Практическое занятие №1 Тема.

Практическое занятие №1
Тема.
Структура и классификация вирусов. Особенности жизнедеятельности вирусов. Лабораторная диагностика
вирусных инфекций и ее особенности. Особенности противовирусного иммунитета
ПОЯСНЕНИЯ К ТЕМЕ
Царство Вирусы (Vira)
Подцарство ДНК-содержащие вирусы
Подцарство РНК-содержащие вирусы
Уровень морфологической организации вируса.
Неклеточная (молекулярная) форма живого организма.
Сущность понятия "вирус"?
Облигатный внутриклеточный паразит, репродукция которого происходит
только в эукаритической клетке.
Сущность понятия "вирион"?
Элементарная вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и
капсида.
Кому из ученых принадлежит приоритет от- Дмитрий Иосифович Ивановский. Вирусы открыты в 1892 году.
крытия вирусов и кто из ученых является основателем вирусологии? Когда были открыты вирусы?
Как назвал Д. И. Ивановский микроорганизмы, Фильтрующиеся организмы.
вызывавшие мозаичную болезнь табака?
Кто из ученых впервые предложил термин "ви- Мартинус Бейеринк
рус"?
Сущность понятия "дефектный вирус".
Самостоятельный вид вируса, способный к репликации только в присутствии вируса-хелпера, например вирус гепатита D (гепатита дельта).
Сущность понятия "дефектный вирион".
Микроорганизм, который утратил часть генетического материала и может
накапливаться в популяции многих вирусов во время множественного инфицирования клеток.
Сущность понятия "вироид".
• Гиперспирализованная молекула однонитевой РНК, замкнутая в кольцо.
• Молекула РНК вироида не кодирует собственных белков.
• Репродукция вироида зависит от клетки-хозяина.
• Вироид – организм-саттелит.
• Вироидам характерна наследственная изменчивость, адаптация к условиям существования.
Какие признаки положены в основу классифика- • Тип нуклеиновой кислоты.
ции вирусов?
• Тип симметрии капсида.
• Наличие или отсутствие суперкапсида.
• Особенности репликации.
• Антигенная структура.
• Тип хозяина, в котором паразитирует вирус: вирусы человека, животных,
растений и бактерий.
• Резистентность к действию физических и химических факторов.
Структурные компоненты вируса.
ДНК или РНК
Капсид
Суперкапсид (у отдельных вирионов)
Морфо-физиологические особенности, по кото- • Облигатные внутриклеточные паразиты.
рым вирусы отличаются от других организмов.
• Не имеют клеточного строения.
• Основой структуры вируса является нуклеокапсид.
• Содержат только один тип нуклеиновой кислоты – или ДНК, или РНК.
• Организмы, которым не характерен рост и бинарное деление.
• Организмы, у которых репродукция происходит по дизъюнктивному типу.
• Занимают промежуточное положение между живой и неживой материей.
• Могут кристаллизоваться, как неорганические вещества.
Основная структурная особенность вирусов, по Наличие только одного типа нуклеиновой кислоты.
которой они отличаются от других живых организмов.
Группы вирионов по особенностям морфологии.
• Простые ("голые").
• Сложные ("одетые").
Какими вариантами нуклеиновых кислот могут • Двухнитевая нефрагментированная ДНК.
быть представлены вирусные геномы?
• Двухнитевая фрагментированная РНК (Семейство Reoviridae).
• Однонитевая нефрагментированная РНК плюс-типа (Семейство
Picornaviridae).
• Однонитевая нефрагментированная РНК минус-типа (Семейство
Paramyxoviridae).
• Однонитевая фрагментированная РНК минус-типа (Семейство
Orthomyxoviridae).
• Две идентичных нити РНК плюс-типа (диплоидный геном – Семейство
Место вирусов в системе живых организмов.
Структура капсида.
Функции капсида вириона?
Что такое капсомер?
Группы вирусов по расположению капсомеров
(типы симметрии).
Сущность структурных белков вируса.
Сущность неструктурных белков вируса.
Что такое суперкапсид (пеплосома)?
Возможные способы определения размера вируса.
Форма вириона.
Биологические свойства, сближающие вирусы с
риккетсиями.
Некоторые особенности вирусов
Принципиальное отличие характера внутриклеточного паразитизма вирусов от паразитизма
риккетсий.
Причина невозможности выявления вирусов (за
редким исключением) при световой микроскопии.
Retroviridae).
• Однонитевая кольцевая РНК (дефектный вирус – вирус гепатита дельта).
Белковый слой, который окружает генетический материал. Структурной
единицей капсида является капсомер.
• Защищает вирусный геном от действия внешних факторов.
• Обеспечивает адсорбцию вириона на поверхности эукариотической
клетки за счет взаимодействия с рецепторами клетки.
• Обеспечивает проникновение (пенетрацию) вириона в эукариотическую
клетку.
Структурная единица капсида.
• Спиральный.
• Кубический / икосаэдрический.
• Комбинированный (смешанный).
Входят в состав зрелой вирусной частицы и являются составной частью
вириона.
• Обеспечивают репродукцию вируса на всех этапах.
• Не являются составной частью вириона, но присутствуют в инфицированной клетке.
Дополнительная структура, которая покрывает нуклеокапсид и является
модифицированной цитоплазматической или ядерной мембраной клеткихозяина.
• Фильтрование через мелкопористые фильтры.
• Ультрацентрифугирование.
• Фотографирование при помощи электронного микроскопа.
• Сферическая.
• Палочковидная.
• Нитевидная.
• Пулевидная.
• Кирпичеобразная.
• Полиморфная.
• Сперматозоидная.
Облигатный внутриклеточный паразитизм.
• Могут инфицировать ткани, не вызывая воспалительного процесса.
• Могут реплицироваться в клетках в течении их жизни и не вызывать их
повреждений.
• Иногда нарушают некоторые специализированные функции клеток, не
нарушая целостности организма.
• Иногда вызывают разрушение тканей, а затем полностью исчезают из
организма.
Генные паразиты.
Размеры вирусов меньше разрешающей способности микроскопа.
2
Способ репродукции вируса.
Что такое внутриклеточные включения при вирусных инфекциях?
Функции нуклеиновых кислот вируса.
Функции капсида и суперкапсида.
Механизмы уклонения вирусов от действия иммунных факторов.
Типы взаимодействия вируса с эукариотической
клеткой.
Этапы репродукции вируса при продуктивном
взаимодействии вируса с эукариотической клеткой.
Сущность персистенции вируса.
Сущность латентного состояния вируса.
Иммунитет при вирусных инфекциях (определение)
Механизмы защиты организма от вирусов.
Специфические гуморальные механизмы нейтрализации вируса.
Неспецифические гуморальные факторы защиты от вируса.
Неспецифические клеточные факторы защиты
при вирусных инфекциях.
Механизм действия интерферона.
Патофизиологические механизмы защиты при
вирусных инфекциях.
Принципы лабораторной диагностики вирусных
инфекций.
Выбор метода диагностики вирусной инфекции.
Методы лабораторной диагностики вирусных
инфекций.
Вирусоскопический метод диагностики вирусной
инфекции.
Дизъюнктивный (отдельно происходит синтез нуклеиновой кислоты и
капсида с последующей сборкой вируса).
Скопления вирусов, окруженные измененными клетками.
• Носители наследственной информации.
• Инфекционность – происходит репродукция вируса.
• Защитная.
• Антигенная.
• Формообразующая.
Антигенная изменчивость (например, антигенный дрейф и антигенный
шифт).
• Продуктивный тип.
• Абортивный тип.
• Интегративный тип (вирогения).
• Адсорбция вируса на мембране клетки-мишени.
• Проникновение вириона в клетку.
• "Раздевание" вириона и освобождение вирусного генома (депротеинизация вируса).
• Синтез вирусных компонентов: репликация генома вируса и синтез вирусных белков.
• Формирование дочерней популяции вирусов.
• Освобождение дочерних вирионов из клетки.
Характерная черта некоторых вирусных инфекций. Если в иммуноскомпрометированном организме не распознается вирус, то развивается вирусная инфекция с медленным течением и присутствием вируса в организме,
например, при гепатите В. Выход вирусов происходит путем почкования.
Встраиваясь в геном клетки, вирус не экспрессирует на мембране клетки
свои антигены.
Способ защиты генетического гомеостаза организма.
• Гуморальные.
• Клеточные.
• Патофизиологические.
IgG и IgM
sIgА
• Интерферон.
• Комплемент.
• Лизоцим.
• Ингибиторы.
• Фагоцитоз инфицированных клеток.
• Резистентность клеток в связи с потерей рецепторов.
• Регенерация резистентных к вирусам клонов клеток.
• Нарушение трансляции вирусной РНК.
• Угнетение синтеза вирусного белка.
• Барьеры (кожа, слизистые оболочки).
• Повышение температуры, ацидоз, гипоксия.
• Секреция и экскреция.
• Отторжение части цитоплазмы с вирусом.
• Внутриклеточные включения и их удаление.
• Выявление антигена (возбудителя).
• Выявление специфических антител.
Выбор метода диагностики зависит от характера вирусной инфекции,
свойств возбудителя и определяется в каждом конкретном случае в зависимости от патогенеза, периода заболевания, исследуемого материала и
возможностей лаборатории.
• Вирусологический.
• Серологический.
• Метод экспресс-диагностики.
• Вирусоскопический (с применением светового микроскопа).
• Вирусоскопический (с применением электронного микроскопа).
• Молекулярно-генетический.
Визуальное выявление вируса или внутриклеточных включений непосредственно в исследуемом материале при помощи электронной или световой
микроскопии. Микроскопия используется и при иммунофлюоресценции.
3
Вирусологический метод диагностики вирусной
инфекции.
Серологический метод диагностики вирусной
инфекции.
Молекулярно-генетический метод диагностики
вирусной инфекции.
Сущность ранней диагностики вирусных инфекций.
Сущность ретроспективной диагностики вирусных инфекций.
Экспресс-методы диагностики вирусных инфекций.
Этапы вирусологического метода диагностики
вирусных инфекций.
Биологические модели для культивирования вирусов.
Виды культуры клеток.
Что такое перевиваемая культура клеток?
Что такое полуперевиваемая культура клеток?
Выделение вируса из клинического материала путем инфицирования
культуры клеток, куриных эмбрионов, лабораторных животных с последующей идентификацией вируса.
Выявление специфических антител в сыворотке крови больного.
Выявление в клиническом материале специфических фрагментов вирусной РНК или ДНК при помощи молекулярной гибридизации или ПЦР.
Полимеразно-цепнаяреакция (ПЦР) позволяет выявить наличие в клиническом материале минимального количества специфических фрагментов
вирусной РНК или ДНК с определенной нуклеотидной последовательностью и тем самым диагностировать природу вирусной инфекции.
Проводится в первые дни заболевания путем выявления в исследуемом
материале вирусов, внутриклеточных включений, вирусных антигенов или
нуклеиновых кислот вирусов различными методами, в первую очередь,
при помощи экспресс-методов диагностики.
Дает возможность поставить диагноз в более поздние сроки заболевания
или после выздоровления. Диагноз ставится при помощи серологического
метода диагностики, определяя нарастание титра специфических противовирусных антител в парных сыворотках крови больного, взятых в первые
дни заболевания и поздние сроки заболевания.
• Световая микроскопия окрашенных мазков-отпечатков с поврежденной
ткани с целью выявления внутриклеточных включений (бешенство, герпес, цитомегалия, грипп).
• Электронная микроскопия клинического материала в препаратах, обработанных негативным контрастированием (ротавирусная инфекция, цитомегалия).
• Иммунная электроноскопия (ИЭМ) основывается на взаимодействии
вирусов, находящихся в исследуемом материале со специфическими противовирусными антителами. При этом образуются скопления вирусов,
которые значительно легче выявить, чем отдельные вирусы.
• Реакция иммунофлюоресценции (прямой и непрямой варианты) основывается на явлении люминесценции при помощи флюорохрома.
• Иммуноферментный анализ (ИФА) применяется для выявления вирусных антигенов и противовирусных антител.
• Радиоиммунный анализ (РИА) является одним из наиболее чувствительных реакций, которая позволяет выявить минимальное количество антигенов или антител в исследуемом материале.
• Иммуноблотинг позволяет одновременно определить в исследуемой сыворотке крови спектр антител к определенным белкам вирусов (их антигенным фракциям) или выявить наличие вирусных белков-антигенов в
патологическом материале при помощи диагностических сывороток (моноклональных антител).
• Накопление вируса.
• Индикация вируса.
• Идентификация вируса.
• Культура клеток (ткани).
• Эмбрионы птиц (чаще куриные эмбрионы).
• Организм лабораторных животных.
•Первично-трипсинизованные (неперевиваемые).
• Полуперевиваемые.
• Перевиваемые.
• Культура клеток, которую готовят из эмбриональных и опухолевых тканей.
• Культура клеток, которая in vitro выдерживает большое количество пассажей.
• Клетки характеризуются быстрым ростом и размножением.
• Клетки длительное время (десятки лет) сохраняют свои свойства в замороженном состоянии.
• Злокачественный характер клеток – фактор, который ограничивает использование культуры клеток.
• Соматические мутации во время многочисленных генераций – ограничивающий фактор во время применения культуры клеток.
• Культура клеток чувствительна ко многих вирусам.
• Обычно диплоидные клетки фибробластов эмбриона человека.
4
Что
такое
неперевиваемая
(первичнотрипсинизированная) культура клеток?
Результат введения вирулентного вируса в культуру клеток.
Результат введения вирулентного вируса в куриный эмбрион.
Результат введения вируса в организм подопытного животного.
Почему использование лабораторных животных
для диагностики вирусных инфекций является
ограниченным?
Способы индикации вирусов.
Типы проявления цитопатического действия
вирусов на культуру клеток при условиях частичной дегенерации клеток.
Структуры куриного эмбриона, которые используют для культивирования вирусов.
Способы инфицирования лабораторных животных.
• Клеточная система, которая сохраняет диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток в процессе 40-50 пассажей (пересеваний).
• Культура клеток, которая имеет ограниченную продолжительность жизни.
• Во время культивирования вирусов не происходит злокачественной
трансформации диплоидных клеток.
• Культура клеток, полученная из тканей и органов многоклеточных организмов: почек эмбрионов человека, обезьян, свиней.
• Дезинтеграция клеток происходит под воздействием трипсина или действия температуры (t = 37 °С или t = 4 °С).
• Клетки, которые выдерживают 5-10 пассажей после выделения из ткани.
Цитопатическое действие (ЦПД).
Гибель эмбриона.
• Развитие клинических симптомов заболевания.
• Гибель животного.
• Животным присуща видовая резистентность ко многим вирусам человека.
• Животные контаминированны другими микроорганизмами, например,
вирусами, бактериями.
• Необходимость дополнительного применения культуры клеток для получения чистой культуры вируса.
• Животные – это экономически нецелесообразная модель для исследования.
• Применение животных нецелесообразно за этическими нормами.
• Цитопатическое действие (ЦПД).
• Реакция гемагглютинации (РГА).
• Реакция гемадсорбции (РГадс)
• Образование внутриклеточных включений.
• Выявление феномена бляшкообразования.
• Применение феномена интерференции.
• Очаговая мелкозернистая дегенерация клеток.
• Гроздеподобная дегенерация клеток.
• Симпластообразующий тип.
• Трансформация клеток.
• Пролиферативный тип.
• Хорион-аллантоисная оболочка.
• Аллантоисная полость.
• Амниотичная полость.
• Желточный мешок.
• Пероральное инфицирование.
• Интраназальное инфицирование.
• Накожное инфицирование.
• Внутримышечное инфицирование.
• Внутрибрюшное инфицирование.
• Инфицирование на скарифицированную роговицу.
• Интрацеребральное инфицирование.
5
Принцип идентификации вируса.
Способы идентификации вирусов.
Вирус+специфическая иммунная сыворотка +
культура клеток.
Ингредиенты реакции торможения гемагглютинации с целью идентификации вируса.
Ингредиенты цветной пробы для идентификации
вируса.
Принцип выявления антител при вирусных инфекциях.
Ингредиенты реакции торможения гемагглютинации с целью выявления антител.
Ингредиенты реакции нейтрализации на животном с целью выявления антител.
Специальная реакция для поиска антител к отдельным белкам вируса.
Ингредиенты реакции иммуноблотинга с целью
выявления антител.
Ингредиенты иммуноферментного анализа с
целью выявления антител.
Препараты, которые применяются для специфической профилактики и иммунотерапии вирусных инфекций.
Сущность гомологичных сывороточных препаратов.
Нейтрализация вируса специфической иммунной диагностической сывороткой.
• Реакция нейтрализации цитопатического действия (РН).
• Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).
• Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс).
• РСК.
• РНГА.
• РИФ.
• Иммунная электронная микроскопия.
• Реакция радиального гемолиза.
• Реакция иммунодиффузии.
• Встречный иммуноэлектрофорез.
Реакция нейтрализации цитопатического действия.
• Исследуемый вирус.
• Специфическая иммунная сыворотка.
• Эритроциты.
• Исследуемый вирус.
• Иммунная сыворотка.
• Культура клеток в среде 199.
Нейтрализация (связывание антигенов вируса с антителами).
• Исследуемая сыворотка.
• Вирусный диагностикум.
• Эритроциты.
• Сыворотка крови больного.
• Вирусный диагностикум.
• Подопытное животное.
Иммуноблотинг.
• "Стрип" с нанесенными антигенами.
• Сыворотка крови больного.
• Антиглобулиновая сыворотка, меченная ферментом.
• Субстрат для фермента, индикатор.
• Тест-планшет (твердая фаза) с нанесенным антигеном.
• Сыворотка крови больного.
• Антиглобулиновая сыворотка, меченная ферментом (пероксидазой или
щелочной фосфатазой).
• Субстрат для фермента, индикатор.
Для активной профилактики вирусных инфекций сейчас используют вакцины:
 живые – состоят из непатогенных возбудителей как естественных (вирус коровьей оспы), так и полученных искусственно методом аттенуации вирусов;
 инактивированные – содержат полный набор антигенов возбудителя.
Для их получения вирусы инактивируют химическими препаратами
или физическими факторами, которые обеспечивают сохранение
структуры протективных антигенов и, в то же время, надежно инактивируют вирусы;
 химические вакцины – представляют собой или разрушенные вирионы (раздробленные на несколько небольших субъединиц) или поверхностные антигены вирусов, главным образом протективные антигены;
 рекомбинатные вакцины – при создании трансгенных генноинженерных вакцин в геном живых непатогенных микроорганизмов
(это могут быть дрожжевые клетки) встраивают гены, которые детерминируют синтез протективных антигенов вируса, против которого
необходимо создать иммунитет, и эти микроорганизмы начинают синтезировать соответствующие антигены. Дальше микроорганизмы разрушают, а антигены очищают и консервируют. Такой вакциной является рекомбинантная дрожжевая вакцина HBs- Аг гепатита В.
Для серотерапии и серопрофилактики вирусных инфекций могут быть
примененны препараты крови: сыворотки и гамма-глобулины.
Получают из сыворотки крови реконвалесцентов или вакцинированных
людей, например, препараты направленного действия – противогриппоз-
6
Сущность гетерогенных сывороточных препаратов.
ный, антирабический иммуноглобулины и другие. Гомогенные сывороточные препараты не являются чужеродными для организма человека, не
реактогенны.
Получают, как правило, из крови гипериммунизированных лошадей; являются чужеродными для организма человека, они имеют ряд недостатков:
• вызывают сенсибилизацию организма с развитием реакций ГНТ (анафилактический шок, сывороточная болезнь);
• имеют кратковременное действие (10 - 15 суток).
7
Дополнение 2
"Структура, классификация и особенности жизнедеятельности вирусов.
Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций и их особенности. Особенности противовирусного
иммунитета"
Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций
Вирусоскопический
Накопление
Электронная микроскопия
- Особенности вирусов, которые не культивируются: ротавирусы, вирус гепатита А,
кишечные аденовирусы и другие.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
- Выявление вирусных
антигенов в патологическом материале
Вирусологический
Индикация
І. Культура клеток
1/ первичнотрипсинизированная;
2/ полуперевиваемая;
3/ перепрививаемая.
ІІ. Куринные эмбрионы
Выявление специфических включений
тельца Гварниери
тельца Бабеша-Негри.
ІІІ. Чувствительные
животные
Идентификация
ЦПД (изменение Реакция
нейклеток под воз- трализации
действием виру- (РН) на культусов):
ре клеток
1/ очаговая деструкция;
2/ гроздеобразование;
3/ симпластообразование;
4/ трансформация
клеток.
РГадс
РГА
РТГАдс
РТГА
Болезнь и гибель
инфицированных
животных
РН на животных. Выявление
специфических
внутриклеточных включений
(например,
тельца БабешаНегри) и другие
Серологический
Исследование
парных сывороток: ИФА,
РСК, РТГА,
РПГА и другие
Молекулярногенетический
метод.
ПЦР - увеличение генетического материала вируса и его
идентификация.
Лабораторная диагностика вирусных инфекций
На первый план диагностики выступают выявление возбудителя и его идентификация. Поиск и выявление специфических изменений в организме под воздействием вируса имеют значение больше для
постановки диагноза ретроспективно.
Вирусоскопическое исследования имеет ограниченное использование в связи с тем, что размеры
большинства вирусов находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа и поэтому вирусы могут быть изучены с помощью электронной микроскопии.
Вирусологический метод диагностики инфекционного заболевания вирусной этиологии
состоит из трех этапов:
1.
накопление вируса;
8
2.
индикация (выявление) вируса;
3.
идентификация вируса.
Общим принципиальным положением во время выделения вирусу является их культивирование в живой клетке (культуре клеток, курином эмбрионе, организме животного).
Накопление и индикация вирусов в культуре клеток
Исследуемый материал, в котором возможно находится интересующий нас вирус, суспендируют в небольшом количестве культуральной
среды, фильтруют через миллипоровый фильтр с целью удаления бактерий и исследуемый материал вносят в колбу-матрац, которая содержит
монослойную культуру чувствительных клеток. Через 48 – 72 часа регистрируют появление изменений. Невооруженным глазом видна полное
или частичное разрушение монослоя и его слущивание с поверхности
колбы-матраца. Морфологические изменения клеток обнаруживают с
помощью инвертированного микроскопа.
Инфицирование куриных эмбрионов
Исследуемый
материал
вводят
в
аллантоисную или амниотическую полости, на
хорионаллантоисную мембрану или в желтковый
мешок куриного яйца. Перед инфицированием
скорлупу яйца дезинфецируют этанолом и йодом. На
овоскопе определяют границы воздушного мешка,
вскрывают его и при помощи шприца вводят в яйцо
на 2 - 3 мм ниже границы воздушного мешка 0,1 - 0,2
мл исследуемого материала. Отверстие в скорлупе
заклеивают.
Инфицированные куриные эмбрионы инкубации в термостате при t = 37 °С в течении 48 – 72
часов. После периода инкубации куриное яйцо
вскрывают. Скорлупу снова обрабатывают спиртом
и 2 % раствором йода. Куриное яйцо вскрывают
ножницами, снимают скорлупу и изучают хорионаллантоисную мембрану в месте инфицирования, отмечая геморрагии и другие поражения.
Выявление вирусов в культуре клеток
и их идентификация
Существуют первично-трипсинизированные, полуперевиваемые и перевиваемые культуры клеток.
Первично-трипсинизированные культуры клеток получают непосредственно из ткани животного или
человека путем разрушения трипсином межклеточного вещества. Полученные таким образом клетки
переносят в колбу-матрац с питательной средой, в которой они сохраняют жизнеспособность в течение
нескольких генераций, благодаря чему их можно несколько раз пассивировать (пересевать). Такие культуры клеток высокочувствительны к определенным вирусам и широко применяются в вирусологической практике.
Полуперевиваемые культуры клеток (фибробласты эмбриона человека) сохраняют диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток в процессе 40-50 пассажей и во время культивирования вирусов не происходит злокачественной трансформации этих клеток.
Перевиваемые культуры клеток способны выдерживать неограниченное количество пассажей, поскольку получены из трансформированных или опухолевых клеток.
9
По характеру роста культуры клеток делят на монослойные и суспендированные. Хорошо прикрепляются к подложке и растут в монослое эпителиальные клетки и фибробласты. Клетки крови формируют, как правило, суспендированные линии. Питательные среды, которые применяют для культур клеток, могут быть ростовыми и поддерживающими. Ростовые питательные среды содержат, наряду с другими компонентами, 5-15% сыворотки крови животных и способствуют размножению клеток, быстрому
росту и формированию монослойных культур. Для выживания клеток в уже сформированном монослое
используют поддерживающие среды, которые содержат около 2% сыворотки крови животных.
Также существует классификация питательных сред по происхождению на естественные и синтетические.
Индикация (выявление) вирусов



Цитопатическое действие (ЦПД) (индикация вирусов на культуре клеток) – это дегенеративные
изменения в клетках, которые появляются в результате репродукции в них вирусов. Характер ЦПД
зависит, в основном, от:
вида вируса;
дозы вируса;
свойств клеток и условий их культивирования.
Различают полную и частичную дегенерацию клеток монослоя.
Во время полной дегенерации происходит тотальный некроз клеток и слущивание монослоя. Таким
действием на культуру клеток обладают, например, вирусы полиомиелита и Коксаки.
Частичная дегенерация клеток имеет несколько разновидностей:
1/
очаговая деструкция – на фоне сохраненного монослоя появляются очаги дегенерации (вызывается вирусами оспы, осповакцины,
гриппа);
2/
гроздеобразование – клетки округляются, увеличиваются в
размерах, частично сливаются между собой с образованием характерных гроздеподобных скоплений (вызывается аденовирусами);
3/ симпластообразование – под действием вирусов клетки сливаются
между собой с образованием гигантских многоядерных клеток – симпластов. Это свойство является характерным признаком вирусов кори,
паротита, герпеса, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса;
4/ трансформация клеток - онкогенные вирусы способны трансформировать клетки монослойных культур с образованием фокусов пролиферации.
Внутриклеточные включения (индикация вирусов на культуре клеток) образуются во
время репродукции некоторых вирусов в цитоплазме и ядре клеток
(например, вирусов оспы, бешенства, гриппа, герпеса). Динамика их
формирования, форма, размер, субклеточная организация, наличие у
них вирусспецифических нуклеиновых кислот и белков имеют важное
диагностическое значение. Включения можно выявить во время
микроскопии микропрепаратов.
Образование "бляшек" или "негативных колоний"
10
Этот способ позволяет проводить количественное
определение вирусов. Для выявления вирусов используют
монослойные культуры клеток, которые инфицируют материалом, содержащий вирус и покрывают слоем агара с индикатором.
Колбу-матрац инкубируют при t = 37 ºС. Через 48 –
72 часа обнаруживают "бляшки", которые возникают за счет
ЦПД вируса.
Реакция гемагглютинации (РГА) (индикация вирусов на куриных эмбрионах)
После вскрытия куриного эмбриона отсасывают аллантоисную жидкость и разливают ее в ячейки планшета по 0,5 мл (для контроля берут 0,5 мл такой же жидкости незараженного эмбриона). Затем в
ячейки планшета добавляют по 0,2 мл 1 % суспензии отмытых куриных эритроцитов и инкубируют при
комнатной температуре. Учет реакции делают через 40 минут после оседания эритроцитов:
+ + + + – выраженная гемагглютинация – тонкая пленка склеенных эритроцитов на дне планшетки, которая имеет вид "зонтика";
+ + + – наличие просветов в пленке;
++
– пленка из склеенных эритроцитов имеет фестончатые края;
+
– хлопьеподобное оседание эритроцитов, которое окружено небольшим количеством агглютинируемых эритроцитов;
–
– четко очерченное оседание эритроцитов, которое не отличается от контроля.
Наличие гемагглютинации в опытных ячейках в случае ее отсутствия в контрольных ячейках указывает на содержимое вируса в исследуемой жидкости.
В случае положительной реакции гемагглютинации, то есть, если в аллантоисной жидкости есть вирус, происходит образование комплекса куриный эритроцит + вирус (гемагглютинация), который можно визуально увидеть в ячейке планшетки в виде "зонтика" за счет оседания эритроцитов.
Если вирус, который способен к гемагглютинации в аллантоисной жидкости отсутствует, то в ячейке наблюдается оседание эритроцитов с образованием ровных краев - в виде "пуговицы".
Схема положительной РГА
Реакция гемадсорбции (РГадс) (индикация вирусов на культуре клеток)
РГадс дает возможность выявить вирус до развития ЦПД благодаря появлению на поверхности инфицированной клетки вирусспецифического антигена. При этом эритроциты адсорбируются на инфицированных клетках монослоя.
Эритроциты
При микроскопии монослоя культуры клеток, на
которую нанесли вируссодержащий материал от больного, в положительном случае наблюдается эффект
гемадсорбции вследствие способности вирусинфицированных клеток адсорбировать на своей поверхности
куриные эритроциты (за счет наличия на поверхности
клеток вирусных антигенов).
При отрицательном результате (когда в материале
не было вируса) эритроциты не адсорбируются на
культуре клеток.
11
Идентификация вирусов
Идентификация вирусов осуществляется с помощью специфических противовирусных сывороток в
РН, РТГадс, РТГА, РСК и др. Эти же реакции можно применить и для серологической диагностики заболевания с целью выявления антител в сыворотке крови больного.
Реакция нейтрализации (РН)
РН основывается на угнетении цитопатогенного эффекта в культуре клеток после добавления
специфической сыворотки (антител). РН инфекционного и цитопатического действия вирусов
осуществляется на чувствительных к вирусу
живых системах и культурах клеток.
Из материала, который содержит вирус,
готовят серийные разведения и обрабатывают специфической сывороткой, после чего
этой смесью инфицируют культуру ткани,
куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем является чувствительная
система, которая инфицирована вирусом и
не обработана сывороткой. Положительной
считают РН в случае отсутствия ЦПД в культуре клеток, изменений в куриных эмбрионах,
заболевания или гибели животных. Поскольку большинство сред, которые вирусолог использует для
культивирования эукариотических клеток, содержат индикатор, оценить реакцию нейтрализации также
можно по изменению (или отсутствию) цвета среды –цветная РН.
Реакция торможения гемадсорбції (РТГадс) применяется с целью идентификации гемадсорбующихся
вирусов и определения титра антител в сыворотках крови больного.
Для постановки этой реакции используют материал после этапа индикации, специфические иммунные сыворотки и культуру клеток. На первом этапе этой реакции материал после накопления смешивают со специфическими иммунными сыворотками и такую смесь вносят в культуру клеток.
Интерпретация результатов проводится следующим образом:
Положительная реакция − отсутствие адсорбции эритроцитов на культуре клеток. Такой результат образуется в том случае, если вирус был нейтрализован антителом специфической иммунной
сыворотки. При внесении такой смеси в культуру клеток вирус уже не способен проникнуть в клетку,
не оставляет на ее поверхности специфические антигены и на поверхности клеток не адсорбируются
куриные эритроциты.
В
случае
отрицатель
тельной
реакции, в
силу
того,
что на
первом этапе не произошло нейтрализации вируса антителом иммунной сыворотки, вирус проникает в
клетку и при внесении куриных эритроцитов происходит гемадсорбция.
12
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основывается на блокировании гемагглютинина вируса антителами специфической иммунной сыворотки.
Н
а
первом этапе реакции вирусосодержащий материал смешивают
со специфическими сыворотками, а затем добавляют куриные
эритроциты.
При положительном результате реакции, то есть когда вирус нейтрализуется антителом специфической сыворотки, не происходит гемагглютинации и куриные эритроциты оседают на дно ячейки пластиковой планшетки в виде "пуговицы".
При отрицательной реакции нейтрализация вируса антителами специфической сыворотки не
происходит, потому в ячейке наблюдается эффект гемагглютинации – агглютинат в виде "зонтика ".
Иммуноферментний анализ (ИФА) стал одним из ведущих методов в экспресс-диагностике
вирусных инфекций. Чаще применяется его твердофазний сэндвич-вариант. Диагностические наборы
для ИФА содержат пластиковые планшеты с 96 ячейками, на дне которых фиксированы специфические
антитела.
При
добавлении
в
ячейку
исследуемый
материал
с
соответствующим вирусом последний
связывается с антителом. На втором
этапе в отмытые ячейки добавляют
моноклональные
или
монорецепторные
антитела
с
прикрепленными к ним молекулами
фермента (пероксидазы или щелочной
фосфатазы).
После
добавления
индикатора
и
соответствующего
субстрата, происходит изменение
цвета (от желтого до коричневому)
жидкости в результате изменения рН
(ферментации субстрата). Появляющуюся окраску анализируют при помощи спектрофотометра.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в прямом и непрямом вариантах также достаточно
широко применяется для идентификации вирусов и еще чаще для экспресс-диагностики вирусных заболеваний.
Прямой вариант РИФ, как экспресс-метод диагностики вирусных инфекций, основывается на
том, что вирусы из материала от больного обработаны иммунными сыворотками с антителами, меченными флюлорохромом, которые способны светиться в люминисцентном микроскопе.
Непрямой вариант РИФ основан на выявлении комплекса антиген (вирус) – антитело с помощью
антиглобулиновой сыворотки, меченной флюорохромом.
13
Дополнение 3
Классификация вирусов
опо
лне
ние
4
Ме
ха
ни
зм
пр
от
иов
иус
но
го
де
йс
тв
ия
ин
те
рф
ер
он
аИФ
Н(
IF
N
)
14
Д
15