Институт экспериментальной медицины

Институт экспериментальной медицины
Патогенные стрептококки: от генома до протеома
Санкт-Петербург
27 ноября 2013 г.
Патогенные стрептококки
стрептококки группы А
(Streptococcus
pyogenes)
Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus mutans
стрептококки группы В
(Streptococcus
agalactiae)
стрептококки групп C и G
(Streptococcus anginosus,
Streptococcus dysgalactiae
subsp. equisimilis,
Streptococcus dysgalactiae
subsp. dysgalactiae,
Streptococcus constellatus),
Геном стрептококка состоит из двух частей:
“core”-генома и “sub”-генома
Разработка методов идентификации стрептококков
Multiplex-ПЦР диагностика
стрептококковых видов
400 п.н., S. uberis
310 п.н., S. agalactiae
192 п.н., S. dysgalactiae
subsp. dysgalactiae
In situ гибридизация
S. pneumoniae в тонких
срезах легких
Разработка методов внутривидовой дифференцировки штаммов
ПЦР с «рассеянными» праймерами
(RAPD)
Электрофорез в пульсирующем
электрическом поле (PFGE)
2000 п.н.
100 т.п.н.
400 п.н.
Штаммы S. pyogenes emm1 генотипа
40 т.п.н.
Гетерогенность SmaI
рестрикционных фрагментов
ДНК S. agalactiae
Разработка методов внутривидовой дифференцировки штаммов
Метод IS-типирования
Различные паттерны гибридизации гидролизатов хромосомных ДНК S.
agalactiae с зондами на соответствующие IS элементы ISSa4 (слева),
IS1548 (в центре) и IS861 (справа)
Разработка методов внутривидовой дифференцировки штаммов
Multiplex-ПЦР анализ штаммов, отличающихся наличием
генов вирулентности и IS элементов
530 п.н. (bac)
255 п.н. (scpB)
184 п.н. (bca)
1 2 3 4 5 6 7 8
564 п.н. (ISSa4)
447 п.н. (IS861)
320 п.н. (IS1381)
217 п.н. (IS1548)
1 2
3 4 5 6 7 8 9 10
Обнаружение и характеристика прямых повторов и спейсеров
Мигрирующие генетические элементы стрептококков
«Островок» патогенности S. agalactiae
8992 п.н.
sak184 IS1167
bac
sak187
bgrS
bgrR
IS1381
Треки 1-5: штаммы, не содержащие
«островок» патогенности;
Треки 6-11: штаммы, содержащие
«островок» патогенности.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Мигрирующие генетические элементы стрептококков
Транспозон S. pyogenes, обнаруженный ранее только у S. pneumoniae
Паттерны
RAPD
Мигрирующие генетические элементы стрептококков
«Островок» патогенности S. agalactiae
Паттерны PFGE
Гены вирулентности S. agalactiae:
bca, bac, scpB, lmb, cyl, hylB, cfb, scaB, glnA
147 т.п.н.
Ген
Штаммы,
выделенные от
человека
Штаммы,
выделенные от
животных
bac
38%
3%
bca
69%
51%
scpB
100%
21%
lmb
100%
21%
158 т.п.н.
scpB,
lmb
Регуляция транскрипции генов у патогенных стрептококков
Rajagopal
et. al, 2009
Регуляция транскрипции генов у патогенных стрептококков
Разработана единая методологическая схема инактивации генов регуляторной
сети и выяснения их функциональной роли в метаболизме патогенных
микроорганизмов и проявлении ими вирулентных свойств
А) Инактивация гена-регулятора
исходный штамм
EmR pVA891-2
Em 2,5 мкг/мл
мутантный штамм
Б) Сравнительный анализ исходного и мутантного штаммов
Регуляция транскрипции генов у патогенных стрептококков
Белок-регулятор Rgg S. pyogenes
Контролирует синтез многочисленных белков
5005
Контролирует метаболизм
5005 [rgg ]
0,9
0,8
0,9
0,7
0,8
0,6
0,7
SF370 wild-ty
0,5
0,6
0,4
0,5
0,4
0,2
0,3
0,1
0,2
0
SF370 rgg
0
0,1
2
4
0
0
NZ131
NZ131 [rgg]
2
4
SF370 rgg
SF370 wild-type
0,3
6
8
6
8
Гены, регулируемые белком Rgg
SF370
(28 genes)
9
SF370
(17 genes)
0
0
0
0
CS101
NZ131
(227 genes)
2
(10 genes)
0
NZ131
1
0 0
(340 genes)
0 0
0
0
5005
(1 gene)
Гены, репрессируемые
регулятором Rgg
CS101
(3 genes)
5005
(2 genes)
Гены, активируемые
регулятором Rgg
Rgg-регулон:
“core” Rgg-регулон (speB и ко-транскрибируемый ген spy2040);
специфичный для каждого штамма “sub”- регулон.
Инактивация гена rgg приводит к изменениям в
синтезе факторов патогенности
Синтез токсина SpeB
rgg мутанты
CS101
5005
Синтез секретируемых
ДНКаз
дикий тип
SF370
мутант
Активность белка Rgg зависит от аллели гена rgg
86-858 (замена 89-ой аминокислоты)
MGAS6180
(замена 11-ой
аминокислоты)
MGAS315
(замена 103-ей
аминокислоты)
MGAS8232 (замена 227-ой аминокислоты)
Регуляция транскрипции генов у патогенных стрептококков
Двухкомпонентная система BgrR/BgrS S. agalactiae
8992 п.н.
sak184 IS1167
bac
bac
bac
sak187
bgrS
bgrR
bgrR
IS1381
Двухкомпонентная система BgrR/BgrS регулирует синтез
IgA-связывающего белка Bac
1
2
3
4
250
1
2
3
1 – исходный штамм
2 – штамм, мутантный
по гену bgrS
3 – штамм, мутантный
по генам bgrS+bgrR
150
100
88
1
5
6
4
7
150
150
100
100
Штамм дикого типа
3
Значение pI
Значение pI
4
2
5
6
7
Штамм, мутантный по генам bgrS+bgrR
Активность белка BgrR зависит от аллели гена bgrR
1
2
3
4
5
6
7
Bac
150
100
Восстановление синтеза белка Bac
в штамме с неактивной аллелью bgrR
1
Белок BgrR, кодируемый
активной аллелью bgrR
2
150
100
88
Белок BgrR, кодируемый
неактивной аллелью bgrR
ДНК-связывающий белок BgrR контролирует
вирулентные свойства S. agalactiae
100
Выжившие мыши, %
90
80
70
1 - исходный штамм
2 - штамм, мутантный по генам
bgrS+bgrR
3 - штамм, мутантный по гену bgrS
4 - контроль
60
50
40
30
20
10
0
1
0
2
4
3
5
7
6
8
10
9
Время, сутки
11
22
33
Доза возбудителя – 108 КОЕ/жив.
Количество животных в группе – 15
44
Регуляция транскрипции генов у патогенных стрептококков
Белок-регулятор MutR S. pyogenes
влияет на метаболизм
SF370 [mutR]
SF370
SF370[mutR] SF370
Белок-регулятор MutR S. pyogenes
влияет на синтез белков
SF370 SF370 [mutR]
Ингибитор комплемента SIC
Секретируемые ДНКазы
Факторы элонгации G, Tu, Ts
74
Аминопептидаза N
Энолаза
Фосфоглицераткиназа
34 (SIC)
Пируваткиназа
Орнитинкарбамоилтрансфераза
MutR контролирует вирулентные свойства S. pyogenes
РЕЗЮМЕ
- получены многочисленные фундаментальные данные об организации генома
стрептококков, и на основе этих данных обнаружены новые мигрирующие
генетические элементы, несущие гены вирулентности, и выявлены различные
генетические линии в пределах вида;
- на основании данных об организации генома разработаны разнообразные
методы и подходы для дифференцировки штаммов, выявлены генетические
маркеры для идентификации клонов-возбудителей заболеваний;
- изучена регуляция транскрипции генов и показана роль белков-регуляторов
и двухкомпонентных регуляторных систем в метаболизме стрептококков и
проявлении ими вирулентных свойств;
- многие из разработанных методов и подходов были внедрены в лабораторную
практику ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН и зарубежные научно-исследовательские
и медицинские учреждения.
Патогенные стрептококки: от генома до протеома ….
Благодарности
Сотрудникам отдела молекулярной микробиологии;
Prof. Michael Chaussee (Университет Южной Дакоты);
Prof. Yang Yonghong (Пекинский детский госпиталь);
Prof. Ivan Mikula (Университет ветеринарной медицины).