2.4. Регуляция генов патогенности. Регуляция патогенности у

2.4. Регуляция генов патогенности.
Регуляция патогенности у прокариот. Факторы вирулентности.
Токсичность как свойство патогенных микроорганизмов.
Регуляция генов вирулентности. Островки патогенности.
Возникновение устойчивых к антибиотикам форм патогенов.
Регуляция генов патогенности.
Многие микроорганизмы являются возбудителями инфекционных заболеваний.
Изучение взаимодействий между патогенными организмами и их хозяевами всегда было
приоритетной задачей биологии и медицины. Современные методы молекулярной
биологии позволяют исследовать факторы вирулентности и кодирующие их гены, также
стало возможным изучать регуляторные механизмы, контролирующие экспрессию генов
вирулентности.
К
факторам
вирулентности
можно
отнести
молекулы
адгезии,
необходимые для прикрепления к клеткам хозяина, токсины, капсулы, липополисахариды,
специфические ферменты, обеспечивающие защиту от иммунной системы хозяина.
Понятие патогенности определяется, как способность микроорганизмов вызывать
заболевание, а болезнетворный организм – патоген. Для многих патогенов характерна
коэволюция с организмом-хозяином (совместная эволюция взаимодействия паразитхозяин). Подобная коэволюция обеспечивает оптимальную регуляцию вирулентности,
поскольку
избыточная
патогенность
приводит
к
гибели
организмов-хозяев
и,
следовательно, гибели паразита. Также коэволюция включает эволюцию патогенов,
направленную на защиту от иммунитета хозяина. Гены, кодирующие факторы
патогенности часто локализованы в геноме микроорганизмов в виде островков
патогенности, это облегчает перенос генов патогенности с мобильными элементами и при
конъюгации.
С точки зрения экологических отношений, заболевания можно рассматривать как
отношения паразит-хозяин. Известно, что многие паразиты имеют сложный жизненный
цикл, при это м имеется несколько хозяев. Хозяин, в котором происходит размножение –
основной хозяин, промежуточный хозяин (необходим для завершения жизненного цикла).
Дополнительные хозяева (не обязательны для жизненного цикла, но могут быть звеном
передачи), резервуарные (носители паразита, способные заражать человека).
До введения в практику использования антибиотиков, ведущий вклад в смертность
населения по всей Земле вносили инфекционные болезни, «классические» патогенные
бактерии, облигатные патогены. К ним относят Vibrio cholerae, Salmonella enterica серовар
1
Typhi
(возбудитель
брюшного
Mycobacterium
тифа),
tuberculosis
(возбудитель
туберкулеза). В настоящее время большое значение приобрели факультативно патогенные
бактерии (оппортунистичессие), присутствующие в окружающей среде или в составе
нормальной микрофлоры человека. Примерами таких микроорганизмов являются
бактерии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, гриб Candida albicans.
Регуляция патогенности у прокариот. Факторы вирулентности.
Регуляция вирулентности.
Индукция экспрессии факторов вирулентности возможна под действием факторов
окружающей среды или фагов. Например, дифтерийный токсин Corynebacterium
diphtheriae переносится умеренным фагом, и его экспрессия регулируется содержанием
железа. Токсин Bordetella pertussis (вызывает судорожный кашель) экспрессируется при
37С. Холерный токсин (Vibrio cholerae) переносится фагом, заболевание может быть
вызвано штаммом, перенесшим успешную трансдукцию.
Наряду с 200 видами «классических» патогенных бактерий, в наше время описано
несколько десятков новых патогенных прокариот, главным образом оппортунистических.
Патогенность новых
возбудителей определяется модификацией их генетических
характеристик, путем горизонтального переноса генов происходит передача генов
факторов вирулентности локализованных в плазмидах, транспозонах, бактериофагах,
островках патогенности в составе бактериальных хромосом. Примером «нового» патогена
является энтерогеморрагический вариант E. coli (EHEC), вызывающий геморрагический
колит и гемолитический уретический синдром. Такой штамм, описанный в 1982г., несет
Slt-конвертирующий токсин (Shiga-like toxin), плазмиду, содержащую ген другого токсина
(гемолизина), а также ген фактора адгезии.
Возникновение «новых» патогенов связано с изменениями условий жизни
населения Земли. Многие возбудители были открыты в последнее время благодаря
совершенствованию
методов
диагностики.
Применение
молекулярных
методов
клонирования генов, использования ДНК и РНК-зондов для гибридизации позволило
описать ряд бактерий – внутриклеточных паразитов (Helicobacter pylori, Chlamydia
pneumonia,
Borrelia
burgdorferi
и
другие).
Выявленные
факторы
патогенности
используются как основной инструмент исследования данных заболеваний. В таблице 1
представлены некоторые «новые» патогены [Ленгелер, Древс, Шлегель, 2005].
2
Таблица 1. Патогенные бактерии с «приобретенными» свойствами вирулентности.
Возбудитель
Ген
Соединение
Механизм
Заболевание
(свойство)
приобретени
я
Escherichia
coli slt
(Энтерогеморрагически
й вариант EHEC)
Шигоподобны
Перенос фага Энтерогеморрагически
е токсины
e-hly
й колит
Гемолизин
Перенос
Синдром
EHEC
плазмиды
гемолитической
уремии
Salmonella
серовар
entericа aer
Аэробактин
Enteritidis
Перенос
Кишечная инфекция
плазмиды
фаготип 4
Vibrio cholerae O139
rfb
О-антиген
Перенос
Холера
О139
хромосомны
х генов
Staphylococcus aureus
tss
Токсины
Перенос фага Синдром токсического
токсического
шока
шока
mecA
Устойчивость
Перенос
Внутрибольничные
к метициллину хромосомны
инфекции
х генов
Streptococcus pyogenes
speA
Суперантиген
Перенос фага Синдромы
токсического шока
Mycobacterium
rpoB
tuberculosis
Устойчивость
Точковые
к
мутации
рифампицину
гене
Туберкулез
в
РНК-
полимеразы
Enterococcus
pbp2
Устойчивость
pneumoniae
b
к пенициллину хромосомны
Перенос
Пневмония
х генов
Примечание. По материалам [Ленгелер, Древс, Шлегель, 2005].
3
Патогенез бактериальной инфекции.
Основные этапы бактериальной инфекции:

Резервуар.

Попадание в хозяина.

Прикрепление, колонизация, и/или проникновение в клетки.

Защита от иммунитета хозяина.

Рост или завершение жизненного цикла.

Вред организму хозяина.

Возвращение в резервуар или нового хозяина.
При
этом
бактериальные
и
вирусные
патогены
могут
проникать
через
плацентарный барьер, вызывая заражение эмбриона. Патогенность бактерий может
усиливаться факторами адгезии. К ним относятся: фимбрии (на поверхности),
гликокаликс или капсула (ингибирует фагоцитоз, увеличивает адгезию), пили (передача
наследственного материала), тейхоевые кислоты (грам+, увеличивают адгезию).
Рисунок 1. А) Фимбрии на поверхности патогенной формы E. сoli выделенной у
больного человека, непатогенная, свободноживущая форма не имеет фимбрий.
Б)
Прикреплений бактерий р. Vibrio к поверхности эпителиальных клеток. (х1,200) [Joanne
M. Willey et al. 2008].
Рост бактериальных патогенов.
Патогену необходима подходящая среда в организме хозяина для успешного роста.
Многие
патогены
являются
внутриклеточными
паразитами
(облигатными
и
факультативными). Brucella abortus – пример факультативного внутриклеточного
паразита (развивается внутри макрофагов, нейтрофилов и трофобластов), можно
4
вырастить в чистой культуре. Облигатные внутриклеточные паразиты (вирусы и
рикеттсии) как правило, невозможно вырастить вне клетки хозяина.
Микробные механизмы преодоления защиты.
Патогенные
микроорганизмы
вырабатывают
факторы
вирулентности,
способствующие колонизации организма-хозяина и разрушению его клеток. Многие
вирусы меняют антигенные сайты (дрейф антигенов у вирусов гриппа). У бактерий для
сопротивлению деятельности системы комплимента, имеются капсулы или О-антигены
(цепи липополисахаридов), у Neisseria gonorrhoeae вырабатывается липополисахарид,
мешающий образованию мембраноатакующего комплекса. Streptococcus pneumoniae,
Neisseria meningitidis и Haemophilus influenzae продуцируют капсулу, затрудняющую
фагоцитоз макрофагами. У Streptococcus рyogenes синтезируется М-протеин для защиты
от фагоцитоза.
Адгезины.
Молекулы адгезии способствуют прикреплению к эукариотическим клеткам,
облегчая
внедрение
в
ткани
хозяина.
Инфицирование
начинается
с
процесса
неспецифической агрегации на основе гидрофобного взаимодействия. Многие адгезины
специфичны к тканям, например клетки уропатогенного штамма E. coli связываются с
клетками мочеполовых путей, а Vibrio cholerae с клетками ЖКТ. Факторы прикрепления
можно разделить на адгезины фимбрий и нефимбриальные адгезины. Адгезины
фимбрий образуют гибкую тонкую нить на конце фимбрий. Адгезины способны
распознавать рецепторные молекулы на клетках эукариот, обеспечивая специфичность
взаимодействия.
Инвазины.
Факторы вирулентности, участвующие в процессе инвазии, получили название
инвазинов. Это является обязательным условием жизни облигатных внутриклеточных
паразитов, обитающих и размножающихся только внутри клеток хозяина (Chlamydia,
Rickettsia). На первом этапе происходит прикрепление к клетке хозяина, часто путем
связывания с рецепторами хозяина, участвующими в передаче сигнала. На втором этапе
патогены проникают в клетку, используя сигнальные молекулы, стимулирующие
фагоцитоз. Например, Salmonella typhimurium производит белок Inv-A, который способен
связываться с рецептором фактора роста эпидермиса и активировать ассоциированную с
микротрубочками протеинкиназу, которая активирует фосфолипазу А2, после чего
происходит открытие кальциевых каналов, мембраны сморщиваются и происходит
поглощение бактерии.
5
Капсулы.
Поверхностные полисахаридные структуры – характерный элемент защиты многих
внутриклеточных патогенов. Капсула может противодействовать активации системы
комплимента, комплекс C3Bb не может сформироваться на поверхности капсулированной
бактерии. Другой механизм – имитация капсулой молекулярных структур хозяина.
Капсулы типа K1, состоящие из полимера сиаловой кислоты и характерные для E. coli и
Neisseria meningitides, сходны по строению с компонентом эмбрионального «адгезина»
нервных клеток.
Защитные комплексы.
Молекулы бактериальной поверхности могут предотвращать связывание бактерий
с
фагоцитарными
клетками
и
компонентами
комплемента.
Антифагоцитарные
компоненты Streptococcus pyogenes блокируют отложение на них опсонизирующего белка
C3b. Супероксиддисмутазы и каталазы бактерий обеспечивают детоксикацию активных
форм кислорода в фаголизосомах. Некоторые протеазы специфически разлагают белки
комплемента.
Также
обнаружены
белки,
специфически
связывающие
иммуноглобулины,бактерии поселяющиеся на слизистых могут выделять IgA-протеазу,
расщепляющую секреторный IgA. Оригинальный механизм передвижения с помощью
полимеризации актиновых нитей хозяина отмечен у некоторых бактерий (Рисунок 1).
Рисунок
1.
А.
Трансмиссионная
электронная
микрофотография
Lysteria
monocytogenes в макрофаге хозяина. Бактерия полимеризует актиновые нити для
продвижения в цитоплазме и между клетками. Б. Burkholderia pseudomallei (окрашена
красным) также формирует актиновые хвосты (окрашены зеленым) для продвижения
(конфокальная микроскопия) [Joanne M. Willey et al. 2008].
6
Токсичность как свойство патогенных микроорганизмов.
Бактериальные токсины можно разделить на 2 основных группы: Экзотоксины
(АВ-токсины,
специфические
экзотоксины,
мембран-разрушающие
токсины,
суперантигены) и Эндотоксин некоторые их особенности представлены в таблице 1.
Таблица 1. Сравнительные характеристики экзо- и эндотоксинов.
Характеристика
Экзотоксины
Эндотоксины
Химический состав Белки, часто двухкомпонентные Липополисахаридные комплексы
Примеры
(А+В)
внешней мембраны
Ботулизм, дифтерия, столбняк
Грам-отрицательные
заболеваний
инфекции,
менингококкцемия.
Эффекты
Очень разнообразны
Общие для всех эндотоксинов
Лихорадка
Обычно нет
Есть,
причина
–
индукция
интерлейкина-1 и ФНО.
Генетика
Часто
переносятся Синтезируются генами бактерий
внехромосомными
факторами,
например плазмидами
Термостабильность Чувствительны
к
нагреванию, Стабильны при нагревании до
инактивируются при 60-80 ºС
Иммуный ответ
Иммунитет
250 ºС
обеспечивается Слабоантигенны
антитоксинами,
высокоантигенны
Локализация
Экскретируются
из
живых Часть мембран грам- бактерий
клеток
Продукция
Продуцируются грам+ и грам- Обнаружены
бактериями
бактериях,
только
в
грам-
выделяются
при
гибели клеток
Токсичность
Высокотоксичны, смертельны в Менее
количестве нанограм
токсичны
специфичны,
могут
и
менее
вызывать
септический шок
Получение
Изменением
структуры, Невозможно получить токсоиды
токсоидов
сохранение антигенных свойств
с утратой токсичности, можно
7
использовать для иммунизации
(противостолбнячная сыворотка)
Экзотоксины.
Растворимые, термолабильные белки, чаще продуцируются грамположительными
бактериями, их гены могут переноситься плазмидами или профагами. Наиболее опасные
известные природные вещества. Весьма иммуногены, могут продуцировать антитоксины
(Антитела).
АВ-токсины.
Состоят из 2 компонентов: ферментная субъединица А и транспортная В. Один из
механизмов проникновение токсической субъединицы А в клетку: В-субъединица создает
пору через которую проникает А-токсин.
Пример: дифтерийный токсин (А-В) связывается с клеточным рецептором, образуя
пузырек, А входит в пузырек, А и В разъединяются и токсин попадает в клетку. Далее
происходит перенос АДФ-рибозы на EF2-фактор транскрипции, что ведет к прекращению
синтеза белка. Таким образом дифтерийный токсин оказывает токсическое действие на
рибосомы, блокируя синтез белка, что вызывает гибель клетки.
Специфические экзотоксины.
Нейротоксины (ботулотоксин, Bacillus cereus), энтеротоксины (холерный токсин),
цитотоксины, мембрана-разрушающие экзотоксины.
Экзотоксины, формирующие канал в цитоплазматической мембране (цитолизины
или гемолизины). Образующийся канал, нарушает целостность мембраны, что приводит
к лизису и гибели клетки. Обычно мало специфичны по отношению к разным типам
клеток.
Экзотоксин – фосфолипид-гидролизующая фосфолипаза нарушает целостность
мембраны. Токсин отделяет полярные группы фосфолипидов, дестабилизации мембраны
ведет к гибели клетки.
Суперантигены. Бактериальные и вирусные белки, провоцирующие выброс
цитокинов у части Т-клеток. Стафилококковый энтеротоксин В проявляет активность в
нанограммах. Выброс цитокинов провоцирует повреждение эндотелия, шок и нарушение
работы внутренних органов.
Эндотоксины.
Грамотрицательные
бактерии
в
составе
внешней
мембраны
имеют
липополисахариды, которые могут быть токсичными для хозяина. Компоненты мембраны
8
высвобождаются при гибели клеток, образуются эндотоксины. Их общие свойства:
термостабильность, токсичность (в нанограммах), слабая иммуногенность, общая
схожесть, общие эффекты (жар, шок, свертывание крови, воспаление, гемморагия,
фибринолиз). Эндотоксины грамотрицательных МО вызывают лихорадку, воздействуя на
макрофаги, которые выделяют эндогенные пирогены, воздействующие на гипоталамус.
Один из тестов на эндотоксины LAL (Limulus amoebocyte assay), чувствительность –
нанограммы.
Рисунок 1. Различия в эффектах экзотоксинов и эндотоксинов [Joanne M. Willey et
al. 2008].
Факторы распространения.
Многие полипептиды, вырабатываемые патогенами, не являются токсинами, но
способствуют распространению бактерий в организме хозяина. Например, стафилокиназа,
продуцируемая Staphylococcus aureus может растворять фибриновую сеть. Фермент
стрептокиназа Streptococcus pyogenes расщепляет плазминоген с образованием плазмина,
который расщепляет фибрин.
Регуляция генов вирулентности. Островки патогенности.
Участки генома бактерий, кодирующие антигены вирулентности – островки
патогенности (ОП). В ходе эволюции и горизонтального переноса генов факторы
9
вирулентности часто организуются в «островки вирулентности». Возможно наличие
нескольких таких структур у одного патогена. По краям последовательности ОП (3` и 5`)
содержатся инсерционные элементы. Состав таких ОП (содержание G+C пар, %) может
значительно отличаться от состава общей бактериальной ДНК.
Пример – гены кодирующие синтез специфических белков. Одна из наиболее
изученных систем секреции вирулентных белков у Yersinia pestis (бубонная чума) и
Yersinia enterocolitica (гастроэнтерит). У них в ОП кодируются белки инжектисомы и
некоторые другие. Инжектисома состоит из базального тела (схожее со жгутиком
образование, включающее много схожих субъединиц) и иглы.
Рисунок 1. Гены системы секреции III (TTSS) и другие гены вирулентности в pYV
плазмиде бактерий Yersinia. TTSS гены, кодирующие внешние протеины Yersinia (Yop),
гомологичны генам, кодирующим многие флагеллярные белки. эндотоксинов [Joanne M.
Willey et al. 2008].
10
Рисунок 1. Строение базальной части инжектисомы. Подобно жгутику, TTSSинжектисома заякорена в мембране с помощью базального тела [Joanne M. Willey et al.
2008].
Рисунок 1. Образование поры в клетке-мишени
эндотоксинов [Joanne M. Willey et al. 2008].
11
с помощью инжектисомы
Рисунок 1. Микрофотография инжектисомы, полученная с помощью сканирующей
туннельной электронной микроскопии, показано закрепление инжектисомы в мембране
клетки-мишени эндотоксинов [Joanne M. Willey et al. 2008].
Инжектисома работает как АТФаза, перенося ряд белков патогена через пору.
Перенос
осуществляется
по
центральному
каналу
инжектисомы.
«Островки
патогенности» усиливают вирулентность и отсутствуют у непатогенных видов, у
энтеропатогенных E. сoli присутствуют гены, которых нет у комменсалистической формы.
Недавно было обнаружено, что небольшие участки генов, названные «островки
суперантигенной патогенности» (SaPIs) могут использовать белки бактериофагов для того
чтобы покинуть геном стафилококков, упаковать себя в компактные частицы и покинуть
зараженную
бактериальную
клетку.
Открытие
сделано
международной
группой
исследователей под руководством José R. Penadés из Centro de Investigatiòn y Tecnologia
Animal in Segorbe, Castellón, Spain).
Возникновение устойчивых к антибиотикам форм патогенов.
Факторы антимикробной активности.
Активность антибиотиков зависит от ряда факторов:

Путь введения (парентеральный/оральный).

Токсичность и доза антибиотика.

Доступ антибиотика к патогену (сгустки крови и другие структуры могут
затруднять доступ).

Чувствительность патогена.
12
Некоторые типы инфекций, характеризуются медленной репликацией патогенов,
что снижает эффективность антибиотиков. Распространение устойчивых патогенов –
одна из главных проблем здравоохранения. В 2002 в США отмечено появление
Streptococcus aureus устойчивого к метициллину и ванкомицину, нечувствительного также
к ципрофлоксацину, метициллину, пенициллину. У пациента – носителя нового штамма,
также обнаружены энтерококки, носители гена устойчивости, они в результате
конъюгации передали ген стрептококку.
Рисунок 1. Предполагаемая схема возникновения «супермикроба» Staphylococcus
aureus эндотоксинов [Joanne M. Willey et al. 2008].
Устойчивость приобретается патогенами несколькими путями. Механизм не
является уникальным для данного типа антибиотика.
1. Предотвращение доступа. Многие патогены предотвращают попадание
антибиотика в клетку. Микобактерии устойчивы благодаря миколиновым кислотам в
наружном липидном слое, многие грам- не чувствительны к пенициллину, т.к. он не
может преодолеть внешней мембраны.
2. Выделение антибиотика. Выкачивание антибиотика из клетки, ферменты
транспорта неспецифичны и обеспечивают устойчивость ко многим лекарствам, многие
работают по типу лекарство/протон антипорт.
3. Разрушение антибиотика.
13
4. Модификация антибиотика. Химическая модификация. Пример – разрезание
пенициллиназой
бета-лактамного
кольца.
Хлорамфеникол
деактивируется
при
ацетилировании гидроксильных групп .
5. Изменение чувствительности мишени антибиотика. Пример – изменение 23S
субъединицы РНК, Энтерококки меняют терминальную группу пептидогликана, фермент
метаболизма парабензойной кислоты с низкой аффинностью к сульфаниламидам.
Рисунок 1. Схема генетических механизмов переноса генов устойчивости.
Показана бактериальная конъюгация, трансформация фрагментами ДНК и трансдукция
фагами [Joanne M. Willey et al. 2008].
Происхождение и перенос устойчивости.
14
Основной источник – спонтанные мутации в бактериальной хромосоме. Перенос
генов устойчивости осуществляется Р-плазмидами,
плазмидами, возможен перенос нескольких генов
одновременно. Гены устойчивости могут быть локализованы в других элементах. Многие
транспозоны переносят такие гены, часто ассоциированные группы генов. Единица
переноса – интегрон:: интегразный ген + группа генов чувствительности.
Факторами, способствующими появлению устойчивых форм, являются:
1. Наружное применение антибиотиков в местах высокой частоты контактов
между людьми (общежития, детские сады, школы, тюрьмы).
2. Внутренне применение антибиотиков в лечебных учреждениях.
3. Применение антибиотиков при выращивании с/х животных.
Рисунок 1. Схема формирование
формирование устойчивой к антибиотикам популяции
микроорганизмов.
Ситуация с возникновением новых устойчивых форм патогенов продолжает
ухудшаться. Ведется
едется поиск новых антимикробных средств, используя моделирование при
помощи трехмерных моделей молекул-мишеней.
молекул мишеней. Сиквенс и анализ геномов патогенов
помогает находить новые цели. Перспективны также исследования бактериофаг
бактериофагов.
Меры противодействи
ротиводействия включают:

использование больших доз для уничтожения чувствительных бактерий и
большинства спонтанных мутантов;

использование 2-33 средств;

использование
антибиотиков
широкого
необходимости.
15
спектра
только
при
крайней