Занятие 2. Лизоцимы и бета-лизины. Лизоцим. Лизосомальный

Занятие 2. Лизоцимы и бета-лизины.
Лизоцим. Лизосомальный фермент присутствует в слезах, слюне,
носовой слизи, секрете слизистых оболочек, сыворотке крови и экстрактах
органов и тканей, в молоке; много лизоцима в белке куриных яиц. Лизоцим
устойчив к нагреванию (инактивируется при кипячении), обладает свойством
лизировать
живые
и
убитые
в
основном
грамположительные
микроорганизмы.
Метод определения лизоцима основан на способности сыворотки
действовать на культуру микрококкус лизодектикус, выращенную на косом
агаре. Взвесь суточной культуры готовят по оптическому стандарту (10 ЕД)
на физиологическом растворе. Исследуемую сыворотку последовательно
разводят физиологическим раствором в 10, 20, 40, 80 раз и т. д. Во все
пробирки добавляют равный объем взвеси микробов. Пробирки встряхивают
и ставят в термостат на 3 ч при 37 °С. Учет реакции производят по степени
просветления сыворотки. Титр лизоцима — это последнее разведение, в
котором происходит полный лизис микробной взвеси.
Определение активности лизоцима турбидиметрическим методом
Основан
на способности
лизоцима,
добавленного
к ацетоновому
порошку тест-бактерий лизировать последних в одном и том же временном
интервале.
Необходимые ингредиенты — исследуемый материал (сыворотка),
ацетоновый порошок культуры М. lysodeicticus, фосфатный буфер 1/15 M
(рН 6,2).
Приготовление ацетонового порошка: тест-культуру выращивают
в течение
48
часов
при
температуре
37 °C
на агаре
Хоттингера,
суспендируют в 0,85% р-ре NaCl, трижды отмывают дистиллированной
водой, четырежды — ацетоном на холоду и высушивают при комнатной
1
температуре.
Полученный
порошок
можно
длительно
хранить
при
температуре 4−6° С.
Ход определения: измерения проводятся в калиброванных пробирках,
в каждую
из которых
вносят
1
мл исследуемого
р-ра
лизоцима
3
параллельные пробы. Контролем служит 1/15 M фосфатный буфер. Для
количественной
характеристики
лизоцима
в растыворах
с неизвестной
концентрацией строят калибровочную кривую, исходя из концентраций
фермента 2, 4, 6, 8 мкг в пробе.
Для разведения лизоцима используют стандартный р-р 200 мкг/мл.
Из него готовят исходный раствор лизоцима 8 мкг/мл. Из сухого лизоцима —
50 мг/100 мл. Для построения калибровочной кривой берут 10 пробирок.
1 и 2 — контроль без лизоцима (1 мл воды),
3 и 4 — 2 мкг лизоцима (0,25 мл лизоцима + 0,75 мл воды),
5 и 6 — 4 мкг лизоцима (0,5 мл лизоцима + 0,5 мл воды),
7 и 8 — 6 мкг л изоцима (0,75 мл лизоцима + 0,25 мл воды),
9 и 10 — 8 мкг лизоцима (1 мл исходного р-ра лизоцима).
После приготовления всех р-ров лизоцима в каждую пробирку вносят
с интервалом в 30 сек по 6 мл суспензии ацетонового порошка микрококка
в фосфатном буфере. Оптическая плотность суспензии 0,6 — 0,7.
Сразу после этого измеряют начальную оптическую плотность
растворов, через 30 минут — конечную, начиная с 1-й пробирки и делая
каждое последующее измерение через 30 сек после предыдущего.
Определение активности лизоцима нефелеметрическим методом
В этом случае об активности лизоцима судят по изменению степени
светопропускания опытной микробной взвеси микрококка по сравнению
с исходной.
2
Необходимые ингредиенты — исследуемый материал (сыворотка),
суточная культура М. lysodeicticus (штамм 2665 ГКИ им. Л. А. Тарасевича),
фосфатный буфер (рН 9,2 -7,4).
Приготовление микробной взвеси: суточную агаровую культуру
микрококка смывают фосфатным буфером (рН 9,2 -7,4), фильтруют ее через
слой ваты, стандартизуют ФЭК-56 при использовании зеленого светофильтра
(540 ммк) в кювете с рабочей длиной 3 мм. Светопропускание исходной
взвеси должно составить 20%.
Ход определения: в опытную пробирку помещают 1,47 мл взвеси
микрококка и 0,03 мл цельной сыворотки (в итоге получают разведение
сыворотки 1:50). Смесь встряхивают и выдерживают при 37 °C в течение
часа. После этого ее снова встряхивают и нефелометрируют, отмечая
показания по шкале светопропускания правого барабана. Для этого процент
светопропускания исходной микробной взвеси (20%) вычитают из процента
светопропускания испытуемой взвеси.
Для стандартизации этой методики одним была изучена зависимость
активности лизоцима от состава применяемого раствора (0,5% раствор NaCl
или фосфатный буфер), а также от экспозиции. Оказалось, что лизоцим более
активен в фосфатном буфере, где действие его проявляется уже через 30
минут, а в растворе NaCl только через 1 час.
Несмотря на большую объективность нефелометрического метода,
он не дает возможности определить количество лизоцима в граммах.
Бухарин О. В., Васильев Н. В. Лизоцим и его роль в биологии
и медицине. — ТДМПк, 1984. — 208 с.
3
Современный способ определения лизоцима.
Сконструирован рекомбинантный штамм Bacillus subtilis, несущий
плазмиду с luxAB генами грамотрицательного морского микроорганизма
Photobacterium leiognathi, перед каждым из которых интродуцирован рибосом
связывающий
сайт,
характерный
для
грамположительных
бактерий.
Полученный штамм, характеризующийся высоким уровнем трансляции
бактериальной
генов
люциферазы,
депонирован
во
Всероссийской
коллекции промышленных микроорганизмов под № B 10548. При оценке
реакции B.subtilis ВКПМ B 10548 на воздействие сывороток крови
различного компонентного состава показано соответствие подавления
биолюминесценции уровню бактерицидного эффекта, преимущественно
определяемому активностью бета лизина.
Бета-лизины и бактерицидная активность сыворотки крови.
Бета-лизины, белковая сывороточная система, обеспечивающая защиту
организма против спороносных и некоторых других. Активация бета-лизинов
на фоне повышения физиологических возможностей организма позволяет
считать эту систему индикатором физиологической нормы. В этом аспекте
изучение бета-лизинов у спортсменов является важным для выяснения их
роли в противоинфекционной устойчивости организма.
Принцип нефелометрического метода определения БАСК заключается
в том, что микробы в течение определенного времени подвергаются воздействию сыворотки при 37°С, при этом чем слабее бактерицидное дей-ствие
сыворотки, тем сильнее размножаются микробы и тем больше мут-ность
взвеси.
Реактивы. Оптическую плотность (Е) определяют на ФЭКа с использованием зеленого светофильтра. Контролем (в параллельном пучке света)
служит дистиллированная вода (кювета 3 мм).
4
Для постановки реакции используется разлитый в стерильные пробирки МПБ в объеме 4,5 мл.
В качестве тест-культуры используют 24-часовую бульонную культуру кишечной палочки или золотистого стафилококка.
Подготовка микробной культуры: смыв суточной агаровой культуры
доводится до 2 млрд. м. клеток в 1 мл стерильного физраствора на ФЭКе (по
красной шкале барабана, экстинкция должна быть 0,3). Затем 0,01 мл (1
капля) 2 млрд. микробной взвеси вносится в 4,5 мл МПБ и оставляется в
термостате на 24 ч (суточная бульонная культура). Как в опыте, так и в
контроле в пробирки вносится по 0,1 мл суточной бульонной культуры.
Ход определения. В пробирки с 4,5 мл стерильного МПБ добавляется
по 1 мл испытуемой сыворотки. Затем во все пробирки вносится по 0,1 мл
суточной бульонной культуры кишечной палочки или золотистого стафилококка. Контролем служит пробирка с МПБ, но без сыворотки. Содержимое пробирок тщательно перемешивается и стерильной пипеткой от
каждой пробы отбирается по 2 мл для измерения оптической плотности.
Смесь, оставшуюся в пробирках (МПБ + сыворотка + культура микроба),
помещается в термостат при 37ºС на 3 ч. Таким образом, получаются 2
показателя – первый характеризует оптическую плотность МПБ с культу-рой
и сывороткой сразу после смешивания и второй – оптическую плот-ность той
же смеси после 3 ч инкубации в термостате.
Расчет. В пробирках с добавлением активной сыворотки крови оптическая плотность остается на прежнем уровне или снижается. При слабой
БАСК оптическая плотность среды резко возрастает за счет накопления в ней
размножающихся микробов. В контрольных пробирках оптическая плотность
может возрастать в 3 и более раз.
Удобнее выражать БАСК в единицах угнетения роста и развития микробов, а не в показателях нарастания оптической плотности:
5
где
БАСК - усл. ед.
Еоп0 - оптическая плотность опытной пробы до инкубации;
Еоп3
Ек0
Ек3
- оптическая плотность опытной пробы через 3 часа инкубации;
- оптическая плотность контрольной пробы до инкубации;
- оптическая плотность контрольной пробы через 3 часа инкуба-
ции.
В пробирках, в которые добавляется сыворотка, происходит задерж-ка
роста микроорганизмов и оптическая плотность нарастает тем меньше, чем
сильнее выражено это действие.
6