Комплекты реагентов для выявления ДНК возбудителя чумы

117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, к.6
Тел./факс +7 (495) 980-45-55
Е-mail: help@dna-technology.ru
www.dna-technology.ru
Комплекты реагентов для выявления ДНК возбудителя чумы
(Yersinia pestis) методом полимеразной цепной реакции
(ПЦР)
Yersinia pestis pla
Yersinia pestis caf1
Информация о комплектах
Назначение:
Комплекты реагентов предназначены для выявления ДНК возбудителя чумы (Yersinia pestis) в биологическом
материале человека, в материале от падших и больных животных, в клещах, эктопаразитах и др.
Комплект реагентов YERSINIA PESTIS PLA предназначен для выявления последовательности гена pla (плазмиды
pPst).
Комплект реагентов YERSINIA PESTIS CAF1 предназначен для выявления последовательности гена caf1
(плазмиды pFra).
Для выявления Yersinia pestis необходимо использование обоих комплектов реагентов, т.к. одновременное
определение двух ДНК-мишеней позволяет обнаружить штаммы Y.pestis, лишенные одной из указанных
видоспецифичных плазмид (pFra или pPst).
Метод:
Полимеразная цепная реакция с детекцией результатов в режиме реального времени; качественный анализ.
Материал для исследования:
Отделяемое из язв, пунктат из бубонов, мокрота, кровь, фекалии, биоптаты; материал от падших и больных
животных; клещи; эктопаразиты и др.
Выделение ДНК:
Рекомендуется комплект реагентов для выделения ДНК ПРОБА-ГС (ООО «НПО ДНК-Технология»).
Особенности комплектов:
Внутренний контрольный образец (ВК) – присутствует в каждой пробирке с амплификационной смесью,
необходим для контроля прохождения полимеразной цепной реакции.
В зависимости от способа детекции результатов амплификации комплекты реагентов для ПЦР-амплификации
выпускаются в двух форматах:
«Flash» – предназначен для детекции результатов ПЦР после окончания амплификации с использованием
детектора флуоресцентного.
«Real-time» – предназначен для детекции результатов ПЦР во время амплификации с помощью амплификаторов
детектирующих.
Приборное обеспечение:
Формат «Flash»
Термостат программируемый для проведения ПЦР анализа четырехканальный «Терцик» (ООО «НПО ДНКТехнология»);
Детектор флуоресцентный «Джин» (ООО «НПО ДНК-Технология»); версия программного обеспечения не ниже
3.3, рекомендуемая версия 4.4.0.10
или «Джин-4» (ООО «НПО ДНК-Технология»); версия программного обеспечения не ниже 4.4.0.8, рекомендуемая
версия 4.4.0.10.
Формат«Real-time»
Амплификаторы детектирующие (ООО «НПО ДНК-Технология») ДТ-322, ДТлайт1, ДTпрайм2 и ДТ-96; версия
программного обеспечения не ниже 7.3, рекомендуемая версия 7.3.5.573
или амплификатор iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories).
Внимание! Возможность использования других амплификаторов необходимо уточнить у представителя
компании.
1
– только модели 4S1; 4S2; 5S1; 5S2; 6S1; 6S2.
– только модели 4M1; 4M3; 4M6; 5M1; 5M3; 5M6; 6M1; 6M3; 6M6.
– по мере обновления программного обеспечения рекомендуемая версия ПО может измениться. Последнюю
рекомендуемую версию ПО можно скачать на сайте компании «ДНК-Технология»:
http://www.dna-technology.ru/support/
2
3
Количество определений:
48
Состав комплектов










Реактив
Состав комплекта YERSINIA PESTIS PLA
Смесь для амплификации «Yersinia pestis ген pla»,
запечатанная парафином
20 мкл
ПЦР-буфер*
200 мкл
Раствор Taq-полимеразы
500 мкл
Минеральное масло
1,0 мл
Положительный контрольный образец
(«К+»)«Yersinia pestis pla»
75 мкл
Состав комплекта YERSINIA PESTIS CAF1
Смесь для амплификации«Yersinia pestis ген caf1»,
запечатанная парафином
20 мкл
ПЦР-буфер*
200 мкл
Раствор Taq-полимеразы
500мкл
Минеральное масло
1,0 мл
Положительный контрольный образец
(«К+»)«Yersinia pestis caf1»
75 мкл
Количество
48 пробирок
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
48 пробирок
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
1 пробирка
* – в комплектах в формате «Flash»
Каналы детекции продуктов амплификации
FAM
HEX
Rox
Cy5
Cy5.5
Yersinia pestis pla
ВК
-
-
-
Yersinia pestis caf1
ВК
-
-
-
Инструкция по применению
1.
Выделение ДНК
В результате предобработки образцов необходимо получить 0,2-0,5 мл анализируемого материала
(суспензии бактериальных клеток) в пробирке пластиковой объёмом 1,5 мл.
Полученный материал можно использовать для выделения ДНК.
2.
Подготовка и проведение полимеразной цепной реакции
Внимание! Для исследования на наличие искомых фрагментов гена pla или гена caf1 Yersinia pestis
необходимо применять соответствующий комплект для ПЦР-амплификации ДНК «YERSINIA PESTIS ГЕН
PLA» или «YERSINIA PESTIS ГЕН CAF1».
2.1.
Промаркируйте необходимое количество пробирок с запечатанной парафином смесью для
амплификации с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца – «K–» и для
положительного контрольного образца – «K+». При использовании ПЦР-детектора для учёта
результатов амплификации (формат «FLASH») промаркируйте дополнительно две пробирки («ФОН») для
контроля фона флуоресценции.
Например, необходимо проанализировать 2 образца. Нужно промаркировать 4 пробирки для
исследуемых образцов, 2 пробирки для «K-» и 2 пробирки для «К+». Общее количество пробирок – 8.
Для комплектов в формате «FLASH» нужно промаркировать дополнительно 4 пробирки «ФОН»; общее
количество пробирок — 12.
Смесь для амплификации
«Yersinia pestis ген pla»
Смесь для амплификации«Yersinia
pestis ген caf1»
Образец 1
√
√
Образец 2
√
√
«К–»
√
√
«К+» «Yersinia pestis pla»
√
-
«К+» «Yersinia pestis caf1»
-
√
«ФОН» пробирка 1*
√
√
«ФОН» пробирка 2*
√
√
* - только в формате «Flash»
2.2.
Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок «ФОН»), не повреждая слой парафина, добавьте
по 10 мкл раствора Taq-полимеразы. В пробирки, промаркированные «ФОН», добавьте по 10 мкл ПЦРбуфера.
2.3.
В каждую пробирку добавьте по 1 капле минерального масла (примерно 20 мкл), плотно закройте
пробирки.
2.4.
Для предотвращения контаминации следует перед внесением образцов открывать крышку только той
пробирки, в которую будет вноситься данный образец, и закрывать ее перед внесением следующего.
Препараты ДНК следует вносить наконечниками с аэрозольным барьером.
Внесите, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл выделенного из образцов препарата ДНК в
соответствующие пробирки для исследуемых образцов (кроме пробирок «К–», «K+», «ФОН»).
2.5.
Внесите, не повреждая слой парафина, 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего
этап выделения ДНК, в пробирки, маркированные «K–» и «ФОН». Внесите, не повреждая слой
парафина, 5,0 мкл положительного контрольного образца в пробирку, маркированную «K+».
2.6.
Центрифугируйте пробирки при 1000 об/мин (или на микроцентрифуге/вортексе) в течение 1–3 сек.
2.7.
Установите все пробирки в блок амплификатора и проведите ПЦР в режиме, приведённом в таблицах 13, с учётом объёма реакционной смеси, равного 35 мкл.
Для комплектов в формате «Real-time»: оформление протокола для ДТ-322, ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96
проводится для типа анализа «Качественный» в соответствии с инструкцией к прибору.
Таблица 1. Формат «Flash»
Программа амплификации для амплификатора «Терцик»
Алгоритм регулирования: «точный»
№ п.п.
1
Для амплификаторов с активным
регулированием
Время
Температура, °С
мин
сек
94,0
1
00
Количество
циклов
1
2
94,0
64,0
67,0
0
0
0
20
5
5
5
3
94,0
64,0
67,0
0
0
0
1
5
5
40
4
10,0
…
…
Хранение
Таблица 2. Формат «Real-time»
Программа амплификации для амплификаторов детектирующих ДТ-322, ДТлайт, ДTпрайм и ДТ-96
№ блока
Температура, °С
мин
сек
Число циклов
1
80,0
94,0
0
1
30
30
1
2
94,0
64,0
0
0
30
15
5
3
94,0
64,0
0
0
10
15
45
4
10,0
…
…
Хранение
Режим
оптических
измерений
Тип блока
Цикл
√
√
Цикл
Цикл
Хранение
Таблица 3. Формат «Real-time»
Режим амплификации для детектирующего амплификатора iCycler iQ
Cycle
1
2
3
4
5
PCR/Melt Data
Acquisition
Программа для считывания динамических факторов лунок dynamicwf.tmo
1
1
60 sec
80,0
2
1 min 30 sec
94,0
5
1
30 sec
94,0
2
45 sec
64,0
2
1
30 sec
80,0
Real Time
Программа амплификации
45
1
10 sec
94,0
2
45 sec
64,0
Real Time
…
…
10,0
storage
Repeats
Step
Dwell Time
Setpoint, Co
Примечание. При работе с комплектами в формате «Flash» готовые нормировочные пробирки «ФОН»
допускается использовать многократно при каждой детекции результатов ПЦР с реакционными пробирками из
той же серии комплекта реагентов для ПЦР-амплификации. Нормировочные пробирки следует хранить при 2-8 °С
в течение 1 месяца в тёмном месте. При проведении детекции пробирки должны иметь комнатную температуру
(18-25 °С), поэтому за 1 час до проведения детекции их необходимо достать из холодильника.
3.
Проведение детекции и учет результатов ПЦР
Формат «Flash»: регистрация и учёт результатов ПЦР проводятся с помощью детектора флуоресцентного «Джин»
или «Джин-4» согласно инструкции к прибору (пороговые значения для специфичного продукта составляют
1,75–2,10, для внутреннего контроля – 2,50).
Формат «Real-time»: регистрация и учёт результатов проводятся на приборах ДТ-322, ДТлайт, ДTпрайм и ДТ-96
или iCycler iQ в соответствии с инструкциями к приборам.
Условия хранения
Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации следует хранить при температуре 2-8 °С в течение всего
срока годности.
Срок годности комплектов - 9 месяцев с даты изготовления.
По вопросам, касающимся качества комплектов реагентов для выявления ДНК возбудителя чумы (Yersinia pestis)
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (YERSINIA PESTIS PLA и YERSINIA PESTIS CAF1), следует
обращаться к официальному представителю производителя по адресу:
ООО «ДНК-Технология», 117587, Москва, Варшавское шоссе, д.125ж, к.6
Тел./факс +7 (495) 980-45-55
E-mail: help@dna-technology.ru, www.dna-technology.ru
Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК-Технология»:
http://www.dna-technology.ru/support/
Номер: 207
21.11.11