Физиология микроорганизмов . Питание и дыхание

«ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ.
І ЭТАП БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ »
Актуальность темы: бактериологический метод диагностики является основным
методом микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, поэтому уметь
его проводить, начиная с отбора материала для посева, и оценивать результаты должен
каждый опытный врач.
Культивирование микроорганизмов - выращивание бактериальных клеток на
питательных средах.
На питательной среде микроорганизмы растут в виде культур.
Культура - популяция клеток одного вида. Культуры бывают чистыми и
накопительными.
Чистая культура (определение) - скопление бактерий одного вида, которые
выросли на плотной или жидкой питательной среде.
Накопительная - состоит из клеток преимущественно одного вида.
Цели культивирования бактерий в медицинской практике
Культивирование бактерий, а именно бактериологический метод исследования
проводят с целью диагностики инфекционных заболеваний, выявления микроорганизмов
в окружающей среде, определение вида и варианта микроорганизмов, а также для
извлечения продуктов их жизнедеятельности - токсинов, ферментов, антибиотиков и т.п..
Чистые культуры бактерий необходимы для:
- Изучения свойств данного вида микробов.
- Определения видовой принадлежности данных микробов, т.е. для их
идентификации.
- Изготовления бактериальных препаратов: диагностических, лечебных и
профилактических.
- Использования в микробиологических экспериментах.
По способу получения чистые культуры разделяют на:
1. Одноклеточную культуру, полученная из одной исходной микробной клетки
путем прямой ее изоляции с помощью микроманипулятора. Такую одноклеточную
культуру называют клоном. Этот метод используется в научно-исследовательской работе.
2. Культура, полученная с изолированной колонии путем ее пересева в пробирку с
плотной или жидкой питательной средой. Этот метод является общепринятым. Такую
культуру можно считать одноклеточной, хотя в отдельных случаях колония может
образовываться в результате размножения не одной, а нескольких бактериальных клеток штамм.
Культивирование микроорганизмов в искусственных условиях
бывает 3 типов:
• непрерывное;
• периодическое;
• синхронное.
А) Периодическое осуществляется на питательной среде. При этом бактериальная
популяция проходит 5 фаз развития, во время которых изменяются размеры клетки,
скорость размножения, морфологические и физиологические свойства.
Б) Непрерывное: осуществляется в специальных установках - хемостатах и
турбидостатах. В них происходит постоянный приток свежей питательной среды и
выведения продуктов обмена. В таких условиях период логического роста продолжается
бесконечно долго. Непрерывное культивирование используется при изучении физиологии
микроорганизмов и биотехнологии.
В) Синхронное: осуществляется тогда, когда популяция делится одновременно,
однократно. Ее используют для изучения физиологии клеточного деления.
Основу жизнедеятельности микроорганизмов, как и всех живых существ,
составляет обмен веществ (метаболизм) - совокупность химических превращений
веществ в клетке. Он состоит из двух процессов:
1. Анаболизм (строительный обмен, ассимиляция). В результате ряда
преобразований с простых питательных веществ среды строятся сложные органические
вещества микробной клетки - процесс анаболизма, или строительного (конструктивного)
обмена.
2. Катаболизм (энергетический обмен, диссимиляция) - распад попадающих в
клетки питательных веществ.
Для анаболизма, а также для поддержания других жизненных функций (роста,
размножения, движения и др.). Микроорганизмам необходим постоянный приток энергии,
которую они получают в результате разложения попадающих в клетки питательных
веществ.
У микроорганизмов часто очень трудно разграничить энергетические процессы и
процессы, связанные не только со строительным обменом. В большинстве случаев
питательные вещества (белки, углеводы, органические кислоты и т.п.), которые
потребляются микроорганизмами, одновременно являются источником питания для
построения веществ своего тела и источником энергии.
Метаболизм
Конструктивный
(анаболизм)
Совокупность
биосинтетических реакций, в
результате которых из
низкомолекулярных
соединений образуются
клеточные полимеры
Енергетический
(катаболизм)
Расщепление при участии
ферментов крупных молекул
различных субстратов к
простым соединениям с
высвобождением энергии и
накопление ее в виде АТФ
Типы катаболизма (или энергетического метаболизма)
бактерий в зависимости от способа получения энергии
Тип метаболизма определяющие реакции, в результате которых образуется АТФ,
конечные продукты тех реакций, которые используются для идентификации
бактерий и условия культивирования бактерий
Окислительный, или
дыхание
Бродильный или
ферментативный
Процесс получения
энергии в реакциях
окислениявосстановления,
связанные с реакциями
окислительного
фосфорилирования, при
котором донорами
электронов могут быть
органические (у
органотрофов) и
неорганические (в
литотрофов) соединения,
а акцептором - только
неорганические
соединения
Процесс получения
энергии, при котором
отщепленый от
субстрата водород
переносится на
органические
соединения
Смешаный
Спиртовое
брожение
Пропионовокисло
е брожение
Мураминокислое
брожение
Маслянокислое
брожение
Молочнокислое
брожение
Гомоферментный
тип
Гетероферментный тип
Для решения конкретных задач бактериального исследования (выделение чистых
культур бактерий, определение их биологических свойств и т.п.) необходимо уметь
выращивать микробы в лабораторных условиях. Это осуществляется на питательных
средах.
Типология микроорганизмов по способам питания и получения энергии
В отличие от растений и животных, имеющих определенный тип питания
(автотрофы или гетеротрофы), прокариоты характеризуются различными типами питания.
Поэтому для характеристики их типов питания, используют 3 критерия: источник
углерода, источник энергии и донор электронов водорода.
1) По отношению к источникам углерода прокариоты делятся на две группы:
- Автотрофы - используют для биосинтеза веществ клетки углекислоты;
- Гетеротрофы - нуждаются в готовых органических угольвмесных соединениях для
синтеза веществ клетки.
2) По источнику энергии прокариоты делятся на:
- Фототрофы - используют энергию солнечного света. Синтез органических веществ из
углекислого газа и воды при участии световой энергии (фотосинтез);
- Хемотрофы - получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций
(химическим путем - хемосинтез). Для построения органических веществ своего тела с
углекислоты используют химическую энергию (хемосинтез)
3) По донору электронов прокариоты делятся на:
- Литотрофы - используют неорганические доноры электронов (H2, NH3, H2 S, CO);
- Органотрофы - используют в качестве донора электронов органические соединения
(белки, спирты, кислоты).
По трем вышеуказанным критериям выделяют 4 основных
типы питания прокариот:
- Фотолитотрофы;
- Фотоорганотрофы;
- Хемолитотрофы;
- Хемоорганогетеротрофы
Помимо углерода прокариотами необходим и азот
По отношению к источнику азота микроорганизмы делятся на:
- Аминоавтотрофы - усваивают азот из минеральных соединений;
- Азотфиксаторы - усваивают молекулярный азот воздуха и строят из него необходимые
компоненты клетки.
- Аминогетеротрофы - требуют азот готовых органических азотосодержащих
соединений.
Тип питания
Фотолитоавтотрофы
Фотоорганоавтотрофы
Хемолито-
Источник
углерода
Джерело
енергії
Донор
електронов
Представители
CO2
Свет
CO2 и
орган.
срединения
CO2
Свет
H2O
(H2S, S, H2,
Na2S2O3)
Орган. соединения
(спирты,орг.кислот
ы и др.)
Неорган.
Цианобактерии,
зеленые, серные
пурпурные
Некоторые пурпурные
Реакции
окисления
Нитрифицирующие,
автотрофы
неорганических соединения
веществ
(H2, H2S, NH3)
Органические
Хеморганогетеротрофы соединения
Реакции
окисления
неорганических
веществ
Органические
соединения
тионовые,
водородные,
ацидофильные
железобактерии
большинство бактерий
(аммонификаторы,
азотфиксаторами,
клетчаткоразрушающие,
молочнокислые,
уксуснокислые,
маслянокислые и др.)
Бактерии используют питательные вещества только в виде небольших молекул,
которые проникают внутрь клетки. Такой способ питания, характерный для всех
организмов растительного происхождения, называют голофитним. Сложные органические
вещества (белок, полисахариды, клетчатка и т.д.) могут служить источником питания и
энергии только после их предварительного гидролиза до более простых соединений,
растворимых в воде или в липоиде. Способность различных соединений проникать в
цитоплазму клетки зависит от проницаемости цитоплазматической мембраны и
химической структуры питательного вещества.
Дыхание бактерий. Аэробы, анаэробы, микроаэрофилы, капофильные
бактерии.
Окислительно-восстановительные
реакции
лежат
в
основе
главных
энергоснабжающих процессов у микроорганизмов - дыхание и брожение. Эти реакции
объединены названием биологическое окисление.
Особенностью биологического окисления является трансформация химической
энергии, которая выделяется при разрыве связей органических веществ в энергию
макроэргических связей аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). При разрыве таких
химических связей выделяется до 48 тыс. кДж энергии на 1 грамм-молекулу (кДж / моль).
Поэтому соединения, обладающие высоким запасом энергии, и их химические связи
называются макроэргическими.
Типы биологического окисления
Полное окисление - окисление органических питательных веществ к минеральным
в аэробных условиях - СО2 и Н2О.
Неполное окисление - окислении углеводов, когда наряду с Н2О образуются
промежуточные недоокисленные продукты органической природы, поэтому количество
высвобожденной энергии бывает значительно меньше.
Брожение - неполное окисление углеводов в анаэробных условиях - это
сопряженное окисление - восстановление субстрата, который используется, когда часть
вещества, поставляемого восстанавливается, а часть - окисляется.
Облигатные (строгие) анаэробы - развиваются только при отсутствии кислорода.
Факультативные анаэробы - живут как в отсутствии, так и при наличии кислорода
в среде.
Облигатные (строгие) аэробы, которые требуют для своего развития кислород.
Микроаэрофилы - развиваются при низких концентрациях молекулярного
кислорода и получают энергию только путем брожения.
Капнеичнимы называют такие микроорганизмы, которые требуют, кроме
кислорода, еще и до 10% углекислого газа. Типичными представителями последних
является возбудитель бруцеллеза бычьего типа.
Аэробное дыхание (цикл трикарбоновых кислот - ЦКТ)
В аэробных условиях пировиноградная кислота окисляется до СО2 и Н2О с
помощью серии реакций - цикла трикарбоновых кислот. В ходе ЦКТ четыре реакции
дегидрирования две реакции декарбоксилирования приводят к полному окислению
пировиноградной кислоты до углекислого газа и воды. ЦКТ функционирует только в
аэробных условиях, он связан с дыхательной цепью.
Анаэробное дыхание
В анаэробных условиях некоторые микроорганизмы получают энергию при
окислении органических веществ не кислородом воздуха, а связанным кислородом
нитратов или сульфатов. Такой способ дыхания характерен только для микрорганизмов и
они окисляют субстрат достаточно полно без доступа кислорода и получают больше
энергии, чем при брожении.
Если при анаэробном дыхании конечными акцепторами водорода являются
нитраты, процесс называют нитратным дыханием, а если сульфаты - сульфатным
дыханием.
Окисление субстратов кислородом нитратов называют денитрификацией, а
бактерии - денитрофицирующими, а кислород сульфатов - десульфатацией, бактерии десульфатуючимы.
Брожение - процесс получения энергии в анаэробных условиях, когда конечным
акцептором для отщепленных от НАД * Н2 водорода являются органические вещества, то
при брожении донорами (броженные субстраты) и акцепторами (промежуточные
продукты брожения) водорода являются органические вещества.
Конечными продуктами брожения являются возобновляемые соединения - спирты и
органические кислоты. В зависимости от вида основного из образовывающихся продуктов
брожения называется спиртовым, молочно-кислым, масляно-кислым и т.п
Спиртовое брожение - вызывают дрожжи род. Сахаромицеты, некоторые
бактерии (сарцины вентрикуло) и некоторые грибы.
Дрожжи - факультативные анаэробы. Поэтому и в анаэробных условиях они сбраживают
сахар и процесс идет в кислой среде (рН = 4-5) и побочными продуктами являются
глицерин и высшие спирты - сивушные масла. А в аэробных условиях - окисляющие
углеводы полностью в процессе дыхания, особенно при большом доступе кислорода.
Процесс подавления брожения кислородом воздуха называется эффект Пастера, который
установил, что кислород уменьшает образование этилового спирта и СО2, но способствует
активному размножению дрожжевых клеток.
Молочно-кислое
брожение.
Вызывается
молочно-кислыми
бактериями
стрептококками, лактобактериями. Все они микроаэрофилы и брожение для них
единственный источник энергии.
Маслянокислое
брожение
вызывается
облигатными
анаэробными
микроорганизмами. Способны сбраживать субстрат только в отсутствии кислорода. Он
для них - яд, т. д. В этих батериях отсутствуют цитохромы, цитохромоксидазы, каталазы,
но имеют аэробные дегидрогеназы.
Клостридии вызывают несколько типов брожений с общим признаком накоплением масляной, уксусной и других органических кислот, и еще бутилового и др.
спиртов, ацетона, водорода, метана, углекислоты. Сбраживать они могут различные
органические соединения (полисахариды, спирты, аминокислоты), и поэтому широко
распространены в природе. Они живут там, где много органических веществ и мало
кислорода - в муловых отложениях водоемов, в навозе, почве, гниющих скоплениях,
сточной воде. В почве они живут в симбиозе с аэробными бактериями. Образуют
высокостойкие группировки.
Механизмы переноса питательных веществ в бактериальную клетку
Поступление воды и питательных веществ из окружающей среды и выделение
продуктов жизнедеятельности у микроорганизмов происходит через всю поверхность
тела.
Проницаемость клеток микроорганизмов для различных веществ неодинакова и
обусловлена наличием в нормально функционирующих клетках двойного барьера клеточной стенки и цитоплазматической мембраны.
Большинство веществ питательной среды может проникнуть внутрь клетки только
при участии белков пермеаз - осуществляется перенос веществ питательной среды в
клетку путем:
- Облегченной диффузии (переноса веществ якобы по течению);
- Активного переноса.
Пассивная диффузия - перенос питательных веществ в клетку за счет разницы
концентрации по обеим сторонам цитоплазматической мембраны. Наблюдается в
основном при попадании в бактериальную клетку воды.
Облегченная диффузия - прохождение большинства растворимых веществ через
цитоплазматическую мембрану происходит за счет их захвата на внешней и перенос на
внутреннюю поверхность мембраны молекулами-переносчиками, которые называются
пермеазамы. Они характеризуются разной степенью специфичности к веществам.
Активный транспорт - прохождение против градиента концентрации, т.е.
"против течения", происходит со значительными затратами энергии АТФ, которая
выделяется в процессе метаболизма.
Транслокация радикалов - перенос химически измененных молекул, которые в
целом виде не способны пройти через цитоплазматическую мембрану. Экзоферменты
фрагментируют их в единичные радикалы, каждый из которых отдельно пермеазы
переносят через цитоплазматическую мембрану всредину клетки, где происходит
ресинтез этого соединения.
Питательные среды, классификация по назначению, требованию. Примеры
питательных сред, используемых для культивирования аэробных бактерий.
Классификации питательных сред
Существуют различные классификации питательных сред в зависимости от их
свойств и назначения.
По происхождению питательные среды бывают:
- Природные - сыворотка крови, желчь, молоко, картофель, морковь.
- Искусственные - среды, приготовленные из мясных или растительных настоек, к
которые добавляют различные азотосодержащие продукты (МПА, МПБ)
По консистенции питательные среды бывают:
- Плотные - МПА, желатин, свернутая сыворотка, белок, картошка.
- Полуплотные -0,5% МПА.
- Жидкие - МПО, пептонная вода, сахар, куриный бульен.
В зависимости от потребностей бактериологов существуют питательные
среды, которые делятся на основные группы:
Первая группа - универсальные (простые) среды. К ним относятся простые среды:
мясо - пептонный бульон (МПБ) и мясо - пептонный агар (МПА). Они пригодны для
культивирования многих видов бактерий.
Вторая группа - специальные среды. Они используются в тех случаях, когда
микроорганизмы не растут на простых. К ним относятся кровяной, сывороточный агар,
сывороточный бульон, асцитический бульон и асцит-агар.
Третья группа - селективные среды, их используют для целенаправленного
выделения и накопления бактерий из материала, который содержит много посторонних
микроорганизммов. Создавая такие среды, учитывают биологические особенности
бактерий определенного вида, которые отличают их от других. Например, элективной для
холерных вибрионов является 1% щелочная пептонная вода, среды Ру и Леффлера - для
возбудителей дифтерии, среда Плоскирева - для дизентерийных палочек. Хороший рост
стафилококков наблюдается на средах, в составе которых до 10% хлорида натрия.
Микрококки и коринебактерии растут на агаре, содержащий фуразолидон.
Добавление антибиотиков в состав питательных сред делает их элективными
относительно антибиотикоустойчивых штаммов.
Четвертая группа - дифференциально-диагностические среды. Это среды, которые
позволяют определить определенные биохимические свойства микроорганизмов и
осуществлять их первичную дифференциацию. Они делятся на среды для определения
протеолитических, пептолитичних, сахаролитических, гемолитических, липолитических и
редуцирующих свойств и т.п..
Пятая группа - специальные среды. Они специально готовятся для получения роста
тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. К ним
относятся среды для получения роста возбудителей туляремии, туберкулеза, патогенных
стрептококков.
Питательные среды готовятся по общепринятым методикам в соответствии с
рецептурой.
Готовые питательные среды должны удовлетворять все потребности обмена
веществ микробной клетки, то есть:
1) легко усваиваться;
2) содержать необходимые соли (хлорид натрия, соединения калия, натрия, магния,
кальция, марганца, кобальта и др..)
3) быть стерильными;
4) иметь оптимальную рН;
5) быть прозрачными;
6) иметь достаточную влажность (плотная питательная среда должна иметь не менее 60%
влаги);
7) содержать факторы роста различного происхождения (дрожжевой экстракт, витамины и
др.)..
Методы выделения чистых культур, основаны на биологическом принципе.
Биологический принцип разъединения бактерий предполагает целенаправленный поиск
методов, которые учитывают многочисленные особенности микробных клеток:
1) Типом дыхания (аэробы и анаэробы).
2) Способность микроорганизмов проникать через неповрежденные кожные покровы.
3) Способность к спорообразованию и термостойкости (споровые формы).
4) Устойчивость микроорганизмов к действию кислот и щелочей (микобактерии).
5) Подвижность бактерий (протей)
6) Чувствительность лабораторных животных к возбудителям инфекционных заболеваний
(пневмококки)
7) Чувствительность бактерий к действию антибиотиков, химических веществ и других
противомикробных средств (менингококки, бордетелы).
Условия культивирования бактерий
1 Оптимальная питательная среда.
2 Оптимальная температура.
3 Аэробные или анаэробные условия.
4 Срок культивирования.
5 Оптимальная влажность.
6 Отсутствие света.
Бактериологический метод диагностики. I этап: цель, задачи, манипуляции
Бактериологический метод исследования является важным в практической
деятельности любой микробиологической лаборатории. От правильности его выполнения
зависит определение этиологического фактора, вызвавшего заболевание, и,
соответственно, выбор тактики лечения инфекционного больного. Важность данного
метода связана прежде всего тем, что он позволяет врачу владеть информацией не только
о природе главного этиологического агента, но и о микробной ассоциации.
Чистая культура - это популяция микроорганизмов одного вида. Для выделения
чистой культуры аэробов используют методы, основанные на:
1. Механическом разъединении бактериальных клеток.
2. Действии физических и химических факторов, оказывающих избирательное действие.
3. Способности некоторых бактерий размножаться в организме.
I этап.
1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовление мазка,
окраска по Граму).
2. Посев в чашку Петри с питательной средой (универсальным, элективным, селективным,
специальным т.п.)
3. Засеяны чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате 18-20 часов при
температуре 37 ° С.
Биологический метод исследований инфекционных заболеваний
Биологические методы исследований направлены на определение наличия
токсинов возбудителя в исследуемом материале и на выявление возбудителя (особенно
при незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают
заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим
выделением чистой культуры патогена или установлением факта присутствия микробного
токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных
животных - важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера
взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения
биологических проб используют только здоровых животных определенной массы тела и
возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно,
внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, через трепанационное
отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных
прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшной полости, после гибели - кровь,
кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.
Этапы биологического метода диагностики инфекционных болезней
1. Подготовка животных к заражению. Включает следующие этапы:
Отбор лабораторного животного
маркировка
Фиксация.
2. При внутрибрюшинном введении материала животное фиксируют головой вниз
для перемещения кишечника к диафрагме. Поверхность разреза обрабатывают
дезинфицирующим раствором.
3. Вскрытие наружных покровов начинают с продольного разреза кожи от нижней
челюсти к лобку. Кожу отсепаровывают. Делают надрезы в направлении конечностей.
Отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов. При наличии в них
изменений готовят мазки-отпечатки и осуществляют посев на питательные среды.
4. Вскрытие грудной полости. Всю область вскрытия обрабатывают дезинфицирующим
раствором. Пинцетом захватывают мечевидный отросток, после чего делают продольные
разрезы. Исследуют состояние органов грудной клетки. (Отмечают наличие экссудата,
производят посев крови в среду и мазки-отпечатки с легочной ткани.
5. Вскрытие брюшной полости. Поднимают пинцетом брюшную стенку, ножницами
осуществляют продольные разрезы от диафрагмы до лобка и 2 поперечных разреза. После
этого отвлекают мышечные лоскуты и исследуют состояние органов брюшной полости.
Обращают внимание на размер, цвет, консистенцию селезенки, печени, надпочечников.
6. После завершения работы труп животного и инструменты опускают в дезраствор.