этом случае результаты
теста учитываются в течение 15 мин. К недостаткам теста относится получение
ложноотрицательных (при малом количестве микробных тел) или ложноположительных
(контаминирование материала другими уреазопродуцентами) результатов.
Методы оценки антибиотикорезистентности H.pylori [103]
При интерпретации результатов исследования резистентности штаммов
H.pylori к антибиотикам следует учитывать следующие факторы:
• состав культуральной среды (так как некоторые компоненты этих сред
могут неспецифически взаимодействовать с антибиотиками),
• количество и размеры выросших колоний,
• характер роста бактерий в культуре (бациллярные или кокковые
формы),
• состав атмосферы для инкубации,
86
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
Эпсилометрический ε-тест в агаре
• рН среды,
• возраст культуры (длительность инкубации).
Скрининговый тест на устойчивость к метронидазолу
Проводится путём помещения одного фрагмента биоптата слизистой оболочки
желудка на агар, содержащий 8 мг/л метронидазола. Эта концентрация является
критической для установления устойчивости H.pylori к этому антибиотику.
Другой фрагмент биоптата помещается на стандартный кровяной агар.
Отсутствие роста на агаре с метронидазолом при росте колоний на кровяном
агаре свидетельствует о наличии резистентного штамма. Положительный
скрининговый тест необходимо подтвердить другими методами (агаровых
разведений, бумажных дисков или ε-тест).
Диско-диффузионная методика
• собрать колонии, выросшие на кровяном агаре в течение 2-3 дней и
растворить в 1 мл стерильной воды
• довести плотность суспензии до 0,5х109 колониеобразующих единиц
(КОЕ) в 1 мл (3-4 по шкале McFarland)
• проконтролировать подвижность и морфологические свойства бактерий
(не следует использовать культуру, в которой более 25% бактерий имеют
кокковую форму или образуют крупные агрегаты)
• поместить на неселективный кровяной агар 0,25-0,5 мл приготовленной
суспензии
• высушить в течение 5-10 минут
• размещать не более двух дисков для тестирования каждого
антибактериального препарата на чашке диаметром 90 мм
• регистрировать рост культуры через 2-3 дня.
Результат
Данные о корреляции минимальной ингибирующей концентрации (MIC)
и размера зоны, свободной от роста колоний, вокруг дисков приводятся
в инструкции к наборам дисков для тестирования. Обычно при наличии
штамма H.pylori, чувствительного к антибиотику, размер этой зоны превышает
40 мм. Рост колоний в непосредственной близости к диску свидетельствует
о наличии у этого штамма H.pylori резистентности к данному антибиотику.
Появление единичных мелких колоний внутри зоны подавления роста колоний
свидетельствует о мутациях и генетической неоднородности резистентного
штамма H.pylori.
87
Этот тест представляет собой количественный вариант диско-диффузионной
методики. В агаре на чашке с растущей культурой быстро возникает
экспоненциальный градиент концентрации антибиотика. Результаты этого
метода хорошо коррелируют с результатами методики серийных разведений,
поэтому он всё чаще применяется для оценки чувствительности штаммов
H.pylori к антибиотикам.
Приготовление культуры к тестированию не отличается от дискодиффузионной методики, но вместо дисков в чашку помещается тестовая
полоска с градиентом концентрации антибиотика и соответствующей
цифровой шкалой. Регистрация результата осуществляется через 2-3 дня.
Вокруг тестовой полоски образуется эллипсоидная зона задержки роста
H.pylori.
Результат
Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) антибиотика, выраженная
в мг/л или мкг/л считывается с тестовой полоски на уровне, соответствующем
краю зоны подавления роста культуры.
Методика проведения анализа методом ПЦР [25]
При выполнении анализа методом ПЦР необходимо строго соблюдать
протокол исследования, указанный в инструкции к конкретному ПЦР набору
конкретного производителя. В общих чертах в постановке ПЦР можно
выделить три основных этапа:
1. Выделение ДНК из клинического образца;
2. Амплификация специфических фрагментов ДНК;
3. Детекция продуктов амплификации.
Выделение ДНК из биопсийного материала
На данной стадии проведения анализа биопсийный материал подвергается
специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного
материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение
раствора ДНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей
амплификации. В наборе для выделения ДНК НПФ «ЛИТЕХ» реализован
сорбционный способ очистки ДНК.
Методика экстракции и очистки ДНК Н.pylori:
1. биопсийный материал из желудка и/или двенадцатиперстной кишки
88
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
помещается в 100 мкл лизирующего раствора, содержащего 10 мМ Трис
HCl рН 8,8, 25 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл протеиназы К и инкубируется
при температуре +65°С в течении 4-х часов (до полного растворения
биопсийного материала);
2. к полученному раствору добавляется 10 мкл водной суспензии сорбента
и 300 мкл буфера (раствор I), состоящего из 10 мМ Трис HCl рН 8,0, 5,5
М гуанидин тиоцианата и 10 мМ ЭДТА;
3. суспензия инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин с
периодическим вортексированием;
4. сорбент осаждается центрифугированием в течение 7 сек. при
12 000 об/мин;
5. супернатант удаляется с помощью вакуумного насоса;
6. сорбент однократно промывается в 150 мкл промывочного раствора
(р-р II);
7. сорбент двукратно промывается в 1000 мкл промывочного раствора
(р-р III);
Амплификация специфических фрагментов ДНК
На данной стадии происходит накопление коротких специфических
фрагментов ДНК в количестве, необходимом для дальнейшей детекции. В
методике, предложенной НПФ «ЛИТЕХ» для определения специфических
фрагментов генома Н.pylori используется «классический» вариант ПЦР с
использованием одной пары праймеров, которые ограничивают специфически
синтезируемый фрагмент ДНК.
В комплект набора «Хеликопол» для амплификации входит пробирка с
положительным контрольным образцом, который всегда анализируют
параллельно с исследуемыми пробами для корректной оценки результатов
амплификации на последнем этапе анализа. Кроме того, рекомендуется
анализировать и отрицательный контрольный образец, которым может
служить деионизованная вода, для оценки чистоты эксперимента (исключения
возможности контаминации).
Детекция продуктов амплификации
На этапе детекции проводится разделение смеси продуктов амплификации,
полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в
агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к
амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий
с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения.
Эти соединения под действием ультрафиолетового облучения способны
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
89
флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся
полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в
агарозном геле.
Изображение с такого электрофорезного геля можно зафиксировать
фотографическим способом (с использованием оранжевого светофильтра)
или при помощи специальных систем цифровой регистрации на базе
компьютера. Электрофоретический метод детекции продуктов амплификации
самый простой в исполнении, однако имеет ряд существенных недостатков.
К ним следует отнести субъективность оценки результатов электрофореза
оператором, низкую производительность, невозможность автоматизации
процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР реакции в каждом
конкретном образце. Наибольшую опасность представляет возможность
наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного с исследуемым
образцом. При этом возможна выдача оператором ложноположительного
результата.
Альтернативой
электрофоретическим
методам
детекции
ПЦРамплифицированной ДНК являются методы ДНК-гибридизации. В ходе
такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется с
олигонуклеотидным зондом, специфичным к внутренней последовательности
анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически
регистрируется флуоресцентным или фотометрическим ридером. Таким
образом, при гибридизационном способе детекции ДНК специфичность
реакции амплификации подтверждается несколько раз. Сначала в ходе самого
этапа амплификации (отжига праймеров) и вторично при гибридизации
получившегося продукта со специфичным зондом.
Порядок проведения дыхательного теста с использованием
прибора ХЕЛИК-аппарат
Обследование на ХЕЛИК-аппарате можно проводить как автономно, так и
подключив ХЕЛИК-аппарат к персональному компьютеру (ПК).
В обоих случаях время проведения тестирования занимает 9 минут.
Требования к пациенту:
1. Обследование проводится натощак, не менее чем через три часа после
приема пищи.
2. Недопустимо употребление крепких спиртных напитков в течение
трех суток и бобовых в течение суток до обследования, а также прием
антибиотиков и антисекреторных средств за две недели до обследования.
Противовоспалительные средства, антацидные препараты и анальгетики
90
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
не принимаются в течение 5 дней перед обследованием.
3. Рекомендуется не курить 2–3 часа перед началом обследования.
4. Необходимо отказаться от жевательной резинки минимум за три часа до
обследования.
5. Рекомендуется перед обследованием почистить зубы и тщательно
прополоскать рот.
I ПРОВЕДЕНИЕ ОБСЛЕДОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ
ХЕЛИК®-АППАРАТА, РАБОТАЮЩЕГО БЕЗ ПК
На передней панели аппарата находится небольшой дисплей и 4 кнопки
управления, аппарат должен быть подключен к сети электропитания.
После подключения аппарата к сети и нажатия кнопки «вкл/выкл» аппарат
готовится к тестированию.
О времени принятия нагрузки и начале тестирования сообщает звуковой
сигнал и надпись на мониторе аппарата.
Больному дают выпить раствор 0,5 г карбамида в 50 мл теплой воды, затем
– еще 50 мл воды чтобы ополоснуть рот. Затем просят поместить мундштук,
присоединенный к аппарату гибким шлангом в ротовую полость так, чтобы
он не касался языка или нёба. Рот на протяжении всего обследования должен
быть приоткрыт. Форма одноразового мундштука позволяет фиксировать его
зубами, что делает исследование проще для пациента и удобным даже для
детей младше 5 лет.
Нажатием кнопки «старт» подтверждаем начало тестирования.
В течение 9 минут ХЕЛИК®-аппарат будет анализировать состав выдыхаемого
воздуха и выводить на дисплей следующую информацию:
– время, прошедшее с начала анализа,
– текущие показания датчика,
– максимальный показатель датчика,
– период: базальный или нагрузочный,
– общий показатель базального уровня и общий показатель нагрузочного
уровня,
– гистограмма поминутного изменения показаний -9 столбиков
соответствуют 9 минутам и 9 меняющимся значениям концентрации
аммиака.
Встроенный в аппарат микрокомпрессор сам осуществляет аспирацию воздуха
из ротовой полости. Высокочувствительный датчик аппарата успевает замерить
базальный уровень аммиака до вступления мочевины в реакцию гидролиза
(первые 1.5 минуты), затем он фиксирует изменения, происходящие в ходе
реакции.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
91
Прибор сам прекращает тестирование и сообщает об этом звуковым
сигналом.
После этого прибор отобразит на экране сообщение, подобное следующему:
• Номер проведенного
обследования
• Результат обследования
в графическом виде гистограмма, каждый столбец
которой соответствует среднему
уровню содержания аммиака
за соответствующую минуту
обследования.
Кнопкой «Выбор представления результата» результат может быть переведен в
числовые значения, что позволяет сравнить значения базального и нагрузочного
уровня и получив разницу, сделать заключение о инфицированности больного
(см. ниже в Х-аппарате с ПК).
По окончании обследования прибор сохранит полученные показатели
и гистограмму и перейдет сначала в режим подготовки к следующему
обследованию (продувки в течение 120 секунд), а после этого в режим
ожидания перед следующим обследованием (продолжительность ожидания
неограниченна).
Кнопа «архив» позволяет просмотреть последние 25 обследований,
сохраняющихся в памяти прибора, как в числовых значениях, так и в виде
гистограмм.
II ПРОВЕДЕНИЕ ОБСЛЕДОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ ХЕЛИК®-АППАРАТА,
ПОДКЛЮЧЕННОГО К ПК.
При выключенном ХЕЛИК®-аппарате запускаем
программу
ХЕЛИК®-софт. На экране ПК появится окно с базой данных
проведенных обследований.
После этого включаем ХЕЛИК®-аппарат, нажав на кнопку «Вкл./
Выкл.»
После этого ПК установливает связь с включенным прибором. На эране
92
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
компьютера появится сообщение «Подключен.
Все кнопки прибора, за исключением кнопки «Вкл./Выкл.», окажутся
заблокированными, прибор перейдет в состояние ожидания начала
обследования.
По истечении времени подготовки прибора к работе, на экране
отобразится сообщение программы со счетчиком времени ожидания начала
обследования.
Пока длится период ожидания, выполняем следующие действия:
Нажатием на кнопку «Новый» в окне запущенной программы
ХЕЛИК®-софт открываем и заполняем карточку пациента( данные,
занесенные в электронную базу, вместе с полученными результатами,
сохраняются и в дальнейшем, могут быть использованы в ходе лечения и
наблюдения за пациентом вместе с графиками и результатами последующих
измерений).
Даем пациенту выпить раствор карбамида, а затем воду, чтобы он
ополоснул рот. Мундштук помещаем в ротовую полость пациента.
Убеждаемся, что пациент правильно удерживает мундштук во рту,
сидит прямо и дышит свободно.
Левой кнопкой мыши нажмите кнопку «Старт».
Начнется обследование пациента, которое будет продолжаться 9 минут. В
течение этого времени будут меняться сообщения программы и на экране ПК
будет строиться график изменения содержания аммиака.
По окончании обследования прибор перейдет в режим подготовки к
следующему обследованию (продувки в течение 120 секунд).
Оценка результата обследования и формулирование диагностического
заключения относительно инфицированности пациента бактерией H.pylori
осуществляется на основе анализа полученных в ходе обследования
показателей. Сравнив полученные значения базального и нагрузочного уровня
и вычислив разницу - «∆», делаем заключение:
Если ∆ ≥ 5, то пациента следует считать HP+ (инфицирован)
Если ∆ < 2, то пациента следует считать HP- (не инфицирован)
При ∆ ≥ 2 и ∆ < 5 заключение об инфицированности пациента сделать
нельзя.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Абдулхаков Р.А., Гриневич В.Б., Иваников И.О., Исаков В.А., Кудрявцева Л.В.
/Схемы тройной терапии луковицы двенадцатиперстной кишки на основе препарата Де-нол // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2000. №2. С. 26–30.
2. Аруин Л.И. /Патологоанатомы лауреаты Нобелевской премии. //Архив патологии, 2010. Т.72. №3. С. 37–45.
3. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М.: Триада-Х, 1998. 496 с.
4. Говорун В.М., Гущин А.Е., Исаков В.А. и др. /Молекулярная диагностика и генотипирование H.pylori в биоптатах слизистой оболочки желудка. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2000. №2.
Приложение 10. С. 12–15.
5. Григорьев П.Я., Исаков В.А., Розенталь В.М. и др. /Метод определения
Campylobacter pylori в слизистой оболочке желудка при хроническом гастрите и язвенной болезни. //Лаб. Дело, 1989. N.6. С. 52–54.
6. Диагностика и лечение хеликобактерной инфекции. Рекомендации третьей
конференции Европейской группы по изучению H.pylori, 2005 г. //Клиническая фармакология и терапия, 2006. Т.15. №1. С. 32–35.
7. Жебрун А.Б., Лазебник Л.Б., Ткаченко С.Б. и др. Диагностика и лечение заболеваний желудочно-кишечного тракта, ассоциированных с инфекцией
Helicobacter pylori (практическое руководство для врачей). Москва, 2006. 94 с.
8. Жебрун М.Г., Александрова В.А., Гончарова Л.Б., Ткаченко Е.И. Диагностика, профилактика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter
pylori-инфекцией. Пособие для врачей. С.-Пб., 2002. 44 с.
9. Иваников И.О. /Проблема преодоления резистентности штаммов Helicobacter
pylori // Материалы 7-ой сессии Российской группы по изучению Helicobacter
pylori. Н. Новгород, 1999. С. 34–36.
10. Иваников И.О., Исаков В.А., Кудрявцева Л.В. и др. /Молекулярная диагностика инфекции Helicobacter pylori: достижения и перспективы применения.
//Кремлевская медицина. Клинический вестник, 2000. №1. С. 71–74.
11. Ильченко А.А. Роль Helicobacter pylori в этиологии и патогенезе язвенной
болезни двенадцатиперстной кишки. Патогенетическая терапия. Автореф.
дисс… докт.мед.наук. 1991. 50 с.
12. Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. М.: Медпрактика-М., 2003.
411 с.
13. Исаков В.А., Цодиков Г.В. /Серологические методы диагностики инфекции
H.Pylori: показания к применению и перспективы использования. // Клин. лабор. диагностика, 2000. №1. С. 38–41.
14. Касьяненко В.И. Дифференцированная медикаментозная терапия язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Дисс. … докт. мед. наук.
М., 2004, 490с.
94
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
15. Кишкун А.А., Садоков В.М., Арсенин С.Л. и др. /Полимеразная цепная реакция в оценке эффективности лечения инфекции Helicobacter pylori. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2001.
Т.XI. №5. С. 31–36.
16. Кожапова М.Г. /Helicobacter pylori: роль в развитии гастродуоденальных заболеваний и методы диагностики. //Клиническая лабораторная диагностика, 1999. №11. С. 52–55.
17. Корниенко Е.А. /Хелик-тест метод неинвазивной диагностики хеликобактериоза. //Рос.журн. гастроэнтерол.,гепатол., колопроктол., 1998. N6. С. 34–38.
18. Корниенко Е.А. Современная диагностика инфекции Helicobacter pylori. С.Пб., 2002. 20 с.
19. Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А., Паролова Н.И., Григорьев С.В. /Неинвазивная диагностика инфекции Helicobacter pylori по аммиаку. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2006. №.1. С. 47–53.
20. Корниенко Е.А., Милейко В.Е., Гольбиц С.В. и др. /О диагностике инфекции
Helicobacter pylori у детей. //Росс. вестник перинатал. педиатрии. 1998. №5.
С. 34–38.
21. Кудрявцева Л.В. /Первичная антибиотико-резистентность штаммов
Helicobacter pylori, выделенных в г. Москве и г. Санкт-Петербурге. //Российский
журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2000. №2. С. 41–43.
22. Кудрявцева Л.В., Исаков В.А., Говорун В.М. /Методы определения антибиотикорезистентности у Helicobacter pylori // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2001. Т.11. №2. Приложение №13. С.
54–57.
23. Кудрявцева Л.В., Исаков В.А., Иванников И.О. и др. /Резистентность
Helicobacter pylori к антибиотикам: диагностика и значение для клинической
практики. //Клиническая медицина, 2000. №1. С. 69–71.
24. Кудрявцева Л.В., Несвижский Ю.В. /Устойчивость Helicobacter pylori к метронидазолу, амоксициллину, кларитромицину: опыт изучения российских штаммов // Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter
pylori. Материалы первого международного симпозиума Российской группы
по изучению Helicobacter pylori. Москва, 4 апреля 1998. С. 11–14.
25. Кудрявцева Л.В., Щербаков П.Л., Иваников И.О., Говорун В.М. Helicobacter
pylori инфекция: Современные аспекты диагностики и терапии. Пособие для
врачей. НПФ «ЛИТЕХ». М., 2004. 41 с.
26. Курилович С.А., Шлыкова Л.Г., Копычко Т.А., Ламыкина Н.Я. Факторы
эффективности эрадикационной терапии Helicobacter pylori ассоциированной язвенной болезни. Этно-экологические особенности ассоциации инфекционных факторов и патологии органов пищеварения у взрослого и детского населения. Красноярск, 2001. 291 с.
27. Лазебник Л.Б., Михайлов А.А., Николаев И.Н. с соавт. /Оценка эффективности диагностики хеликобактериоза с помощью газоанализатора аммиака
на основе МДП-сенсора в сравнении с методами инвазивной диагностики. //
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
95
Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2008. №.8. С. 54–58.
28. Лазебник ЛБ Хомерики С.Г., Морозов И.А . и др. /Дрожжеподобные грибы в
желудочной слизи при кислотозавизимых заболеваниях. //Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2004. №4. C. 27–32.
29. Лазебник Л.Б., Хомерики С.Г., Морозов И.А. и др. /Сравнительное изучение эффективности различных методов диагностики хеликобактерной инфекции. //Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2004. №1
(Ж63). С. 165.
30. Логинов А.С., Аруин Л.И., Ильченко А.А. Новый методический подход к патогенетической терапии язвенной болезни. Методические рекомендации. Главное медицинское управление г.Москвы. 1994. 26 c.
31. Логинов А.С., Аруин Л.И., Ильченко А.А., Жуховицкий В.Г. Диагностика и лечение кампилобактерных поражений желудка и двенадцатиперстной кишки.
Методические рекомендации МЗ СССР. Москва. 1989. 23 с.
32. Логинов А.С., Аруин Л.И., Смотрова И.А. /Значение Campylobacter pyloridis
в этиологии гастрита и язвенной болезни. //Клиническая медицина, 1987. №
8. С. 20–25.
33. Мерабишвили В. М. Рак желудка: эпидемиология профилактика, оценка эффективности лечения на популяционном уровне // В Кн. Практическая онкология: избранные лекции. С.-Пб., 2004. С. 433–442.
34. Минушкин О.Н., Васильева Н.Ю. /Диагностика H.pylori у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. //Кремлевская медицина, 1998.
№2. С. 9–11.
35. Морозов И.А. /Проблемы морфологической диагностики H.pylori в желудке.
// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 1999.
№2. Прилож. №9. С. 46–47.
36. Морозов И.А. Проблемы морфологической диагностики инфекции Helicobacter pylori в желудке. / В кн.: Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. / Под ред. Ивашкина В.Т., Мегро Ф., Лапиной Т.Л. М.: Триада-Х, 1999.
С. 117–121.
37. Морозов И.А., Лукина Е.В. Цитологическая диагностика инфекции Helicobacter pylori в желудке. Материалы IX тематической сессии Российской группы
по изучению Helicobacter pylori. 2000. С. 31–34.
38. Морозов И.А., Лукина Е.В., Лопатина И.В., Гринберг А.А. /Зависимость темпа репарации кровоточащих язвенных дефектов двенадцатиперстной кишки от эрадикации Helicobacter pylori. // Диагностика и лечение заболеваний,
ассоциированных с Helicobacter pylori. Мат.II междунар.симпозиума. Москва.
1999. С. 43–47.
39. Морозов И.А., Матушевская В.Н., Пустовойтов В.В. и др. Оценка надежности
некоторых используемых на практике методов выявления Helicobacter pylori
в желудке. Диагностика и лечение, Архангельск, 1996. Т.II. №12. С. 22–25.
40. Стандарты (протоколы) диагностики и лечения болезней органов пищеварения. МЗ РФ. М., 1998. 48 с.
41. Стандарты диагностики и лечения кислотозависимых и ассоциированных с
96
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Helicobacter pylori заболеваний (четвёртое московское соглашение), принятые X съездом НОГР 5 марта 2010 года. //Экспериментальная и клиническая
гастроэнтерология, 2010. №5. С. 113–118.
42. Хомерики Н.М., Хомерики С.Г. /Оценка эффективности серологического
экспресс-теста Stat-Simple pylori в диагностике хеликобактериоза. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 1999. Т.9.
№5. Приложение №8. А162. С. 45.
43. Хомерики Н.М. и Хомерики С.Г. /Факторы, влияющие на чувствительность
уреазного теста при диагностике хеликобактерной инфекции. //Российский
журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2003. Т.13. №3.
Прил. №19. С. 20–21.
44. Хомерики С.Г. /Helicobacter pylori индуктор и эффектор окислительного
стресса в слизистой оболочке желудка: традиционные представления и новые данные. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2006.
№1. С.37–46.
45. Хомерики С.Г., Морозов И.А. /Роль кокковых форм Helicobacter pylori в патогенетических мехенизмах и персистенции хеликобактерной инфекции. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2001. Т.11.
№2. Прил. №13. С. 99–102.
46. Хомерики С.Г., Хомерики Н.М. Лезеротерапия хеликобактериоза новые пути
преодоления лекарственной резистентности. В кн.: Диагностика и лечение
заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori. Мат.II междунар.симпозиума г.Москва 1–2 апреля 1999. С. 56–59.
47. Хомерики С.Г. и Морозов И.А. Морфологические трансформации H.pylori
при неэффективной эрадикационной терапии. Мат.3-го Российского научн. форума «Санкт-Петербург-Гастро2001» . Гастробюллетень, 2001. №2–3. А334.
С. 93.
48. Хомерики С.Г. и Хомерики Н.М./ Влияние антисекреторных и антацидных
средств на чувствительность уреазного теста при диагностике хеликобактерной инфекции. //Фарматека, 2003. №10. С. 57–60.
49. Щербинина М.Б., Хасилев О.И., Кудрявцева В.Е., Будзак И.Я. /Современные
направления неинвазивной диагностики заболевания желудка. // Сучасна
гастроентерологiя, 2004. №1(15). С. 4–9.
50. Adamopoulos AB, Stergiou GS, Sakizlis GN et al. /Diagnostic value of rapid
urease test and urea breath test for Helicobacter pylori detection in patients with
Billroth
II gastrectomy: a prospective controlled trial. //Dig Liver Dis. 2009. V.41. P.4–8.
51. Adesanya A.A., Oluwatowoju I.O., Oyedeji R.S. et al. /Evaluation of a locallymade urease test for defecting Helicobacter pylori infection. //Niger Postgrad Med.
J., 2002. V.9. N.1. P.43–47.
52. Agha-Amiri K, Peitz U, Mainz D et al. /A novel immunoassay based on monoclonal antibodies for the detection of Helicobacter pylori antigens in human stool. //Z.
Gastroenterol., 2001. V.39. N.8. P. 555–60.
53. Allardyce RA, Chapman В A, Tie AB, et al. /37 kBq 14C-urea breath test and gas-
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
97
tric biopsy analyses of H. pylori infection. //Australian and New Zealand Journal of
Surgery, 1997. V.67. N.1. P. 31–34.
54. Allerberger F., Oberhumer G, Wrba F et al. /Detection of Helicobacter pylori
infection using single serum specimens: comparison of five commercial serological
tests. //Hepatogastroenterology, 1996. V.43. P. 1656–1659.
55. Aromaa A., Kosunen T.U., Knekt P., et al. /Circulating anti-Helicobacter pylori
immunoglobulin A antibodies and low serum pepsinogen I level are associated
with increased risk of gastric cancer. //American Journal of Epidemiology, 1996.
V.144. N.2. P. 142–149.
56. Asante MA, Mendall MA, Finlayson C, et al. /Screening dyspeptic patients for
Helicobacter pylori prior to endoscopy: laboratory or near-patient testing? //Eur J
Gastroenterol Hepatol., 1998. V.10. N.10. P. 843-846.
57. Atherton J.C. /Non-endoscopic tests in the diagnosis of Helicobacter pylori infection. //Aliment. Pharmacol. Ther., 1997. V.11. Suppl.1. P. 11–20.
58. Atherton J.C., Peek R.M., Tham K.T. et al. /Clinical and pathological importance
of heterogeneity in vacA, the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori. //
Gastroenterol., 1997. V.112. P. 92–99.
59. Atherton JC, Washington N, Blackshaw PE et al. /Effect of test meal on the
intragastric distribution of urea in the 13C-urea breath test for Helicobacter pylori. //
Gut., 1995. V.36. P. 337–40.
60. Basso D., Stefani A., Brigato L., et al. /Serum antibodies anti-H. pylori and antiCagA: a comparison between four different assays. //J Clin Lab Anal., 1999. V.13.
N.4. P. 194–198.
61. Bazzoli F., Cecchini L., Corvaglia L., et al. /Validation of the 13C-urea breath test
for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children: a multicenter study.
//Am J Gastroenterol. 2000. V.95. N.3. P.646–650.
62. Bazzoli F., Zagari M., Fossi S. et al. /Urea breath tests for the detection of Helicobacter pylori infection. //Helicobacter. 1997. V.2. Suppl.1. P.34–37.
63. Bell G., Weil J., Harrison G. et al. /C-urea breath test, a non-invasive test for
Campylobacter pylori in the stomach. //Lancet. 1987. V.1. P.1367–1368.
64. Berrino F., Capocaccia R., Esteve J et al. Survival of cancer patients in Europe:
the EUROCARE-2 Study. IARC Scientific Publications No. 151 Lyon: International
Agency for Research on Cancer; 1999.
65. Blecker U., Lanciers S., Hauser B., et al. /The contribution of specific immunoglobulin M antibodies to the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children.
//Eur J Gastroenterol Hepatol. 1995. V.7. N.10. P.979–983.
66. Braden B., Haisch M., Duan L.P., et al. /Clinically feasible stable isotope technique at a reasonable price: analysis of 13CO2/12CO2-abundance in breath samples
with a new isotope selective-nondispersive infrared spectrometer. //Z Gastroenterol.
1994. V.32. N.12. P.675–678.
67. Bravo LE, Realpe JL, Piccirillo MM et al. /Effectrs of acid suppression and
bismuth medications on the performance of diagnostic tests for Helicobacter pylori
infection. //Am J Gastroenterol. 1999. V.94. P.2380–2383.
68. Buck G.E., Gourley W.K., Lee W.K. et al. /Relation of Campylobacter pyloridis to
98
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
gastritis and peptic ulcer. //J. Infect. Dis. 1986. V.153. N.4. P. 664–669.
69. Calvet X, Sanchez-Delgando J, Montserrat A et al. /Accuracy of diagnostic tests
for Helicobacter pylori : a reappraisal. //Clin Infect Dis. 2009. V.48. P.385–391.
70. Chan WY, Hui PK Leung KM, Chow J Kwok F, Ng C-S. /Coccoid forms of Helicobacter pylori in the human stomach. //Am J Clin Pathol. 1994. V.102. P. 503–507.
71. Chey W.D., Woods M., Scheiman J.M., et al. /Lansoprazole and ranitidine affect
the accuracy of the 14C-urea breath test by a pH-dependent mechanism. //American
Journal of Gastroenterology. 1997. V.92. N.3. P.446–450.
72. Chey WD, Murthy U, Shaw S, et al. /A comparison of three fingerstick, whole
blood antibody tests for Helicobacter pylori infection: a United States, multicenter
trial. //Am J Gastroenterol. 1999. V.94. N.6. P.1512–1516.
73. Chey WD, Murthy UK, Linscheer W, et al. /The ChemTrak H.pylori Chek fingerstick whole blood serology test for the detection of Helicobacter pylori infection.
//Am J Gastroenterol. 1998. V.93. N. 1. P.16–19.
74. Clayton C.L., Kleanthous H., Margan D.D. et al. /Rapid fingerprinting of Helicobacter pylori by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. //J.Clin. Microbiol. 1993. V.31. P. 1420–1425.
75. Clyne M, Ocroinin T, Suerbaum S et al. /Adherence of isogenic flagellum-negative mutants of Helicobacter pylori and Hicobacter mustelae to human and ferret
gastric epithelial cells. // Infect Immun. 2000. V.68. N.7. P.4335–4339.
76. Cockburn M., Collett J., Cox B. /Validation of the saliva-based H.pylori test,
heliSAL, and its use in prevalence surveys. //Epidemiol.Infect. 2001. V.126. N.2.
P.191–196.
77. Cohen H., Laine L. /Endoscopic methods for the diagnosis of Helicobacter
pylori. // Aliment. Parmacol. Ther. 1997. V.11. Suppl.1. P.3–9.
78. Comtois SL, Hughes NJ, Kelly DJ. /Pleiotropic loss of numerous NAD(P)H
oxidising activities in metronidazole resistant strains of H.pylori.// Gut. 1999. V.45.
Suppl.111. A20.
79. Culter AF, Prasad VM. /Long-term follow-up of Helicobacter pylori serology after
successful eradication. //Am J Gastroenterol. 2000. V.91. P.85–88.
80. Cutler A.F., Havstad S., Ma C.K. et al. /Accuracy of invasive and noninvasive
tests to diagnose Helicobacter pylori infection. //Gastroenterology. 1995. Vol.109.
P.136–141.
81. De Bermard M, Moschioni M, Napolitani G et al. /The VacA toxin if Helicobacter pylori identifies a new intermediate filament-interacting protein. // Embo J.
2000. V.19. N.1. P.48–56.
82. Debongnie J., Delmee M., Mainguet P. et al. /Cytology: a symple, rapid, sensitive
method in the diagnosis of Helicobacter pylori. //Am. J. Gastroenterology. 1992.
V.87. P. 20–23.
83. Deguchi R, Matsushima M, Suzuki T et al. /Comparison of a monoclonal with a
policlonal antibody-based enzyme immunoassay stool test in diagnosing Helicobacter
pylori infection after eradication therapy. //J Gastroenterol. 2009. V.44. P.713–716.
84. Dore M., Piano A., Carta M. et al. /Amoxicilline resistance as the reason for failure of amoxicilline-omeprasole treatment of Helicobacter pylori infection // Aliment.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
99
Pharmacol.Ther. 1998. V.12. P.635–663.
85. Drumm B. /Helicobacter pylori. //Arch.Dis.Chil. 1990. V.65. P.1278–1282.
86. El-Zimaity H.M.T., al-Assi M.T., Genta R.M., Graham D.Y. /Confirmation of successful therapy of Helicobacter pylori infection: number and site of biopsies or a
rapid urease test. //Am.J.Gastroenterol. 1995. V. 90. N.11. P.1962–1964.
87. el-Zimaity H.M.T., Graham D.Y., Al-Assi M.T. et al. /Interobserver variation in
the histopathological assessment of Helicobacter pylori gastritis. //Hum. Pathol.
1996. V.27. P.35–41.
88. El-Zimaity H.M.T., Wu J., Graham D.Y. /Modified Genta triple staine for identifying Helicobacter pylori. //J.Clin.Pathol. 1999. V.52. N.9. S.693–694.
89. Enroth H, Rigo R, Hulten K, Engstrand L. /Diagnostic accuracy of a rapid wholeblood test for infection of Helicobacter pylori. //J Clin Microbiol. 1997. V.35.
P.2695–2697.
90. Everhart J.E., Kruszon-Moran D., Perez-Perez G. /Reliability of Helicobacter
pylori and CagA serological assays. //Clin Diagn Lab Immunol. 2002. V.9. N.2.
P.412–416.
91. Faigel DO, Magaret N, Corless C, et al. /Evaluation of rapid antibody tests for
the diagnosis of Helicobacter pylori infection. //Am J Gastroenterol. 2000. V.95.
N.l. P.72–77.
92. Faogali J., Troughton D., Aitken J., Gwynne J. /Campylobacter like organisms in
gastric biopsies: a christchurch study. //N.Z. Med. J. 1986. V.99. P.50–52.
93. Feldman R.A., Deeks J.J., Evans S.J. /Multi-laboratory comparison of eight commercially available Helicobacter pylori serology kits. Helicobacter pylori Serology
Study Group. //Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1995. V.14. N.5. P.428–433.
94. Figura N., Oderda G., Verdiani S. /Evaluation of a commercial ELISA kit for the
serological diagnosis of Helicobacter pylori infection. // Microbiologica. 1994.
Vol.17. P.319–325.
95. Ford AC, Axon ATR . /Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public
health implications. //Helicobacter. 2010. V.15. Supll.1. P.1–6.
96. Fusconi M., Vaira D., Menegatti M., et al. /Anti-CagA reactivity in Helicobacter
pylori-negative subjects: a comparison of three different methods. //Dig Dis Sci.
1999. V.44. N.8. P.1691–1695.
97. Ge Z., Taylor D.E. /Helicobacter pylori molecular genetics and diagnostic typing.
//Br.Med.Bull. 1998. V.54. N.1. P. 31–38.
98. Genta R.Y.G. Diagnosis and treatment of Helicobacter pylori infection. In:
Graham D.Y., Genta R.M., Dixon M.F., editors. Gastritis. Philadelphia: Lippincott
Williams & Wilkins; 1999: 177–188.
99. Gerhard M, Lehn N, Neumayer N et al. /Clinical relevance of the Helicobacter
pylori gene for blood-group antigen-binding adhesion. // Proc Natl Acad Sci USA.
1999. V.96. N.22. P.12778–12783.
100. Gershtein E.S., Babkina I.V., Stilidi I.Z., et al. /CagA and VacA status in patients
with proximal or distal gastric carcinoma from population with high prevalence of
H.pylori infection. //Gut. 2001. V.49. Suppl.2. A59.
101. Glupczynski Y, Delmée M, Goossens H, Struelens M. /Distribution and preva-
100
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
lence of antimicrobial resistance among gram-negative isolates in intensive care units
(ICU) in Belgian hospitals between 1996 and 1999.// Acta Clin Belg. 2001. V.56.
N.5. P.297–306.
102. Glupczynski Y, Mégraud F, Lopez-Brea M, Andersen LP. /European multicentre
survey of in vitro antimicrobial resistance in Helicobacter pylori. //Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001. V.20. N.11. P.820–823.
103. Glupczynski Y, Broutet N, Cantagrel A, et al. /Comparison of the E test and agar
dilution method for antimicrobial suceptibility testing of Helicobacter pylori. //Eur
J Clin Microbiol Infect Dis. 2002. V.21. N.7. P.549–552.
104. Glupczynski Y. Culture of Helicobacter pylori from gastric biopsies and antimicrobial susceptibility testing. In:Helicobacter pylori:techniques for clinical diagnosis and basic research. Ed. A.Lee and F.Megraud. Saunders Company Ltd. 1996.
P.17–32.
105. Goodwin C.S., Blincow E.D., Warren J.R. et al. /Evaluation of cultural techniques for isolating Campylobacter pyloridis from endoscopic biopsies of gastric
mucosa. //J.Clin.Pathol. 1985. V.38. N.10. P.1127–1131.
106. Goscimski A, Matras J, Wallner G. /Microflora of gastric juice in patients after
eradication of Helicobacter pylori and treatment with a proton pump inhibitor. //
Wiad Lek. 2002. V.55. N.1–2. P.19–28.
107. Gosciniak G. /IgG and IgA antibodies in Helicobacter pylori infections. //
Zentralblatt Fur Bakteriologie. 1997. V.286. N.4. P.494–502.
108. Graham D.Y., Klein P.D., Evans D.G. et al. /Simple noninvasive method to test
efficacy of drags in the eradication of Helicobacter pylori infection: the example of
combined bismuthsubsalicylate and nitrofurantoin. //Amer.J.Gastroenterol. 1991.
V.86. P.1158–1162.
109. Graham D.Y., Klein P.D., Evans D.J. et al. Campycobacter pylori detected noninvasively by the С13-urea breath test. //Lancet. 1987. Vol.1. P.1174–1177.
110. Graham D.Y., Runke D., Anderson S.Y., et al. /Citric acid as the test meal for the
ПС-urea breath test. //Am J Gastroenterol. 1999. V.94. N.5. P.1214–1217.
111. Guariso G, Basso D, Bortoluzzi CF et al. /GastroPanel: evaluation of the usefulness in the diagnosis of gastro-duodenal mucosal alterations in children. //Clin
Chim Acta. 2009. V.402. P.54–60.
112. Gzyl A., Driezzanowska D., Rozynek E. et al. /PCR-based diagnosis of Helicobacter pylori infection in Polish children and adults. //J.Med.Microbiol. 1999. V.48.
N.4. P. 349–356.
113. Hamlet A.K., Erlandsson K.I.M., Olbe L. et al. /A simple, rapid and highly reliable capsule-based C14 urea breath test for diagnosis of Helicobacter pylori infection. //Scand.J. Gastroenterol. 1995. V.30. N.1l. P.1058–1063.
114. Harris PR, Mbley HL, Perez-Perez GI et al. /Helicobacter pylori urease is a
potent stimulus of mononuclear phagocyte activation and inflammatory cytokine
production //Gastroenterology. 1996. V.111. N.2. P.419–25.
115. Hartmann D., van Graevenitz A. /A note on name, viability and urease tests of
Campylobacter pylori. //Eur.J.Clin.Microbiol. 1987. V.6. N.1. S.82–83.
116. Hawthorne AB, Morgan S, Westmoreland D, et al. /A comparison of two rapid
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
101
whole-blood tests and laboratory serology, in the diagnosis of Helicobacter pylori
infection. //Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999. V.11. N.8. P.863–865.
117. Helicobacter pioneers. Blackwell Science Asia Pry Ltd. 2002. Ed. by B. Marshall. p.222.
118. Hildebrand P., Beglinger С. /Nondispersive infrared spectrometry: a new
method for the detection of Helicobacter pylori infection with the 13C-urea breath
test. // Clinical Infectious Diseases. 1997. V.25. N.5. P.1003–1005.
119. Hughes N.J., Kelly D.J. /Metronidazole resistance in H.pylori — The role of
decreased NADH oxidation in resistant strains.// Gut., 1997. Vol. 41. Suppl.1. A.5
(01/3).
120. IARC Monographs of the evaluation of cancerogenic risks. Lyon, 1994. Vol.61.
121. Ilver D, Arnqvist A, Ogren J et al. /Helicobacter pylori adhesin binding fucosylated histo-blood group antigens revealed by retagging //Science. 1998. V.279.
N.5349. P.373–377.
122. Itoh T., Yanagawa Y., Shingaki M., et al. /Isolation of Campylobacter pyloridis
from human gastric mucosa and characterization of the isolates. //Microbiol.Immunol. 1987. V.31. N.7. P.603–614.
123. Jones R, Phillips I, Felix G, Tait C. /An evaluation of near-patient testing for
Helicobacter pylori in general practice. //Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 1997. V.11. N1. P.101–105.
124. Kassa E., Tsega E., Gebre W. /Comparison of diagnostic methods for detection
of Helicobacter pylori. //East African Medical Journal. 1996. V.73. N.4. S.239–241.
125. Kato M., Asaka M., Saito M. et al. /Clinical usebulness of urine-based enzymelinked ummunosorbent assay for detection of antibody to Helicobacter pylori: a
collaborative study in nine medical institutions in Japan. // Helicobacter. 2000.
№4. P.109–119.
126. Khomeriki SG, Khomeriki NM / Clinical significance of oxygen free radicals produced by Helicobacter pylori. // Gut. 2001. V.49. Suppl III. A2101.
127. Khomeriki SG, Khomeriki NM, Morozov IA, Telegin GB / Helicobacter pylori as
a source of oxygen free radicals in the gastric mucosa // New aspects in hepatology
and gastroenterology. Falk Symposium. 1998. May 29–30. Tbilisi. А137.
128. Khomeriki SG, Khomeriki NM, Telegin GB, Morozov IA / Localization of NADHoxidase in the surface of Helicobacter pylori by an electron microscopic cytochemistry//Gut. 1998. Vol.43. Suppl.2. A60.
129. Khomeriki SG, Zhukhovitsky VG /Emission of oxygen free radicals from bacteria: Difference between Campylobacter and Helicobacter. //Int.J.Med.Microbiol.
2001. V.291. Suppl.31. P.98.
130. Khomeriki SG, Zhukhovitsky VG, Khomeriki NM, Kubatiev AA / Activation of
oxidative metabolism in different strains of Helicobacter pylori: Dynamics with aging and morphology. // Gut. 2001. V.49. Suppl.11. A3.
131. Khomeriki SG, Zhukhovitsky VG, Khomeriki NM, Kubatiev AA /Detection of
oxygen free radicals in the bacterial suspension of H.pylori. Mechanisms of activation and suppression. // Gut. 2000. V.47. Suppl.1. A7.
132. Khomeriki SG, Zhukhovitsky VG, Khomeriki NM, Kubatiev AA /Helicobacter
102
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
pylori as a source of oxygen free radicals.// 4th International Workshop on pathogenesis and Host Response in Helicobacter infections. Lo-Skolen, Helsingor, Danmark,
2000. H.56.
133. Kim HY, Kim N, Kang JM et al. /Clinical meaning of pepsinogen test and Helicobacter pylori serology in the health chech-up population in Korea. //Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009. V.21. P.606–612.
134. Kimura M, Goto S, Ihara Y et al. /Impairment of glutathione metabolism in
human gastric epithelial cells treated with vacuolating cytotoxin from Helicobacter
pylori. //Microb Pathog. 2001. V.31. N.1. P.29–36.
135. Kimura M, Goto S, Vada A et al. /Vacuolating cytotoxin purifiede from Helicobacter pylori causes mitochondrial damage in human gastric cells. //Microb Pathog.
1999. V.26. N.1. P.45–52.
136. Klein P.D., Graham D.Y. Detection of Campylobacter pylori by the C-urea
breath test. / In:Rathbone B.J., Heatley R.V.eds. Campylobacter pylori and gastroduodenal disease. Blackwell,Oxford, 1989. P.94–105.
137. Koletzko S., Haisch M., Seeboth I., et al. /Isotope-selective non-dispersive
infrared spectrometry for detection of Helicobacter pylori infection with 13C-urea
breath test. //Lancet. 1995. V.345. N.8955. P.961–962.
138. Kosunen T.U., Seppala K., Sarna S., Sipponen P. /Diagnostic value of decreasing
IgG, IgA, and IgM antibody titres after eradication of Helicobacter pylori. //Lancet,
1992. V.339. N.8798. P.893–895.
139. Krajden S., Bohnen J., Anderson J. et al. /Comparison of selective and nonselective media for recovery of Campylobacter pylori from antral biopsies. //J.Clin.
Microbiol. 1987. V.25. N.6. P.1117–1118.
140. Kreuning J., Lindeman J., Biemond I., Lamers C.B. /Relation between IgG and
IgA antibody titres against Helicobacter pylori in serum and severity of gastritis in
asymptomatic subjects. //J Clin Pathol. 1994. V.47. N.3. P.227–231.
141. Krumbiegel P., Herbarth O., Kiess W., et al. /Diagnosis of Helicobacter pylori
infection in children: is the 15N urine test more reliable than the 13C breath test?
//Scand J Gastroenterol. 2000. V.35. N.4. P.353–358.
142. Lage A.P., Godfroid E., Fauconnier A. et al. /Diagnosis of Helicobacter pylori
infection by PCR: Comparison with other invasive techniques and detection of cagA
gene in gastric biopsy specimens. //J.Clin.Microbiol. 1995. V.33. P.2752–2756.
143. Laheij R.J., Straatman H., Jansen J.B., Verbeek A.L. /Evaluation of commercially
available Helicobacter pylori serology kits: a review. //J Clin Microbiol. 1998. V.36.
N.10. P.2803–2809.
144. Laine L, Knigge K, Faigel D, et al. /Fingerstick Helicobacter pylori antibody
test: better than laboratory serological testing? //Am J Gastroenterol. 1999. V.94.
N.12. P.3464–3467.
145. Laine L., Lewin D., Naritoku W., Cohen H. /Prospective comparison of HgcE,
Giemsa, and Genta stains for the diagnosis of Helicobacter pylori. //Gastrointestinal
Endoscopy. 1997. V. 45. N.6. S.463–467.
146. Langenberg W., Rauws E.A., Widjojokusumo A. et al. /Identification of Campylobacter pyloridis isolates by restriction endonueclease DNA analysis. //J.Clin.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
103
Microbiol. 1986. V.24. N.3. P. 414–417.
147. Langhorst J, Heuer S, Drouven FU et al. / Evaluation des helicoCare-Antikorper
Kassettentests zur Diagnose einer Helicobacter pylori-Infektion. //Z Gastroenterol.
2002. V.40. N.6. P.389–393.
148. Lee DG, Kim HN, Park Y et al. /Design of novel analogue peptides with potent
antibiotic activity based on the antimicrobial peptide, HP (2-20), derived from
N-terminus of Helicobacter pylori ribosomal protein L1. //Biochim Biophys Acta.
2002. V.1598. P.185–94.
149. Lee DG, Kim PI, Park Y et al. /HP (2-20) derived from the amino terminal region of Helicobacter pylori ribosomal protein L1 exerts its antifungal effects by damaging the plasma membranes of Candida albicans. // J Pept Sci. 2002; 8: 453–460.
150. Leja M, Kupcinskas I, Funka K et al. /The validity of a biomarker method for
indirect detection of gastric mucosal atrophy versus standard histopathology. //Dig.
Dis. Sci., 2009. V.54. P.2377–84.
151. Leodolter A., Wolle K., Malfertheiner P. /Current Standards in the Diagnosis of
Helicobacter pylori infection. //Dig. Diseases. 2001. V.19. P.116–122.
152. Lerang F., Haug J.B., Mourn B., et al. /Accuracy of IgG serology and other tests
in confirming Helicobacter pylori eradication. //Scand J Gastroenterol. 1998. V.33.
N.7. P.710–715.
153. Li C., Ha T., Ferguson D.A., et al. /A newly developed PCR assay of H.pylori in
gastric biopsy, saliva, and feces. Evidence of high prevalence of H.pylori in saliva
supports oral transmission. //Digestive Diseases and Sciences. 1996. V.41. N.11.
P.2142–2149.
154. Libera M., Pazzi P., Carli G., et al. /Brush cytology: a reliable method to detect
Helicobacter pylori. //J. Clin. Gastroenterology. 1996. V. 22. P. 317–321.
155. Lin S.Y., Jeng Y.S., Wang C.K. et al. /Polymerase chain reaction diagnosis of
Helicobacter pylori in gastroduodenal diseases: comparison with culture and
histopathological axaminations. //Journal of Gastroenterology and Hepatology.
1996. V.11. N.3. P. 286–289.
156. Liston R, Pitt MA, Banerjee AK / IgG ELISA antibodies and detection of Helicobacter pylori in elderly patients. //Lancet. 1996. V.347. P.269.
157. Logan R.P. /Urea breath tests in the management of Helicobacter pylori infection. //Gut. 1998. V.43. Suppl.1. P.47–50.
158. Logan R.P.H., Dill S., Bauer F.E. /The European 13C-urea breath test for the
detection of Helicobacter pylori. //Eur J Gastroenterol Hepatol. 1991. V.3. P.915–921.
159. Loy C.T., Irwig L.M. Katelaris P.H., Talley N.J. /Do commercial serological
kits for Helicobacter pylori infection differ in accuracy? A meta-analysis. //American
Journal of Gastroenterology. 1996. V.91. N.6. P.1138–1144.
160. Luzza F., Imeneo M., Marasco A. et al. /Evaluation of a commercial serological
kit for detection of salivary immunoglobulin G to Helicobacter pylori: a multicentre
study. //Eur.J.Gastroenterol. Hepatol. 2000. V.12. P.1117–1120.
161. Malaty H.M., Logan N.D., Graham D.Y., et al. /Helicobacter pylori infection in
asymptomatic children: comparison of diagnostic tests. //Helicobacter. 2000. V.5.
N.3. P.155–159.
104
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
162. Malfertheiner P., Leodolter A., Gerards C. Pitfalls in Helicobacter pylori diagnosis. in “Helicobacter pylori. Basic Mechanisms to clinical Cure 2000”. Dordrecht/
Boston/London, 2000. P.123–138.
163. Malfertheiner P., Megraud F., O Morain C. /Guidelines for the Management of
Helicobacter pylori infection. //Business Briefing: European Gasrtoenterology
Review. 2005. P.59–60.
164. Malfertheiner P., Megraud F., O´Morain C. et al. Current concepts in the managementof Helicobacter pylori infection the Maastricht 2-2000 Consensus Report. //
Aliment. Pharmocol. Ther., 2002. 16(2). S.167–180.
165. Malfertheiner P., Megraud F., O’Morain C., et al., /The European Helicobacter
Study Group. //Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht III Consensus Report. //Gut. 2007. V.56. P.772–781.
166. Mana F., Franken P.R., Ham H.R., et al. / 13C urea breath test with nondispersive isotope-selective infrared spectrometry: reproducibility and importance of the
fasting status. //Helicobacter. 2000. V.5. N.2. P.104–108.
167. Maraki S, Mouzas IA, Kontoyiannis DP et al. /Prospective evaluation of the impact of amoxicillin, clarithromycin and their combination on human gastrointestinal
colonization by Candida species. //Chemotherapy. 2001. V.47. N.3. P.215–218.
168. Markristatis A., Pasching E., Schutse K., et al. / Detection of Helicobacter pylori
in stool specimens by PCR and antigen enzyme immunoassay // J. Clin. Microbiol.
1998. V.36. P.2772–2774.
169. Marshall B. /Helicobacter pylori: уроки прошлого и новые возможности. //Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2008. N8. С.6–11.
170. Marshall B. J. The discovery that Helicobacter pylori, a spiral bacterium, caused
peptide ulcer disease // In: Helicobacter pioneers. Blackwell Science Asia Pry
Ltd. 2002. P. 165–203.
171. Marshall B.J., Surveyor I. /Carbon-14 urea breath test for diagnosis of Campylobacter pylori associated gastritis. // J.Nucl.Med. 1988. V.29. P.11–16.
172. Marshall B.J., Warren J.R. /Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in
active chronic gastritis. //Lancet. 1983. N.8336 P.1273–1275.
173. Marshall B.J., Warren J.R., Francis G.J. et al. /Rapid urease test in the management of Campylobacter pylori-associated gastritis. //Am.J.Gastroenterol. 1987.
V.82. N.3. S.200–210.
174. Mazzio L., Angelucci D., Grossi L. et al. /Anti-Helicobacter pylori specific antibody immunohistochemistry improves the diagnostic accuracy of Helicobacter pylori
in biopsy specimen from patients treated with triple therapy. //Am.J.Gastroenterol.
1998. V.93. N.2. P.223–226.
175. McNulty C.A., Nair P., Watson B.E., Uff J.S., Valori R.M. /A comparison of six
commercial kits for Helicobacter pylori detection. //Comm. Dis. Public. Health.
1999. Vol.2. №1. P.59–63.
176. Megraud F. /How should Helicobacter pylori infection be diagnosed? //Gastroenterology. 1997. V.113. Suppl.6. S.93–98.
177. Megraud F. /Rationale for the choice of antibiotics for the eradication Helicobacter pylori // Eur.J.Gastroenterol. 1995. Suppl.1. P.49–54.
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
105
178. Megraud F., Bonnet F., Garnier M., Lamouliattet H. /Characterization of
“Campylobacter pyloridis” by culture, enzymatic profile, and protein content. //J.
Clin. Microbiol. 1985. V.22. N.6. P.1007–1010.
179. Merchant JL /VacA pores as portable portals for urea. // J Clin Invest. 2001.
V.108. N.6. P.803–4.
180. Minoli G., Prada A., Schuman R., et al. /A simplified urea breath test for the
diagnosis of Helicobacter pylori infection using the LARA System. Laser Assisted
Ratio Analyzer. //J Clin Gastroenterol. 1998. V.26. N.4. P.264–266.
181. Misra S., Dwivedi M., Misra V., Gupta S. /Imprint cytology a cheap, rapid and
effective method for diagnosing Helicobacter pylori. //Postgrad. Med. J. 1993. V.
69. P. 291–295.
182. Miyabayasti H., Furihata K., Shimizu T. et al. /Jubluence of oral Helicobacter
pylori on the success of eradication therapy against gastric Helicobacter pylori. //
Helicobacter. 2000. №5. P.30–37.
183. Moayyedi P. Braunholtz D., Heminbrough E., et al. /Do patients need to fast for
a 13C-urea breath test? //European Journal of Gastroenterology and Hepatology.
1997. V.9. N.3. P.275–277.
184. Monteiro L, Birac C, Megroud F. Detection of Helicobacter pylori in gastric
biopsy by polymerase chain reaction. In:Helicobacter pylori:techniques for clinical
diagnosis and basic research. Ed. A.Lee and F.Megraud. Saunders Company Ltd.
1996. P.112–120.
185. Montgomery E., Martin D., Peura D. /Rapid diagnosis of Campylobacter pylori
by Gram’s stain. //Am. J. Clin. Pathol. 1988. V.90. P. 606–609.
186. Morgan D.R., Freedman R., Depew C.E., Kraft W.G. /Growth of Campylobacter
pylori in liquid media. //J.Clin.Microbiol. 1987. V.25. N.11. P.2123–2125.
187. Morozov I. A. Helicobacter pylori was discovered in Russia in 1974 // In: Helicobacter pioneers. Blackwell Science Asia Pry Ltd. 2002. Ed. by B. Marshall. P.
99–105.
188. Morris A., Nicholson G. Campylobacter pylori: human ingestion studies.// In:
Rathbone B.J., Heatley R.V. eds. Campylobacter pylori and gastroduodenal disease.
Blackwell,Oxford, 1989. P.185–189.
189. Mowat C, Murray L, Hilditch ТЕ, et al. /Comparison of helisal rapid blood test
and 14C-urea breath test in determining Helicobacter pylori status and predicting
ulcer disease in dyspeptic patients. //Am J Gastroenterol. 1998. V.93. N.l. P.20–25.
190. Nagata K.,Yu H., Nishikawa M. et al. /Helicobacter pylori generates superoxide
radicals and modu-lates nitric oxide metabolism. //J.Biological Chemistry. 1998.
v.273. No.23. p.14071–14073.
191. Nakata H., Itho H., Yokoya Y. et al. /Serum antibody against Helicobacter pylori
assayed by a new capture ELISA. // J. Gastroenterol. 1995. Vol.30. P.295–300.
192. Negrini R., Lisato L., Cavazzini L. et al. /Monoclonal antibodies for specific immunoperoxidase detection of Campylobacter pylori. //Gastroenterology. 1989.
V.96. N.2. Pt.1. P.414–420.
193. Nguyen LT, Uchida T, Tsukamoto Y et al. /Evaluation of rapid urine test for the
detection of Helicobacter pylori infection in the Vietnamese population. //Dig Dis
106
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
Sci. 2010. V.55. P.89–93.
194. Nishikawa K., Sugiyama T., Kato M. et al. /A prospective evaluation of new
rapid urease tests before and after eradication treatment of Helicobacter pylori, in
comparison with histology, culture and 13C-urea breath test. //Gastrointest. Endosc.
2000. V.51. N.2. S.164–168.
195. Norgaard A, Andersen LP, Elsborg L, Holck S, Nielsen H /Specific neutrophil
hyporesponsiveness in chronic Helicobacter pylori infection.// J Infect Dis. 1996.
V.174. N.3. P.544–551.
196. Odenbreit S, Puls J, Sedlmaier B et al. / Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. // Science. 2000. V.287.
N.5457. P.1497–1500.
197. Ohkura R., Miwa H, Murai T. et al. /Usefulness of a novel enzyme immunoassey
for the detection of Helicobacter pylori in feces. //Scand.J.Gastroenterol. 2000.
V.35. P.49–53.
198. Ohno YI, Hirai KI, Kanoh T. et al. /Subcellular localization of hydrogen peroxide
production in human polymorphonuclear leukocytes stimulated with lectins, phorbol
myristate acetate and digitonin: an electron microscopic study using CeCl3 .
//Blood. 1982. V.60. No.5. P.1195–1202.
199. Ozturk E, Yesilova Z, Ilgan S et al. /Performance of acidified 14C-urea capsule
breath test during pantoprazole and ranitidine treatment. //J Gastroenterol Hepatol.
2009. V.24. P.248–51.
200. Pacheco N., Mago V., Gomez I. et al. /Comparison of PCR and common clinical
tests for the diagnosis of H.pylori in dyspeptic patients. //Diagn.Microbiol. Infect.
Dis. 2001. V.39. N.4. P.207–210.
201. Parente F., Bianchi Porro G. /The (13)C-urea breath test for non-invasive
diagnosis of Helicobacter pylori infection: which procedure and which measuring
equipment? //Eur J Gastroenterol Hepatol. 2001. V.13. N.7. P.803–806.
202. Park C.S., Kim J. /Rapid and easy defection of Helicobacter pylori by in situ
hydridization. //J.Korean Med.Sci. 1999. V.14. N.1. P.15–20.
203. Parsonnet J., Welch K., Compton C. et al. /Simple microbiologic defection of
Campylobacter pylori. //J.Clin.Microbiol. 1988. V.26. N.5. P.948–949.
204. Perez-Perez G.I., Brown W.R., Cover T.L., et al. /Correlation between serological and mucosal inflammatory responses to Helicobacter pylori. //Clin Diagn Lab
Immunol. 1994. V.1. N.3. P.325–329.
205. Perri F, Maes B, Geypens B et al. /The influence of isolated doses of drugs,
feeding and colonic bacterial ureolysis on urea breath test results. //Aliment Pharmacol Ther. 1995. V.9. P.705–709.
206. Peura D.A., Pambianco D.J., Dye K.R. et al. /Microdose urea breath test offers
diagnosis of Helicobacter pylori in 10 minutes. //Amer.J.Gastroenterol. 1996. V.91.
N.2. P.233–238.
207. Pilotto A., Rassu M., Franceschy M., Di Mario F. /Prevalence of Helicobacter
pylori resistance to antibiotics in Northerst Italy: a multicentre studi // Dig.Liver
Dis. 2000. V.32. N.9. P. 763–768.
208. Prazeres Magalhaes P., de Magalhaes D., Vale Campos Barbosa D. et al. /Helico-
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
107
bacter pylori primary resistance to metronidazole and clarithromicin in Brazil. //
Antimicrob.Agents and Chemother. 2002(june). P.2021–2023.
209. Price AB. The histological recognition of Helicobacter pylori. In: Helicobacter pylori: techniques for clinical diagnosis and basic research. Ed by A.Lee and
F.Megraud. WB Saunders Company Ltd. London, 1996. P.33–49.
210. Rauws E., Royen E., Lanhgenberg W. et al. /14C-urea breath test in C.pylori
gastritis. //Gut. 1989. V.30. P.798–803.
211. Reilly T.G., Poxon V., Sanders D.S., et al. /Comparison of serum, salivary, and
rapid whole blood diagnostic tests for Helicobacter pylori and their validation against
endoscopy based tests. //Gut. 1997. V.40. N.4. P.454–458.
212. Ribeiro C.D., Gray S.J. /Long term freeze storage of Campylobacter pyloridis.
//J. Clin.Pathol. 1987. V.40. N.10. P.1265.
213. Ruiz-Palacios G.M., Guerrero M.L., Luqueno V. et al. /The role of noninvasive
tests, immunoblot and the 13C-urea breath test, for the diagnosis of Helicobacter
pylori infection in epidemiologic studies of infants and children. //Int.J.Med.Microb.
2001. V.291. Suppl.31. F-17. P.49.
214. Russmann H., Kempf V.A., Koletzko S. et. al. /Comparison of fluorescent in situ
hybridization and conventional culturing for detection of Helicobacter pylori in
gastric biopsy specimens. //J.Clin.Microbiol. 2001. V.39. P.304–308.
215. Sadowski D, Cohen H, Laine L, et al. /Evaluation of the FlexSure HP whole
blood antibody test for diagnosis of Helicobacter pylori infection. //Am J Gastroenterol. 1998. V.93. N.11. P.2119–23.
216. Sahin F.I., Tinaz A.C., Simsek I.S. et al. /Detection of Helicobacter pylori in
dental plaque and gastric biopsy samples of Turkish patients by PCR-RFLP. //Acta
Gastroenterol. Belg. 2001. V.64. N.2. P.150–152.
217. Sato T., Fujino M.A., Kojima Y. et al./ Endoscopic urease sensor system for defecting Helicobacter pylori on gastric mucosa. //Gastrointest. Endosc. 1999. V.49.
N.1. S.32–38.
218. Shirahase H., Yamamoto E., Gouda Y. et al. /Semi-quantitative detection of
Helicobacter pylori using immunohistochemical staining. //Rinsho Byori. 1998. V.46.
N.12. P.1258–1263.
219. Sipponen P, Harkonen M, Alanko A., Suovaniemi O. /Diagnosis of atrophic
gastritis from a serum sample.//Clin. Lab. 2002. Vol.48. P. 505–515.
220. Slater B. /Superior stain for Helicobacter pylori using toluidine O. //J.Clin.
Pathol. 1990. V.43. N.11. P.961.
221. Smith M.A., Edwards D.I. /The influence of microaerophilia and anaerobiosis
on metronidazole uptake in Helicobacter pylori. //J Antimicrob Chemother. 1995.
V.36. N.3. P.453–461.
222. Smith MA, Edwards DI. Oxygen scavenging, NADH-oxidase and metronidazole resistance in Helicobacter pylori.// J Antimicrob Chemother. 1997. V.39(3).
P.347–353.
223. Sorberg M., Engstrand L., Strom M., et al. /The diagnostic value of enzyme immunoassay and immunoblot in monitoring eradication of Helicobacter pylori. //
Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 1997. V.29. N.2. P.147–151
108
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
224. Steer H. W. /Ultrastructure of cell migration through the gastric epithelium and
its relationship to bacteria // J. Clin. Pathol. 1975. Vol. 28. P. 639–646.
225. Stone MA, Mayberry JF, Wicks AC, et al. /Near patient testing for Helicobacter
pylori: a detailed evaluation of the Cortecs Helisal Rapid Blood test. //European
Journal of Gastroenterology and Hepatology. 1997. V.9. N.3. P.257–260.
226. Suzuki H, Mori M, Suzuki M, Sakurai K, Miura S, Ishii H /Extensive DNA damage induced by monochloramine in gastric cells.// Cancer Lett. 1997. V.115(2).
P.243–248.
227. Taha A.S., Boothman P., Nakshabendi I. et al. /Diagnostic tests for Helicobacter
pylori: comparison and influence of non-steroidal anti-inflammatory drugs. //J.Clin.
Pathol. 1992. V.45. N.8. P.709–712.
228. Tahara T, Shibata T, Nakamura M et al. /Gastric mucosa petterrn by using magnifying narrow-band endoscopy clearly distinguishes histological and serological
severity of chronic gastritis. //Gastrointst Endosc. 2009. V.70. P.246–53.
229. Teh SK, Zheng W, Ho KY et al. /Near-infrared Raman spectroscopy for optical
diagnosis in the stomach: identification of Helicobacter pylori infection and intestinal metaplasia. //Int J Cancer, 2010. V.126. P.1920–7.
230. Thijs J.C., van Zwet A.A., Moolenaar W., Wolfhagen M.J.H.M., J. ten Bokkel
Huinink. /Triple therapy vs. amoxicillin plus omeprazole for treatment of Helicobacter pylori infection: a multicenter, prospective, randomized, controlled study of
efficacy and side effects. //Am.J.Gastroenterol. 1996. V.91. P.93–97.
231. Thijs JC, van Zwet AA, Thijs WJ et al. / Diagnostic tests for Helicobacter pylori:
a prospective evaluation of their accuracy, without selecting a single test as the gold
standard. //Am J Gastroenterol. 1996. V.91. N.10. P.2125–2129.
232. Thoreson A.C.E., Hosseini N., Svennerholm A.M., Bolin I. /Different Helicobacter pylori strains colonize the antral and duodenal mucosa of duodenal ulcer
patients. //Helicobacter. 2000. V.5 P.69–78.
233. Tombola F, Morgiato L, Del Giudice G et al. /The Helicobacter pylori VacA
toxin is a urea permease that promotes urea diffusion across epithelia. // J Clin Invest
2001. V.108. N.6. P.929–937.
234. Toulaymat M., Marconi S., Garb J. et al. /Endoscopic biopsy pathology of Helicobacter pylori gastritis. Comparison of bacterial defection by immunohistochemistry and Genta stain. //Arch.Pathol.Lab.Med. 1999. 123(9). S.778–781.
235. Trebesins K., Panthel K., Strobel S. et al. /Rapid and specific detection of Helicobacter pylori macrolide resistance in gastric tissue by fluorescent in situ hybridization.
//Gut. 2000. V.46. P.608 614.
236. Trevisani L, Sartori S, Rossi MR et al. /Evaluation of a new rapid immunoassay
for the detection of Helicobacter pylori in faeces: a prospective pilot study. //Aliment
Pharmacol Ther. 2005. V.21. N.4. P.485–489.
237. Trevisani L., Sartori S., Galvani F. et al. /Evaluation of a new enzyme immunoassay for detecting Helicobacter pylori in feces: a prispective pilot study // Am. J.
Gastroenterol., 1999, 94:1830–1833.
238. Väänänen H, Vauhkonen M, Helske T.et al. /Non-endoscopic diagnosis of atro-
Лабораторная диагностика инфекции Helicobacter pylori
109
phic gastritis with a blood test. Correlation between gastric histology and serum
levels of gastrin-17 and pepsinogen I: a multicentre study. // Eur J Gastroenterol
Hepatol. 2003. V.15. P.885–891.
239. Vaira D., Malfertheiner P., Megraud F. et al. /Noninvasive antigen-based assay
for assessing Helicobacter pylori eradication: A European multicenfer study. //
Am.J.Gastroenterol. 2000. V.95. P.925–929.
240. Vaira D., Vakil N. /Blood, urine, stool, breath, money, and Helicobacter pylori. //
Gut. 2001. V.48. P.287–289.
241. Vakil N., Affi A., Robinson J., Sundaram M., Phadnis S. /Prospective blinded
trial of a fecal antigen test for the detection of Helicobacter pylori infection. //
Am.J.Gastroenterol. 2000. V.95. P.1699–1701.
242. van der Hulst R.W., Keller J.J., Rauws E.A., et al. /Treatment of Helicobacter
pylori infection: a review of the world literature // Helicobacter. 1996; 1 (1): 6–19.
243. van Der Hulst R.W., Lamouliatte H., Megraud F., et al. /Laser assisted ratio analyzer 13C-urea breath testing, for the detection of H. pylori: A prospective
diagnostic European multicentre study. //Aliment Pharmacol Ther. 1999. V.13. N.9.
P.1171–1177.
244. van Doorn L.J., Henskens Y., Nouhan N. et al. /The efficacy of laboratory diagnosis of Helicobacter pylori infections in gastric biopsy specimens is related to
bacterial density and vacA, cagA and iceA genotipes. //J.Clin. Microbiol. 2000.
V.38. N.1. P.13–17.
245. Vartanian R.K., Leung J.K., Davis J.E. et al. /A novel Alcian yellow-toluidine
blue (Leung) stain for Helicobacter species: comparison with standard stains, a costeffectiveness analysis, and supplemental utilities. //Mod.Pathol. 1998. V.11. N.1.
S.72–78.
246. Vecsei A, Innerhofer A, Binder C et al. /Stool polymerase chain reaction for Helicobacter pylori detection and clarithromycin susceptibility testing in children. //
Clin Gastroenterol Hepatol. 2010. V.8. P.309–312.
247. Veenendaal R.A., Lichtendahl-Bernands A.T., Pena A.S. et al. /Effect of transport medium and transportation time on culture of Helicobacter pylori from gastric
biopsy specimen. //J.Clin.Pathol. 1993. V.46. P.561–563.
248. Versalovic J., Osato M.S., Spakovsky K. et al. /Point mutations in the23S rRNA
gene of Helicobacter pylori associated with different levels of clarithromycin resistance // J.Antimicrob.Chemother. 1997. V.40. P.283–286.
249. Versalovic J., Shortridge D., Kibler K. et al. / Mutation in 23SrRNA are associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori. //Antimicrob. Agents.
Chemother. 1996. V.40. P.477–480.
250. Viara D., Holton J., Menegatti M. et al. /New immunological assays for the diagnostics of Helicobacter pylori infection // Gut., 1999. Vol.45. №1. P.123–127.
251. Wagner S., Beil W., Westermann J. et al. /Regulation of gastric epithelial cell
growth by Helicobacter pylori: evidence for a major role of apoptosis. //Gastroenterology. 1997. V.113. P.1836–47.
252. Warren J. R. The discovery of Helicobacter pylori in Perth Western Australia. In:
Helicobacter pioneers. Blackwell Science Asia Pry Ltd. 2002. Ed. by B. Marshall.
110
С.Г. Хомерики, В.И. Касьяненко
P. 151–164.
253. Westblom T.V., Barthel J.S., Havey A.D. et al. /Long term freeze storage of
Campylobacter pyloridis. //J.Clin.Pathol. 1987. V.40. N.3. P. 353.
254. Wildgrube H.J. /The 13C-urea breath test in Helicobacter pylori colonisation of
the gastric mucosa. // Dtsch. Med. Wochensch. 1995. Vol.120. P.940–942.
255. Wong BC, Wong W, Tang VS et al. /An evaluation of whole blood tests for Helicobacter pylori infection in the Chinese population. //Aliment Pharmacol. 2000.
V.14. P.331–335.
256. Wyatt J.I., Rathbone B.J. /Immune response of the gastric mucosa to Campylobacter pylori. //Scand.J.Gastroenterol. 1988. V.142. P.44–49.
257. Xia HH, Talley NJ //Apoptosis in gastric epithelium induced by Helicobacter
pylori infection: implications in gastric carcinogenesis. //Am J Gastroenterol. 2001.
V.196. N.1. P.16–26.
258. Yamamoto I, Fukuda Y., Mizuta T. et al. /Serum anti-Helicobacter pylori antibodies and gastritis. //J.Clin.Gastroenterol. 1995. V.21. S.1. P.164–168.
259. Yoshida H., Hirota K., Ogura K., et al. /Determination of the optimal cut-off
value for the [13C]-urea breath test based on a Helicobacter pylori-specific polymerase chain reaction assay. //J Gastroenterol Hepatol. 2000. V.15. N.2. P.155–160.
260. Zhang ZW, Farthing MJG Helicobacter pylori in gastric malignancy: role of oxidants, antioxidants and other co-factors. In: «Helicobacter pylori. Basic mechanisms
to clinical cure 2000». Ed.by Hunt RH and Tytgat GNJ. Kluwer Academic Publishers. 2000. P.513–524.
261. Zwolinska-Wcisto M., Budak A., Bogdat J., Trojanowska D., Stachura J. /Fungal
colonization of gastric mucosa and its clinical relevance. //Med.Sci.Monit. 2001.
V.7. N.5. P.982–988.
Скачать