Федеральная целевая программа

14.607.21.0086
<Номер постера>
Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Науки о жизни
Тема: Разработка высокопроизводительной системы для выявления антибактериальных препаратов
Руководитель проекта: профессор Сергиев Петр
Соглашение 14.607.21.0086
на период 2014 - 2016 гг.
Владимирович
Получатель субсидии: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
"Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова
Цели и задачи проекта
Для эффективного поиска антибиотиков с одновременным эффективным и дешевым определением механизма их действия необходима система автоматизации, позволяющая вместе с
обнаружением антибактериальной активности сразу идентифицировать те соединения, которые действую на определенную мишень, в данном случае, систему биосинтеза белка.
Цель проекта: Разработка системы поиска антибактериальных препаратов–веществ-ингибиторов биосинтеза белка, основанной на генетически модифицированном репортерном штамме.
Ожидаемые результаты проекта
-Разрабатываемая Система должна позволять проводить анализ не менее 96 образцов на одной агаризованной чашке.
-Производительность разрабатываемой системы должна быть не ниже 900 образцов в сутки.
-Тестирование должно проводиться с помощью роботизированной системы, например Janus (Perkin-Elmer) или Biomek (Beckman) или аналогичной, оснащенной 96-канальной пипетирующей
насадкой.
-Должно быть проведено тестирование не менее 10 000 органических химических соединений.
Система будет основана на репортерном штамме, способном сигнализировать о ингибировании продвижения рибосомы. Обычно, применяющиеся высокопроизводительные системы
основаны на модельных реакциях in vitro, которые как правило дороги и требуют сложных схем пипетирования. Разрабатываемая система будет требовать минимального количества
пипетирований и не будет требовать дорогих реактивов. С помощью разработанной системы будет проведен тестовый скрининг большой выборки соединений, предоставленной
индустриальным партнером.
Аналогичные работы за рубежом ведутся, как уже отмечалось, с использованием дорогостоящих систем, основанных на модельных реакциях. Репортерные штаммы, разработанные за
рубежом не обладают теми характеристиками универсальности по отношению к ингибиторам биосинтеза белка, которыми обладает созданный нами штамм. Аналогичные системы способны
реагировать на предопределенные
узкие классы
известных антибиотиков и не способны выявлять новые классы соединений, объединенных мишенью - процессом биосинтеза белка.
Перспективы
практического
использования
В результате выполнения проекта будет выполнена разработка и тестирование автоматизированной системы поиска антибактериальных препаратов, ингибиторов биосинтеза белка. Эта
система будет применяться научно-исследовательским сообществом и фармацевтическими компаниями для поиска новых антибактериальных препаратов с заранее известной мишенью
действия. Без установления мишени невозможно внедрение препарата. Разрабатываемая система скрининга позволит уже на первом этапе и без дополнительных затрат выявлять не только
собственно антибактериальную активность, но и сразу определять те вещества, которые действуют на биосинтез белка. Это ускорит процедуру поиска потенциальных антибиотиков. Кроме
того, разрабатываемая система позволит находить новые классы соединений, действующих на биосинтез белка, что имеет важное значение для понимания молекулярных механизмов этого
биологического процесса. Механизмы ингибирования биосинтеза белка вызывают большой интерес у Российского и международного научного сообщества и служат основой для
многочисленных публикаций в высокорейтинговых научных журналах. Таким образом, разрабатываемая система будет востребована как учеными, занимающимися процессом биосинтеза
белка, так и фармацевтической промышленностью, проводящей разработку и внедрение антибактериальных препаратов.
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Исследован созданный набор репортерных штаммов на основе генов флюоресцентных белков RFP и CER. Мы сравнили созданный нами ранее штамм на основе триптофанового оперона
pRFPCER-TrpL2A со штаммами, созданными на основе других аттенюаторов (pRFPCER-PheMST, pRFPCER-HisLGDCBHAFI, pRFPCER-IlvLXGMEDA), промоторов (pRFPCER-pdhRaceEF, pRFPCERgadAX, pRFPCER-SulA) и РНК-сенсоров (pRFPCER-IbpAB, pRFPCER-CspA). Конструкции были протестированы в присутствии антибиотиков, ингибирующих биосинтез белка и контрольных.
Лучше всего показали себя конструкции на основе мутированного триптофанового аттенюатора. При этом оптимальным и соответствующим требованиям технического задания оказался
штамм ΔtolC, трансформированный плазмидой pRFPCER-TrpL2A.
отношение CER/RFP,
нормированное на CER/RFP
контроля
Тестирование антибиотиков на различных конструкциях
Ингибиторы биосинтеза
белка
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ery
PheMST
Cm
HisLGDCBHAFI
Kan
Tet
IlvLXGMEDA
Другие
мишени
Sm
Spm
Антибиотики
IbpAB
CspA
Rif
pdhRaceEF
Lev
Cip
Oflo
SulA
gadAX
TrpL2A
Для высокопроизводительного тестирования потенциальных антибактериальных препаратов –веществ-ингибиторов биосинтеза белка была разработана программа для ЭВМ. Мы
использовали высокопроизводительную роботизированную станцию Janus (Perkin-Elmer), находящуюся в центре коллективного пользования МГУ. Роботизированная станция управляется
программой WinPREP, позволяющей создавать программные инструкции (т.н. скрипты) и интерпретировать их. На языке программирования MultiPROBE II WinPREP Protocol Script была
создана программа, управляющая роботизированной станцией.
Партнеры проекта
Индустриальный партнер: ЗАО «Исследовательский Институт Химического Разнообразия».
ЗАО "ИИХР" - крупный негосударственный центр, выполняющий контрактные научно-исследовательские работы в области доклинических и
клинических исследований инновационных лекарственных средств для отечественных и зарубежных компаний, а также разработку лабораторных и
опытно-промышленных регламентов производства синтетических и биотехнологических препаратов.
Внебюджетное финансирование за 2015 год: предоставление ЗАО ИИХР 10 000 соединений на сумму 2 500 000 рублей
14.607.21.0086
<Номер постера>