Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России) научно-популярные материалы для школьников и школьных учителей При поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы» Соглашение на предоставление гранта от 23 октября 2012 г. № 8302 Томск, 2013 На сегодняшний день инструментарий исследователя постоянно расширяется и прочно входит в практику не только научную, но и клиническую, позволяя проводить точную лабораторную диагностику различных заболеваний. Представленная презентация позволит познакомиться с существующими современными методами исследования. В основе всех иммунологических методов лежит реакция взаимодействия антиген-антитело. Антиген – это молекула, чаще белок или полисахарид, образованная в организме или поступившая из вне, вызывающая образование специфического антитела. Антитело – это молекула, обладающая способностью избирательно связываться с антигеном. Антиген и антитело подходят друг другу как ключ и замок. К иммунологическим методам относятся: ИФА, иммунофлуоресцентная микроскопия, иммуноблоттинг, иммуногистохимия, иммунохроматография, проточная цитофлуориметрия Объектом исследования является кровь, сыворотка, ликвор. Антиген прикреплен к лунке планшета, если в исследуемом образце вносимом в лунку присутствует антитело, Исследователь видит: содержимое лунки окрасится в цвет. Окрашивание происходит благодаря ферменту, который связан с антителами против анализируемых антител. В качестве метки используют такие ферменты как: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, галактозидаза и др. Для визуального учета реакции используют хромогенные субстраты, растворы которых, изначально бесцветные, а в процессе ферментативной реакции способны приобретать окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству фермента. Так, для выявления активности пероксидазы хрена в качестве субстрата используют 5аминосалициловую кислоту, дающую интенсивное коричневое окрашивание, орто-фенилендиамин, образующий оранжево-желтое окрашивание. Для выявления активности щелочной фосфатазы и β-галатозидазы используют нитрофенилфосфаты и нитрофенилгалактозиды соответственно. Необходимое оборудование: Для отмывки необходим прибор вошер, для инкубации с антителами - шейкер, и для оценки окраски – ридер. Пример: определение титра антител к вирусу гепатита С, диагностика клещевого энцефалита. Объектом исследования являются ткани, взятые у человека (биопсия, соскоб). На ткань наносится антитело содержащее флуоресцентную метку. Если в ткани присутствует соответствующий антиген, то он светится в ультрафиолетовом свете. Необходимое оборудование: Люминесцентный микроскоп Пример: выявление возбудителя инфекций, например передающихся половым путем. Исследователь видит: Объектом исследования являются клетки, взятые у человека. На ткань наносится антитело содержащее ферментную метку. Если в ткани присутствует соответствующий антиген, то он окрашивается в цвет расщепленным с помощью фермента красителем. Необходимое оборудование: Световой микроскоп Пример: определение типа опухоли Исследователь видит: Объектом исследования является белок. В агарозный гель вносится смесь беков, после чего они разделяются с помощью электрофореза и переносятся на мембрану. Затем на мембрану наносится антитело содержащее флуоресцентную метку. Если в смеси белков присутствует соответствующий антиген, то он светится оставляя опечаток на рентгеновской пленке. Необходимое оборудование: Камера для электрофореза и трансфера (переноса) Пример: диагностика ВИЧ инфекции Исследователь видит: Объектом исследования являются любые биологические жидкости. Антитела находятся на бумажной тест-полоске. При смачивании под действием капилярных сил жидкость распределяется к противоположному концу. Если в жидкости имелись искомые антигены, то место прикрепления антител , окрашивается в цвет. Необходимое оборудование: Иммунохроматографический анализатор, для некоторых тестов оборудование не требуется, оценка проводится визуально Пример: тест на беременность Исследователь видит: Объектом исследования являются клетки. К исследуемым клеткам добавляют антитела несущие флуоресцентную метку, если соответствующий антиген имеется на поверхности либо внутри клетки, то после отмывки излишек антител, связавшиеся останутся и будут светиться. Далее клеточная взвесь поступает в проточный цитофлуориметр, где с помощью двух лазерных лучей происходит оценка размеров и свечения клеток. Необходимое оборудование: Проточный цитофлуориметр Пример: диагностика лейкозов Исследователь видит: В основе лежит свойство комплементарности нуклеиновых кислот, т.е. образования водородных связей между аденином— тимином (или урацилом в РНК) и гуанином—цитозином при взаимодействии цепей нуклеиновых кислот. Принцип метода основан на копировании участка ДНК с помощью специфических праймеров и фермента. На первом этапе под действием высокой температуры (940С) двойная цепь ДНК расходится. На втором этапе происходит присоединение специфических коротких цепочек нуклеиновых кислот к цепям ДНК. На третьем этапе фермент под названием ДНК-полимераза производит достраивание цепи, таким образом удваивая количество исследуемого фрагмента и так происходит от 30 до 40 раз, что позволяет экспоненциально увеличивать количество анализируемого фрагмента. Затем с помощью электрофореза реакционная смесь разделяется и фрагменты светятся в ультрафиолетовом свете, что позволяет их визуально идентифицировать. Пример: диагностика герпеса Отличается от классической ПЦР методом детекции продукта. С помощью флуоресцентных красителей, либо специфических флуоресцентных олигонуклеотидных меток после каждого цикла специальный прибор считывает уровень свечения и выдает исследователю график, по которому возможно оценить не только наличие продукта, так и его количество. На исследуемые клетки наносят специфический ДНК-зонд с флуоресцентной меткой, если в геноме клетки есть комплементарный этому зонду участок, то происходит их связывание. Необходимое оборудование: гибридайзер, люминесцентный микроскоп Пример: диагностика синдрома Дауна Основана на сравнении тестируемой и контрольной ДНК, меченных разными флуорохромами, которые смешиваются в соотношении 1:1 и гибридизуются на метафазных хромосомах кариотипически здорового человека. Позволяет выявлять грубые нарушения в ДНК человека. Это определение последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК. Дает наиболее полную характеристику генетического кода человека, позволяет выявлять мутации. Представляют собой подложку с множеством нанесённых молекулам белков или нуклеиновых кислот. Позволяют одновременно проводить большое число анализов в одном образце. В зависимости от нанесенных молекул механизм действия биочипов основывается либо на связывании антител с антигенами, либо на взаимодействии комплементарных цепей ДНК. Область применения биочипов от определения концентрации веществ в крови до выявления мутаций в геноме. Применение представленных методов анализа биологического материала помогает врачам прогнозировать развитие заболевания, устанавливать диагноз и оценивать эффективность проводимого лечения, а также ученым разрабатывать новые средства диагностики и способы лечения.