ЦЕНТР «БИОИНЖЕНЕРИЯ» РАН
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ЦЕНТР «БИОИНЖЕНЕРИЯ» РАН На правах рукописи АНДРИАНОВА Екатерина Павловна Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений Специальность: 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 2 СОДЕРЖАНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ………………….. 4 ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………. 5 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ……………….………………………………. 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………….……………………………... 8 1. Вирус ящура……………………………………….…………………….... 8 2. Вакцины против ящура……………………………………….…………. 12 2.1 Традиционная вакцина…………………………………………..….... 13 2.2 ДНК-вакцины…………………………………………..……………... 15 2.3 Вакцины на основе ослабленных вирусов……………………….... 16 2.4 Пустые вирусные капсиды как основа для вакцины…………….... 18 2.5 Субъединичные вакцины………………………..…………………… 21 3. Антигенные сайты вируса ящура…………………………………….… 23 4. Гетерологичные системы экспрессии белков…………………………. 31 4.1 Бактериальная система экспрессии………………………………….. 31 4.2 Растительная система экспрессии…………………………………… 33 4.2.1 Трансгенные растения как система получения белков………. 35 4.2.2 Получение белков в хлоропластах…………………………….. 37 4.2.3 Транзиентная экспрессия белков в растениях………………... 39 5. Получение в растениях вакцинных белков вируса ящура……………... 48 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………………… 53 РЕЗУЛЬТАТЫ…………………………………………………………..…… 72 1. Изучение возможности получения пустых капсидов ящура в растениях…………………………………………………………………….. 72 1.1 Экспрессия предшественника капсидных белков Р1-2А в растениях N. benthamiana………………………………………………………. 72 1.2 Коэкспрессия предшественника P1-2А и протеазы 3Сpro в N. 3 benthamiana………………………………………………………………………... 78 1.3 Экспрессия индивидуальных капсидных белков вируса ящура в растениях N. Benthamianа………………………….………………….……….. 80 2. Получение полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях……………………………………………………………………. 85 2.1 Получение белка CBD-PE в клетках E. сoli…………………….……... 85 2.2 Получение полиэпитопного белка HPE в E. сoli……………………..... 89 2.3 Получение белка HPE в растениях N. benthamiana ………………..… 93 2.4 Схема получения полиэпитопного белка НРЕ из клеток бактерий и растений…………………………………………………………………. 98 2.5 Оценка иммуногенности НРЕ белка……………………………….. 101 ОБСУЖДЕНИЕ……………………………………………………………… 108 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………….. 114 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ………………… 115 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………. 116 ПРИЛОЖЕНИЯ 4 ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ В настоящей работе применяют следующие определения, обозначения и сокращения: uGFP – зеленый флуоресцентный белок НТР – нетранслируемый район мРНК ХВК – Х вирус картофеля ВТМ – вирус табачной мозаики HBc – ядерный антиген вируса гепатита В ВПЧ – вирусоподобная частица ВТЦ – вирус тристецы цитрусовых ВЖС – вирус желтухи свеклы Р1-2А – предшественник капсидных белков Р1 с пептидом 2А CBD-PE – полиэпитопный белок с хитин-связывающим доменом НРЕ - полиэпитопный белок с шестью аминокислотными остатками гистидинов 5 ВВЕДЕНИЕ Начиная с двадцатого столетия животноводство многих экономически развитых стран мира несет большие убытки от эпидемических вспышек ящура. Недавние инфекционные вспышки ящура в Тайване (1997) и Великобритании (2001) существенно усилили обеспокоенность производителей и потребителей мяса сельскохозяйственных животных во многих странах мира. Основным способом контроля возникновения вспышек заболевания ящуром в настоящее время является вакцинация сельскохозяйственных животных вакцинами на основе инактивированного вируса. Несмотря на то, что иммунизация препаратами инактивированного вируса достаточно эффективна, такие вакцины имеют ряд существенных недостатков. Наиболее серьезные из них – проблемы безопасности, связанные с возможной утечкой не полностью инактивированного вируса, а также сложность достоверного диагностического различия вакцинированного животного от заболевшего, необходимость использования специальных лабораторий для их получения и недостаточно высокая скорость получения в условиях возникновения очага заболевания. В связи с этими недостатками предпринимаются попытки разработать альтернативные вакцины против вируса ящура. В настоящее время разрабатываются методы использования в качестве вакцины фрагментов структурных и неструктурных белков вируса, например структурного белка VP1 или пустых вирусных капсидов, ослабленных вирусов, например с делецией участка капсидного белка VP1 или протеиназы Lpro. Такие вакцины не имеют некоторых недостатков традиционных вакцин, однако на сегодняшний день они менее эффективны по сравнению с вакцинами, созданными на основе инактивированного вируса. Поэтому задача получения альтернативной вакцины против ящура остается актуальной. 6 В настоящее время перспективной и представляющей огромный интерес для биотехнологических компаний системой получения белка является растение. Главными преимуществами использования растений для получения белка являются низкая конечная стоимость и биобезопасность продукта вследствие отсутствия у растений и животных общих патогенов. Рекомбинантные белки в растениях могут быть получены двумя методами: с помощью генетической трансформации или транзиентной экспрессии с помощью вирусных векторов. Создание трансгенного растения, а значит и получение белка из него, требует значительных временных затрат. Уровень экспрессии целевых белков трансгенными растениями обычно низок, что определяет высокую стоимость продукта вследствие сложности его очистки. Получение белка с использованием фитовирусной системы транзиетной экспрессии в растениях имеет ряд преимуществ; в первую очередь более высокий уровень экспрессии, биобезопасность и короткое время, необходимое для создания и тестирования экспрессионной системы. Настоящая работа посвящена получению вакцинных белков вируса ящура, способных индуцировать иммунный ответ у лабораторных животных, способный защищать их от заболевания ящуром, и разработке систем экспрессии этих белков в бактериях и растениях. 7 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ Целью работы являлось конструирование рекомбинантных вакцинных белков вируса ящура и разработка систем их экспрессии в бактериях и растениях. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1. Создание систем транзиентной экспрессии предшественника капсидных белков Р1 и 3С-протеазы или отдельных капсидных белков вируса ящура (изолята O/Тайвань/99) в клетках растений Nicotiana benthamiana с помощью фитовирусных векторов; 2. Конструирование рекомбинантного гена, кодирующего искусственный белок НPE, содержащий набор иммуногенных В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура О-серотипа 3. Создание систем экспрессии белка НРЕ в клетках Escherichia coli и в растениях Nicotiana benthamiana; 4. Проверка иммуногенных свойств выделенных из клеток бактерий и растений препаратов белка НРЕ на лабораторных животных. 8 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1. Вирус ящура Первое письменное упоминание о болезни, похожей на ящур, появилось в шестнадцатом веке в Италии, где описывается заболевание крупного рогатого скота. На заре становления вирусологии, в конце девятнадцатого века, было показано, что, инфекционным агентом ящура является патоген, способный проходить через бактериальный фильтр. Впоследствии, было показано, что этим патогеном является вирус, названный вирусом ящура. Серологическими методами удается различить семь серотипов вируса: А, О, С, Азия-1, SAT (Территории Южной Африки) -1, -2 и -3. Также установлено более 60 подтипов вируса. На территории стран СНГ обычно встречаются вирусы серотипов О и А. Вирус ящура является типовым представителем семейства Picornaviridae, рода Aphtovirus. Его геном представлен однонитевой линейной (+) РНК размером около 8500 нуклеотидов (схема генома вируса представлена на Рис. 1). Вирус имеет икосаэдрический капсид, составленный из четырех структурных белков - VP1, VP2, VP3 и VP4. Ранние исследования вируса ящура с использованием обработанного трипсином вируса или химически очищенных вирусных белков показали важность капсидного белка VP1 в антигенной и иммуногенной активности вируса (Wild et al., 1969; Bachrach et al., 1975). В 80-х годах было установлено, что иммунизация морских свинок (Bittle et al., 1982; Pfaff et al., 1982) и крупного рогатого скота (Di Marchi et al., 1986) фрагментами белка VP1, которые соответствуют 141-160 (или 141-158) аминокислотным остаткам и находятся в так называемой G-H-петле, приводила к выработке антител и в некоторых случаях к защите от заболевания. Позднее было 9 показано, что G-H-петля белка VP1 присутствует у всех серотипов вируса ящура (Borrego et al., 1995; Mateu et al., 1995), но является высоковариабельным участком, что объясняет низкую кросс-реактивность между разными серотипами вируса (Feigelstock et al., 1992; Mateu et al., 1994). Эти данные позволили сформулировать утверждению, что G-H-петля белка VP1 является иммунодоминантным антигенным сайтом. Однако, системный иммунный ответ, вызываемый заболеванием или вакцинацией, никогда не исследовался достаточно тщательно, чтобы подтвердить это. Для проникновения в клетку вирус использует два класса рецепторов на ее поверхности. Инициация трансляции вирусной РНК происходит на последовательности внутреннего сайта посадки рибосом (IRES) (Belsham et al., 1990; Kuhn et al., 1990). В результате трансляции образуется белокпредшественник 240-250 кД, который подвергается последовательному расщеплению до функционально активных структурных и неструктурных белков. Протеаза Lpro автокаталитически выщепляется из полипротеинапредшественника. После этого Lpro участвует в подавлении синтеза хозяйских белков в инфицированной клетке путем протеолиза клеточного фактора инициации трансляции, подавляя таким образом cap-зависимую трансляцию (Devaney et al., 1988; Kirchweger et al., 1994). Область P1 кодирует белки оболочки вируса: VP4, VP2, VP3 и VP1. Предшественник P1 процессируется протеазой 3Сpro с образованием 3 белков: VP0, VP3 и VP1. Расщепление VPO на VP4 и VP2 происходит при сборке капсида. Для этого необходимо взаимодействие структурных белков с вирусной РНК. Расщепление VPO на VP4 и VP2 происходит автокаталитически и необходимо для образования инфекционного вируса. Белки VP1, VP2 и VP3 стыкуясь между собой, образуют поверхность капсида, в то время как миристилированный по N-концу белок VP4 погружен внутрь капсида. Сборка капсида начинается с образования протомеров белками VP0, VP1 и VP3. 5 протомеров формируют пентамеры, а 12 10 пентамеров образуют капсид вируса. Вирус ящура, как и ряд других пикорновирусов, способен формировать пустые капсиды, идентичные по своим антигенным свойствам интактным не содержащим РНК вирионам. Такие частицы менее стабильны, при этом в составе капсида содержится непроцессированный белок VP0 вместо белков VP2 и VP4 (Rweyemamu et al., 1979; Basavappa et al., 1994). Рис. 1. Схема генома вируса ящура Область P2 кодирует неструктурные белки 2B и 2C и пептид 2А. Пептид 2A автокаталитически выщепляется из состава полипротеина P2 и остается связанным с предшественником капсидных белков P1. Функция белка 2B достоверно не установлена, а белок 2С имеет нуклеозидтрифосфатсвязывающие (Klein et al., 1999; Pfister et al., 1994) и хеликазные мотивы (Klein et al., 2000). 11 Область P3 также кодирует ряд неструктурных белков, в числе которых протеаза 3Cpro и РНК-зависимая РНК-полимераза вируса 3Dpol. После трансляции вирусная РНК служит матрицей для образования (-) цепи РНК, синтез которой происходит при помощи 3Dpol. Затем происходит синтез (+) цепей РНК и образование вирионов (Harber et al., 1991; Nugent et al., 1999). Зрелые вирионы освобождаются из клетки при ее разрушении путем лизиса. Основной причиной распространения ящура является международная торговля домашними животными. Вспышки заболевания происходят во всех странах мира, где в сельском хозяйстве используется крупный рогатый скот. Болезни подвержены все домашние парнокопытные животные. Наиболее восприимчив к заболеванию ящуром крупный рогатый скот, менее восприимчивы свиньи, овцы, козы, более 70 видов диких животных и человек. Вирус передается от заболевших животных к здоровым воздушнокапельным путем. Первые признаки заболевания могут появляться через 2-3 дня после заражения. У зараженных животных появляется жар, нарушение походки, хромота, афтозное поражение слизистой оболочки ротовой полости, кожи, вымени и межкопытной щели конечностей. Несмотря на то, что заболевание ящуром не приводит к высокому уровню смертности среди взрослых животных, оно проявляется в потери веса, резком понижении молочной продуктивности. Смертельный исход чаще происходит у молодых животных с ослабленным иммунитетом. У них наблюдаются нарушения функций сердечно-сосудистой системы и скелетной мускулатуры. Крупный рогатый скот, а также овцы и козы могут быть бессимптомными носителями вируса, приобретая при этом способность заражать других животных в течение 2-3 лет. Вспышки ящура наносят большой экономический ущерб промышленности и сельскому хозяйству. По данным Федерального Центра Охраны Здоровья Животных (Институт Ящура, г. Владимир) при эпизоотии 12 вируса серотипа О на Тайване в 1997 г. возникло более 6 тыс. очагов заболевания, пало или было забито свыше 4 млн. свиней, общий экономический ущерб составил около 10 млрд. долларов США (http://www.zzr.ru/archives/2001/06/article3/article3.html). При возникновении очагов ящура А-22 в балканских странах в 1996 г. экономический ущерб превысил 300 млн. долларов. Ликвидация очага этого заболевания в Московской области в 1995 г. обошлась в 14,6 млрд. руб. в ценах того периода (около 3,2 млн. долларов), в Приморском крае в 2000 г. — в 8,7 млн. руб. (свыше 300 тыс. долларов).В результате вспышки ящура серотипа А в 2010 году в Южной Корее, названной самой сильной в истории этой страны, уничтожено около 30% или 10 млн. голов свиней и 5% или более 3 млн. голов крупного рогатого скота. Стоит отметить что, Южная Корея считалась свободной от ящура страной после последней вспышки ящура серотипа О в 2002 году. Эта эпидемия ящура стоила Южной Корее больше 1,8 млрд. долларов США. Япония в 2010 году также понесла многомиллионные убытки вследствие вспышки ящуре серотипа О, в ходе которой было забито около 300 тыс. животных. 2. Вакцины против ящура Вирус ящура впервые был описан в 1897 г Леффлером и Фрошем. Но до 20-х гг. ХХ века, единственным способом контроля ящура был забой заболевших животных. В 30-х годах прошлого столетия в Германии была создана первая вакцина против вируса ящура. Такую вакцину получали путем инактивации «живого» вируса формалином в присутствии гидроксида алюминия. Вирус для нее получали, собирая ткани эпителия и жидкость из язв зараженных животных. Поскольку в то время не было известно других способов накопления вируса ящура, этот метод получения вакцины не мог предоставить достаточное количество материала для иммунизации, 13 необходимое для контроля заболевания. Такое положение вещей сохранялось до тех пор, пока в середине прошлого века во Франции не был разработан первый метод размножения вируса в клетках эпителия языка здоровых коров и не был налажен первый коммерческий выпуск вакцины против вируса ящура. Существенные успехи в получении вакцины против ящура стали возможны только после разработки методов культивирования вируса в культуре клеток BHK-21 (от англ. baby hamster kidney-21 cells – клетки почек новорожденных хомяков-21) в 60-х гг., начала использования этиленимина в процессе инактивации вируса и применения масляных адьювантов в 70-х гг. Инфекционные вспышки ящура недавних лет в странах, предположительно свободных от этого вируса, особенно в таких странах как Тайвань (1997) или Великобритания (2001), существенно усилили обеспокоенность производителей и потребителей мяса парнокопытных животных во многих странах мира. Это направило интерес исследователей к проблемам защиты сельскохозяйственных животных от этого заболевания и разработки методов более эффективной иммунизации. 2.1 Традиционная вакцина Вакцину, используемую в настоящее время, производят из вируса, полученного в клеточной культуре, обработкой бинарным этеленимином. В конце 90-х годов мировое производство такой вакцины составляло приблизительно 0,8-1 миллиардов доз в год (Rweyemamu et al., 1999). Программы по систематической вакцинации позволили существенно уменьшить число вспышек заболеваний ящуром. В начале ХХ века в восточной Европе каждый год происходило несколько тысяч вспышек ящура, но начало повсеместной вакцинации животных в 50-х годах привело практически к полному прекращению заболеваний животных к концу ХХ века. 14 Несмотря на относительно высокую эффективность вакцины на основе инактивированного вируса, ее использование в чрезвычайных ситуациях возникновения очага заболевания имеет ряд проблем. Вот некоторые из них: - для производства вакцины необходимы специально оборудованные лаборатории, обеспечивающие высокую биобезопасность производства, для предотвращения утечки инфекционного вируса (как это случилось в Питбрайте (Великобритания) в 2007 году (Cottam et al., 2008); - вирусные препараты, используемые для производства вакцины, представляют собой надосадочную жидкость клеточной суспензии, инфицированной вирусом ящура. Такие препараты, в зависимости от качества производства, могут содержать различное количество вирусных неструктурных белков, загрязняющих вакцину. У привитых такой вакциной животных, наряду с антителами против структурных белков вируса ящура, вырабатываются антитела против загрязняющих неструктурных белков. Присутствие антител против неструктурных белков делает сложным достоверное различие вакцинированных животных от зараженных с помощью существующих методов диагностики заболевания; - вакцина не вызывает быстрого иммунного ответа. Количество антител в крови у вакцинированных животных, способное защитить их от заражения, можно наблюдать лишь на 14-й день после вакцинации. Поэтому вакцина, вызывающая быстрый иммунный ответ, приобретает особую важность, учитывая, что репликация и распространение вируса ящура происходят очень быстро. Следовательно, в период между вакцинацией и индукцией иммунного ответа животное чувствительно к заражению ящуром; - после контакта с вирусом привитые животные могут становиться бессимптомными носителями инфекции; - недолговременный иммунитет (примерно 6 месяцев), что значительно увеличивает стоимость необходимых иммунизаций (www.iah.bbsrc.ac.uk.); 15 - вакцина нестабильна при высоких температурах, что осложняет ее транспортировку и хранение (www.iah.bbsrc.ac.uk.). Попытки разрешить эти проблемы в течение последних 30 лет привели к формированию двух основных направлений исследования. Первое включает в себя разработку новых диагностических тестов, позволяющих различать зараженное животное от вакцинированного, или усовершенствование уже существующих методов анализа. Второе состоит в создании новых вакцин, которые не требуют получения инфекционного вируса и вызывают более длительный иммунитет у животных. К разработкам второго направления относятся: ДНК вакцины, «живая» вирусная вакцина, пустые вирусные капсиды, белки и пептиды. 2.2 ДНК-вакцины ДНК-вакцины представляют собой сравнительно новый тип вакцин, принцип применения которых заключается в том, что в организм вводят препарат плазмидной ДНК, кодирующей гены белков, к которым необходимо получить иммунный ответ. В настоящее время было показано, что вакцины, на основе плазмидной ДНК, кодирующей последовательности антигенов различных вирусов, способны индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ (Lewis et al., 1999). В нескольких работах иммунизация мышей плазмидной ДНК, кодирующей последовательности вируса ящура, приводила к индукции иммунного ответа (Yang et al., 2005; Ward et al., 1997). В работе Wong et al., 2000 было показано, что иммунизация свиней плазмидной ДНК, кодирующей эпитопы белка VP1, приводила к защите животных от инфекции вирусом, хотя титр антител у иммунизированных животных был очень низким. Однако, в большинстве работ многократные иммунизации сельскохозяйственных животных большими дозами препарата плазмидной 16 ДНК, кодирующей последовательности вируса ящура, приводили только к слабому иммунному ответу и частичной защите животных от заболевания (Ward et al., 1997; Niborski et al., 2006). Несмотря на эти недостатки, ДНК-вакцины являются привлекательными, поскольку для их производства не требуется обеспечения высокой степени биобезопасности, такие вакцины стабильны при длительном хранении, позволяют быстро произвести вакцину с новой последовательностью нового подтипа вируса в случае вспышки заболевания и позволяют произвести достоверную дифференциацию заболевшего животного от привитого (Yang et al., 2005; Niborski et al., 2006). Еще одной особенностью ДНК-вакцин является то, что они способны не только вызывать иммунный ответ против клинических признаков заболевания, но и предотвращают «носительство» вируса у овец (Niborski et al., 2006). Важным свойством ДНК-вакцин является их способность усиливать действие инактивированной вакцины. Первичная иммунизация плазмидной ДНК, кодирующей капсидные и некоторые неструктурные белки вируса ящура, и вторичная иммунизация вакциной, содержащей инактивированный вирусный антиген и рекомбинантный белок 3D, приводили к выработке высокого титра антител и защите свиней не только от гомологичного серотипа вируса, но и других серотипов вируса ящура (Li et al., 2008). 2.3 Вакцины на основе ослабленных вирусов В качестве «живых» вирусных вакцин могут быть использованы ослабленные варианты вируса, утратившие патогенность в результате мутаций исходных штаммов. В некоторых случаях удается получить близкородственный слабопатогенный вирус, вакцинация которым обеспечивает иммунную защиту от более опасного вируса. Главным преимуществом «живых» вакцин является то, что они активируют 17 гуморальный и клеточный компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный иммунный ответ. Кроме того, такие вакцины относительно дешевы, так как для иммунизации требуется небольшая доза вируса, поскольку он способен размножаться в зараженном организме. Ослабленный вирус ящура, обладающий некоторой степенью иммуногенности, классическим методом получают его пассажами в нечувствительных к ящуру животных (мыши, кролики) (Bachrach et al., 1977; Brooksby et al., 1982). Однако, получение вируса, ослабленного в невосприимчивом виде животных, иммуногенностью, низкой одновременно патогенностью и обладающего инфекционного для вакцинируемого вида животных, является сложной технической задачей. Первые попытки создания вакцины на основе ослабленного вируса не имели успеха вследствие его генетической нестабильности, приводившей к возвращению вирулентности, различия патогенности к разным видам (например, ослабленные у рогатого скота, но не у свиней) или ослабления вируса настолько, что он уже не индуцировал иммунный ответ у животных (Mowat et al., 1962; Martin et al., 1965; Zhidkov et al., 1969; Mowat et al., 1969). Последнее происходило, вероятно, потому, что механизмы ослабления в значительной степени были неизвестны и вирусы для таких вакцин отбирали на культурах клеток или на лабораторных животных, которые демонстрировали ослабление вирулентности. В настоящее время для усовершенствования вакцин на основе ослабленного вируса некоторые исследователи пытаются изменить геном вируса. Так был получен вирус ящура с делецией фрагмента, кодирующего участок капсидного белка VP1 (McKenna et al., 1995), функцией которого является специфическое взаимодействие с рецептором поверхности клетки – интегрином. Вирус ящура, обладающий такой делецией, был не способен проникать в клетки. Животные, привитые такой вакциной, вырабатывали антитела аналогичные антителам, вырабатываемым против 18 инактивированного вируса ящура, и поэтому были полностью защищены от инфекции. Недостаток такого подхода состоит в том, что вирус ящура иногда способен проникать в клетки используя взаимодействие с другими рецепторами клеточных мембран. Другой попыткой создания «живой» ослабленной вакцины, было создание вируса, у которого отсутствовал белок Lpro (Chinsangaram et al., 1998; Mason et al., 1997). Этот неструктурный белок, присутствующий у всех серотипов вируса, участвует в блокировании трансляции клеточных матричных РНК и позволяет вирусу переключить все клеточные ресурсы на синтез вирусных белков. Вакцинация крупного рогатого скота и свиней таким вирусом приводила к образованию низкого титра антител у этих животных. При последующем заражении этих животных вирусом ящура дикого типа они заболевали, но болезнь протекала легче, чем у контрольных животных. Также осуществлялись попытки ослабить вирус путем внесения мутации в протеазу Lpro, которая приводила к нарушению функции ее протеолитического домена, участвующего в деградации транскрипционного фактора NF-kB. Иммунизация свиней таким вирусом приводила к защите животных от инфекции ящуром (Segundo et al., 2012). 2.4 Пустые вирусные капсиды как основа для вакцины Перспективным направлением исследования в получении вакцины против вируса ящура является использование пустых вирусных капсидов, обладающих способностью к самосборке с образованием вирусоподобных частиц (ВПЧ). Вакцины на основе таких частиц не уступают традиционным вакцинам по эффективности индукции иммунного ответа, так как содержат в себе полный набор иммуногенных эпитопов вируса. Вирусоподобные частицы лишены геномной РНК и поэтому не являются инфекционными. В 19 норме пустые капсиды образуются в значительных количествах в инфицированных клетках. Получение такой вакцины включает в себя клонирование и экспрессию участков генома вируса ответственных за синтез, протеолитический процессинг и сборку структурных белков вируса в пустой капсид (участки, кодирующие белки P1-2A и вирусную протеазу 3Cpro). В составе таких конструкций могут отсутствовать гены 3Dpol и других неструктурных белков. Вакцинирование облегчить препаратами дифференциацию пустых капсидов животных может зараженных существенно ящуром от вакцинированных, так как антитела против неструктурных белков могут вырабываться только у инфицированных особей. Были предприняты попытки получить ВПЧ или предшественник Р1-2А вируса ящура в клетках E. сoli (Grubman et al., 1993; Lewis et al., 1991) или культурах клеток насекомых, зараженных рекомбинантным бакуловирусом (Belsham et al., 1991; Grubman et al., 1993; Roosien et al., 1990; Sáiz et al., 1994). Иммунизация лабораторных животных препаратами таких белков приводила к выработке антител, однако при последующем заражении, животные были только частично защищены от заболевания ящуром. Также вакцины на основе таких белков пока не находят применения из-за относительно низкого выхода иммуногенных частиц и высокой стоимости конечного продукта. Для индукции иммунного ответа против вируса ящура можно использовать прямую внутримышечную инокуляцию препаратом ДНК, кодирующей капсидные белки вируса (Chinsangaram et al., 1998). Множество работ было направлено на применение различных вирусных векторов, кодирующих последовательности капсидных белков вируса и протеазы 3С (или только последовательности капсидных белков): векторы на основе герпесвируса Suidherpesvirus 1 (Li et al., 2008), бакуловируса тутового шелкопряда (Li et al., 2008) или хорошо охарактеризованные векторы на 20 основе поксвируса (Sanz-Parra et al., 1998; Berinstein et al., 2000; Ma et al., 2008) или аденовируса (Sanz-Parra et al., 1999; Mayr et al., 1999), обладающие низкой патогенностью в отношении животных и человека (Abrams et al., 1995). Использование всех вышеперечисленных систем получения вирусных капсидов показало разную степень индуцирования выработки защитных антител и степень защиты животного от заражения. Однако до настоящего времени самой успешной из них является использование человеческого аденовируса типа 5 (Аd5). Для обеспечения дополнительной безопасности использовали вектора с делециями части генома. Иммунизация животных подобными дефектными векторами, кодирующими белок P1, пептид 2A и протеазу 3Cpro вируса ящура серотипа А, приводила к возникновению иммунного ответа и защиты против заболевания вирусом серотипа А у свиней и крупного рогатого скота (Grubman et al., 2010; Moraes et al., 2002; Pacheco et al., 2005). Также было показано, что совместное введение такой вакцины с препаратом интерферона обеспечивало быструю индукцию иммунного ответа в течение нескольких дней после иммунизации. Однако, иммунизация свиней конструкцией на основе Ad5, кодирующей P1, пептид 2A и протеазу 3Cpro серотипа О, индуцировала существенно меньшее количество нейтрализующих антител, чем в аналогичном эксперименте с серотипом А. Также такая вакцина не обеспечивала защиты против заболевания: все животные, участвовавшие в эксперименте, заболели, хотя вакцинация и замедляла проявление признаков заболевания на 1-2 дня по сравнению с контрольной группой (Caron et al., 2005). В нескольких работах использовали высоко иммуногенный и способный к самосборке структурный белок капсида вируса гепатита B (HBc) в качестве основы создания пустых капсидов вируса ящура. Впервые о применении НВс для экспрессии аминокислот 141-160 белка VP1 вируса ящура сообщалось более 20 лет назад (Clarke et al., 1987). Иммуногенность 21 таких структур была схожа с иммуногенностью инактивированной вакцины. В другой работе исследование ВПЧ, полученных на основе НВс, слитого с эпитопами вируса ящура, в клетках млекопитающих, показало, что такие частицы индуцировали гуморальный и клеточный ответ у мышей (Zhang et al., 2007). 2.5 Субъединичные вакцины Одним из направлений исследований получения альтернативных вакцин против вируса ящура является использование очищенных вирусных белков или пептидов. Такие вакцины называют субъединичными. Субъединичные вирусные вакцины обычно представляют собой препараты капсидных вирусных белков или их фрагменты. Первоначально для создания субъединичных вакцин использовался структурный белок VP1, или применялись его фрагменты, содержащие эпитопы G-H-петли или С-концевого участка. В этих работах использовали белок VP1, выделенный из препаратов вирусных частиц (Laporte et al., 1973; Bachrach et al., 1975), рекомбинантный VP1 (Kleid et al., 1981), отдельные фрагменты VP1 (Strohmaier et al., 1982), химически синтезированные пептиды белка VP1 (Bittle et al., 1982; Di Marchi et al., 1986; Pfaff et al., 1982). В некоторыx работах VP1 экспрессировали при помощи «живых» рекомбинантных вакцин с использованием векторов на основе коровьего вируса ринотрахеита (коровий герпесвирус 1, BoHV-1) (Kit et al., 1991), полиовирусов (Kitson et al., 1991), герпесвируса Suidherpesvirus 1 (Qian et al., 2004). В качестве вакцины использовали плазмидную ДНК, кодирующую эпитопы белка VP1 (Wong et al., 2000), экстракты из трансгенных растений, экспрессирующих белок VP1 или растений, зараженных инфекционным вектором на основе вируса табачной мозаики (ВТМ), содержащим в геноме 22 участок, кодирующий VP1 (Wigdorovitz et al., 1999a; Wigdorovitz et al., 1999b). Иммунизация сельскохозяйственных животных вакцинами на основе белка VP1 или его фрагментов представлялась перпективным направлением разработки вакцин против ящура. Был проведен крупномасштабный эксперимент по вакцинации 138 голов крупного рогатого скота, в котором в качестве вакцины применяли пептиды, содержащие эпитопы G-H-петли белка VP1 серотипа С. Но, несмотря на несколько доз и различные схемы иммунизаций, степень защиты животных от заражения ящуром достигала всего 40% (Taboga et al., 1997). В последующих работах предпринимались попытки увеличить иммуногенность белка VP1 путем включения последовательности сайта распознавания Т-хелперов (Rodriguez et al., 2003; Wang et al., 2002), применения токсина холеры в качестве адъюванта (Beignon et al., 2005) или нетоксичного экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa (Challa et al., 2003). Однако иммунизация лабораторных или сельскохозяйственных животных такими вакцинами приводила либо к выработке низкого титра антител, либо к низкой степени защиты животных от заболевания. Недостатком всех этих подходов было то, что такие вакцины предоставляли только ограниченное количество вирусных эпитопов иммунной системе вакцинированного животного. Как правило, такие вакцины дают высокие титры нейтрализующих антител при иммунизации лабораторных животных и способны защищать их при инфекции небольшими дозами вируса, однако, протективность таких вакцин при иммунизации сельскохозяйственных животных не высока (Di Marchi et al., 1986; Mulcahy et al., 1990; Mulcahy et al., 1991). Хотя эпитопы белка VP1 являются иммуннодоминантными во многих тестовых системах, они являются только частью общего количества распознаваемых эпитопов вириона (Cartwright et al., 1980). Кроме того, эпитопы белка VP1 имеют 23 разную иммуногенность для различных видов животных (Rowlands et al., 1975). Высокая вариабельность генома вируса ящура накладывает некоторые ограничения на использование таких субъединичных вакцин. При использовании вакцин с неполным набором антигенов существует опасность возникновения быстрой селекции новых высоко инфекционных антигенных вариантов, преодолевающих иммунный ответ хозяина. Эти данные подтверждаются экспериментами (Taboga et al., 1997). Из-за недостатков всех вышеперечисленных экспериментальных вакцин против вируса ящура разработка альтернативной вакцины для борьбы с заболеванием остается актуальной задачей. Для повышения эффективности субъединичных вакцин могут быть использованы препараты рекомбинантных белков, образованных набором иммуногенных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи. Для дизайна последовательности подобной вакцины необходимо определить (выявить) подходящие эпитопы, которые могут индуцировать выработку цитотоксических Т-клеток, Т-хелперов и антител. Возможно, вакцинация такими полиэпитопными белками, содержащими комбинацию известных Ви Т-клеточные эпитопов вируса, может приводить к улучшению иммунного ответа у животного и способствовать более эффективной защите от заболевания. 3. Антигенные сайты вируса ящура Известно, что гуморальный иммунный ответ является важнейшим фактором протективной активности вакцины против заболевания, так как наблюдается строгая корреляция между уровнем антител, производимых после вакцинации, и последующей защиты от заболевания крупного рогатого скота (Pay & Hingley, 1987). Механизм, которым антитела защищают от 24 заболевания ящуром, не до конца известен, и различные факторы, которые не учитываются in vitro, могут быть вовлечены in vivo (Dunn et al., 1998; McCullough et al., 1992). За последние двадцать лет было проведено несколько работ по идентификации таких антигенных сайтов на поверхности вирусного капсида, которые способны связываться с антителами. Используя моноклональные антитела, антигенные сайты удалось определить для вируса ящура серотипов О (Aktas & Samuel, 2000; Barnett et al., 1998; Crowther et al., 1993b), A (Baxt et al., 1989; Bolwell et al., 1989; Mahapatra et al., 2011; Thomas et al., 1988a), C (Mateu et al., 1990), Aзия-1 (Grazioli et al., 2003), и SAT (Crowther et al., 1993a; Grazioli et al., 2006). Наиболее распространенным в мире является вирус ящура серотипа О, и он же является наиболее изученным (Klein, 2009; Knowles and Samuel, 2003; Rweyemamu et al., 2008; Valarcher et al., 2008). Было показано, что антигены вируса серотипа О индуцируют более низкий иммунный ответ, чем антигены серотипов А и С (Pay & Hingley 1987; Doel et al., 1994). Поэтому для индукции иммунного ответа против ящура серотипа О требуются иммунизации большими количествами антигенного материала. На поверхности капсида вируса серотипа О было выявлено пять антигенных сайтов, содержащих В-клеточные эпитопы, которые находятся на капсидных белках вируса VP1, VP2 и VP3 (Xie et al., 1987; McCahon et al., 1989; Aktas & Samuel, 2000; Barnett et al., 1998; Crowther et al., 1993b; Kitson et al., 1990). Наиболее выступающая часть вириона образована G-H-петлей белка VP1 и вместе с С-концом VP1 они образуют антигенный сайт 1, важными для связывания антител аминокислотными остатками которого являются 144, 148, 154 и 208 аминокислоты. Аминокислотные остатки в позициях 70-73, 75, 77 и 131 белка VP2 составляют антигенный сайт 2, а 43 и 44 аминокислоты В-C-петли белка VP1 составляют сайт 3. Важными для иммунного ответа для антигенного сайта 4 аминокислотными остатками являются 56 и 58 аминокислоты белка VP3. Антигенный сайт 5 образован 25 аминокислотой 149 белка VP1, и, вероятно, образуется путем взаимодействия G-H-петли с другими аминокислотами, расположенными на поверхности вириона. Нужно отметить, что антигенный сайт 1 линейный и чувствителен к обработке трипсином, а остальные идентифицированные поверхностные антигенные сайты представляют собой зависимые от конформации и не чувствительные к обработке трипсином структуры. Поскольку G-H-петля белка VP1 (антигенный сайт 1) является иммунодоминантным сайтом с линейной структурой, предпринимались попытки создания вакцин на ее основе. Однако, иммунизации такими вакцинами сельскохозяйственных животных не приводили к достижению полной защиты животных от заболевания (Krebs et al., 1993; Rodriguez et al., 2003; Taboga et al., 1997). Это может свидетельствовать, что G-H-петля не является единственно необходимым компонентом для выработки иммунного ответа против вирусной инфекции (Fowler et al., 2008; Fowler et al., 2010; Rieder et al., 1994). Многие исследования были направлены на определение других важных для развития полноценного иммунного ответа антигенных сайтов. В сыворотке крови крупного рогатого скота с использованием метода ИФА с конкурирующими моноклональными антителами было показано наличие относительно высокого титра антител, специфичных к антигенному сайту 2 (Samuel, 1997). Но в другом исследовании, с помощью такой же методики, было установлено, что ни один из антигенных сайтов 1, 2 и 3 вируса серотипа О не являлся иммунодоминантным у крупного рогатого скота и овец, поскольку в сыворотках крови этих животных количество антител против этих антигенных сайтов было примерно одинаковым (Aggarwal and Barnett, 2002). Эта же группа исследователей сообщала, что в сыворотке крови свиней антитела, направленные против антигенного сайта 1, практически отсутствовали. Исследования сывороток крови животных, зараженных вирусом ящура других серотипов, также указывают на участие 26 других антигенных сайтов в формировании иммунитета против ящура. Например, в сыворотках крови крупного рогатого скота и лабораторных животных, зараженных вирусом серотипа А, около половины антител было направлено против белка VP1, в то время как остальные антитела были направлены против эпитопов других белков (Thomas et al., 1988b). Также, с помощью метода фракционирования сывороток, было показано, что только около 27% антител у вакцинированных от вируса ящура серотипа С свиней было направлено против антигенного сайта 1, в то время как большая часть антител была против других антигенных сайтов (Mateu et al., 1995). Несмотря на успешное использование иммунно-ферментного анализа (ИФА) с конкурирующими моноклональными антителами для определения эпитопов на поверхности вириона вируса, потенциальной проблемой этого метода для количественного определения антител против определенного антигена, может быть то, что антитела связанные с одним сайтом на поверхности капсида, вследствие своего большого размера, могут мешать другим антителам, направленным на другие антигенные сайты на вирионе. Усложняется это еще и маленьким размером вириона и близкой расположенностью антигенных сайтов друг относительно друга. Для решения этой проблемы было проведено исследование, призванное определить относительное количество антител, вырабатываемых против известных антигенных сайтов вируса ящура серотипа О в поликлональных сыворотках трех видов животных – крупного рогатого скота, свиней и овец, с использованием вирусов с аминокислотными заменами в положениях важных, для взаимодействия или индукции антител. Такие мутации предотвращали связывание моноклональных антител с соответствующим сайтом. Результаты показали, что у 58% привитых вакциной, на основе инактивированного вируса, свиней, 65% овец, и у 76% крупного рогатого скота большая часть антител вырабатывалась против антигенного сайта 2, у 15-18% иммунизированных животных большая часть иммунного ответа была 27 направлена против сайта 1, у 9-15% вырабатывалось одинаковое количество антител как против сайта 1, так и против сайта 2 (Mahapatra et al., 2012). Таким образом, авторы показывают, что при иммунизации различных видов сельскохозяйственных животных инактивированным вирусом серотипа О, большая часть антител при иммунном ответе направлена против антигенного сайта 2, однако подчеркивают, что антител против различных антигенных сайтов может отличаться при заражении животных вирусом. Одним из факторов, лимитирующих эффективность субъединичных вакцин, может быть отсутствие Т-клеточных эпитопов в составе субъединичных вакцин или вакцин на основе инактивированного вируса (Collen, 1994; Rowlands, 2004; Sobrino et al., 1999). Выработка антител зависит от Т-клеточного иммунного ответа, поскольку при инфекции или иммунизации вакцинами на основе инактивированного вируса происходило накопление Т-лимфоцитов CD4+ (Collen, 1994). В то время как антитела, вырабатываемые в ответ на вакцинацию или на заражение вирусом, являются специфичными для каждого серотипа, бычьи Т-лимфоциты обладали кроссреактивностью к различным серотипам вируса ящура (Сollen et al., 1990). До настоящего времени, значение клеточного иммунного ответа в защите от заболевания ящуром остается в большей степени неизвестным. В пользу важности клеточного ответа говорит несколько работ, в которых наблюдалась частичная защита свиней и крупного рогатого скота (Sanz-Parra et al., 1999; García-Briones et al., 2004) и даже полная защита овец (Cox et al., 1999; Parida et al., 2008) от заболевания ящуром при отсутствии противоящурных антител. Также сообщалось, что пептиды, включающие GH-петлю белка VP1 и гетерологичные Т-хелперные эпитопы, индуцировали выработку антител у мышей (Francis et al., 1987) и обеспечивали защиту от заражения свиней (Wang et al., 2002). Несколько Т-клеточных эпитопов, узнаваемых лимфоцитами свиней и крупного рогатого скота, было идентифицировано в составе капсидных 28 белков вируса ящура (Blanco et al., 2000; Collen et al., 1991; Rodriguez et al., 1994a, 1994b; van Местонахождение Lierop трех et al., 1995b; Т-клеточных Zamorano эпитопов et белков al., 1994). VP2 (49-68 аминокислотные остатки), VP3 (81-100) и VP4 (20-40) совпадало для нескольких серотипов вируса (Van Lierop et al., 1995a). Иммунизация пептидом, включающим Т-клеточный эпитоп, находящийся на белке VP1 (аминокислотные остатки 21-40), и В-клеточный антигенный сайт 1, приводила к индукции Т-клеток, антител и частичной защиты от заражения у крупного рогатого скота (Collen et al., 1991). Однако последовательности этого эпитопа сильно различаются у разных серотипов вируса. Стоит отметить, что в нескольких работах Т-клеточные эпитопы были идентифицированы между аминокислотными остатками 150-160 и 200-212 белка VP1 (Pfaff et al., 1982; Francis et al., 1987; Glass et al., 1991; Van Lierop et al., 1992). В другом исследовании при иммунизации крупного рогатого скота пептидами, содержащими эти эпитопы, или инактивированным вирусом, идентифицировать указанные фрагменты белка VP1 как Тклеточные эпитопы не удалось (Van Lierop et al., 1994). Однако ряд работ указывает на то, что узнавание капсидных Тклеточных эпитопов вируса ящура лимфоцитами разных видов сельскохозяйственных животных, ограничивает полиморфизм молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), которые ответственны за презентацию инородных антигенов антиген-презентирующими клетками (García-Briones et al., 2000; Glass et al., 1991; Van Lierop et al., 1995a, 1995b). В этом отношении в качестве источника Т-клеточных эпитопов среди капсидных белков наиболее интересен VP4, обладающий высоко консервативной последовательностью не только среди различных серотипов вируса ящура, но и среди других пикорновирусов (Beck et al., 1983). Было показано, что фрагмент белка VP4 (20-40 аминокислотные остатки) является 29 основной мишенью, распознаваемой Т-клетками, который индуцирует выработку вирус-специфических Т-клеток (Van Lierop et al., 1995b; Gerner et al., 2009). Эпитоп белка VP4 распознается лимфоцитами у вакцинированных свиней и крупного рогатого скота (Van Lierop et al., 1994; Van Lierop et al., 1995a). Иммунизация рекомбинантными вирусоподобными частицами на основе НВс, слитого с антигенным сайтом 1 белка VP1 и Т-клеточным эпитопом белка VP4, показала, что такие частицы индуцировали как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ у мышей (Zhang et al., 2007). Вклад неструктурных белков в формирование иммунитета против ящура мало изучен. Неструктурные белки обладают низкой вариабельностью аминокислотных последовательностей между разными серотипами вируса ящура. Консервативность последовательностей позволяет идентифицировать Т-клеточные эпитопы, распознаваемые лимфоцитами разных видов животных (Blanco et al., 2001), что также является важным требованием для включения эпитопов в последовательность синтетических вакцин против ящура. В составе неструктурных белков 3А, 3В и 3С было определено множество Т-клеточных эпитопов (аминокислотные остатки 21-35 и 121-135; 13-23 и 39-53; 51-75, 91-110, 121-150, 161-180 и 191-210, соответственно), узнаваемых лимфоцитами свиней, предварительно зараженных вирусом ящура серотипа С (Blanco et al., 2001). В этом же исследовании было показано, что один из этих эпитопов 3А (21-35) слитый с аминокислотной последовательностью G-H-петли белка VP1 in vitro эффективно стимулировал Т-лимфоциты, полученные из инфицированных свиней. Исследования белков 3А, 3В и 3С вируса серотипа О не производилось, однако высокая консервативность последовательностей этих белков позволяет предположить наличие аналогичных эпитопов у других серотипов, включая серотип О. 30 Было показано, что добавление последовательности белка 2В к ДНКвакцине на основе Ad5 c последовательностями, кодирующими белок P1, пептид 2A и протеазу 3Cpro вируса ящура серотипа А увеличивало выработку антител у иммунизированных такой вакциной свиней (Pena et al., 2008). Позже на примере такой же вакцины, только с использованием последовательностей серотипа О, было доказано, что иммунизированных вакциной, содержащей у животных последовательность 2В, количество Т-лимфоцитов было выше, чем у животных контрольной группы, иммунизированных последовательностью без 2В (Moraes et al., 2011). Вирусная РНК полимераза 3Dpol – один из неструктурных белков вируса ящура, показывающий самую низкую степень вариабельности нуклеотидной последовательности среди изолятов различных серотипов вируса (Domingo et al., 1990). Таким образом, полимераза 3Dpol хороший источник консервативных вирусных Т-клеточных эпитопов, что также доказывается его распознаванием Т-лимфоцитами животных, зараженных ящуром или иммунизированных инактивированным вирусом серотипов О и С (Collen et al., 1998) и улучшением иммунного ответа, вызванного иммунизацией животных ДНК-вакциной на основе 3Dpol и капсидного предшественника Р1 (Cedillo-Baron et al., 2001). В настоящее время считается, что на 3Dpol находятся иммунодоминантные Т-клеточные антигенные сайты (Collen et al., 1998). На белке 3Dpol было обнаружено множество Т-клеточных эпитопов (Gerner et al., 2006; García-Briones et al., 2004). Еще одним высоко-консервативным среди разных серотипов вируса ящура белком является неструктурный белок 2С. Было показано, что у зараженных ящуром сельскохозяйственных животных вырабатывались антитела против белка 2С (Berger et al., 1990). В составе белка 2С идентифицирован эпитоп, индуцирующий выработку цитотоксических Тлимфоцитов после вирусной инфекции или иммунизации ДНК, кодирующей 31 последовательность эпитопа (Barfoed et al., 2006). Авторы исследования также подчеркивают, что иммунный ответ у мышей против этого эпитопа (KYKDAKEWL, 68-76 аминокислотные остатки), индуцируемый вакцинацией ДНК, был такой же силы, как и иммунный ответ, возникающий после инфицирования вирусом. 4. Гетерологичные системы экспрессии белков В настоящее время в качестве систем экспрессии белков используются различные прокариотические и эукариотические клетки и ткани: дрожжи, культуры тканей насекомых, трансгенные растения и культуры клеток млекопитающих. Каждая из систем имеет свои преимущества и недостатки. В большинстве случаев прокариотические системы экспрессии проще в использовании и экономически выгодны. Однако, вследствие неспособности прокариотических клеток к пост-трансляционным модификациям, такая система экспрессии может быть применена в продукции белков, для функциональной активности которых не требуются такие модификации. При получении белков с использованием культуры клеток млекопитающих удается решить проблему пост-трансляционной модификации, но получение белков в таких системах дороже и требует больше времени. Поэтому привлекательной системой в настоящее время являются растения, получение белков в которых позволяет обойти недостатки использования прокариотических клеток и культур клеток млекопитающих. 4.1 Бактериальная система экспрессии Наиболее простой системой экспрессии рекомбинантных белков являются клетки Е. coli. Первый терапевтический белок, соматостатин, был получен в клетках Е. coli более 30 лет назад (Itakura et al., 1977). К 32 достоинствам использования Е. coli можно отнести высокий уровень экспрессии целевого белка, быструю наработку клеточной биомассы и простоту культивирования. Однако большой проблемой остается неправильное сворачивание белка, а также образование телец включения. В клетках Е. coli рекомбинантные белки удобно получать методом самоиндукции (Studier, 2005). Для его использования необходимы клетки штаммов бактерий, содержащие в геноме единичную копию гена Т7 полимеразы под контролем Lac оперона. В экспрессионной плазмиде целевой ген должен находиться под контролем Т7 промотора. В отсутствие экспрессии Т7 полимеразы этот промотор не активен и целевой белок не экспрессируется. Для самоиндукции экспрессии целевого белка используется среда, содержащая два сахара – глюкозу и лактозу. Предпочтительным субстратом для роста клеток кишечной палочки является глюкоза, поэтому она потребляется в первую очередь. В это время клеточный белок lac репрессор связывается с нуклеотидной последовательностью Lac оперона, препятствуя началу транскрипции гена Т7 полимеразы. Исчерпание глюкозы происходит при достижении культурой поздней лог-фазы. В это время клетки начинают использовать лактозу. Когда в клетках появляется лактоза, она связывается с репрессором и провоцирует его отделение от оперона. При этом происходит индукция экспрессии Т7 полимеразы и экспрессия целевого белка. При экспрессии белка методом самоиндукции не нужно использовать дополнительные индукторы, что значительно снижает затраты на производство белка. Также нет необходимости контролировать плотность клеток в культуре, т. к. экспрессия целевого белка начинается при достижении культурой поздней лог-фазы, что обеспечивает высокий уровень выхода продукта. 33 4.2 Растительная система экспрессии В настоящее время перспективной и представляющей огромный интерес для биотехнологических компаний системой получения белка является растение. За последние десятилетия разработано множество эффективных растительных систем экспрессии. Производство рекомбинантных белков в генетически модифицированных растениях стало возможной альтернативой традиционным продуцентам – бактериям и культурам животных клеток. Растения имеют много преимуществ перед другими системами получения белка особенно в плане практичности, экономичности и безопасности. Для роста растений требуется только почва, вода, свет и небольшое количество удобрения, поэтому стоимость их выращивания несравнимо ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей или животных, для культивирования которых необходимо использование дорогостоящей аппаратуры (ферментеров), культуральных сред и систем стерильности. Вследствие этого стоимость белков, получаемых в растениях, уже сегодня в несколько раз ниже стоимости аналогичных белков, получаемых из бактерий и клеток млекопитающих (Evangelista et al., 1998) Клетки растений биологически безопасны, поскольку растения и животные или человек не имеют общих патогенов. Поэтому получаемые в растениях продукты не содержат опасных для животных или человека вирусов и бактерий (Giddings et al., 2000). Важным преимуществом использования растений как продуцентов белка по сравнению с использованием бактерий является отсутствие в растениях эндотоксинов – веществ, которые загрязняют конечный продукт и от которых чрезвычайно сложно очистить целевой белок. Эндотоксины образуются при распаде бактериальных клеток, поэтому при промышленном получении рекомбинантного белка культуры клеток должны сразу 34 подвергаться обработке (Fischer et al., 2000), в то время как большое количество выращенной биомассы растений может быть легко оставлено на хранение до дальнейшей переработки. В отличие от бактерий и дрожжей, растения и животные имеют сходную систему посттрансляционных модификаций белков. Поэтому в растениях могут быть получены белки, полностью функциональные и практически идентичные белкам животных и человека. Различные исследования показали, что в растениях можно получать даже сложные функциональные белки млекопитающих с сохранением биологической активности, таких как человеческие сывороточные белки, регуляторы роста, антитела, вакцины, гормоны, цитокины и ферменты (Liénard et al., 2007). В случае необходимости количество получаемого белка можно увеличить в сравнительно быстрые сроки путем увеличения количества выращиваемых растений. В растениях было получено большое количество различных рекомбинантных белков, такие как антитела, вакцины, гормоны и др. В настоящее время несколько кандидатных вакцин и других белков, полученных в растениях, находятся на разных стадиях клинических испытаний, к ним относятся вакцина против гепатита В (Streatfield, 2006), холеры (Tacket, 2005), одна из вакцин – против болезни Ньюкасла домашних птиц, разработанная Dow AgroSciences, – уже была одобрена для использования. Рекомбинантные белки в растениях могут быть получены несколькими основными методами: с помощью генетической трансформации (т. е. созданием трансгенного растения), экспрессией в хлоропластах или использованием системы транзиентной (временной) экспрессии. 35 4.2.1 Трансгенные растения как система получения белков Создание трансгенного растения генетическую трансформацию включает в себя непосредственно растительной клетки и дальнейшую регенерацию растения из трансформированной клетки. Впервые способность растения к генетической трансформации была выявлена в 80-х гг. (Bevan et al., 1983). Первый рекомбинантный фармацевтический белок (гормон роста) и антитела были получены в трансгенных растениях в 1986 и 1989 гг. соответственно (Hiatt et al., 1989; Barta et al., 1986). Но только в 1997 году рекомбинантный белок авидин стали получать из трансгенной кукурузы для коммерческих целей (Hood et al., 1997). Это доказало, что растения действительно можно использовать для получения белков в промышленных масштабах. Одним из первых вакцинных белков, полученных из трансгенных растений, были поверхностные антигены вируса гепатита В из трансгенного табака в 1992 году (Mason et al., 1992). С тех пор многие исследовательские группы изучали возможности получения вакцинных белков различных патогенов и вирусов в растениях. В трансгенных растениях было получено огромное число вакцинных белков различных патогенов в табаке, картофеле, томатах, люцерне и др.: В-субъединица токсина холеры, поверхностный антиген гепатита В (HBsAg), капсидные белки и эпитопы рота- и папиломавирусов, пептиды вируса бешенства, гемагглютинины возбудителя кори и многие другие (Tiwari et al., 2009). В настоящее время процесс получения трансгенного растения не представляется сложным и является самым распространенным методом получения белков в растениях. На его основе создано множество интересных и практичных систем для получения белков. Например, аккумуляция белков в семенах злаковых, что позволяет хранить эти семена достаточно продолжительное время при комнатной температуре с сохранением свойств 36 получаемых белков (Horn et al., 2004). Такой способ наработки белка позволяет наработать большое количество белка практически во всех климатических условиях. Однако, недостатками такого подхода являются большие временные затраты, необходимые для культивирования культур злаковых и возможность переноса генов в результате перекрестного опыления с растениями дикого типа, что существенно ограничивает общественное принятие это метода. Существенным недостатком получения белка в трансгенных растениях является непредсказуемость уровня экспрессии целевого белка из-за возможного транскрипционного или постранскрипционного подавления экспрессии генов (gene silencing). Уровень экспрессии целевых белков трансгенными растениями обычно низок - около 0,1% общего белка. Например, содержание сывороточного альбумина человека в трансгенных тканях табака составило 0,02% от суммарного белка (Sijmons et al., 1990). Ещё меньшие значения были получены для эритропоэтина (0,003%) и bинтерферона (0,001%) (Edelbaum et al., 1992; Kusnadi, 1992). Низкий уровень продукции белка увеличивает стоимость его очистки, составляющую основную долю всей стоимости производства. В работе, посвященной анализу экономической эффективности продукции рекомбинантного лактоферрина (Nandi et al., 2005), показано, что стоимость конечного продукта обратно пропорциональна уровню экспрессии. Поэтому, чтобы растения как система для получения белков могла быть конкурентоспособной по сравнению с другими гетерологичными системами продукции белков, необходимо добиться уровня экспрессии как минимум 1% от всех растворимых белков (Rybicki, 2009). Несмотря на то, что методы получения трансгенных растений на сегодняшний день хорошо отработаны, создание трансгенного растения, а, значит, и получение белка из него, требует значительных временных затрат. Это также ограничивает возможности использования генетически 37 трансформированных растений в качестве источника белков. Кроме того культивирование трансгенных растений осложняется возрастанием государственных ограничений и требований к биобезопасности. 4.2.2 Получение белков в хлоропластах Система получения белков в растениях с помощью трансформации хлоропластов является альтернативой трансгенным растениям. Важным преимуществом использования хлоропластов для продукции рекомбинантных белков является высокая биобезопасность, что связано с тем, что хлоропласты имеют материнское происхождение, иными словами, в пыльце они не содержатся. Таким образом, распространение генетической конструкции при опылении исключено (Meyers et al., 2010). Это было подтверждено в работе, продемонстрировавшей, что при опылении пыльцой растения, в геном хлоропластов которого была внедрена маркерная генетическая конструкция, только 6 саженцев из 2 млн. продемонстрировали наличие этих генов (Ruf et al., 2007). Встраивание чужеродной ДНК в хлоропластный геном осуществляется с помощью биолистической доставки ДНК. Благодаря тому, что геном хлоропластов способен к гомологичной рекомбинации, чужеродные последовательности могут быть направлены в определенные локусы генома. Несмотря на то, что характер экспрессии зависит от используемой экспрессионной кассеты и типа экспрессируемого белка, средний уровень продукции белка в хлоропластах составляет 5-20% всех растворимых белков клетки, в то время, как уровень экспрессии в ядре составляет лишь 0,001-1%. Например, в хлоропластах N. tabacum количество экспрессируемых бактериальных и человеческих терапевтических белков составляло 3-6% от всех растворимых белков клетки (Sadhu and Reddy, 2003). В одной из работ сообщалось об очень высоком уровне экспрессии белкового антибиотика в 38 хлоропластах (около 70% всех растворимых белков), что на сегодняшний день является самым высоким уровнем аккумуляции рекомбинантного белка в растениях (Oey et al., 2009). В хлоропластах табака был получен пептид 2L21 парвовируса (CPV), слитый с В-субъединицей токсина холеры (СТВ). Иммунизация таким пептидом приводила к образованию антител у мышей и кроликов (Molina et al., 2005). Также структурный белок L1 человеческого папиломавируса (HPV-16), полученнный в хлоропластах табака, был иммунногенен и приводил к выработке антител у мышей (Millan et al., 2008). В хлоропластах были получены белки, которые достаточно сложно получить в других системах экспрессии, как, например, антимикробные белки (Oey et al., 2009). Недавно (Bally et al., 2009) был проведен анализ процесса продукции белка в хлоропластах с целью ответа на вопрос, благодаря чему в растении, несмотря на серьезные изменения, связанные с интенсивным накоплением белка, сохраняется нормальный метаболизм. Было выяснено, что RuBisCO (рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилаза), самый многочисленный белок в растениях, существует в количествах, превышающих метаболические нужды. Рекомбинантный белок, синтезируемый хлоропластами в большом количестве, замещает часть RuBisCO, уменьшая его количество. При этом содержание общего количества белка не изменяется и экспрессия рекомбинантного белка не оказывает вредного эффекта на рост и развитие растения. Использование такой системы получения белков обладает огромным потенциалом, однако существующие на сегодняшний день методы трансформации пластид ограничены. Несмотря на то, что некоторым исследователям удалось трансформировать хлоропласты томатов, баклажанов, салата и сои, рутинная процедура трансформации пластид возможна только у табака (Singh and Verma, 2010). 39 Еще одним ограничением системы экспрессии в хлоропластах (как и в бактериях) является отсутствие гликозилирования, необходимое для многих фармацевтических гликопротеинов, включая моноклональные антитела. 4.2.3 Транзиентная экспрессия белков в растениях Получение белка методом транзиентной экспрессии в растениях имеет ряд преимуществ по сравнению с другими системами получения белков в растениях. Экспрессия белка достигается за короткий промежуток времени, так как не требуется создание трансгенного растения, и необходимые количества белка можно наработать за несколько дней. Также достижение транзиентной экспрессии технически проще осуществимо, чем получение устойчивой формы генетически трансформированного растения. Для получения транзиентной экспрессии в растениях может быть использован метод агробактериальной инфильтрации, разработанный в 1997 году (Kapila et al., 1997). Для этого культуру клеток Agrobacterium tumefaciens трансформируют плазмидой, Т-ДНК которой кодирует последовательности промотора, целевого гена и терминатора транскрипции. Суспензию трансформированной агробактерии вводят в ткань растения путем вакуум-инфильтрации или шприцем. Агробактерия осуществляет перенос Т-ДНК в ядро растения, где она может находиться в виде эписом. В ядре происходит транскрипция целевого гена, затем следует трансляция транскрипта в цитоплазме. Как известно, уровень накопления рекомбинантного белка в растениях зависит от многих факторов. Очень часто экспрессионные системы, идеальные для экспрессии одного гена, оказываются совершенно непригодными для экспрессии другого. Поэтому при получении новой системы продукции белка также удобно использовать метод транзиентной экспрессии, с помощью которого можно быстро и без особых затрат оценить 40 уровень экспрессии конкретного белка в определенном виде растения и с использованием различных векторов. Одним из наиболее эффективных методов, позволяющих быстро получать в растениях значительные количества целевого белка, является использование рекомбинантных векторов на основе вирусов растений. Получение белка с использованием вирусных векторов может иметь много преимуществ. Скорость репликации вирусной РНК в растениях достаточно высока, за счёт этого достигается высокая копийность мРНК целевого гена в заражённых клетках. Это позволяет в течение нескольких дней экспрессировать в растениях целевые белки на достаточно высоком уровне (Marillonnet et al., 2005). Вирусные векторы используются в двух вариантах: в виде полноразмерной вирусной последовательности (так называемые векторы первого поколения) и в виде векторов, которые содержат только часть вирусной последовательности (векторы второго поколения). Вирусные векторы первого поколения – это полноразмерные функционирующие вирусы, синтезирующие помимо полного набора вирусных белков целевой белок. При этом нуклеотидная последовательность, кодирующая целевой белок, клонируется под контролем сильного вирусного промотора, такого как субгеномный промотор белка оболочки или сливается с последовательностью белка оболочки (применяется, как правило, для экспрессии небольших белковых фрагментов). Ген целевого белка попадает в растительные клетки либо посредством инфекционной нуклеиновой кислоты, либо с помощью зрелых частиц вируса. В зависимости от вирулентности вектора, потребуется порядка двух-трех недель до полного заражения трансфицированных растений (Gleba et al., 2007). Одним из первых вирусов растений, на основе которого был получен вектор для транзиентной экспрессии белков, был вирус табачной мозаики (ВТМ). Одной из первых потенциальных вакцин была вакцина, полученная с 41 использованием рекомбинантных частиц ВТМ с экспонированными на поверхности вириона эпитопами возбудителя малярии (Turpen et al., 1995). Подтверждением того, что такой подход можно использовать для получения вакцин с целью иммунизации животных стало получение рекомбинантных частиц ВТМ с эпитопами или белками папиломавирусов кролика на поверхности капсида (Palmer et al., 2006). Иммунизация кроликов препаратами на основе таких частиц, предохраняла животных от последующего заражения вирусами. Проблемой использования в качестве вектора инфекционного растительного вируса, который распространяется по растению самостоятельно, является возможная потеря целевого (чужеродного) гена вирусом. Например, в одной из работ было показано, что последовательность, кодирующая белок L1 папиломавируса кролика, экспрессируемая посредством ВТМ в растениях N. benthamiana, утрачивается вирусом по мере роста растения (Kohl et al., 2006). Другими недостатками вирусных векторов первого поколения является ограниченный размер гена целевого белка (Kohl et al., 2006; Avesani et al., 2007) и относительно низкий уровень экспрессии, что, вероятно, связано со значительным выделением ресурсов клетки на синтез вирусных белков оболочки. Для преодоления этих недостатков были предприняты попытки по удалению некоторых частей вирусной последовательности, например, последовательностей, кодирующих вирусные белки, которые участвуют в процессах инфицирования и межклеточного движения вируса, а также капсидных белков. Таким образом, такие редуцированные вирусы не способны к межклеточному транспорту и не могут самостоятельно проникать в клетки растения, но сохраняют способность к репликации вирусной РНК. Поэтому для привнесения векторов на основе редуцированных вирусов в клетки растения необходимо применение других средств. 42 Доставлять вирусные вектора к клеткам растений можно путем инфильтрации тканей растений агробактериями, несущими вирусный экспрессионный вектор. Для трансформации агробактерии необходима конструкция, содержащая в зоне Т-ДНК последовательности, кодирующие промотор, вирусные последовательности с целевым геном и терминатор. При контакте клеток растений с агробактерией, трансформированной такой конструкцией, Т-ДНК область переносится в ядро клетки. В результате транскрипции образуется РНК, которая реплицируется в цитоплазме, как это происходит при заражении клетки вирусом. В результате трансляции вирусных РНК происходит экспрессия целевого белка (Рис. 2). Рис. 2. Принцип агробактериальной инокуляции Агроинфильтрировать можно как целое растение, так и отдельные его части (главным образом листья) сильноразбавленной суспензией агробактерии. В зависимости от используемого вектора, растения и количества бактерий в суспензии максимально возможный уровень экспрессии целевого белка можно получить за 4-10 дней, и в зависимости от свойств гена интереса можно получать до 5 г рекомбинантного белка с 1 кг свежей биомассы листьев (Gleba et al., 2007). 43 Однако, также как в большинстве других систем получения белков из свежих растений, ткани растений должны быть обработаны сразу же, чтобы предотвратить порчу растений и деградацию белка. Но, несмотря на этот недостаток, с помощью транзиентной экспрессии с использованием фитовирусных векторов успешно получают свыше 50 белков различного медицинского и фармакологического назначения (Klimyuk et al., 2005). В частности, был получен биологически активный гормон роста человека, уровень экспрессии которого был относительно высок – около 1 мг на 1 г веса растения (Gils et al., 2005). Также с высоким уровнем экспрессии (2-3 мг/г) были получены вакцинные антигены Yersinia pestis, и было продемонстрировано, что данные антигены обеспечивали высокий уровень защиты от заболевания (Santi et al., 2006). Другая группа исследователей получила антигены туберкулеза, с уровнем экспрессии примерно 0,8 мг/г (Dorokhov et al., 2006). Также векторы на основе фитовирусов успешно применяются для продукции в растениях вакцинных белков возбудителей бешенства (Yusibov et al., 2002), папиломовируса человека (Massa et al., 2007), вирусов гриппа (Mett et al., 2008), а также В-субъединицы термолабильного энтеротоксина (Wagner et al., 2004) и многих других. Стоит отметить, что с помощью вирусных векторов в растениях возможно получение даже сложных гетероолигомерных белков. Например, были получены полноценные неконкурирующих антитела IgG путем векторов на основе ВТМ и коинфильтрации ХВК, кодирующих последовательности тяжелой и легкой цепей, в количестве 0,5 г на 1 кг биомассы (Gleba et al., 2007). Фармацевтическая компания Large Scale Biology Corporation адаптировала систему для получения вакцины для лечения В-клеточных неходжкинских лимфом (B-cell non-Hodgkin's lymphoma), которая успешно прошла первую стадию клинических испытаний (McCormick et al., 2008). 44 Рис. 3. Схема получения рекомбинантных белков методом транзиентной экспрессии с помощью вирусных векторов. 1 – выращивание растений и культуры агоробактерий; 2 – агроинфильтрация растений; 3 – инкубация растений; 4 – сбор биомассы; 5 – экстракция белков; 6 – промышленная очистка белков. Процесс производства белков с помощью транзиентной экспрессии с использованием агробактерии для доставки вирусных векторов к клеткам растений достаточно легко автоматизировать (как, например, в компании Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, http://www.fraunhofercmb.org/). Один из простых способов инокуляции растений суспензией агробактерий предполагает погружение надземной части растений в суспензию и создание небольшого разрежения (0,8-0,9 бар) в течение 10-30 секунд (Gleba et al., 2007) (Рис. 3). Одним из первых вирусов растений, на основе которого был получен вектор для транзиентной экспрессии белков, был вирус табачной мозаики (ВТМ). Одной из первых потенциальных вакцин была вакцина, полученная с использованием рекомбинантных частиц ВТМ с экспонированными на поверхности вириона эпитопами возбудителя малярии (Turpen et al., 1995). 45 Подтверждением того, что такой подход можно использовать для получения вакцин с целью иммунизации животных стало получение рекомбинантных частиц ВТМ с эпитопами или белками папиломавирусов кролика на поверхности капсида (Palmer et al., 2006). Иммунизация кроликов препаратами на основе таких частиц, предохраняла животных от последующего заражения вирусами. В настоящее время описано множество вирусов, векторы на основе которых успешно применялись для экспрессии белков или пептидов, слитых с капсидными белками: вирус табачной мозаики (ВТМ), Х-вирус картофеля (ХВК), вирусы мозаики бамбука (BaMV), папайи (PapMV), люцерны (AlMV) и коровьего гороха (CPMV), вирус желтой карликовости бобов (BeYDV), вирусы мозаики люцерны (AlMV) и огурца (CMV) и др. (Yusibov et al., 2006). Например, иммунизация капсидами CPMV с эпитопами синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa на поверхности защищала мышей от заболевания (Brennan et al., 1999); иммунизации экстрактами из растений, в которых с помощью вектора на основе ХВК экспрессировали онкопротеин Е7 человеческого папиломавируса 16, с последующей инъекцией опухолевых клеток, не приводили к формированию опухолей у мышей (Franconi et al., 2006). Однако, наиболее широко используемыми векторами являются вектора на основе ВТМ и ХВК, которые использовали для получения множества белков различного назначения или отдельных пептидов (Yusibov et al., 2006; Pogue et al., 2002). ВТМ и ХВК – вирусы небольшого размера (около 6,5 т. п. н.), поэтому с помощью векторов на основе этих вирусов можно в короткие сроки на высоком уровне экспрессировать одиночные целевые гены небольшого размера. Однако, при включении в вектора на основе этих вирусов двух или более целевых генов или генов большого размера, наблюдается очень низкий уровень накопления целевых белков (Avesani et al., 2007; Pogue et al., 2002). Причинами этого могут являться возможная рекомбинация, 46 сопровождающаяся выбросом чужеродных вставок большого размера из генома вируса, или низкая эффективность репликации вируса. Одним из способов решения проблемы одновременной экспрессии нескольких генов или гена большого размера, может быть использование векторов на основе вирусов с большим геномом, которые способны стабильно нести вставки большого размера и осуществлять их эффективную экспрессию. Одним из привлекательных кандидатов для получения таких векторов могут быть вирусы семейства представителей Closteroviridae семейства - клостеровирусы. клостеровирусов является Одним вирус из тристецы цитрусовых (ВТЦ), размер генома которого более 19 т. п. н. В нашей работе для транзиентной экспрессии белков в растениях был использован вектор, полученный на основе ХВК, а также вектора, полученные на основе клостеровируса ВТЦ. В настоящее время практически единственным ограничением использования растений как источника рекомбинантных белков является низкий уровень накопления некоторых белков. Для повышения уровня выработки белков разные стадии экспрессии могут быть оптимизированы. Проблемой в получении белков как из трансгенных растений, так и из растений, транзиентно экспрессирующих белок, является РНК умолчание (РНК-сайленсинг) гена целевого белка. РНК-сайленсинг играет ключевую роль в противовирусной защите многих эукариот путем влияния на репликацию вируса в клетках (Hamilton and Baulcombe, 1999). РНК умолчание может быть инициировано не только в присутствие в клетке вирусной РНК, но также чужеродного гена. Поэтому вследствие РНК умолчания уровень экспрессии белка может быть существенно ниже ожидаемого. Проблема низкого накопления целевого белка в растениях существовала на протяжении длительного времени, пока в конце девяностых годов у белка НСPro вирусов семейства Potyviridae была обнаружена способность подавлять РНК-сайленсинг (Kasschau and Carrington, 1998). 47 Впоследствии у вирусов растений и животных были открыты подобные белки. Позднее было показано, что коэкспрессия вирусных супрессоров (например, супрессора p19 вируса кустистой карликовости томатов (TBSV)) с целевым белком может эффективно препятствовать РНК умолчанию гена целевого белка, существенно повышая уровень его экспрессии (Voinnet et al., 2003). Исследования на E. coli и дрожжах показали, что редкие кодоны и количество отдельных тРНК могут влиять на время, необходимое для трансляции. Одним из способов увеличения эффективности трансляции в каком-либо организме является оптимизация кодонового состава путем такого изменения нуклеотидной последовательности, которое не отражается на аминокислотной последовательности. Применение такого подхода в различных работах позволило увеличить уровень экспрессии белков в растениях в 5-100 раз (Perlak et al., 1991; Hamada et al., 2005). Например, в одной из работ сравнивали уровень экспрессии гена, кодирующего инсектицидный белок cryIA Bacillus thuringiensis в трансгенных томатах и табаке. В растениях, трансформированных геном с частично оптимизированной последовательностью (около 3% нуклеотидного состава) уровень экспрессии увеличивался в 10 раз, а в растениях, которые трансформировали полностью оптимизированной последовательностью (около 21% нуклеотидного состава) уровень экспрессии увеличился примерно в 100 раз (Perlak et al., 1991). В пользу использования такого подхода говорят и эксперименты по экспрессии GFP в табаке (Rouwendal et al., 1997). Предпочтительный кодоновый состав различается даже между ядром и пластидами одного и того же растения (Kawabe & Miyashita, 2003). Использование нужной последовательности в соответствии с предпочитаемыми кодонами того растения, которое будет использоваться, может существенно увеличить количество синтезируемого белка, а, значит, и уменьшить стоимость конечного продукта. Для оптимизации кодонового 48 состава можно использовать сайт-специфический мутагенез, либо использовать химически синтезированную последовательность. В вирусном РНК-транскрипте могут присутствовать специфические последовательности, которые могут приводить к разрушению РНК молекул (Sullivan & Green, 1993). Поэтому для увеличения накопления рекомбинантных белков в некоторых случаях необходимо предотвращать появление таких последовательностей. Например, последовательности, которые могут действовать как сайты сплайсинга мРНК (Mishra et al., 2006), сайты терминации транскрипции, сайты рестрикции, сайты метилирования ДНК и т. д. Однако до настоящего времени подбор условий для увеличения экспрессии рекомбинантных белков в растениях происходит в большей степени эмпирическим путем (Rybicki, 2009). 5. Получение в растениях вакцинных белков вируса ящура Множество исследований было направлено на получение разнообразных вакцинных белков вируса ящура в растениях: отдельных эпитопов вируса слитых с различными белками, капсидного белка VP1 или предшественника капсидных белков. Самой ранней попыткой получения вакцинных белков вируса ящура была экспрессия иммунодоминантного эпитопа VP1 (141-160 аминокислотные остатки) серотипа О в составе капсида вируса мозаики коровьего гороха путем включения эпитопа в B-C-петлю капсидного белка S. Однако такой вирус не мог системно распространяться по растению (Usha et al., 1993). При помощи вектора на основе инфекционного вируса табачной мозаики (ВТМ) в растениях были экспрессированы иммунодоминантные эпитопы белка VP1, слитые с капсидным белком ВТМ. В этом исследовании вирус был способен к систематической инфекции всего растения, и эпитоп 49 ящура стабильно экспрессировался в составе вирусных частиц ВТМ в количестве 0,3-0,4 г на 1 кг инфицированной ткани листа. Морские свинки, иммунизированные очищенными вирусными частицами, были частично защищены от заражения ящуром (Wu et al., 2003). В растениях C. quinoa были получены вирионы вируса мозаики бамбука, презентирующие 128-164 аминокислотные последовательности белка VP1. При иммунизации свиней такими химерными частицами и последующем заражении вирусом у животных не появлялось признаков заболевания (Yang et al., 2007). В одной из работ была получена трансгенная люцерна, экспрессирующая антигенный сайт белка VP1 (135-160 аминокислотные остатки), слитый с белком β-глюкуронидазой (GUS). Уровень накопления такого белка был низким – 0,05-0,1% всех растворимых белков. Дальнейшие исследования показали, что мыши, иммунизированные таким белком, были полностью защищены от заболевания ящуром при контрольном заражении (Dus Santos et al., 2002). Исследовалась возможность использования трансгенных растений, экспрессирующих антигены вируса ящура, в качестве съедобной вакцины. Например, растения Arabidopsis thaliana (Carrillo et al., 1998), люцерна (Wigdorovitz et al., 1999) и картофель (Carrillo et al., 2001) были трансформированы геном структурного белка VP1 вируса ящура серотипа О1 Campos. Уровень экспрессии белка в тканях трансгенных растений был относительно низок (например, у трансгенного картофеля количество экспрессируемого белка было 0,005-0,01% от всех растворимых белков), поэтому для образования достаточного титра антител было необходимо провести несколько иммунизаций. Было показано, что как при парентеральной иммунизации экстрактом листьев трансгенных растений, так и при кормлении мышей свежими листьями, происходило появление антител, 50 но животные были только частично защищены от заболевания ящуром: около 80% мышей при парентеральной и 70% при оральной иммунизации. Структурный белок VP1 вируса ящура также был получен в трансгенных растениях вида Stylosanthes guianensis cv. Reyan II (Wang et al., 2008) с уровнем экспрессии белка 0,1-0,5% всех растворимых белков растений. Более высокий уровень экспрессии белка VP1 (2-3%) удалось получить в хлоропластах табака (Li et al., 2006). Для увеличения количества антигенного материала в тканях растений в хлоропластах зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii был получен белок VP1, слитый с В-субъединицей токсина холеры. Однако, несмотря на высокий уровень экспрессии такого белка (около 3-4% от всех растворимых белков клеток), экспериментов по иммунизации животных не проводилось (Sun et al., 2003). Но, несмотря на то, что белок VP1 или его отдельные эпитопы были получены в растениях на уровне, позволяющем их выделение, многочисленные эксперименты показывают, что иммунизация вакцинами, на основе таких белков часто не эффективна (Krebs et al., 1993; Rodriguez et al., 2003; Taboga et al., 1997). Поэтому полноценной вакцины до настоящего времени получено не было. ВПЧ ящура содержат в себе полный набор эпитопов вируса и по эффективности могут сравниться с традиционными вакцинами. Поэтому были предприняты попытки получения таких ВПЧ в растениях. Например, предшественник белка Р1 удалось экспрессировать в трансгенном рисе (около 0,1% всех растворимых белков растения). Было показано, что мыши, иммунизированные внутрибрюшинно экстрактом из трансгенного риса, были защищены от заражения, в то время как только 20% мышей было защищено при оральной иммунизации (Wang et al., 2012). В одном из исследований были получены трансгенные томаты, продуцирующие предшественник капсидных белков P1 с пептидом 2A и 51 протеазой 3Cpro. Экстракты, полученные из листьев таких растений, индуцировали иммунный ответ у морских свинок при внутримышечном введении (Pan et al., 2008). Однако уровень накопления таких белков в растениях был очень низок, и детектировать образование ВПЧ биохимическими и иммунологическими методами авторам не удалось. В приведенных работах для получения ВПЧ ящура использовали трансгенные растения. Однако, по причине очень низкого уровня их экспрессии в таких растениях, достоверно детектировать и выделить ВПЧ не удалось. Сложность создания эффективной системы, обеспечивающей синтез капсидных белков на достаточном уровне и сборку полноценных капсидов из отдельных капсидных белков в растительных клетках, также подчеркивает немногочисленность работ по данной тематике. Таким образом задача по получению ВПЧ ящура в растениях остается актуальной. Растительная система экспрессии имеет множество преимуществ перед другими системами. Полученные данные показали, что в растениях можно получать вакцинные белки вируса ящура, иммунизация которыми приводила к индукции иммунного ответа у лабораторных животных и в некоторых случаях защищала их от последующего заражения вирусом. Однако, успешно работающей системы получения вакцинных белков ящура в растениях на сегодняшний день нет, что связано, прежде всего, с недостаточным уровнем накопления целевых белков или с низким уровнем иммуногенности полученных белков. В большей части работ, посвященным получению вакцинных белков ящура, для получения таких белков использовали трансгенные растения. Однако, трансгенные растения в качестве системы экспрессии имеют ряд недостатков, наиболее существенный из которых – низкий уровень экспрессии целевого гена. Одной из альтенатив использования трансгенных растений является транзиентная экспрессия белков в растительных тканях с использованием фитовирусных векторов. Такой подход, на сегодняшний 52 день, является одним из самых эффективных, экономичных и простых методов, позволяющих количества целевого белка. быстро получать в растениях значительные 53 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы Escherichia coli штаммы JM109, Rosetta2. Agrobacterium tumefaciens штаммы EHA105, C58C1. Среды, реактивы, ферменты Бактерии E.coli штамма JM109, использованного для клонирования, выращивали на чашках Петри с LB агаром или в колбах с LB бульоном (Sambrook, 1989) при 37°С. В среды добавляли соответсвующие антибиотики: ампициллин (50 мкг/мл), канамицин (50 мкг/мл), хлорамфеникол (30 мкг/мл). В работе использовали термостабильные ДНК полимеразы Phusion компании Finzymes (Финляндия) и Go-Taq (Promega, США), эндонуклеазы рестрикции, Т4 ДНК лигазу, производства компаний Fermentas (Литва) и Сибэнзим (Россия) в условиях, рекомендованных производителем. Дизайн и синтез рекомбинантного гена Для дизайна последовательности ДНК рекомбинантного гена, кодирующего белок, состоящий из слитых эпитопов вируса ящура, была составлена химерная аминокислотная последовательность. Она представляла собой комбинацию В- и Т- клеточных эпитопов, разделенных глицинбогатыми линкерами. На её N-конец была добавлена аминокислотная последовательность хитин-связывающего домена. «Обратная трансляция», оптимизация кодонового состава и добавление фланкирующих и внутренних сайтов рестрикции были осуществлены с помощью компьютерной программы Gene Designer компании DNA 2.0 Inc. (США). ДНК гена была синтезирована компанией Евроген (Россия). 54 Синтетические олигонуклеотиды (5′-3′) В работе были использованы следующие синтетические олигонуклеотиды: Для получения конструкции pA7248AMVP1uGFP: AscIP1+ TGACGGCGCGCCATGGGCGCCGGGCAATCCAG P1uGFPXmaI- TGACCCCGGGCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCA PR1 ACTGCTGCCGCCGCCGCCCTTGAGCAGGTTAAAGTTCAA AAGCTGTTTCACAGGCGC GR1 CAGGCCGTGCTTGGACTGGGCACTGCTGCCGCCGCCGCC CT GF AGGGCGGCGGCGGCAGCAGTGCCCAGTCCAAGCACGGC CTG Для получения конструкции pCCa3CintR: PmeI3C+ TGACGTTTAAACAATGTCTGGTGCTCCTCCTACTGATC 3CPstI- TGACCTGCAG TCAAGGGTCA ATATGTGCCT TCATCT Для получения конструкций pET23а-VP0, pEТ23а-VP3, pET23а-VP1: VP0FNde6H GACTCATATGCATCATCACCATCACCATGGCGCCGGGC AATCCAGCCC VP0RSal CTGAGTCGAC CTA TTCCTTCGAAGGGAACTCAC VP3FNde6H GACTCATATGCATCATCACCATCACCATGGCATCTTCCC CGTCGCATG VP3RXho CTGACTCGAG CTA CTGTGTGCGAATTGCGTCAA VP1FNde6H GACTCATATGCATCATCACCATCACCATACCACATCTAC CGGTGAGTC VP1RSal CTGAGTCGAC CTA CTGTTTCACAGGCGCCACAA Для получения клостеровирусных конструкций: pavr1+ GGCCAAGGCCTAGGTAGTTG pAVRP2+ GGCCAAGGCCTAGGTAGTTGGTTTGGGGACGGTAA CATTATAC 55 pPVP0- CTGGATTGCCCGGCGCCCATAATTCAAACCTAGTAA ATGTATC pPVP0+ GATACATTTACTAGGTTTGAATTATGGGCGCCGGGCA ATCCAG pVP0P1- GTATAATGTTACCGTCCCCAAACCAAGGATCCCTATTC CTTCGAAGGGAACTCACCC pBAMP1+ GGGTGAGTTCCCTTCGAAGGAATAGGGATCCTTGGTTT GGGGACGGTAACATTATAC pPVP3- GCCACGGGGAAGATCCCCATAATTCAAACCTAGTAA ATGTATC pPVP3+ GATACATTTACTAGGTTTGAATTATGGGGATCTTCCCC GTGGC pVP3P- GTATAATGTTACCGTCCCCAAACCAGGCGATCGCCT ACTGCGTGCGAGCGTCAACTG pASIP+ CAGTTGACGCTCGCACGCAGTAGGCGATCGCTTGGTTT GGGGACGGTAACATTATAC pPVP1- TCACCTGTGGAGGTGGTCATAATTCAAACCTAGTAAA TGTATC pPVP1+ GATACATTTACTAGGTTTGAATTATGACCACCTCCAC AGGTGA pVP12a1- CCAACTTGAGCAGGTTAAAGTTCAAAAGCTGTTTCA CAGGCGCCACAATC pVP12a2- AAACCTAAGGGTTGGACTCGACGTCTCCTGCCAACTT GAGCAGGTTAAAG pVP12a3- ATATAGGCCTCCGGTCCGCGCAAGAGATACGGGAG TTTAAACCTAAGGGTTGGACTCG pVP1- ATATAGGCCTCCGGTCCGCGCAAGAGATACGGGAGTT TAAACCTACTGTTTCACAGGCGCCACAAT Для получения конструкции pET23a-HPE: 56 m13f CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC M13R CAGGAAACAGCTATGAC pHisPE ACCTTGGGCGCGCCCATATGCATCATCACCATCAC CATATAA TCAATAACTATTATATG PVXseq456 GAGAGAAATTGGCAAGGGCT PVXdAvr CAGTCAGGCGCATAATTGAT Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Для амплификации фрагментов ДНК, необходимых для создания конструкций, описанных в данной работе использовали метод ПЦР. Амплификацию проводили с ферментами Phusion (Finzymes) и Pfu (Fermentas) в течение 25-30 циклов, согласно рекомендациям производителя. Обработка ДНК рестриктазами Обработку ДНК рестриктазами проводили с использованием прилагающихся к ферментам буферов. ДНК обрабатывали рестриктазами в соответствующем буфере при 37°С в течение 1-12 часов. Электрофорез ДНК в агарозном геле Электрофорез ДНК проводили в гарозном геле (0.8%) в буфере 1x TАЕ (Sambrook, 1989), содержащем бромистый этидий (0,1 мг/мл). В качестве маркера для определения молекулярных масс фрагментов ДНК использовали смесь GeneRuler™ DNA Ladder Mix (Fermentas, Литва). Режим проведения электрофореза – 120 В, стабилизация по напряжению. Выделение ДНК из агарозного геля Выделение фрагментов ДНК из геля производили с помощью набора фирмы QIAGEN (Германия), согласно рекомендациям производителя. 57 Лигирование фрагментов ДНК Лигирование проводили при температуре 4°С в течение 16 часов. Реакционная смесь содержала необходимое количество лигируемых фрагментов ДНК, 1х лигазный буфер, 0,3 Ед/мкл ДНК-лигазы фага Т4. Затем реакционную смесь использовали для трансформации клеток E. coli. Трансформация E. сoli Для получения компетентных клеток штаммов Rosetta 2 и JM109 и их трансформации использовали модифицированную методику (Inoue et al., 1990). Для трансформации клеток в ледяной бане к 100 мкл компетентных клеток добавляли 0,5 мкл препарата плазмидной ДНК или 1-20 мкл лигазной смеси. Клетки выдерживали 20 минут при 0°С, затем подвергали тепловому шоку в течение 1,5 минут при 42°С и охлаждали во льду 5 минут. Далее добавляли 400 мкл SOC-среды без антибиотиков и инкубировали 30-45 мин при 37°С при постоянном перемешивании. Затем сеяли весь объем клеток на чашки Петри с 25 мл LB-агара с добавлением соответствующих антибиотиков. Чашки инкубировали при 37°С в течение 12 часов. Выделение плазмидной ДНК из E.coli Для выделения плазмидной ДНК использовали стандартные методики, основанные на щелочном лизисе (Sambrook, 1989), с модификациями. Для выделения ДНК брали 40 мл ночной культуры. Клетки осаждали при 4000 об/мин в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в 3 мл деионизованной воды, добавляли 3 мл лизирующего буфера II, перемешивали, выдерживали при комнатной температуре 4 минуты. Затем добавляли 3 мл нейтрализующего буфера III, тщательно перемешивали, и выдерживали 15 минут при -20°С. Затем центрифугировали при 8000 об/мин 10 минут. Отбирали примерно 9 мл супернатанта. Добавляли 4,5 мл изопропанола, перемешивали, выдерживали 5 минут при комнатной 58 температуре и центрифугировали при 6000 об/мин 10 минут, отбирали верхнюю фазу. Осадок промывали: добавляли 3 мл 75% этанола, центрифугировали при 6000 об/мин 10 минут, отбирали верхнюю фазу. Осадок высушивали до полного испарения этанола (примерно 30 мин), осадок растворяли в 500 мл деионизованной воды до полного растворения (примерно 15 мин), затем добавляли 500 мкл 8М LiCl, тщательно перемешивали, выдерживали в течение 30 мин при температуре -20°С. Центрифугировали при 14000 об/мин 5 минут. К 1 мл отобранного супернатанта добавляли 500 мкл изопропанола (1/2 объема супернатанта), тщательно перемешивали, выдерживали 5 минут при комнатной температуре, центрифугировали при 14000 об/мин 5 минут. Надосадочную жидкость отбирали и осадок промывали 150 мкл 75%-го этанола, центрифугировали при 14000 об/мин 5 минут. Осадок высушивали до полного испарения этанола (примерно 5 мин), затем растворяли в 50-200 мкл деионизованной воды. Электрофорез в полиакриламидном геле Электрофорез в полиакриламидном геле и приготовление образцов проводили по стандартному методу (Sambrook, 1989). Использовали 4% концентрирующий и 10% разделяющий полиакриламидные гели. Режим проведения электрофореза: 15 мА, 295 В, стабилизация по току. Белки в геле окрашивали красителем Coomassie G-250, разведенным в 7% растворе уксусной кислоты, в течение 30 мин при комнатной температуре с перемешиванием. Отмывку геля проводили в 7% растворе уксусной кислоты при комнатной температуре. Экспрессия белка в клетках E. coli методом самоиндукции Для получения эффективной экспрессии белка применяли метод самоиндукции (Studier, 2005) с модификациями. 59 Трансформировали клетки Rosetta2 и сеяли на чашки Петри с 25 мл агара LB, 1% глюкозой и антибиотиками (хлорамфеникол, ампицилин). Чашки инкубировали в течение 12 часов при 37°С. Одиночные колонии с чашки переносили в 2 мл среды ZYP-0.8G с соответствующими антибиотиками, культуры растили 7 часов при температуре 37°С при постоянном перемешивании. Из полученной культуры получали культуру для инокуляции: 300 мкл культуры перемешивали с 100 мкл 75% глицерина и хранили при -80°С. 5 мкл культуры клеток (или культуры для инокуляции) сеяли в 2-50 мл среды ZYP-5052 с нужными антибиотиками и растили при температуре 21°С, 28°С или 37°С в течение 12-48 часов. Измеряли плотность культуры и образцы наносили на полиакриламидный гель в 1х SB из расчета 200 мкл 2хSB на 200мкл клеток с оптической плотностью (ОП600) 5,0. Определение растворимости бактериального белка Для определения растворимости бактериального белка, полученного методом самоиндукции, 50 мл культуры индуцированных клеток центрифугировали при температуре 4°С при 5000 об/мин 10 мин. Осадок ресуспендировали в 900 мкл буфера АВ. Суспензию инкубировали во льду в течение 30 мин с лизоцимом (50 мк/мкл) и обрабатывали ультразвуком до полного разрушения клеток. Лизат центрифугировали при 14000 об/мин и отделяли супернатант от осадка, затем образцы супернатанта и осадка, ресуспендированного в 900 мкл буфера АВ, наносили на полиакриламидный электрофорез. Буфер АВ: 50 мМ NaP pH 8.0; 10 мМ EDTA pH 8.0; 5 мМ 2-Меркаптоэтанол; 2% глицерин; 1 мМ PMSF. 60 Трансформация агробактерий Для получения компетентных клеток штамма EHA105 и их трансформации использовали стандартную методику (Sambrook, 1989). Для трансформации в ледяной бане к 100 мкл компетентных клеток добавляли 0,5 мкг плазмидной ДНК. Клетки выдерживали 5 минут при 37°С, затем добавляли 500 мкл среды LB и инкубировали 4 часа при 27°С при постоянном перемешивании. Затем высевали весь объем клеток на чашки Петри с 25 мл LB-агара с добавлением антибиотиков (канамицин (50 мкг/мл), рифампицин (15 мкг/мл) и гентамицин (25 мкг/мл).). Чашки инкубировали при 27°С в течение 3-4 дней. ПЦР–скрининг ПЦР–скрининг проводили для подтверждения наличия нужной вставки в плазмидной ДНК агробактерий. Для ПЦР–скрининга использовали Go-Taq-полимеразу (Promega, США). Амплификацию проводили в течение 30 циклов. Состав реакционной смеси для каждой реакции был следующим: 1хGreen-буфер; 2,5 мМ MgCl2; Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) в конечной концентрации 0,2 мМ каждого; 0,5 мкМ прямого праймера; 0,5 мкМ обратного праймера; 1,25 Ед Go-Taq-полимеразы; 1мкл клеточной культуры агробактерии. Режим для амплификации: Начальная денатурация – 94°С 30 с Денатурация – 94°С, 30с Отжиг – 42°С, 30с 61 Наращивание цепи – 72°С, 2мин Достройка цепи – 72°С, 2мин Агроинфильтрация растений Агробактерии (единичную колонию) с чашки Петри сеяли в 3 мл среды LB с антибиотиками (канамицин, рифампицин, гентамицин) и с 10мМ MES, выращивали 12 часов на качалке при 27°С. Клетки осаждали при 4000 об/мин в течение 5 минут, осадок ресуспендировали в 500 мкл индуцирующего буфера. Определяли оптическую плотность, готовили суспензию клеток в индуцирующем буфере с оптической плотностью (ОП600) 0,2.Выдерживали 3 часа при комнатной температуре. Шприцом без иглы вводили суспензию агробактерий в листья растений. Индуцирующий буфер: 10mM MgSO4 10mM MES(2-(N-Морфолино)-этансульфоновая кислота) 150 мкМ ацетосирингона Приготовление образцов растительного материала для электрофореза Образцы ткани растения готовили из зоны листа, инокулированной культурой клеток агробактерии. Для этого 50 мг свежего листа растирали в ступке с добавлением 50 мкл S-буфера. Добавляли 100 мкл 2хSB, прогревали 5 мин при 95°С, центрифугировали 5 мин при 14 000 об/мин и 10 мкл наносили на полиакриламидный гель. 1М Na-фосфатный буфер рН 7.0: 61% Na2HPO4; 39% NaH2PO4; S буфер: 50 мМ Na-фосфатный буфер рН 7.0; 10 мМ β-Меркаптоэтанол; 62 10 мМ Этилендиаминтетрауксусная кислота; 0,1% Тритон Х-100. Фенольная экстракция белков из образцов растительного материала 300 мг свежего листа растирали в ступке с добавлением 1,5 мл буфера для экстракции и 1,5 мл фенола, насыщенного ацетатом аммония. 2 мл суспензии переносили в пробирку, центрифугировали 5 мин при 14 000 об/мин при 4°С. Отбирали фенольную фазу и три раза промывали однократным объемом буфера для реэкстракции. Затем добавляли пять объемов холодного метанола с ацетатом аммония и оставляли на 12 часов при -20°С. После этого центрифугировали 10 мин при 14 000 об/мин при 4°С. Супернатант отбирали, осадок трижды промывали 0,5 мл холодного метанола и один раз холодным ацетоном. Высушенный при комнатной температуре осадок растворяли в 300 мкл 8М мочевине pH 8.0 при 95°С. Добавляли 300 мкл 2хSB, прогревали 5 мин при 95°С, центрифугировали 5 мин при 14 000 об/мин и необходимое количество образца наносили на полиакриламидный гель. Фенол три раза насыщали 0,1 М ацетата аммония, 0,01 М дитиотреитола (ДТТ) Буфер для экстракции: 0,08 М Tris pH 6.8; 0,001 M DTT; 0,01 M EDTA; 2% SDS; 0,5 мM PMSF (добавляли непосредственно перед применением). Буфер для реэкстракции: 0,08 М Tris pH 6.8; 0,001 M DTT; 0,01 M EDTA; 63 0,1 М ацетат аммония; В случае необходимости рН доводили до 6.8 уксусной кислотой. Экстракция белков гуанидином гидрохлоридом из образцов растительного материала 150 мг свежего листа растирали в ступке с добавлением 600 мкл 6М GuHCl. Центрифугировали 5 мин при 14 000 об/мин, отбирали 300 мкл супернатанта. К нему добавляли 1,5 мл метанола насыщенного ацетатом аммония и выдерживали 2 часа при -20°С, после чего центрифугировали 10 мин при 14 000 об/мин при 4°С. Отбирали супернатант, осадок промывали сначала 800 мкл холодного метанола, затем 800 мкл холодного ацетона. Осадок, высушенный при комнатной температуре, растворяли в 300 мкл 8М мочевине pH 8.0 при 95°С. Добавляли 300 мкл 2хSB, прогревали 5 мин при 95°С, центрифугировали 5 мин при 14 000 об/мин и необходимое количество образца наносили на полиакриламидный гель. Фракционирование листового материала 400 мг свежего листа растирали в ступке с добавлением 2 мл буфера GB и переносили в пробирку. Центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, отбирали супернатант. Осадок ресуспендировали в 1 мл буфера для экстракции. 200 мкл кашицы переносили в другую пробирку, центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин. Отбирали супернатант, к осадку добавляли 150 мкл 8 М мочевины pH 8.0. Добавляли 150 мкл 2хSB, прогревали 5 мин при 95°С, центрифугировали 5 мин при 14 000 об/мин и необходимое количество образца наносили на полиакриламидный гель. Буфер для фракционирования GB: 100 мM Tris pH 8.0; 0,4 M сахароза; 10 мМ KCl; 64 5 мМ MgCl2; 10 мМ β-меркаптоэтанола; 0,5 мM PMSF (добавляли непосредственно перед применением). Выделение и очистка рекомбинантного бактериального белка Бактериальный белок с шестью аминокислотными остатками выделяли в денатурирующих условиях с помощью аффинной хроматографии на NiNTA сефарозе (Promega) модифицированным на методикам колонке (QUAGEN, 10 17 и из Германия) руководства по The QIAexpressionist™ компании QIAGEN (Германия). Метод основан на аффинном взаимодействии рекомбинантного белка, включающего блок из 3-7 аминокислотных остатков гистидина, с никель-нитрилотриуксусной кислотой (Ni-NTA), выступающей в роли хелатора, и частиц сефарозы размером 20-70 мкм, выступающей в роли носителя. Для очистки белка 4 мл экспрессирующей клеточной культуры центрифугировали при 13000 об/мин 5 минут и осадок ресуспендировали в 750 мкл буфера А (из расчета 1 мл буфера на 80 мг осадка), перемешивали на вращающейся мешалке в течение 30 мин. Обрабатывали ультразвуком 6 раз по 30 сек с перерывами на 10 сек при мощности 200-300 W. Клеточный лизат центрифугировали при 14000 об/мин 15 мин и отбирали супернатант. Супернатант инкубировали с уравновешенной в 5 мл буфера А суспензией Ni-NTA сефарозы в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Переносили смесь лизата и сорбента в колонку. Промывали сорбент 5 мл буфера А, двукратно 5 мл буфера В, двукратно 5 мл буфера С, 5 мл буфера D, 5 мл буфера Е. Элюировали белок 1,2 мл буфера F. Буфер А, рН 8.0: 100 мM NaH2PO4 10 мM Tris·НCl 6 M GuHCl; 65 Буфер В, рН 8.0: 100 мM NaH2PO4 10 мM Tris·НCl 8 M мочевина; Буфер С, рН 6.3: 100 мM NaH2PO4 10 мM Tris·НCl 8 M мочевина; Буфер D, рН 5.9: 100 мM NaH2PO4 10 мM Tris·НCl 8 M мочевина; Буфер Е, рН 4.5: 100 мM NaH2PO4 10 мM Tris·НCl 8 M мочевина; Буфер F: 6 M GuHCl 0.2 M уксусная кислота. pH растворов доводили непосредственно перед использованием. Определение количества белка методом Бредфорд Для определения содержания белка в образцах использовали реактив Бредфорд (Fermentas, Литва) в соответсвии с рекомендациями производителя. В качестве стандартов использовали растворы БСА в рекомендованных разведениях. 66 Иммунизация лабораторных животных препаратом НРЕ белка Полученным иммунизации очищенным лабораторных белком мышей, НРЕ для проводили получения следующие поликлональной антисыворотки. Иммунизацию проводили 3 раза с интервалом в две недели внутрибрюшинно. На первую и вторую иммунизации мышей использовали по 80 мкг белка НРЕ, на третью – 50 мкг белка. Первая иммунизация проводилась с полным адьювантом Фрейнда (Sigma, США), две последующие с неполным. Для иммунизации использовали препарат белка НРЕ в 4 М мочевине, 10 мМ Tris pH 8,0. Для предварительной оценки иммуногенности белка НРЕ, полученного в бактериях, группе из 7 морских свинок внутримышечно в задние конечности вводили масляную эмульсию с белком в количестве 300 мкг на одно животное. Второй группе из 7 свинок белок не вводили. Для оценки иммуногенности HPE белков масляную эмульсию вводили 3 группам морских свинок (каждая группа по 8 животных) внутримышечно в задние конечности с белками в разных дозах на одно животное: первой группе по 350 мкг белка; второй - по 120 мкг; третьей - по 40 мкг. Четвертая группа была контрольной - 8 морских свинок, которым белок не вводили. Иммунизацию проводили однократным введением НРЕ белка в 4 М мочевине, 10 мМ Tris pH 8.0 с масляным адъювантом Montanide ISA-70 фирмы SEPPIC (Франция). Непрямой метод иммунного ферментного анализа (ИФА) Непрямой варианта ИФА проводили по стандартной схеме с некоторыми модификациями. О/Приморский/00 перевиваемой и О/Маниса, культуры клеток Антигены вируса получали из ПГСК-30 в ящура суспензии процессе штаммов зараженной преципитации инактивированных вирусных частиц 8% раствором полиэтиленгликоля (м.м. 6000 Д) с добавлением NaCl до конечной концентрации 0,9%, и обработки 67 хлороформом (преципитат антигена вируса ящура) с последующей очисткой и концентрированием антигена ультрацентрифугированием через 20% раствор сахарозы (антиген вируса ящура). Препараты антигена анализировали электрофоретически. Электрофорез препаратов антигена вируса ящура проводили в 12%-15% полиакриамидном геле (Sambrook, 1989). Концентрированный и очищенный антиген вируса ящура адсорбировали в лунках 96-луночного полистиролового планшета фирмы «Nunc» MaxiSorp (Дания) в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 1-2 мкг белка на лунку. Несвязавшиеся с антигеном участки в лунках планшет блокировали буфером БСА-ТБСТ, содержащим 0,02М ТрисНСl, 0,15М NaCl, 0,05% Твин-20 и 1% бычий сывороточный альбумин (БСА). Пробы наносили на планшет в буферном растворе ТБСТ, дополненном 5% фетальной сывороткой (ФС-ТБСТ), методом двукратных последовательных разведений и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После 4-кратного промывания планшета буферным раствором ТБСТ в каждую лунку вносили по 50 мкл антивидового иммунопероксидазного конъюгата (производство филиала «МЕДГАМАЛ» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), разведенного в ФС-ТБСТ 1:1000, и инкубировали еще 30 мин при 37ºС. Затем планшет снова промывали. Окрашивание производили с помощью субстратной смеси АБТС. Через 10-15 мин. реакцию останавливали 1% раствором додецил сульфата натрия. Реакцию учитывали с помощью многоканального спектрофотометра путем измерения оптической плотности (ОП) при длине волны 405 нм. Титром сыворотки считали конечное разведение, в котором ОП лунки было меньше или равно удвоенному среднему значению ОП отрицательного контроля. В качестве референтного теста для выявления антител против вируса ящура типа О использовали Ceditest® О FMDV (Cedi-Diagnostics B.V., Нидерланды), рекомендованный для использования Всемирной 68 Организацией здравоохранения Животных (OIE). Тест проводили согласно инструкции производителя. Положительным считали значение процента ингибирования (PI) больше или равного 50%. Микрометод реакции нейтрализации (РМН) РМН проводили на культуральных 96-луночных планшетах фирмы «Costar» в перевиваемой культуре клеток почки свиньи IB-RS-2 против 100 ТЦД50 культурального вируса ящура типа О/Тайвань/99. Перед постановкой реакции сыворотки крови морских свинок разводили 1:4 поддерживающей средой Игла и инактивировали при температуре 56°С 30 мин для удаления неспецифических ингибиторов. Сыворотки титровали двукратным шагом, начиная с разведения 1:16, добавляли равный объем рабочей дозы вируса ящура и выдерживали на контакте 1 час при температуре 37°С. Затем в лунки планшет вносили суспензию культуры клеток с концентрацией 0,8×106 клеток/см3. Планшеты выдерживали 48 часов в СО2-инкубаторе при 5% СО2 и температуре 37°С. Реакцию учитывали под инвертированным микроскопом, титр сыворотки рассчитывали по методу Кербера. Вируснейтрализующим титром антител исследуемой сыворотки считали предельное разведение сыворотки, при котором происходила нейтрализация инфекционного действия 100 ТЦД50 вируса в 50% зараженной культуры клеток IB-RS-2. Положительными считали сыворотки с активностью антител в разведении 1:45 и выше. Заражение морских свинок вирусом ящура Через 21 или 28 дней после иммунизации группы морских свинок были подвергнуты контрольному заражению адаптированным к этим животным вирусом ящура О/Тайвань/99 гомологичным вакцинному штамму интрадермально в плантарную поверхность задних лапок в дозе 104,0 ГД50/0,2 см3. Учет результатов заражения проводили через 3, 5 и 7 суток и оценивали 69 по генерализации ящурного процесса. Генерализацией считали образование вторичных афт на передних лапках, в которые не вводили вирус. Контроль вакцины считали действительным, если из 8 не вакцинированных свинок генерализованной формой заболевали не менее 7 животных. Для оценки достоверности полученных результатов иммунизации использовали биноминальный тест с уровнем значимости (α) равным 0,005. Выделение и очистка растительного рекомбинантного белка Растительный белок с шестью аминокислотными остатками выделяли в денатурирующих условиях на Ni-NTA сефарозе (Promega) на колонке (QUAGEN) по методике, описанной для выделения бактериального белка, с изменением: навеску свежих листьев растения, экспрессирующих рекомбинантный белок, растирали до образования однородного порошка в жидком азоте. Солюбилизацию осуществляли в буфере А из расчета 1 мл на 1,5 г. Определение оптимального разведения сыворотки методом дот блоттинга Белковые препараты (по 1 мкл) наносили на полоски мембраны Hybond-P (Amersham) микропипеткой и давали высохнуть. Обработка мембраны после нанесения образцов аналогична обработке при вестерн-блоттинге. Вестерн-блоттинг Перенос белков из полиакриламидного геля на мембрану Hybond-P (Amersham) осуществляли методом электроблоттинга в течение 1,5 часов при силе тока 80мА и максимальном напряжении (стабилизация по току). После переноса белков, для исключения неспецифического связывания антител с мембраной, ее обрабатывали TBST в течение 2 минут или 5% 70 раствором сухого молока в течение 1 часа. После этого мембрану отмывали в буфере TBSt три раза в течение 5 мин. После отмывки мембрану обрабатывали первичными антителами - сывороткой мышей, разведенными в TBSt буфере в 10000 раз в течение 1 часа с покачиванием. Мембрану отмывали буфером TBSt три раза по пять минут, затем обрабатывали вторичными противо-мышиными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена или со щелочной фосфотазой, разведенными в TBSt буфере в 5000 раз в течение 1 часа. Затем отмывали мембрану буфером TBSt три раза по пять минут. После отмывки мембрану проявляли. При использовании вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, детекцию специфических белковых комплексов проводили с использованием набора Western Blott ECL Plus (Amersham). При использовании вторичных антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой мембрану проявляли субстратом BSIP-T/NBT, приготовленном на AP буфере (но 10мл АР буфера добавляли 33 мкл BSIP-T и 44 мкл NBT). Использованные растворы: TBST 10 mM Tris-HCl pH 7.5 500 mM NaCl 2% Tween 20 TBSt 10 mM Tris-HCl pH 7.5 500 mM NaCl 0.05% Tween 20 AP буфер 100мМ Tris, pH9,5 100 мМ NaCl 50мМ MgCl2 71 BSIP-T: 50 мг/мл, растворяли в 100% диметилфомамиде; NBT: 75 мг/мл, растворяли в 75% диметилфомамиде. Получение фотографий флуоресценции клеток с помощью конфокальной микроскопии Для получения фотографий флуоресцении клеток, экспрессирующих свободный uGFP и P1uGFP был использован конфокальный микроскоп Leica TCS SP2 . Для детекции флуоресценции uGFP был использован лазер 488 нм, для детекции автофлуоресценции хлорофилла был использован лазер 543 нм. Флуоресценцию собирали в диапазонах длин волн 500-552 нм и 606-725 нм, соответственно. 72 РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Изучение возможности получения пустых капсидов ящура в растениях 1.1 Экспрессия предшественника капсидных белков Р1-2А в растениях N. benthamiana Для детекции предшественника капсидных белков вируса ящура или продуктов его протеолитического расщепления в тканях растений, необходимо было получить соответствующие антитела. Для этого были созданы конструкции, кодирующие последовательности индивидуальных капсидных белков вируса (VP0, VP1 и VP3) для их экспрессии в бактериях E. coli. Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки VP0, VP1 и VP3, были амплифицированы на матрице кДНК вируса ящура (переданного ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир) с праймерами VP0FNde6H и VP0RSal, VP3FNde6H и VP3RXho, VP1FNde6H и VP1Rsal, соответственно. С помощью ПЦР на Nконец каждого из белков была добавлена последовательность из стартового кодона и шести гистидиновых остатков для возможности очистки белка. Полученные фрагменты были клонированы в плазмиду pET23a(+) (Novagen): белки VPO и VP1 по сайтам рестрикции NdeI/SalI, VP3 – NdeI/XhoI. Правильность нуклеотидных последовательностей pET23a-VPO, pET23a-VP1 и pET23a-VP3) вставок была (плазмиды подтверждена секвенированием. Полученные плазмиды использовали для трансформации клеток E.coli штамма Rosetta2. Экспрессия индивидуальных капсидных белков осуществляли методом самоиндукции при температуре 37оС в течение 48 часов. Белки, полученные в клетках Е. coli, выделяли методом хроматографии на Ni-NTA сефарозе в денатурирующих условиях с солюбилизацией в буфере А. Белок элюировали минимальным объемом 73 буфера F, содержание белка во фракциях определяли методом Бредфорд. Фракции элюата, содержащие максимальное количество белка, диализовали против раствора, содержащего 4 М мочевину и 10 мМ Tris-HCl (pH 8.0) (Рис. 4). Из 100 мл культуры получили около 1 мг каждого из капсидных белков. Иммунизацию мышей полученными белками проводили в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс». Полученные сыворотки были протестированы методом иммуноферментного анализа и были использованы нами для выявления капсидных белков с помощью вестерн-блоттинга. Полученные сыворотки были протестированы методами ИФА и дотблот анализа. Рабочее разведение сывороток вестрн-блотте было 1:10000. Рис. 4. Препараты выделенных и очищенных белков VP0, VP1 и VP3, полученных в клетках E. coli: 1 – Маркер молекулярного веса; 2,3,4 – препараты очищенных белков VP0, VP1 и VP3, соответственно; стрелками указаны положения белков. Для экспрессии предшественника в растениях был использован вектор, созданный на основе Х вируса картофеля, – pA7248AMV (Марданова и др., 2009). Для получения предшественника капсидных белков вируса ящура в растениях на основе бинарного вектора pA7248AMV была получена конструкция, кодирующая последовательности предшественника капсидных белков P1 и автокаталитического пептида 2A вируса ящура изолята 74 О/Тайвань/99. Для визуальной оценки количества зараженных клеток и локализации предшественника Р1-2A в клетках растений соответствующая ему последовательность была слита с геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок (GFP) Zoanthus Последовательности sp.. соответствующих генов были амплифицированы с помощью ПЦР. В качестве матрицы для амплификации предшественника была использована кДНК вируса ящура, предоставленного ФГУ ВНИИЗЖ (г. Владимир), амплификацию проводили с помощью двух пар праймеров: AscIP1+ и PR1, VP1FNde6H и GR1. Ген GFP амплифицировали с помощью праймеров GF и P1uGFPXma на плазмиде pCCauGFP, полученной ранее в нашей лаборатории. Амплифицированные фрагменты были лигированы с вектором pA7248AMV по сайтам рестрикции AscI/XmaI. Правильность нуклеотидной последовательности полученной конструкции (pA7248AMVP1uGFP), кодирующей последовательность предшественника P1 с автокаталитическим пептидом 2A и GFP, была подтверждена секвенированием. Схема конструкции pA7248AMVP1uGFP приведена на Рис. 5. Рис. 5. Схема конструкции pA7248AMVP1uGFP. Полученную трансформации плазмиду А. использовали pA7248AMVP1uGFP tumefaciens штамма C58C1. Для для экспрессии предшественника Р1-2А, слитого с GFP, листья растения N. benthamiana инокулировали смесью культур агробактерий, трансформированных конструкцией pA7248AMVP1uGFP и полученной ранее в нашей лаборатории конструкцией pCCap24, кодирующей супрессор РНК-сайленсинга p24 вируса 75 ассоциированного с скручиванием листьев винограда 2 (GLRaV-2), клонированный в модифицированную плазмиду pCambia под контролем 35S промотора. Для оценки уровня экспресии предшественника вторую половину того же листа инокулировали трансформированных смесью конструкцией культур pCCauGFP, агробактерий, экспрессирующей свободный GFP, и pCCap24. Поскольку уровень экспрессии белка в растениях может варьировать от растения к растению и неодинаков в листьях разного возраста, сравниваемыми конструкциями инокулировали не менее трех листьев на разных растениях. Поскольку предшественник экспрессировался в виде слитого с GFP белка, количество зараженных клеток оценивали зрительно, используя флуоресцентный микроскоп. Агроинокулированные листья смотрели на четвертый день после инфильтрации. Количество зараженных клеток, экспрессирующих предшественник P1-2А, слитый с GFP, было лишь незначительно ниже количества клеток, экспрессирующих свободный GFP. Свободный GFP распределялся в клетках диффузно, в то время как GFP в составе слитого c предшественником белка образовывал тельца включения (Рис. 6), и только в одиночных клетках (менее 1% клеток) GFP был распределен диффузно. а б Рис. 6. Фотографии флуоресцении клеток, экспрессирующих свободный GFP (а) и GFP, слитый с предшественником Р1-2А (б), полученные с помощью конфокальной микроскопии. 76 Из тканей листьев в зонах агроинфильтрации были приготовлены образцы для белкового электрофореза. В качестве отрицательного контроля был использован образец тканей листьев, агроинокулированных смесями культур агоробактерий, трансформированных плазмидами pCCauGFP и pCCap24. Несмотря на видимую флуоресценцию GFP в листьях растений, инокулированных смесями культур агробактерий, трансформированных плазмидами pA7248AMVP1uGFP и pCCap24, видимых отличий в образцах листового материала выявить не удалось. Образцы для белкового электрофореза из тканей листьев в зонах агроинфильтрации, также были проанализированы с помощью вестернблоттинга с антителами против индивидуальных капсидных белков. С помощью вестерн-блоттинга удалось детектировать только индивидуальные капсидные белки, полученные в клетках E. coli или из препарата инактивированного вируса ящура, которые были использованы в качестве положительных контролей (Рис. 7). Рис. 7. Вестерн-блоттинг образцов, полученных из листьев, экспрессирующих белок P1uGFP: а-в - мембраны, обработанные антисыворотками против белков VP0, VP1, VP3, соответственно; 1 – Маркер молекулярного веса; 2 – образец ткани листа неинокулированного (здорового) растения; 3 – образец ткани листа из зоны, агроинокулированной культурой С58С1/рССар24; 4 - образец ткани листа из зоны, инокулированной смесью культур С58С1/рА7248AMVP1uGFP и С58С1/рССар24; 5 – препарат инактивированного вируса ящура; 6 – препараты очищенных белков VP0, VP1, VP3, полученных в E. coli, соответственно. 77 Образование телец включения, видимых в микроскоп, и отсутствие сигнала в образцах инокулированных листьев на вестерн-блоттинге свидетельствовало о возможной нерастворимости предшественника в денатурирующем SB-буфере для белкового электрофореза. Исходя из этого предположения, были получены образцы из листьев, экспрессирующих белок P1uGFP и из листьев контрольных растений, путем фракционирования листового материала с применением 8М мочевины, экстракции белков гуанидин гидрохлоридом или фенольной экстракцией. Полученные образцы были проанализированы с помощью верстерн-блоттинга с использование антител против индивидуальных капсидных белков (Рис. 8). На вестернблоттинге присутствовал свидетельствующий об сигнал экспрессии в в виде «шмера», растениях слитого косвенно с GFP предшественника Р1-2А в виде нерастворимого белка. Рис. 8. Вестерн-блоттинг образцов нерастворимых белков, полученных из листьев, экспрессирующих белок P1uGFP: а-в - мембраны, обработанные антисыворотками против белков VP0, VP1, VP3, соответственно; 1 – Маркер; 2 - инактивированный вирус ящура; 3, 4 – образцы белков листа экстрагированные 8М мочевиной, из зоны, инокулированной культурой С58С1/pCCaр24 и С58С1/рА7248AMVP1uGFP и С58С1/pCCaр24, соответственно; 5, 6 – образцы белков ткани листа, экстрагированные гуанидин гидрохлоридом, из зоны, инокулированной культурой клеток С58С1/pCCaр24 и С58С1/рА7248AMVP1uGFP и С58С1/pCCaр24, соответственно; 7, 8 – образцы белков ткани листа, экстрагированные фенолом, из зоны, агроинокулированной культурой С58С1/pCCaр24 и С58С1/рА7248AMVP1uGFP и С58С1/pCCaр24, соответственно. 78 1.2 Коэкспрессия предшественника P1-2А и протеазы 3Сpro в N. benthamiana Для процессирования предшественника Р1-2А с образованием капсидных белков необходима вирусная протеаза 3Cpro. Поэтому были получены конструкции, позволяющие экспрессировать предшественник капсидных белков Р1 и протеазу 3Cpro в растениях. С целью коэкспрессии протеазы 3Сpro с предшественником была получена конструкция, кодирующая последовательность протеазы. Для предотвращения возможной токсичности протеазы для клеток бактерий A.tumefaciens и E. coli в ее последовательность был вставлен интрон гена ADK1 (Adenosine kinase 1) из из Arabidopsis thaliana. Для амплификации последовательности 3Cpro с интроном в качестве матрицы использовали плазмиду pA7248AMV3CintR, сконструированную ранее в нашей лаборатории, и праймеры PmeI3C+ и 3CPstI-. Амплифицированный продукт был вставлен в плазмиду pCCa по сайтам рестрикции PmeI/PstI. Полученную плазмиду pCCa3CintR использовали для трансформации А. tumefaciens штамма C58C1. Для коэкспрессии предшественника Р1-2А, слитого с GFP, с протеазой 3Cpro листья растения N. benthamiana инокулировали смесью культур агробактерий, трансформированных конструкциями pA7248AMVP1uGFP, pCCa3CintR и pCCap24. В качестве контроля вторую половину листа инокулировали смесью культур агробактерий, трансформированных плазмидами pA7248AMVP1uGFP и pCCap24. На второй день после агроинокуляции листья, экспрессирующие протеазу, в местах инокуляции сильно желтели, на третий день появлялись видимые нектрозы, на шестой день листья полностью некротизировались. Количество зараженных клеток в листьях растений, инокулированных смесью агробактерий, трансформированных конструкциями 79 pA7248AMVP1uGFP и pCCa3CintR оценивали на четвертый день после инокуляции с помощью флуоресцентной микроскопии. Количество клеток, экспрессирующих слитый с GFP предшественник в растениях N. benthamiana, в контрольной области было значительно выше, чем в области, проинокулированной смесью культур агробактерий, трансформированных конструкциями для экспрессии предшественника и протеазы, где наблюдались множественные некрозы и были обнаружены лишь одиночные флуоресцирующие клетки. В небольшом количестве клеток (менее 1%) распределение GFP было диффузным, как и в случае экспрессии свободного GFP. Из тканей листьев в зонах агроинфильтрации были приготовлены образцы для белкового электорофореза, которые также были проанализированы с помощью вестерн-блоттинга с антителами против индивидуальных капсидных белков. С помощью вестерн-блоттинга удалось детектировать только индивидуальные капсидные белки, продуцированные в клетках E. coli или из препарата инактивированного вируса ящура, которые были использованы в качестве положительных контролей. На вестернблоттинге в образцах белков, полученных из зоны листа, инфильтрированного агробактериями с конструкциями, кодирующими последовательности предшественника Р1-2А и протеазы, сигнал не детектировался. При коэкспрессии предшественника с протеазой большая часть клеток (более 90%) в области, конструкциями, инокулированной смесью агробактерий с кодирующими предшественник и протеазу, некротизировалась, что было видно по специфической желто-зеленой флуоресценции, характерной для мертвых клеток. На основании этого результата можно предположить, что 3Сpro протеаза в свободном виде токсична для растений. 80 1.3 Экспрессия индивидуальных капсидных белков вируса ящура в растениях N. benthamiana На вестерн-блоттинге в образцах листьев, экспрессирующих предшественник капсидных белков Р1-2А и протеазу 3Cpro, сигналов, соответствующих индивидуальным капсидным белкам, не было. Также, 3Сpro протеаза в свободном характеризовалось виде, сильной видимо, токсична для некротической растений, что реакцией в листьях, экспрессирующих протеазу. Это означало, что процессинга предшественника с образованием индивидуальных капсидных белков в клетках растения не произошло. Поэтому для возможности сборки капсидов ящура необходимо было экспрессировать отдельные капсидные белки вируса VP0, VP1 и VP3 внутри одной клетке. Для пробной экспрессии индивидуальных капсидных белков был выбран вектор на основе клостеровируса ВТЦ (pCCaCdR1uGFP), полученный ранее в нашей лаборатории, позволяющий экспрессировать множественные гены даже под последовательностями идентичных промоторов (Folimonov et al., 2007). Для экспрессии индивидуальных капсидных белков вируса ящура в клетках растений на основе плазмиды pCCaCdR1uGFP были получены две конструкции, кодирующие последовательности капсидных белков вируса ящура под контролем индивидуальных субгеномных промоторов мажорного капсидного белка ВТЦ с автокаталитическим пептидом 2А и без него. Для визуальной оценки количества зараженных клеток в листьях растений в конструкции была включена последовательность, кодирующая белок GFP, с субгеномным промотором капсидного белка ВЖС. Конструкции получали с помощью метода ПЦР с перекрывающимися праймерами. На первом этапе последовательности капсидных белков VP0, VP3, VP1 и белка VP1 с пептидом 2A (VP1-2A) были амплифицированы на 81 матрице pA7248AMVP1uGFP с парами праймеров pPVP0+ и pVP0P1-, pPVP3+ и pVP3P-, pPVP1+ и pVP1-, pPVP1+ и pVP12a1-, соответственно. Также на матрице CTV-BC5/uGFP (Folimonov et al., 2007) с парами праймеров pAVRP2+ и pPVP0-, pBAMP1+ и pPVP3-, pASIP+ и pPVP1- был амплифицирован субгеномный промотор мажорного капсидного белка ВТЦ для белков VP0, VP3 и VP1 (для VP1-2A использовали промотор, полученный для VP1), соответственно. Последовательности промоторов были слиты с фрагментами, кодирующими белки, с помощью пар праймеров pavr1+ и pVP0P1-, pBAMP1+ и pVP3P-, pASIP+ и pVP1-, pASIP+ и pVP12a2-, соответственно. Затем фрагменты, кодирующие белки VP0 и VP3 с индивидуальными промоторами, были слиты с помощью праймеров pavr1+ и pVP3P-. Полученная последовательность (кодирующая VP0 и VP3 с индивидуальными промоторами) была слита с последовательностью промотора и белка VP1 с использованием пары праймеров pavr1+ и pVP1-, и промотора и белка VP1-2А с помощью праймеров pavr1+ и pVP12a3-. Один из полученных фрагментов, кодирующий последовательности белков VP0, VP3 и VP1 с промоторами был клонирован в плазмиду pCCaCdR1uGFP по сайтам рестрикции AvrII/PmeI (таким образом, была получена конструкция pCCaCd3CPuGFP). Второй фрагмент, кодирующий последовательности белков VP0, VP3 и VP1-2А и последовательностями промоторов также был вставлен в плазмиду pCCaCdR1uGFP по сайтам рестрикции AvrII/PmeI (конструкция pCCaCd3CP2auGFP). Наличие необходимых вставок в составе конструкций подтвердили с помощью рестрикционного анализа. Схема полученных конструкций представлена на Рис. 9. Таким образом, были получены конструкции на основе вирусного репликона ВТЦ, кодирующие капсидные белки ящура и белок GFP. Полученными плазмидами pCCaCd3CP2auGFP трансформировали А. tumefaciens штамма C58C1. и pCCaCd3CPuGFP 82 Для экспрессии капсидных белков в растениях листья растения N. инокулировали benthamiana трансформированных смесями конструкциями культур агробактерий, pCCaCd3CP2auGFP, рССар24 и pCCaCd3CPuGFP, рССар24. В качестве контроля вторую половину листа инокулировали смесью культур агробактерий, трансформированных исходной плазмидой pCCaCdR1uGFP и pCCap24. Рис. 9. Схемы конструкций pCCaCd3CPuGFP (а) и pCCaCd3CP2auGFP (б). На четвертый день после инокуляции количество зараженных клеток оценивали визуально с помощью флуоресцентной микроскопии. Количество клеток, экспрессирующих GFP в областях инокуляции листьев смесями культур агробактерий, трансформированных конструкциями pCCaCd3CP2auGFP, рССар24 и pCCaCd3CPuGFP, рССар24 было примерно равно количеству клеток в областях, инокулированных смесью культур агробактерий, трансформированных конструкциями pCCaCdR1uGFP и pCCap24. Распределение uGFP в клетках было диффузным. Из тканей листьев в зонах инфильтрации культурами агробактерий трансформированными клостеровирусными конструкциями, кодирующими капсидные белки вируса ящура, были приготовлены образцы для белкового электорофореза, которые также были проанализированы с помощью вестернблоттинга с антителами против индивидуальных капсидных белков. С 83 помощью вестерн-блоттинга удалось детектировать только белок VP0, который присутствовал в образцах листьев, проинокулированных смесями агробактерий, трансформированных конструкциями pCCaCd3CP2auGFP, рССар24 и pCCaCd3CPuGFP, рССар24 (Рис. 10). Рис. 10. Вестерн-блоттинг образцов, полученных из листьев, экспрессирующих индивидуальные капсидные белки: а-в - мембраны, обработанные антисыворотками против белков VP0, VP1, VP3, соответственно; 1 – Маркер молекулярного веса; 2 препарат инактивированного вируса ящура; 3 - образец тканей листьев из области, инокулированной смесью культур С58С1/pCCaCdR1uGFP и С58С1/pCCap24; 4 - образец тканей листьев из области, инокулированной смесью культур С58С1/pCCaCd3CPuGFP, С58С1/рССар24; 5 - образец тканей листьев из области, инокулированной смесью культур С58С1/pCCaCd3CP2auGFP, С58С1/рССар24. Отсутствие сигнала в образцах инокулированных листьев на вестернблоттинге могло свидетельствовать о нерастворимости белков VP1 и VP3. Поэтому путем фракционирования листового материала (с применением 8М мочевины) были инокулированы получены смесями образцы культур из листьев, агробактерий, которые были трансформированных конструкциями, pCCaCd3CP2auGFP, рССар24 и pCCaCd3CPuGFP, рССар24, а также из листьев, инокулированных контрольной конструкцией. Полученные образцы были проанализированы с помощью верстернблоттинга с использованием антител против индивидуальных капсидных белков (Рис. 11). На вестерн-блоттинг также были нанесены образцы 84 растворимых агробактерий, белков листьев, инокулированных трансформированных плазмидами смесями культур pCCaCd3CP2auGFP, рССар24 и pCCaCd3CPuGFP, рССар24. Рис. 11. Вестерн-блоттинг образцов, полученных из листьев, экспрессирующих индивидуальные капсидные белки: а-в - мембраны, обработанные антисыворотками против белков VP0, VP1, VP3, соответственно; 1 – Маркер молекулярного веса; 2 препарат инактивированного вируса ящура; 3 – нерастворимая фракция белков листьев, экстрагированная 8М мочевиной, из зоны, инокулированной культурами С58С1/pCCaCdR1uGFP и С58С1/pCCap24; 4 - нерастворимая фракция белков листьев, экстрагированная 8М мочевиной, из зоны, инокулированной культурами С58С1/pCCaCd3CPuGFP, С58С1/рССар24; 5 – образец белков листьев, экстрагированный 8М мочевиной, из зоны, инокулированной культурами С58С1/pCCaCd3CP2auGFP, С58С1/рССар24; 6 - образец растворимых белков листьев из зоны, инокулированной культурами С58С1/pCCaCd3CPuGFP, С58С1/рССар24; 7 - образец растворимых белков листьев из зоны, инокулированной культурами С58С1/pCCaCd3CP2аuGFP, С58С1/рССар24. На вестерн-блоттинге с полученными методом фракционирования образцам листьев, трансформированных инокулированных конструкциями смесями pCCaCd3CP2auGFP, агробактерий, рССар24 и pCCaCd3CPuGFP, рССар24 с антителами против белка VP1, присутствовал сигнал в виде «шмера», который отсутствовал в контрольном образце, полученном из листьев, инокулированных агробактериями с исходной конструкцией, что является косвенным подтверждением экспрессии белка VP1 в растениях в виде нерастворимого белка. На вестерн-блоттинге с 85 антителами против белка VP3 в образцах листьев, проинокулированных смесями агробактерий, трансформированных конструкциями pCCaCd3CP2auGFP, рССар24 и pCCaCd3CPuGFP, рССар24 сигнал не детектировался. В проинокулированных образцах смесями растворимых агробактерий, белков листьев, трансформированных плазмидами pCCaCd3CP2auGFP, рССар24 и pCCaCd3CPuGFP, рССар24, присутствовал сигнал против белка VP0, что подтвердило экспрессию этого белка в растениях в растворимом виде. 2. Получение полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях 2.1 Получение белка CBD-PE в клетках E. сoli При дизайне синтетического гена искусственного полиэпитопного белка НРЕ были использованы аминокислотные последовательности известных В-клеточных эпитопов структурных белков и Т-клеточных эпитопов неструктурных белков вируса ящура серотипа О/Тайвань/99, перечисленные далее. В-клеточные эпитопы: VP4 (21-40) (Zhang et al., 2007), VP1 (135-160) (Zamorano et al., 1994) и (200-213) (Van Lierop et al., 1992); Тклеточные эпитопы: 2C (68-76) (Barfoed et al., 2006), 3D (1-115) и (421-460) (García-Briones et al., 2004). Во избежание потенциальных проблем сворачивания белка, эпитопы были разделены «гибкими» глицин-богатыми линкерами G4S2. Для обеспечения возможности выделения и очисти белка в нативных условиях на N-конец такой химерной последовательности была добавлена аминокислотная последовательность хитин-связывающего домена Bacillus circulans с мутацией W42F, обеспечивающей обратимое связывание с хитином. «Обратная трансляция» полученной белковой последовательности была произведена с помощью программы Gene Designer компании DNA 2.0 Inc. (США). Для того чтобы повысить эффективность экспрессии 86 рекомбинантного белка кодоновый состав кодирующей последовательности ДНК был оптимизирован для экспрессии в растениях рода Nicotiana. Также при дизайне гена исключали возможность появления известных сайтов сплайсинга мРНК, которые могут распознаваться в клетках растений, сайтов рестрикции и сайтов метилирования ДНК. Для клонирования гена в экспрессионных векторах, на 5’-конец этой ДНК были добавлены последовательности сайтов рестрикции AscI и NdeI, а на 3’-конец - последовательности сайтов XhoI и XmaI. Внутрь рекомбинантного гена в позицию между последовательностью, кодирующей линкер, и последовательностью, кодирующей первый Т-клеточный эпитоп (т. е. между последовательностями, кодирующими В-клеточные и Т-клеточные эпитопы) была добавлена последовательность сайта EcoRI (Рис. 12). ДНК гена была синтезирована компанией Евроген (Россия) и получена в составе плазмиды pGEM-T. Белку с хитин-связывающим доменом, состоящему из эпитопов вируса ящура, было дано условное название CBD-PE. Расчетный вес кодирумого белка – 33,6 кДа. Для получения белка CBD-PE в клетках E. сoli, его последовательность была клонирована в плазмиде pET23a(+) (Novagen). Для этого рекомбинантная последовательность CBD-PE была вырезана из плазмиды pGEM-T по сайтам рестрикции NdeI/XhoI при помощи соответствующих эндонуклеаз рестрикции, по тем же сайтам была расщеплена экспрессионная плазмида pET23a(+). Фрагменты ДНК CBD-PE и pET23a(+) лигировали и полученной лигазной смесью трансформировали клетки E. сoli штамма JM109. В результате рестрикционного анализа полученных клонов было обнаружено пять плазмид, содержащих вставку нужного размера (pET23aCBD-PE-1, -2, -3, -5, -6). Полученные плазмиды были использованы для трансформации штамма E.coli Rosetta2. Выбор данного штамма в качестве реципиента для продукции белка HРЕ обусловлен тем, что он синтезирует 87 РНК- полимеразу фага Т7, а также содержит дополнительную плазмиду pRARE2, обеспечивающую эффективную трансляцию редких кодонов. EcoRI AscI NdeI 6His VP4 (21-40) VP1 VP1 (135-160) (200-213) XhoI XmaI 2C (68-76) 3D (1-115) 3D (421-460) Рис. 12. Схема рекомбинантной последовательности, кодирующей белок CBD-PE. Черным цветом указаны глицин богатые линкеры (4G2S) При температуре инкубации +37°С бактериальные культуры Rosetta2, трансформированные плазмидами pET23a-CBD-PE-1, -2, -3, -5 и -6, продуцировали белок на высоком уровне (Рис. 13). В качестве отрицательного контроля использовали клетки E. coli штамма Rosetta2, не трансформированные плазмидой pET23a-CBD-PE. Доля экспрессированного белка составляла около 70% от общего количества белков клетки. Оптическая плотность культуры клеток (ОП600), продуцирующих белок CBDРЕ, на стадии насыщения была 6,1-7,75. Рис. 13. Экспрессия белка CBD-PE в E. сoli: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – суммарный белок клеток культуры, не трансформированной экспрессионной плазмидой; 3-7- суммарный белок клеток культуры, трансформированной плазмидами pET23a-CBDPE-1, -2, -3, -5 и -6, соответственно; стрелкой показано положение CBD-PE белка. 88 В то время как расчетный молекулярный вес белка CBD-PE составлял 33,6 кДа, примерный молекулярный вес проэкспрессированного белка был около 36-38 кДа, что можно объяснить небольшой аномальной подвижностью CBD-PE белка в акриламидном геле, характерной для некоторых рекомбинантных белков. Для проверки растворимости бактериальных клетках, лизоцимом разрушены и белка индуцированные ультразвуком. CBD-PE, клетки полученного были Фракции в обработаны растворимого и нерастворимого белков были проанализированы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (Рис. 14). Было обнаружено, что большая часть CBD-PE белка в физиологических условиях нерастворима. Рис. 14. Растворимость CBD-PE белка полученного в E. coli: 1 – Маркер молекулярного веса; 2, 3 и 4 – белок клеток культуры, трансформированной плазмидой pET23a-CBD-PE-1; 2 – суммарный белок; 3 – фракция растворимого белка; 4 – фракция нерастворимого белка; стрелкой показано положение белка CBD-PE Для проверки возможности увеличения содержания CBD-PE белка во фракции растворимого белка при экспрессии при пониженной температуре, культура клеток, трансформированная pET23a-CBD-PE-1, была выращена при температуре +21°С. При анализе белкового состава фракций 89 растворимого белка и нерастворимого белка было обнаружено, что большая часть белка, полученного в бактериях также нерастворима. Белок CBD-PE был нерастворим и не мог быть выделен в чистом виде из бактериальных клеток в нативном состоянии, так как для очистки белка с применением хитин-связывающего домена, он должен иметь специфическую конформацию для обеспечения возможности обратимого связывания с хитином. Следовательно, для получения белка, состоящего из эпитопов вируса ящура, должна была быть применена очистка в денатурирующих условиях. Для этого было необходимо получить последовательность, кодирующую белок, содержащий шесть аминокислотных остатков гистидина подряд вместо хитин-связывающего домена. 2.2 Получение полиэпитопного белка HPE в E. сoli Замена последовательности, кодирующей хитин-связывающий домен, на последовательность, кодирующую шесть аминокислотных остатков гистидина, была произведена при помощи ПЦР. В качестве матрицы использовали исходную плазмиду pGEM-T с последовательностью гена белка CBD-PE. ПЦР продукт был получен при использовании пары праймеров m13f и pHisPE, что означало, что вставка рекомбинантного гена в плазмиде pGEM-T находилась в обратной ориентации по отношению к последовательности Т7 промотора. Последовательность синтетического гена HPE представлена на Рис 15. Для получения плазмиды pET23a-НPE, последовательность, кодирующая белок, состоящий из эпитопов вируса ящура с шестью гистидинами на N-конце, была вырезана из ПЦР продукта и затем лигирована с плазмидой pET23a(+) по сайтам рестрикции NdeI/XhoI. В результате рестрикционного анализа полученных клонов было обнаружено 90 шесть плазмид, содержащих вставку нужного размера (pET23a-НPE-1, -2, -3, -4, -5 и -6). Правильность нуклеотидных последовательность вставок этих плазмид была подтверждена секвенированием. Полученные плазмиды были использованы для трансформации клеток штамма E.coli Rosetta2. Экспрессия белка HPE была произведена методом самоиндукции. При температуре инкубации +37°С бактериальные культуры Rosetta2, трансформированные плазмидами pET23a-НPE-1, -2, -3, -4, -5 и -6, экспрессировали белок на высоком уровне (Рис. 16). H-PE GG CGC Аминокислоты AАС TAT TAT ATG N Y Y M GAT GGA GGT GGC D G G G GTT AGG GGC GAT V R G D GGT GGG GGT GGT G G G G AAG CAA CTG CTA K Q L L AAC GCA AGA CAG N A R Q ACA CGT GAT GTT T R D V GCA CCT ACC GTT A P T V GCT CTC TCC AAT A L S N GAA GCT ATC TTT E A I F GAT AAA GCT CTT D K A L CAT AGC GTA CTA H S V L ATT AAG GGG GTC I K G V GGG GGA TCA AGT G G S S CAC TCT GGC CCA H S G P TTG TTT GAG ATC L F E I CCC GGG GCC CAT ATG М CAG CAA TAC Q Q Y GGT AGC TCA G S S CTA CAA GTA L Q V TCC TCC AGG S S R GGG GGC GGT G G G GCT GGA GGG A G G GAG GAA AGA E E R GCT CAC GGA A H G AAA GAT CCT K D P TCA AAA CAC S K H TTT CGT CGA F R R GGC ACA GCC G T A GAT GGC CTT D G L CAG GAA AAG Q E K GAT GAA TAT D E Y CCC TCA TAT P S Y CAT H CAG Q AAA K CTA L CAC H GGA G GGA G GTA V GTA V AGA R AAA K TGT C AAC N GAT D TTA L CGT R AGG R CAT H AAC N TAT Y GCT A AAA K AGT S GGA G CAC H TTT F TTG L GGA G GCT A GCT A GCA A ATT I AGA R AGC S CAC H AGC S GGT G CAG Q CAA Q TCT S TCT S GTC V AAC N AAT N AAC N GCA A CCT P ATG M TCA S CTG L CTC L CAT H ATG M GAA E AAA K AAG K GAA E AGT S ATG M CCT P GAA E ACT T GAT D CTT L GAG E GTT V TTT F TAT CAC H GAC D TCA S GCT A ATT I TTC F GGC G CGA R GAG E GGT G AAG K TAC Y TCT S CCT P GCT A GAA E CTT CAT H ACA T CCC P GCT A GTT V GAA E TTG L AAG K TTT F GTC V ATG M GCC A ACT T GAT D GGT G CCT P TAA ATA I CAA Q GTA V CGA R GCT A TGG W ATT I ACT T GGA G GTT V TCT S TCA S TAC Y ACT T TTG L TTT F TAG ATC I CTC L ACT T ACA T CCA P CTG L GTT V AAG K CCA P TTG L GAA E AGA R GAA E GGC G GCC A CAA Q CTC AAT N GGG G AAT N TTA L GTT V GAC D GAC D CTA L GCT A GAT D GAA E TTG L GCT A GGT G ATA I GGT G GAG Рис. 15. Последовательность синтетического гена HPE, оптимизированного для экспрессии в растениях. В нуклеотидной последовательности подчеркнуты сайты рестрикции. В аминокислотной последовательности серым выделены глицин-богатые линкеры, черным выделены шесть аминокислотных остатков гистидинов. 91 Оптическая плотность культуры клеток (ОП600), экспрессирующих белок НРЕ, на стадии насыщения была 10,83-12,46, что было почти в два раза выше плотности культуры клеток, синтезирующих тот же белок с хитинсвязывающим доменом. В качестве отрицательного контроля использовали клетки нетрансформированной культуры E. coli штамма Rosetta2. Уровень экспрессии белка HPE при культивировании полученного штамма при +37 оС в условиях автоиндукции (Studier, 2005) составил порядка 50% от общего клеточного белка. Рис. 16. Экспрессия белка НPE в E. сoli: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – суммарный белок клеток культуры, не трансформированной экспрессионной плазмидой; 3-8суммарный белок клеток культуры, трансформированной плазмидами pET23a-НPE-1, -2, 3,-4, -5 и -6, соответсвенно; стрелкой показано положение НPE белка Для проверки растворимости бактериального белка НPE, использовали культуры клеток выращенные при +28ºС и при +21°С. Было обнаружено, что НРЕ, полученный в бактериях, в физиологических условиях нерастворим (Рис. 17). Белок НРЕ, полученный в клетках Е. coli, выделяли методом металлхелатной аффинной хроматографии на Ni-NTA сефарозе в денатурирующих условиях с солюбилизацией в буфере А. Белок элюировали минимальным объемом буфера F, содержание белка во фракциях определяли методом 92 Бредфорд. Фракции элюата, содержащие максимальное количество белка, диализовали против буфера G, содержащего 4 М мочевину и 10 мМ Tris-HCl (pH 8.0). Из 5 мл клеточной культуры с оптической плотностью (ОП600) близкой к 11 выделяли примерно 1 мг НРЕ белка с достаточно высоким уровнем очистки – не менее 95% (Рис. 18). Рис. 17. Растворимость НPE белка полученного в E. coli: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – суммарный белок культуры клеток, Rosetta2; 3, 4 и 5 – белок клеток культуры Rosetta2/pET23a-НPE-1, выращенной при +21°С (3 – суммарный белок; 4 – фракция растворимого белка; 5 – фракция нерастворимого белка); 6 и 7 - белок клеток культуры Rosetta2/pET23a-НPE-1, выращенной при +28°С (6 – фракция растворимого белка; 7 – фракция нерастворимого белка); стрелкой показано положение белка НPE. В препарате белка НРЕ присутствовали низкомолекулярные белки, которые, вероятнее всего, являлись продуктами деградации белка НРЕ или преждевременной терминации трансляции, происходящей в клетках культуры на стадии насыщения. Препараты очищенного белка были использованы для получения мышиной поликлональной антисыворотки в Институте Биоорганической Химии (г. Москва). 93 Рис. 18. Выделение и очистка НРЕ белка, полученного в E. coli: 1 – Маркер молекулярного веса; 2 – препарат очищенного белка НРЕ; стрелкой указано положение НРЕ белка. 2.3 Получение белка HPE в растениях N. benthamiana Для получения НРЕ белка в клетках N. benthamiana кодирующая его последовательность была клонирована в плазмиду pА7248AMV по сайтам рестрикции AscI/XmaI. В результате рестрикционного анализа полученных клонов было обнаружено пять плазмид, содержащих вставку нужного размера (pА7248AMV-НPE -2, -3, -4, -5 и -6). Правильность нуклеотидных последовательность вставок трех их них (pА7248AMV-НPE -2, -3 и -4) была подтверждена секвенированием. Одна из полученных плазмид (pA7248AMVHPE-3) была использована для трансформации A. tumefaciens штамма EHA105. Колония агробактерий, трансформированных конструкцией pA7248AMV-HPE, была отобрана с помощью ПЦР скрининга с парой специфичных праймеров, отжигающихся на последовательности ХВК, кодирующей полимеразный домен. Для повышения эффективности транзиентной экспрессии HPE белка растения агроинокулировали смесью культур, трансформированных конструкцией pA7248AMV-HPE и конструкцией, кодирующей супрессор РНК сайленсинга, – HCPro вируса мозаики турнепса – полученной ранее в нашей лаборатории в результате 94 вставки в модифицированную плазмиду pCambia под контролем 35S промотора. В качестве отрицательного контроля была использована ткань того же листа, инфильтрированная культурой агробактерий, трансформированных полученной ранее в нашей лаборатории конструкцией pА7248AMV-GUS, несущей последовательность β-глюкуронидазы. Рис. 19. Экспрессия белка НРЕ в растениях N. benthamiana: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – суммарный белок клеток культуры E. Coli Rosetta2/pET23a-НPE-1, на геле примерно 0,5 мкг белка НРЕ; 3 – образец ткани листа из зоны, агроинокулированной культурами клеток ЕНА105/pA7248AMV-GUS и ЕНА105/pCCaHCPro; 4 - образец ткани листа из зоны, агроинокулированной культурами клеток ЕНА105/pA7248AMV-HPE-3 и ЕНА105/pCCaHCPro; 5 –препарат очищенного белка НРЕ, выделенный из растений; стрелкой указано положение белка НРЕ. Через пять дней из тканей листьев в зонах агроинфильтрации были приготовлены образцы для белкового электорофореза. Было обнаружено, что клетки растений, агроинокулированных конструкцией pA7248AMV-HPE-3, способны экспрессировать белок с электрофоретической подвижностью как у белка НРЕ, экспрессированного в бактериях (Рис. 19). Количество белка НРЕ, накопленного в растениях, оценивали с помощью программы Tina207. Доля белка НРЕ в растении составляла 0,7-1% от общего количества белка. 95 Выделение и очистку НРЕ белка из растения проводили с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA сефарозе. Из 9 г свежей растительной ткани выделяли примерно 0,3 мг HPE белка (что составляло около 34 мг белка на 1 кг свежих листьев), с достаточно высоким уровнем очистки – не менее 90%. Рис. 20. Определение оптимального разведения антисыворотки к белку методом дотблота: А-В - мембраны, обработанные антисывороткой в различных разведениях: 1:1000, 1:5000 и 1:10000, соответственно; 1 – суммарный белок клеток Е. coli Rosetta2; 2,3,4 – белок культуры клеток Е. coli Rosetta2/pET23a-HPE-1; на мембране: 0,5, 0,05, 0,005 мкг белка НРЕ, соответственно. Для подтверждения соответствия НРЕ белка, полученного в растениях, белку, полученному в бактериях, было необходимо провести вестернблоттинг соответствующих образцов. Для определения оптимального разведения полученной мышиной антисыворотки для использования в вестерн-блоттингах, был проведен предварительный дот-блот анализ ее разведений с образцами суммарного белка из культур бактерий E. coli, экспрессирующих и не экспрессирующих НРЕ. Было определено, что оптимальным разведением полученной антисыворотки является 1:10 000, при котором практически отсутствует неспецифическое взаимодействие антител сыворотки с белками бактерий, но возможно детектировать 5 нг НРЕ белка (Рис. 20). 96 Вестерн-блоттинг был проведен с образцами тканей растения, взятых из зоны, инфильтрированной агробактериальной культурой, трансформированной плазмидой pA7248AMV-HPE-3, суммарного белка клеток E. coli и препарата белка НРЕ, выделенного из растений (Рис. 21). Рис. 21. Вестерн-блоттинг препаратов белка НРЕ: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – белок культуры клеток Е. coli Rosetta2/pET23a-HPE, на дорожке ~ 5 нг белка НРЕ; 3 – белок культуры клеток Е. coli Rosetta2; 4 - образец ткани листа из зоны, агроинокулированной культурами клеток ЕНА105/pA7248AMV-HPE-3 и ЕНА105/pCCaHCPro, на дорожке ~ 5 нг белка НРЕ; 5 – образец ткани листа из зоны, инокулированной культурами ЕНА105/pA7248AMV-GUS и ЕНА105/pCCaHCPro; 6 – препарат очищенного белка НРЕ из растений, 25 нг; стрелкой показано положение белка НPE. Взаимодействие антител мышиной сыворотки, полученной к белку HPE, продуцированному в бактериях, с белком, накопленным в растениях, и с препаратом очищенного из растений белка HPE, а также одинаковая электрофоретическая подвижность этих белков, показывают их идентичность и вероятное отсутствие посттрансляционных модификаций белка НРЕ, полученного в высокоспецифична, растениях. поскольку Антисыворотка практически к белку полностью НРЕ была отсутствовало взаимодействие антител с хозяйскими белками клеток бактерий и растений. 97 Для проверки влияния используемого супрессора РНК-сайленсинга на количество нарабатываемого белка в растениях одну половину листа агроинокулировали смесью культур, трансформированных конструкциями pA7248AMV-HPE-3 и pCCaHCPro (кодирует супрессор РНК-сайленсинга, HCPro, вируса мозаики турнепса), а другую - pA7248AMV-HPE-3 и pCCap24 (кодирует супрессор РНК-сайленсинга p24 вируса, ассоциированного с скручиванием листьев винограда 2 (GLRaV-2)). В качестве отрицательного контроля была использована ткань неинфильтрированного листа. Через пять дней из листьев в области агроинфильтрации были приготовлены образцы для белкового электорофореза. Было обнаружено, что уровень экспрессии белка НРЕ в образце листьев, агроинокулированных конструкциями pA7248AMV-HPE-3 с pCCap24, был выше, чем в образце листьев, агроинокулированных конструкциями pA7248AMV-HPE-3 и pCCaHCPro. (Рис. 22). Рис. 22. Сравнение влияния супрессоров РНК-сайленсинга на количество экспрессируемого белка НРЕ в растениях. 1 – маркер молекулярного веса; 2 – образец не агроинфильтрированных листьев; 3 – образец листьев, инокулированных смесью культур агробактерий ЕНА105/pA7248AMV-HPE-3 и ЕНА105/pCCaHCPro; 4 – образец листьев, инокулированных смесью культур агробактерий ЕНА105/pA7248AMV-HPE-3 и ЕНА105/pCCap24. 98 Из 120 гр листьев, инокулированных смесью культур агробактерий, трансформированных конструкциями pA7248AMV-HPE-3 и pCCap24, с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA сефарозе выделяли около 8 мг белка НРЕ, что составляло около 67 мг белка на 1 кг свежих листьев. Таким образом, уровень накопления белка в растениях увеличился примерно в 2 раза – около 1,5% от всех белков клетки растения. Иммунологические характеристики препаратов очищенных белков из бактерий и растений были определены в опытах на лабораторных животных (морских свинках) в Федеральном Центре Охраны Здоровья Животных (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир). 2.4 Схема получения полиэпитопного белка HPE из клеток бактерий и растений Разработанные технологические схемы получения полиэпитопного белка HPE из клеток бактерий и растений включают стадии получения биомассы, разрушения, содержащей достаточное фракционирования, количество аффинной целевого белка, хроматографии. ее Процесс получения рекомбинантного белка HPE приведен на рис. 23. Основной схеме предшествуют стадии вспомогательных работ. 1. Технологическая схема получения белка HPE из клеток E. coli. 1.1. Получение культуры бактериального штамма-продуцента (ВР1б) Плазмидой pET23a-НPE трансформируют компетентные клетки штамма E. coli Rosetta 2(DE3), ампициллин-устойчивые трансформанты отбирают на чашках c LB агаром, содержащим также 1% глюкозу, 30 мкг/мл хлорамфеникола. Одиночную колонию переносят в 2 мл среды ZYP-0.8G с ампициллином и хлорамфениколом, выращивают в течение ночи при 37°С при постоянном перемешивании. 1.2. Подготовка буферных растворов и сорбента (ВР2). 99 Готовят буфера для фракционирования клеток и хроматографии белка: Буфер А: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 6 M GuHCl, рН 8.0. Буфер B: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 8 M мочевина, рН 8.0. Буфер С: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 8 M мочевина, рН 6.3. Буфер D: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 8 M мочевина, рН 5.9. Буфер E: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Tris·Cl, 8 M мочевина, рН 4.5. Буфер F: 6 M GuHCl, 0,2 M уксусная кислота. Буфер G: 4М мочевина, 10 мМ Tris pH 8.0. Готовят индуцирующий буфер для приготовления суспензии A. tumefaciens для агроинокуляции растений: 10 мM MgSO4, 10 мM MES(2-(NМорфолино)-этансульфоновая кислота), 150 мкМ ацетосирингона. Уравновешивают Ni-NTA сефарозу (Promega) в буфере А. 1.3. Получение биомассы клеток для выделения белка (ТП1б). 200 мкл ночной культуры штамм Rosetta 2 (DE3)/pET23a-НPE переносят в 100 мл среды ZYP-5052 с хлорамфениколом, ампициллином, выращивают 48 часов при 28°С в колбах объемом 500 мл, биомассу осаждают центрифугированием. 1.4. Получение грубого экстракта (ТП2б) Полученную биомассу рекомбинантного штамма (2 г) суспендируют в 10 мл буфера А и разрушают ультразвуковой дезинтеграцией. Супернатант собирают после центрифугирования гомогената 15 мин при 14000 об/мин 15 мин, промывают дебрис 5 мл буфера А и дебрис отбрасывают. 1.5. Выделение белка (ТП3). 1.5.1. 5 мл суспензии Ni-NTA сефарозы (Promega), уравновешенной в буфере А инкубируют с осветленным клеточным лизатом в течение 30 мин при постоянном перемешивании (ТП3.1б). 1.5.2. Переносят суспензию лизата и сорбента в хроматографическую колонку, пропускают лизат через колонку со скоростью 0,5-1 мл/мин (ТП3.2б). 100 1.5.3. Промывают сорбент последовательно 4-х кратным избытком буфера А, В, С, D, E со скоростью 0,5-1 мл/мин, не допуская пересыхания сорбента в колонке (ТП3.3б.) Рис. 23. Схема получения полиэпитопного белка HPE из клеток бактерий и растений. 1.5.4. Элюируют белок 20 мл буфера F (ТП3.4б). Полученный препарат диализуют против буфера G. Выход очищенного таким образом белка HPE cоставляет примерно 20 мг из 100 мл культуры. 2. Технологическая схема получения белка HPE в N. benthamiana: 2.1. Получение культуры агробактерий для агроинокуляции (ВР1р). Штаммы A. tumefaciens EHA105/pA7248AMV-HPE и A. tumefaciens EHA105/pCCap24 выращивают на качалке в 3 мл среды LB с антибиотиками (канамицин, рифампицин, гентамицин) и 10мМ MES 12 часов при 27°С. 101 Клетки осаждают при 4000 об/мин в течение 5 минут, осадок ресуспендируют в 500 мкл индуцирующего буфера до конечной плотности (ОП600)=0,4. Выдерживают 3 часа при комнатной температуре. 2.2. Транзиентная экспрессия белка HPE в листьях N. benthaniana (ТП1р). Суспензии индуцированных клеток штаммов A. tumefaciens EHA105/pA7248AMV-HPE и A. tumefaciens EHA105/pCCap24 смешивают в соотношении 1:1. Полученную смесь вводят шприцом в листья 3-х недельных растений N. benthaniana. Выдерживают растения в оптимальных условиях и при достаточном поливе 5 дней. 2.3. Получение грубого экстракта (ТП2р) 100 г инокулированных агробактериями листьев растирают в жидком азоте в ступке, кашицу суспендируют в 60 мл буфера А, перемешивают на мешалке в течение 30 мин, центрифугируют при 14000 об/мин 15 мин, супернатант отбирают. 2.4. Выделение белка (ТП3). Полученный супернатант инкубируют с 1,3 мл суспензии Ni-NTA сефарозы, уравновешенной в буфере А, в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Рекомбинантный белок выделяют на колонке схеме, разработанной для клеток E. coli (стадии 1.5.2-1.5.4). Выход белка составляет примерно 67 мг белка на 1 кг свежих листьев растений. 2.5 Оценка иммуногенности НРЕ белка Через 21 день после вакцинации у 8 иммунизированных и 2 контрольных морских свинок были отобраны пробы крови. Полученные сыворотки крови морских свинок тестировали в непрямом варианте ИФА с 102 антигенами вируса ящура О/Приморский/00 и О/Маниса (тест-системы ФГУ «ВНИИЗЖ»), в референтной тест-системе с использованием набора O FMDV Ab PrioCHECK (Prionics, Швейцария) и РМН. Результаты исследований представлены в таблице 1. Анализ антигенов вируса, с которыми происходило взаимодействие антител был проведен с помощью вестерн-блоттинга с антигенами О/Приморский/00 и О/Маниса (Рис. 24). Антитела сывороток иммунизированных животных преимущественно взаимодействовали со структурным белком VP1 вируса ящура серотипа О. Таблица 1. Антигенные и протективные свойства белка Сыворотки крови морских свинок,№ 1 2 3 4 5 6 7 контроль 1 контроль 2 ВБС* (отр.контроль) ВНИИЗЖ (антиген вируса ящура О/Приморский/00) 1:800 1:400 1:800 1:800 1:1600 1:800 1:800 <1:200 <1:200 ИФА ВНИИЗЖ (антиген вируса ящура О/Маниса) <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 <1:200 O FMDV Ab PrioCHECK PI (PIпол≥50%) РМН с вирусом ящура О/Тайвань/99 71% 62% 76% 72% 81% 73% 72% 2% 10% 1:90 1:64 1:180 1:128 1:90 1:64 1:90 <1:16 <1:16 8% н/и * - антиген вируса везикулярной болезни свиней; н/и - не исследовали. Однократное введение морским свинкам рекомбинантного бактериального белка в количестве 300 мкг на одно животное вызывало образование у животных вируснейтрализующих антител к вирусу ящура типа О/Тайвань/99, выявляемых в РМН, в непрямом варианте ИФА с антигеном вируса ящура типа О/Приморский/00 и О/Маниса, а также в ИФА с набором O FMDV Ab PrioCHECK (Prionics, Швейцария). 103 У 6 из 7 иммунизированных животных отсутствовала генерализация ящурной инфекции через 7 суток после заражения адаптированным к морским свинкам вирусом ящура типа О/Тайвань/99, при наличии генерализации у 7 контрольных морских свинок. Данные предварительной оценки иммуногенности бактериального белка показали, что он способен вызывать иммунный ответ у лабораторных животных в дозе 300 мкг на одно животное. Результаты РМН и ИФА позволили предположить, что доза вводимого белка может быть уменьшена. Рис. 24. Белок НРЕ, выделенный из клеток E.coli, индуцирует антитела, распознающие капсидный белок VP1. Вестерн-блот анализ препаратов стандартных антигенов вируса ящура с сыворотками крови морских свинок, иммунизированных бактериальным белком HPE. 1 – маркер молекулярного веса; 2 и 3 – антигены О/Маниса и О/Приморский/00, обработанные сывороткой свинки №5; 4 и 5 - антигены О/Маниса и О/Приморский/00, обработанные сывороткой контрольной свинки; 6 и 7 - антигены О/Маниса и О/Приморский/00, обработанные сывороткой свинки №4. Для определения минимальной дозы белка НРЕ, вызывающей защиту против вируса, морские свинки были однократно иммунизированы различным количеством белка: 300мкг, 120 мкг и 40 мкг на животное. Через 17 дней после иммунизации у животных были отобраны сыворотки крови, которые тестировали с помощью реакции микронейтрализации (РМН). Результаты исследований представлены в таблице 2. 104 Таблица 2. Зависимость протективного иммунного ответа у морских свинок от дозы вводимого препарата белка НРЕ, выделенного из бактериальных клеток Номер группы/но мер животного 1/1 ½ 1/3 ¼ 1/5 1/6 1/7 1/8 2/1 2/2 2/3 2/4 2/5 2/6 2/7 2/8 3/1 3/2 3/3 ¾ 3/5 3/6 3/7 3/8 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 Количество вводимого белка на животное 350 мкг 120 мкг 40 мкг не вводили РМН 1:64 1:180 1:128 1:180 1:45 1:512 1:64 1:128 1:128 1:45 1:128 1:128 >1:720 1:90 1:180 1:32 1:45 1:16 1:22 1:256 1:16 1:22 <1:16 1:16 <1:16 <1:16 <1:16 <1:16 н/и н/и н/и н/и Результаты контрольное заражение: количество защищенных животных/количество животных в опыте Статистическая значимость по группе (рсл) 8/8 0,004 8/8 0,004 4/8 0,637 0/8 н/и – не исследовали. Однократная иммунизация свинок бактериальным НРЕ белком в количествах 350 мкг и 120 мкг на животное вызывала образование у животных вируснейтрализующих антител к вирусу ящура типа О/Тайвань/99, выявляемых в РМН в разведениях 1:32-1:720. Данные по защите животных 105 от заболевания согласуются с данными РМН их сывороток. У всех восьми иммунизированных животных не происходило появления вторичных афт на передних лапах через 7 суток после заражения. Таблица 3. Зависимость протективного иммунного ответа у морских свинок от дозы вводимого препарата белка НРЕ, выделенного из клеток растений Номер группы/ номер животно го 1/1 ½ 1/3 ¼ 1/5 1/6 1/7 1/8 2/1 2/2 2/3 2/4 2/5 2/6 2/7 2/8 3/1 3/2 3/3 ¾ 3/5 3/6 3/7 3/8 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 Количество вводимого белка одному животному 350 мкг 120 мкг 40 мкг не вводили н/и – не исследовали. O FMDV Ab PrioCHECK PI (PIпол≥50%) 78% 89% 75% 58% 104% 71% 71% н/и 60% 28% 82% 49% 74% 85% 86% 96% 35% 42% 91% 55% 51% 44% 72% 78% 23% 16% 10% н/и н/и н/и н/и н/и Результаты контрольное заражение: тест-система количество ФГУ защищенных «ВНИИЗЖ» животных/количеств о животных в опыте 200 400 100 200 8/8 800 100 200 н/и 100 100 800 100 8/8 200 200 800 800 50 50 200 50 6/8 50 200 50 100 <50 <50 <50 н/и 0/8 н/и н/и н/и н/и Статист ическая значимо сть по группе (рсл) 0,004 0,004 0,145 - 106 При уровне α=0,005 защищенность морских свинок, иммунизированных 350 и 120 мкг белка на животное, была достоверной. У группы свинок, иммунизированных бактериальным НРЕ в количестве 40 мкг, вторичные афты появлялсь у 4 из 8 свинок. Симптомы ящура появлялись у 8 неиммунизированных (контрольных) морских свинок. На следующем этапе мы тестировали иммуногенность белка НРЕ, полученного в растительной системе экспрессии. Иммунизацию морских свинок растительным белком проводили так же, как и бактериальным белком НРЕ (300, 120 и 40 мкг белка/животное). Через 17 суток после вакцинации у 24 иммунизированных разными дозами антигена и 4 контрольных морских свинок были отобраны пробы крови. Полученные сыворотки крови морских свинок были тестированы в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА) с антигеном вируса ящура O/Тайвань/99 (тест-система ФГУ «ВНИИЗЖ») и с использованием набора O FMDV Ab PrioCHECK (Prionics, Швейцария). Результаты исследований представлены в Таблице 3. Рис. 25. Белок НРЕ, выделенный из клеток N.benthamiana, индуцирует антитела, распознающие капсидный белок VP1. Вестерн-блот анализ препаратов стандартных антигенов вируса ящура с сыворотками крови морских свинок, иммунизированных «растительным» белком HPE. 1 - маркер молекулярного веса; 2 и 3 – антигены О/Приморский/00 и О/Тайвань/99, обработанные сывороткой свинки №2/3; 5 и 7 – антигены О/Приморский/00 и О/Тайвань/99, обработанные сывороткой контрольной свинки №.4/3. Через 17 суток после однократной иммунизации морских свинок дозой препарата в 350 мкг/животное выработка антител, определяемая согласно 107 референтному тесту O FMDV Ab PrioCHECK (Prionics, Швейцария), индуцировалась у всех иммунизированных животных. Анализ антигенов вируса, с которыми происходило взаимодействие антител был проведен с помощью вестерн-блоттинга с антигенами вируса ящура О/Тайвань/99 и О/Приморский/00 (Рис. 25). В сыворотках крови иммунизированных животных в иммуноблоттинге были выявлены антитела к белку VP1 вируса ящура типа О. Однократная иммунизация свинок растительным НРЕ белком в количествах 350 мкг и 120 мкг вызывала образование у животных вируснейтрализующих антител к вирусу ящура типа О/Тайвань/99, выявляемых в непрямом методе ИФА и вестерн-блоттинге. У 8 из 8 иммунизированных животных не происходило появления вторичных афт на передних лапах через 7 суток после заражения. При уровне α=0,005 защищенность морских свинок, иммунизированных 350 и 120 мкг/животное белка, была достоверной. У группы свинок иммунизированных растительным НРЕ в количестве 40 мкг вторичные афты появлялсь у 6 из 8 свинок. Симптомы ящура появлялись у 8 неиммунизированных (контрольных) морских свинок. 108 ОБСУЖДЕНИЕ Одним из перспективных подходов к созданию альтернативных вакцин против ящура является получение пустых вирусных капсидов - ВПЧ. Иммунологически такие частицы идентичны полноценным вирионам, поскольку пустые капсиды содержат полный набор поверхностных антигенов вируса (Rweyemamu et al., 1979). Также известно, что индивидуальные капсидные белки вируса ящура могут формировать пустые капсиды или капсидные интермедиаты (пентамеры) in vitro (Grubman et al., 1985). Поэтому задачей первого этапа нашей работы по получению вакцинных белков вируса ящура, было получение пустых капсидов ящура в растениях N. benthamiana методом транзиентной экспрессии. Для получения ВПЧ ящура необходимо было экспрессировать участки генома вируса, ответственные за синтез, протеолиз и сборку капсида: последовательности, кодирующие белок-предшественник структурных белков P1 с автокаталитическим пептидом 2A и вирусную протеазу 3Сpro. Для получения предшественника капсидных белков была создана конструкция на основе бинарного вектора pA7248AMV, кодирующая последовательности предшественника капсидных белков P1 и автокаталитеческого пептида 2A вируса ящура изолята О/Тайвань/99 (конструкция pA7248AMVP1uGFP). инокулированных суспензией В областях агробактерий, листьев растений, трансформированных плазмидой pA7248AMVP1uGFP, с помощью флуоресцентной микроскопии можно было видеть, что количество зараженных клеток лишь незначительно ниже количества клеток, экспрессирующих свободный GFP (Рис. 6). Однако, в отличие от свободного белка GFP, GFP, слитый с предшественником Р12А, в большей части клеток накапливался в виде телец включений, что могло свидетельствовать о его нерастворимости. И только в небольшом количестве клеток (менее 1%) GFP в составе слитого белка распределялся диффузно. 109 Вероятно, в таких клетках происходило высвобождение свободного uGFP из состава полипептида в результате процессинга связи 2A-uGFP. Однако, несмотря на видимую инокулированных флуоресценцию культурой GFP агробактерий, в образцах листьев, трансформированных плазмидой, кодирующей предшественник структурных белков, слитый с GFP, с помощью вестерн-блоттинга со специфичными антителами (Рис. 7) видимый сигнал отсутствовал, что также может говорить о нерастворимости предшественника. Нерастворимость гибрида Р1-2А-uGFP подтверждалась в опытах по вестерн-блот нерастворимых белков анализу листьев, солюбилизированных инокулированных фракций соответствующей конструкцией (Рис. 8). Для процессинга предшественника Р1 с образованием отдельных капсидных белков VP1, VP0 и VP3 необходима вирусная протеаза 3Cpro. С целью коэкспрессии предшествинника (конструкция P1-2А pA7248AMVP1uGFP) и протеазы в растениях была получена конструкция, кодирующая последовательность протеазы, в которую был вставлен интрон из A. thaliana для предотвращения токсического воздействия на клетки E. coli (плазмида pA7248AMV3CintR). При коэкспрессии Р1-2А-GFP гибрида и 3Cpro уровень экспрессии предшественника был предшественника без существенно протеазы, а ниже, места чем при инокуляции экспрессии подвергались выраженной некротизации. При вестерн-блот анализе образцов растительной ткани, подвергнутых агроинокуляции конструкциями для экспрессии предшественника и протеаза, сигнала, не удалось детектировать сигналы, соответствующие индивидуальным капсидным белкам. Таким образом, свободная 3С протеаза, видимо, довольно токсична для растений, что может являться причиной пониженного уровня экспрессии предшественника. Необходимым условием сборки капсидов вируса ящура является одновременная коэкспрессия в одной клетке отдельных капсидных белков 110 вируса VP0, VP1 и VP3. Использование векторов на основе ХВК для подобных экспериментов часто сопровождается потерей одного или нескольких генов (Avesani et al., 2007). Для преодоления этих проблем мы предприняли попытку транзиентной экспрессии отдельных капсидных белков вируса ящура с использованием вектора на основе генома ВТЦ. Оказалось, что характер транзиентой экспрессии белков отдельных капсидных белков вируса ящура в растениях под контролем клостеровирусного вектора имеет выраженные различия. Если белок VP0 экспрессировался в растениях в растворимом виде (Рис. 10), то белок VP3 не экспрессировался вовсе, а белок VP1 подвергался протеолитической деградации (Рис. 11). Была также предпринята попытка транзиентной экспрессии в растениях компонентов, необходимых для сборки пустых капсидов вируса ящура – предшественника капсидных белков Р1 с автокаталитическим пептидом 2А и протеазы 3Сpro или отдельных структурных белков вируса ящура. Мы полагали, что предшественник капсидных белков Р1-2А, полученный в растениях, будет подвергаться процессингу вирусной протеазой на отдельные капсидные белки с последующей сборкой капсидов вируса. Однако, выраженная токсичность протеазы 3Сpro и неоптимальный кодоновый состав гена белка-предшественника Р1-2А-GFP, значительный размер экспрессируемого белка препятствовали получению искомых ВПЧ ящура в растениях методом транзиентной экспрессии. Исследования, посвященные попыткам получения ВПЧ ящура в растениях, немногочисленны. Полученные нами данные во многом коррелируют с данными, представленными в двух известных нам работах. В работе (Dus Santos et al., 2005) предшественник Р1-2А с неструктурным белком 2В и протеазой 3Сpro получали в трансгенной люцерне. Уровень накопления таких белков в растениях, по сообщениям авторов, был крайне низким (0,005-0,01% от всех растворимых белков клетки). Анализ 111 экспрессии предшественника в растениях с помощью вестерн-блоттинга не проводился, в качестве единственного доказательства синтеза ВПЧ в растениях приведены данные о наличии антител против вирусного белка VP1 в сыворотках крови мышей, иммунизированных экстрактами из полученных трансгенных растений. Ни достоверно детектировать образование ВПЧ, ни выделить такие частицы из растений авторам не удалось. В данной работе нет и сведений о синтезе протеазы 3Сpro в растениях и ее возможной токсичности. В другой работе (Pan et al., 2008), предшественник капсидных белков Р1-2А и протеаза 3Cpro были получены в трансгенных томатах. В этой работе, по мнению авторов, процессинг предшественника происходил, поскольку при вестерн-блоттинге детектировали белки размерами примерно 33 и 24 кДа. Но уровень накопления таких белков в растениях также был очень низким, и образование ВПЧ биохимическими и иммунологическими методами авторы не анализировали. В обеих работах, как и в нашей, последовательности вирусных белков не были оптимизированы для экспрессии в растениях, что может быть одной из причин низкого уровня накопления белков. В этом исследовании, как и в приведенном выше, проверяли иммуногенность полученных белков путем иммунизации морских свинок экстрактом трансгенных растений, с последующим анализом сывороток крови иммунизированных животных. В нашей работе мы таких исследований не проводили, поскольку, по имеющимся в литературе данным разработка вакцин на основе белков, полученных в растениях со столь низким уровнем экспрессии (менее 0,5%), нецелесообразна. Поэтому для использования такого подхода с целью получения вакцинных белков уровень экспрессии компонентов капсида должен быть существенно увеличен. Несмотря на то, что использование ВПЧ или предшественника капсидных белков Р1 в качестве основы для вакцины против ящура является 112 важным направлением исследований, получение таких белков в количествах, позволяющих их выделение и практическое применение, остается достаточно трудоемкой задачей. В настоящее время на достаточно высоком уровне в растениях возможно получение белков только небольшого размера, поэтому было предпринято множество попыток получения вакцинных белков против вируса ящура небольшого размера, которые представляли собой белок VP1 (Wigdorovitz et al., 1999a, 1999b; Carrillo et al., 2001; Carrillo et al., 1998; Wang et al., 2008), или его фрагменты, содержащие эпитопы G-Hпетли или С-концевого участка (Usha et al., 1993; Wu et al., 2003; Dus Santos et al., 2002). В работах, посвященных получению капсидного белка VP1 или его отдельных эпитопов, уровень их накопления в растениях был выше, чем уровень экспрессии предшественника (до 2% от растворимых белков клеток). Однако, очень часто при иммунизации лабораторных животных препаратами на основе таких белков, животные были лишь частично защищены от заболевания при дальнейшем заражении вирусом. Происходило это, вероятно, потому что эпитопы белка VP1, несмотря на то, что они считаются иммуннодоминантными, являются только частью общего набора распознаваемых эпитопов вириона. Необходимость оптимизации кодонового состава экспрессируемого целевого белка, минимизации его размера для обеспечения эффективной экспрессии в клетках растений учитывали на следующем этапе работы, посвященном получению искусственного рекомбинантного белка НРЕ, несущего комбинацию известных В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи. Такой белок, состоящий из фрагментов структурных (VP1, VP4) и неструктурных (2C, 3D) белков вируса ящура изолята О/Тайвань/99, был получен в клетках E. coli и растениях N. benthamiana в количествах, позволяющих произвести оценку его иммуногенного действия. Возможно, экспрессировать полиэпитопный белок в растениях на довольно высоком уровне (около 1,5% от всех белков) 113 позволила оптимизация кодонового состава последовательности рекомбинантного гена, а также небольшой размер белка (около 34 кДа). Как оказалось, белок НРЕ обладает перспективными антигенными и защитными свойствами – при однократной иммунизации индуцировал у лабораторных животных выработку вируснейтрализующих антител к вирусу ящура типа О/Тайвань/99. При этом гуморальный иммунный ответ, направленный в основном против капсидного белка VP1, коррелировал c протективным иммунитом – вакцинированные животные были полностью устойчивы к заражению вирусом ящура данного серотипа. Детальная оценка перспективности белка НРЕ как основы для создания противоящурных вакцин требует, несомненно, проведения дополнительных испытаний на сельскохозяйственных животных. Для получения полиэпитопного белка НРЕ мы использовали комбинацию В- и Т-клеточных эпитопов вируса, описанных в нескольких работах. В нашей работе было показано, что такой белок можно получать на достаточно высоком уровне в различных гетерологичных системах и иммунизация таким белком лабораторных животных приводила к полной защите их от заболевания ящуром. По мере изучения антигенных сайтов вируса возможно включение эпитопов, находящихся в этих сайтах, в последовательность полиэпитопного белка. Поэтому использованный нами подход к созданию полиэпитопного белка, предполагающий соединение наиболее иммуногенных эпитопов в составе одной полипептидной цепи, можно применять как образец для создания кандидатных вакцин против ящура и других инфекционных патогенов человека и животных. 114 ВЫВОДЫ 1. Созданы фитовирусные векторы для транзиентной ко-экспрессии в растениях предшественника капсидных белков вируса ящура серотипа О/Тайвань/99 Р1-2А, слитого с геном флуоресцентного белка uGFP и протеазы 3Сpro. Показано, что экспрессия гена предшественника P1-2A в растениях приводит к образованию нерастворимых телец включения. 2. Сконструирован ген искусственного кандидатного вакцинного белка HPE, содержащего набор B- и Т-клеточных эпитопов капсидных белков VP1, VP4, 2C и 3D вируса ящура изолята О/Тайвань/99. 3. Разработаны системы экспрессии и очистки белка НРЕ в клетках бактерий E. coli и растений N. benthamiana, обеспечивающие получение высокоочищенных препаратов для иммунологических испытаний. 4. Рекомбинантный белок HPE обладает высокой иммуногенностью и индуцирует у лабораторных животных образование нейтрализующих антител к вирусу ящура О/Тайвань/99. 5. Однократная иммунизация морских свинок белком НРЕ индуцирует иммунный ответ, обеспечивающий полную защиту лабораторных животных от заражения вирусом ящура О/Тайвань/99. 115 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Полиэпитопный белок вируса ящура, полученный в бактериях и растениях, вызывает протективный иммунитет в морских свинках / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Луговская Н.Н. и др. // Биохимия. – 2011. – № 3. - Т.76. - С. 415-424. 2. Состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В., Эльдаров М.А., Фолимонов А.С. // Патент РФ № 2453557 от 20.06.2012, Бюл. № 17. 3. Андрианова Е.П., Эльдаров М.А., Фолимонов А.С. Полученный в растениях рекомбинантный белок, состоящий из эпитопов вируса ящура, как основа альтернативной вакцины // Биология – Наука ХXI Века: Сб. тезисов 16-й Межд. Пущинской школы-конференции молодых ученых. – Пущино: Пущинский науч. Центр РАН. – 2012. – С. 245-246. 4. Андрианова Е.П., Фолимонов А.С. (2009). Получение белка, состоящего из эпитопов вируса ящура, в бактериях и растениях для изучения возможности разработки альтернативного метода вакцинирования // Горизонты нанобиотехнологии: сб. тезисов Всеросс. научной школы для молодежи – Звенигород: Центр «Биоинженерия» РАН. – 2009. С. 15-16. 5. Продукция полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях с целью получения потенциальной вакцины / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В. и др. // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова: сб. тезисов Междунар. научной конф. – М.: ИБХ РАН. – 2009. – С. 7-9. 116 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1.Wild T. F., Burroughs J. N., Brown F. Surface structure of foot-and-mouth disease virus // J. Gen. Virol. 1969. Apr. № 4(3). P. 313-320. 2.Bachrach H. L., Moore D. M., McKercher P. D., Polatnick J. Immune and antibody responses to an isolated capsid protein of foot-and-mouth disease virus // J. Immunol. 1975. Dec. № 115(6). P. 1636-1641. 3.Bittle J. L., Houghten R. A., Alexander H., Shinnick T. M., Sutcliffe J. G., Lerner R. A., Rowlands D. J., Brown F. Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence // Nature. 1982. Jul. № 298(5869). P. 30-33. 4.Pfaff E., Mussgay M., Böhm H. O., Schulz G. E., Schaller H. Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus // EMBO J. 1982. № 1(7). P. 869-874. 5.Di Marchi R., Brooke G., Gale C., Cracknell V., Doel T., Mowat N. Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide // Science. 1986. № 232. P. 639-641. 6.Borreg O.B., Camarero J. A., Mateu M. G., Domingo E. A highly divergent antigenic site of foot-and-mouth disease virus retains its immunodominance // Viral. Immunol. 1995. № 8. P. 11–18. 7.Mateu M. G., Camarero J. A., Giralt E., Andreu D., Domingo E. Direct evaluation of the immunodominance of a major antigenic site of foot-and-mouth disease virus in a natural host // Virology. 1995. № 206. P. 298–306. 8.Feigelstock D., Mateu M. G., Piccone M. E., De Simone F., BrocchI E., Domingo E., Palma E. L. Extensive antigenic diversification of foot-and-mouth disease virus by amino acid substitutions outside the major antigenic site // J. Gen. Virol. 1992. № 73. P. 3307–3311. 9.Mateu M. G., Hernandez J., Martinez M. A., Feigelstock D., Lea S., Perez J. J., Giralt E., Stuart D., Palma E. L., Domingo E. Antigenic heterogeneity of a foot- 117 and-mouth disease virus serotype in the field is mediated by very limited sequence variation at several antigenic sites // J. Virol. 1994. № 68. P. 1407–1417. 10.Belsham G. J., Brangwyn J. K. A region of the 5’ noncoding region of foot-andmouth disease virus RNA directs efficient internal initiation of protein synthesis within cells: involvement with the role of L protease in translational control // J. Virol. 1990. № 64. Р. 5389–5395. 11.Kuhn R., Luz N., Beck E. Functional analysis of the internal translation initiation site of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. 1990. № 64. Р. 4625–4631. 12.Devaney M. A., Vakharia V. N., Lloyd R. E., Ehrenfeld E., Grubman M. J. Leader protein of foot-and-mouth disease virus is required for cleavage of the p220 component of the cap-binding protein complex // J. Virol. 1988. № 62. Р. 4407– 4409. 13.Kirchweger, R., Ziegler E., Lamphear B. J., Waters D., Liebig H. D., Sommergruber W., Sobrino F., Hohenadl C., Blaas D., Rhoads R. E., Skern T. Foot-and-mouth disease virus leader proteinase: purification of the Lb form and determination of its cleavage site on eIF-4 gamma // J. Virol. 1994. № 68. Р. 5677– 5684. 14.Rweyemamu M. M., Terry G., Pay T. W. Stability and immunogenicity of empty particles of foot-and-mouth disease virus // Arch. Virol. 1979. № 59(1-2). P. 69-79. 15.Basavappa R., Syed R., Flore O., Icenogle J. P., Filman D. J., Hogle J. M. Role and mechanism of the maturation cleavage of VP0 in poliovirus assembly: structure of the empty capsid assembly intermediate at 2.9 A resolution // Protein Sci. 1994. Oct. № 3(10). P. 1651-1669. 16.Klein M., Eggers H. J., Nelsen-Salz B. Echovirus 9 strain Barty non-structural protein 2C has NTPase activity // Virus Res. 1999. № 65. P. 155–160. 17.Pfister T., Jones K. W., Wimmer. E. A cysteine-rich motif in poliovirus protein 2C (ATPase) is involved in RNA replication and binds zinc in vitro // J. Virol. 2000. № 74 P. 334–343. 118 18.Klein M., Hadaschik D., Zimmermann H., Eggers H. J., Nelsen-Salz B. The picornavirus replication inhibitors HBB and guanidine in the echovirus-9 system: the significance of viral protein 2C // J. Gen. Virol. 2000. № 81. P. 895–901. 19.Harber J. J., Bradley J., Anderson C. W., Wimmer E. Catalysis of poliovirus VP0 maturation cleavage is not mediated by serine 10 of VP2 // J. Virol. 1991. № 65. Р. 326–334. 20.Nugent C. I., Johnson K. L., Sarnow P., Kirkegaard K. Functional coupling between replication and packaging of poliovirus replicon RNA // J. Virol. 1999. № 73. Р. 427–435. 21.http P. //www.zzr.ru/archives/2001/06/article3/article3.html 22.Rweyemamu M. M., Leforban Y. Foot-and-mouth disease and international development // Adv. Virus Res. 1999. № 53. Р. 111–126. 23.Cottam E. M., Wadsworth J., Shaw A. E., Rowlands R. J., Goatley L., Maan S., Maan N. S., Mertens P. P., Ebert K., Li Y, Ryan E. D., Juleff N., Ferris N. P., Wilesmith J. W., Haydon D. T., King D. P., Paton D. J., Knowles N. J. Transmission pathways of foot-and-mouth disease virus in the United Kingdom in 2007 // PLoS Pathog. 2008. Apr. № 18.4(4). P. e1000050. 24.www.iah.bbsrc.ac.uk. 25.Lewis P. J., Babiuk L. A. DNA vaccines: a review // Adv. Virus Res. 1999. № 54. P. 129-188. 26.Yang N. S., Wang J. H., Lin K. F. Comparative studies of the capsid precursor polypeptide P1 and the capsid protein VP1 cDNA vectors for DNA vaccination against foot-and-mouth disease virus // J. Gene Med. 2005. № 7(6). P. 708–717. 27.Ward G., Rieder E., Mason P. W. Plasmid DNA encoding replicating footandmouth disease virus genomes induces antiviral immune responses in swine // J. Virol. 1997. № 71(10). P. 7442–7447. 28.Wong H. T., Cheng S. C., Chan E. W., Sheng Z. T., Yan W. Y, Zheng Z. X, Xie Y. Plasmids encoding foot-and-mouth disease virus VP1 epitopes elicited immune 119 responses in mice and swine and protected swine against viral infection // Virology. 2000. Dec. № 5.278(1). P. 27-35. 29.Niborski V., Li Y., Brennan F., Lane M., Torché A. M., Remond M., Bonneau M., Riffault S., Stirling C., Hutchings G., Takamatsu H., Barnett P., Charley B., Schwartz-Cornil I. Efficacy of particle-based DNA delivery for vaccination of sheep against FMDV // Vaccine. 2006. Nov. № 30.24(49-50). P. 7204-13. 30.Li Y., Stirling C. M., Denyer M. S., Hamblin P., Hutchings G., Takamatsu H. H., Barnett P. V. Dramatic improvement in FMD DNA vaccine efficacy and crossserotype antibody induction in pigs following a protein boost // Vaccine. 2008. May. № 19.26(21). P. 2647-2656. 31.Bachrach H. L. Foot-and-mouth disease virus: properties, molecular biology and immunogenicity // Beltsville Symp. Agric. Res. 1977. № 1. P. 3–32. 32.Brooksby, J. B. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus // Intervirology. 1982. № 18. Р. 1–23. 33.Mowat G. N., Brooksby J. B., Pay T. W. Use of BHK 21 cells in the preparation of mouse attenuated live foot-and-mouth disease vaccines for the immunization of cattle // Nature. 1962. № 196. P. 655–666. 34.Martin W. B., Edwards L. T. A field trial in south africa of an attenuated vaccine against foot-and-mouth disease // Research in Veterinary Science. 1965. № 6. P. 196–201. 35.Zhidkov S. A., Sergeev V. A. A study of the properties of attenuated cold variant of type O foot-and-mouth disease virus // Veterinariia. 1969. № 10. P. 29–31. 36.Mowat G. N., Barr D. A., Bennett J. H. The development of an attenuated footand-mouth disease virus vaccine by modification and cloning in tissue cultures of BHK21 cells // Archiv fur die gesamte Virusforschung. 1969. № 26(4). P. 341– 354. 37.McKenna T. S., Lubroth J., Rieder E., Baxt B., Mason P. W. Receptor binding site-deleted foot-and-mouth disease (FMD) virus protects cattle from FMD // J. Virol. 1995. № 69. Р. 5787–5790. 120 38.Chinsangara M. J., Mason P. W., Grubman M. J. Protection of swine by live and inactivated vaccines prepared from a leader proteinase deficient serotype A12 footand-mouth disease virus // Vaccine. 1998. № 16. Р. 1516–1522. 39.Mason P. W., Piccone M. E., McKenna T. S., Chinsangaram J., Grubman M. J. Evaluation of a live-attenuated foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate // Virology. 1997. № 227. Р. 96–102. 40.Segundo F. D., Weiss M., Pérez-Martín E., Dias C. C., Grubman M. J., Santos T. L. Inoculation of swine with foot-and-mouth disease SAP-mutant virus induces early protection against disease // J Virol. 2012. Feb. № 86(3). P. 1316-1327. 41.Grubman M. J., Lewis S. A., Morgan D. O. Protection of swine against foot-andmouth disease with viral capsid proteins expressed in heterologous systems // Vaccine. 1993. № 11(8). P. 825–829. 42.Lewis S. A., Morgan D. O., Grubman M. J. Expression, processing and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs // J. Virol. 1991. Dec. № 65(12). P. 6572-6580. 43.Belsham G. J., Abrams C. C., King A. M., Roosien J., Vlak J. M. Myristoylation of foot-and-mouth disease virus capsid protein precursors is independent of other viral proteins and occurs in both mammalian and insect cells // J. Gen. Virol. 1991. № 72. Р. 747–751. 44.Roosien J., Belsham G. J., Ryan M. D., King A. M., Vlak J. M. Synthesis of footand-mouth disease virus capsid proteins in insect cells using baculovirus expression vectors // J. Gen. Virol. 1990. № 71. Р. 1703–1711. 45.Sáiz J. C., Cairó J., Medina M., Zuidema D., Abrams C., Belsham G. J., Domingo E., Vlak J. M. Unprocessed foot-and-mouth disease virus capsid precursor displays discontinuous epitopes involved in viral neutralization // J Virol. 1994. Jul. № 68(7). P. 4557-4564. 121 46.Chinsangaram J., Beard C., Mason P. W., Zellner M. K., Ward G., Grubman M. J. Antibody response in mice inoculated with DNA expressing foot-and-mouth disease virus capsid proteins // Journal of Virology. 1998. № 72(5). P. 4454–4457. 47.Li X., Liu R., Tang H., Jin M., Chen H., Qian P. Induction of protective immunity in swine by immunization with live attenuated recombinant pseudorabies virus expressing the capsid precursor encoding regions of foot-and-mouth disease virus // Vaccine. 2008. № 26(22). P. 2714–2722. 48.Li Z., Yi Y., Yin X., Zhang Z., Liu J. Expression of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in silkworm-baculovirus expression system and its utilization as a subunit vaccine // PloS One. 2008. № 3(5). P. e2273. 49.Sanz-Parra A., Blasco R., Sobrino F., Ley V. Analysis of the B and T cell response in guinea pigs induced with recombinant vaccinia expressing foot-and-mouth disease virus structural proteins // Archives of Virology. 1998. № 143(2). P. 389– 398. 50.Berinstein A., Tami C., Taboga O., Smitsaart E., Carrillo E. Protective immunity against foot-and-mouth disease virus induced by a recombinant vaccinia virus // Vaccine 2000. № 18(21). P. 2231–2238. 51.Ma M., Jin N., Shen G., Zhu G., Liu H. J., Zheng M., Immune responses of swine inoculated with a recombinant fowlpox virus co-expressing P12A and 3C of FMDV and swine IL-18 // Veterinary Immunology and Immunopathology. 2008. № 121. P. 1–7. 52.Sanz-Parra A., Vazquez B., Sobrino F., Cox S. J., Ley V., Salt J. S. Evidence of partial protection against foot-and-mouth disease in cattle immunized with a recombinant adenovirus vector expressing the precursor polypeptide (P1) of footand-mouth disease virus capsid proteins // The Journal of General Virology. 1999. № 80. P. 671–679. 53.Mayr G. A., Chinsangaram J., Grubman M. J. Development of replicationdefective adenovirus serotype 5 containing the capsid and 3C protease coding 122 regions of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate // Virology 1999.263(2). P. 496–506. 54.Abrams C. C., King A. M., Belsham G. J. Assembly of foot-and-mouth disease virus empty capsids synthesized by a vaccinia virus expression system // J. Gen. Virol. 1995. № 76. Р. 3089-3098. 55.Grubman M. J., Moraes M. P., Schutta C., Barrera J., Neilan J., Ettyreddy D. Adenovirus serotype 5-vectored foot-and-mouth disease subunit vaccines: the first decade // Future Virol. 2010. № 5(1). P. 51–64. 56.Moraes M. P., Mayr G. A., Mason P. W., Grubman M. J. Early protection against homologous challenge after a single dose of replication-defective human adenovirus type 5 expressing capsid proteins of foot-and-mouth disease virus (FMDV) strain A24 // Vaccine. 2002. № 20(11–12). P. 1631–1639. 57.Pacheco J. M., Brum M. C., Moraes M. P., Golde W. T., Grubman M. J. Rapid protection of cattle from direct challenge with foot-and-mouth disease virus (FMDV). by a single inoculation with an adenovirus-vectored FMDV subunit vaccine // Virology. 2005. № 337(2). P. 205–209. 58.Luizinho Caron Mario, Brum C.S., Mauro P. Moraes, William T. Golde, Clarice Weis Arns, Marvin J. Grubman. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor does not increase the potency or efficacy of a foot-and-mouth disease virus subunit vaccine // Pesq. Vet. Bras. 2005. № 25(3). P. 150-158. 59.Clarke B. E., Newton S. E., Carroll A. R., Francis M. J., Appleyard G., Syred A. D., Highfield P. E., Rowlands D. J., Brown F. Improved immunogenicity of a peptide epitope after fusion to hepatitis B core protein // Nature. 1987. № 2.330(6146). P. 381-384. 60.Zhang Y. L., Guo Y. J., Wang K. Y, Lu K., Li K., Zhu Y, Sun S. H. Enhanced immunogenicity of modified hepatitis B virus core particle fused with multiepitopes of foot-and-mouth disease virus // Scand J Immunol. 2007. № 65(4). P. 320-328. 123 61.Laporte J. J., Grosclaude J., Wantyghem S., Bernard Rouze P. Neutralization of the infective power of the foot-and-mouth disease virus in cell culture by using serums from pigs immunized with a purified viral protein // C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 1973. № 276. P. 3399-3401. 62.Kleid D. G., Yansura D., Small B., Dowbenko D., Moore D. M., Grubman M. J., McKercher P. D., Morgan D. O., Robertson B. H., Bachrach H. L. Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease: responses in cattle and swine // Science. 1981. № 214. Р. 1125–1129. 63.Strohmaier K., Franze R., Adam K. H. Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunizing protein // J. Gen. Virol. 1982. № 59. P. 295-306. 64.Kit M., Kit S., Little S. P., Di Marchi R. D., Gale C. Bovine herpesvirus-1 (infectious bovine rhinotracheitis virus) -based viral vector which expresses footand-mouth disease epitopes // Vaccine. 1991. № 9(8). P. 564-572. 65.Kitson J. D., Burke K. L., Pullen L. A., Belsham G. J., Almond J. W. Chimeric polioviruses that include sequences derived from two independent antigenic sites of foot-and-mouth disease virus (FMDV) induce neutralizing antibodies against FMDV in guinea pigs // J. Virol. 1991. № 65(6). P. 3068-3075. 66.Qian P., Li X. M., Jin M. L., Peng G. Q, Chen H. C. An approach to a FMD vaccine based on genetic engineered attenuated pseudorabies virus: one experiment using VP1 gene alone generates an antibody responds on FMD and pseudorabies in swine // Vaccine. 2004. № 2.22(17-18). P. 2129-2136. 67.Wigdorovitz A., Carrillo C., Dus Santos M. J., Trono K., Peralta A., Gomez M. C. Induction of a protective antibody response to foot and mouth disease virus in mice following oral or parenteral immunization with alfalfa transgenic plants expressing the viral structural protein VP1 // Virology. 1999a. № 255. P. 347-353. 68.Wigdorovitz A., Perez Filgueira D. M., Robertson N., Carrillo C., Sadir A. M., Morris T. J. Protection of mice against challenge with foot and mouth disease virus (FMDV) by immunization with foliar extracts from plants infected with 124 recombinant tobacco mosaic virus expressing the FMDV structural protein VP1 // Virology. 1999b. № 264. P. 85-91. 69.Taboga O., Tami C., Carrillo E. A large-scale evaluation of peptide vaccines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants // J. Virol. 1997. № 71(4). P. 2606–2614. 70.Rodriguez L. L., Barrera J., Kramer E., Lubroth J., Brown F., Golde W. T. A synthetic peptide containing the consensus sequence of the G–H loop region of foot-and-mouth disease virus type-O VP1 and a promiscuous T-helper epitope induces peptide-specific antibodies but fails to protect cattle against viral challenge // Vaccine. 2003. № 21(25–26). P. 3751–3756. 71.Wang C. Y, Chang T. Y, Walfield A. M. Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine // Vaccine. 2002. № 20(19–20). P. 2603–2610. 72.Beignon A. S., Brown F., Eftekhari P. A peptide vaccine administered transcutaneously together with cholera toxin elicits potent neutralising anti-FMDV antibody responses // Vet. Immunol. Immunopathol. 2005. № 104(3–4). P. 273– 280. 73.Challa S., Barrette R., Rood D., Zinckgraf J., French R., Silbart L. Non-toxic Pseudomonas aeruginosa exotoxin A expressing the FMDV VP1 G–H loop for mucosal vaccination of swine against foot and mouth disease virus // Vaccine. 2007. № 25(17). P. 3328–3337. 74.Mulcahy G., Gale C., Robertson P., Iyisan S., DiMarchi R. D., Doel T. R. Isotype responses of infected virus-vaccinated and peptide-vaccinated cattle to foot-andmouth disease virus // Vaccine. 1990. № 8, P. 249–256. 75.Mulcahy G., Pullen L. A., Gale C., DiMarchi R. D., Doel T. R. Mouse protection test as a predictor of the protective capacity of synthetic foot-and-mouth disease vaccines // Vaccine. 1991. № 9, 19–24. 76.Cartwright B., Chapman W. G., Brown F. Serological and immunological relations between the 146S and 12S particles of foot-and-mouth disease virus // J. Gen. Virol. 1980. № 50(2). P. 369-375. 125 77.Rowlands D. J., Sangar D. V., Brown F. A comparative chemical and serological study of the full and empty particles of foot-and mouth disease virus // J. Gen. Virol. 1975. № 26(3). P. 227-238. 78.Pay T. W. F., Hingley P. J. Correlation of 140S antigen dose with the serum neutralising antibody response and the level of protection induced in cattle by footand-mouth disease vaccines // Vaccine. 1987. № 5, P. 60-64. 79.Dunn C. S., Samuel A. R., Pullen L. A., Anderson J. The biological relevance of virus neutralisation sites for virulence and vaccine protection in the guinea pig model of foot-and-mouth disease // Virology. 1998. № 247. P. 51-61. 80.McCullough K. C., Desimone F., Brocchi E., Capucci L., Crowther J. R., Kihm U. Protective immune response against foot-and-mouth disease virus // J. Virol. 1992. № 66. P. 1835-1840. 81.Aktas S., Samuel A. R. Identification of antigenic epitopes on the foot and mouth disease virus isolate O/Manisa/Turkey/69 using monoclonal antibodies // Revue Scientifique et Technique Office International des Epizooties. 2000. № 19. P. 744753. 82.Barnett P. V., Samuel A. R., Pullen L., Ansell D., Butcher R. N., Parkhouse R. M. E. Monoclonal antibodies against O-1 serotype foot-and-mouth disease virus from a natural bovine host recognize similar antigenic features to those defined by the mouse // J. Gen. Virol. 1998. № 79. P. 1687-1697. 83.Crowther J. R., Farias S., Carpenter W. C., Samuel A. R. Identification of a 5th neutralizable site on type-O foot-and- mouth-disease virus following characterization of single and quintuple monoclonal-antibody escape mutants // J. Gen. Virol. 1993b. № 74. P. 1547-1553. 84.Baxt B., Vakharia V., Moore D. M., Franke A. J., Morgan D. O. Analysis of neutralising antigenic sites on the surface of type-A12 foot-and-mouth disease virus // J. Virol. 1989. № 63. P. 2143-2151. 126 85.Bolwell C., Clarke B. E., Parry N. R., Ouldridge E. J., Brown F., Rowlands D. J. Epitope mapping of foot-and-mouth disease virus with neutralizing monoclonalantibodies // J. Gen. Virol. 1989. № 70. P. 59-68. 86.Mahapatra M., Seki C., Upadhyaya S., Barnett P. V., La Torre J., Paton D. J. Characterisation and epitope mapping of neutralising monoclonal antibodies to A(24) Cruzeiro strain of FMDV // Veterinary Microbiology. 2011. № 149. P. 242247. 87.Thomas A. A. M., Woortmeijer R. J., Puijk W., Barteling S. J. Antigenic sites on foot-and-mouth disease virus type-A10 // J. Virol. 1988a. № 62. P. 2782-2789. 88.Mateu M. G., Martinez M. A., Capucci L., Andreu D., Giralt E., Sobrino F., Brocchi E., Domingo E. A single amino acid substitution affects multiple overlapping epitopes in the major antigenic site of foot-and-mouth disease virus of serotype C // J. Gen. Virol. 1990. № 71. P. 629-637. 89.Grazioli S., Fallacara F., Brocchi E. Mapping of neutralising sites on FMD virus type Asia 1 and relationships with sites described in other serotypes / Report of the Session of the Research Foot and Mouth Disease Group of the Standing Committee of the European commision of Foot and Mouth disease: Greece P. FAO, 2003. PP. 277-287. 90.Crowther J. R., Rowe C. A., Butcher R. Characterization of monoclonal antibodies against a type SAT 2 foot-and-mouth disease virus // Epidemiol. Infect. 1993a. № 111. P. 391-406. 91.Grazioli S., Moretti S. I. B., Crosatti M. Use of monoclonal antibodies to identify and map new antigenic determinants involved in neutralisation on FMD viruses type SAT 1 and SAT 2 / Report of the Session of the Research Foot and Mouth Disease Group of the Standing Committee of the European commision of Foot and Mouth disease: Cyprus P. FAO,2006. PP. 287-297. 92.Klein J. Understanding the molecular epidemiology of foot-and-mouth-disease virus // Infect. Genet. Evol. 2009. № 9(2). P. 153-161. 127 93.Knowles N. J., Samuel A. R. Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus // Virus Res. 2003. № 91(1). P. 65-80. 94.Rweyemamu M., Roeder P., Mackay D., Sumption K., Brownlie J., Leforban Y, Valarcher J. F., Knowles N. J., Saraiva V. Epidemiological patterns of foot-andmouth disease worldwide // Transbound Emerg. Dis. 2008. № 55(1). P. 57-72. 95.Valarcher J. F., Leforban Y., Rweyemamu M., Roeder P. L., Gerbier G., Mackay D. K., Sumption K. J., Paton D. J., Knowles N. J. Incursions of foot-and-mouth disease virus into Europe between 1985 and 2006 // Transbound Emerg. Dis. 2008. № 55(1). P. 14-34. 96.Doel T. R., Williams L., Barnett P. V. Emergency vaccination against foot-andmouth disease: rate of development of immunity and its implications for the carrier state // Vaccine. 1994. № 12(7). P. 592-600. 97.Xie Q. C., McCahon D., Crowther J. R., Belsham G. J., McCullough K. C. Neutralization of Foot-and-Mouth-Disease Virus Can Be Mediated through Any of at Least 3 Separate Antigenic Sites // J. Gen. Virol. 1987. № 68. P. 1637-1647. 98.McCahon D., Crowther J. R., Belsham G. J., Kitson J. D. A., Duchesne M., Have P., Meloen R. H., Morgan D. O., Desimone F. Evidence for at Least 4 Antigenic Sites on Type-O Foot-and- Mouth-Disease Virus Involved in Neutralization Identification by Single and Multiple Site Monoclonal Antibody-Resistant Mutants // J. Gen. Virol. 1989. № 70. P. 639-645. 99.Kitson J. D., McCahon D., Belsham G. J. Sequence analysis of monoclonal antibody resistant mutants of type O foot and mouth disease virus: evidence for the involvement of the three surface exposed capsid proteins in four antigenic sites // Virology. 1990. № 179. P. 26-34. 100.Krebs O., Ahl R., Straub O. C., Marquardt O. Amino-acid changes outside the G-H loop of capsid protein VP1 of type-O foot-and-mouth disease virus confer resistance to neutralisation by anti-peptide G-H serum // Vaccine. 1993. № 11, P. 359-362. 128 101.Fowler V. L., Paton D. J., Rieder E., Barnett P. V. Chimeric foot-and-mouth disease viruses: Evaluation of their efficacy as potential marker vaccines in cattle // Vaccine. 2008. № 26. P. 1982-1989. 102.Fowler V. L., Knowles N. J., Paton D. J., Barnett P. V. Marker vaccine potential of a foot-and-mouth disease virus with a partial VP1 G-H loop deletion // Vaccine. 2010. № 28. P. 3428-3434. 103.Rieder E., Baxt B., Lubroth J., Mason P. W. Vaccines prepared from chimeras of foot-and-mouth disease virus (FMDV) induce neutralizing antibodies and protective immunity to multiple serotypes of FMDV // J. Virol. 1994. № 68. P. 7092-7098. 104.Samuel A. R. Genetic and antigenic studies on foot-and-mouth disease virus type O. PhD Thesis. University of HertfordshirE. UK, 1997. 105.Aggarwal N., Barnett P. V. Antigenic sites of foot-and-mouth disease virus (FMDV): an analysis of the specificities of anti-FMDV antibodies after vaccination of naturally susceptible host species // J. Gen. Virol. 2002. № 83. P. 775-782. 106.Thomas A. A. M., Woortmeijer R. J., Barteling S. J., Meloen R. H. Evidence for more than one important neutralising sites on foot-and-mouth disease virus // Archives of Virology. 1988b. № 99. P. 237-242. 107.Mahapatra M., Hamblin P., Paton D.J. FMD virus epitope dominance in the antibody response of vaccinated animals // J. Gen. Virol. 2012. № 93. P. 488-493. 108.Collen T. Cell mediated immunity in ruminants: Foot-and-mouth disease (aphthovirus): viral T cell epitopes / CRC Press Inc.; B. M. L. Goddeevis and I. Morrison (ed.): Boca Raton Fla. 1994. PP. 173–197. 109.Rowlands D. J. Synthetic vaccines: Experimental determination of immunogenic sites / Blackwell Scientific Publications; B. H. Nicholson (ed.): Oxford. 1994. PP. 137–168. 129 110.Sobrino F., Blanco E., Garcı´a-Briones M. M., Ley V. Synthetic peptide vaccines: foot-and-mouth disease virus as a model // Dev. Biol. Stand. 1999. № 101. P. 39– 43. 111.Collen T., Doel T. R. Heterotypic recognition of foot-and-mouth disease virus by cattle lymphocytes // J. Gen. Virol. 1990. № 71. P. 309-315. 112.García-Briones M. M., Blanco E., Chiva C., Andreu D., Ley V., Sobrino F. Immunogenicity and T cell recognition in swine of foot-and-mouth disease virus polymerase 3D // Virology. 2004. № 1.322(2). P. 264-275. 113.Cox S. J., Barnett P. V., Dani P., Salt J. S. Emergency vaccination of sheep against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission // Vaccine. 1999. № 17. P. 1858–1868. 114.Parida S., Fleming L., Mahapatra M., Hamblin P., Gloster J., Paton D. J. Emergency vaccination of sheep against foot-and-mouth disease: significance and detection of subsequent sub-clinical infection // Vaccine. 2008. № 26. P. 3469– 3479. 115.Francis M. J., Hastings G. Z., Syred A. D., McGinn B., Brown F., Rowlands D. J. Non-responsiveness to a foot-and-mouth disease virus peptide overcome by addition of foreign helper T-cell determinants // Nature. 1987. № 12-18.330(6144). P. 168-170. 116.Blanco E., McCullough K., Summerfield A., Fiorini J., Andreu D., Chiva C., Borrás E., Barnett P., Sobrino F. Interspecies major histocompatibility complexrestricted Th-cell epitope on foot-and-mouth disease virus capsid protein VP4 // J. Virol. 2000. № 74(10). P. 4902-4907. 117.Collen T., Di Marchi R., Doel T. A., A T cell epitope in VP1 of foot-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle // J. Immunol. 1991. № 146. P. 749–755. 118.Rodrı´guez A., Dopazo J., Sa´iz J.C., Sobrino F., Immunogenicity of nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus: differences between infected and vaccinated swine // Arch. Virol. 1994a. № 136, P. 123–131. 130 119.Rodrı´guez A., Sa´iz J. C., Nombela I. S., Andreu D., Sobrino F., Antigenic specificity of porcine T cell response against foot-and-mouth disease virus: identification of T helper epitopes in VP1 // Virology. 1994b. № 205. P. 24–33. 120.Van Lierop M. J. C., Wagenaar J. P. A., van Noort J. M., Hensen E. J., Sequences derived from the highly antigenic VP1 region 140 to 160 of foot-and-mouth disease virus do not prime for a bovine T cell response against intact virus // J. Virol. 1995b. № 69. P. 4511–4514. 121.Zamorano P., Wigdorovitz A., Pe´rez-Filguera C., Ferna´ndez F. M., Carrillo C., Marcovecchio F.E., Sadir M. A. M., Borca V. Recognition of B and T cell epitopes by cattle immunized with a synthetic peptide containing the major immunogenic site of VP1 FMDV O1 Campos // Virology. 1994. № 201, P. 383–387. 122.Van Lierop M. J. C., Nilsson P. R., Wagenaar J. P. A., van Noort J. M., Campbell J. D. M., Glass E. J., Joosten I., Hensen E. J., The influence of MHC polymorphism on the selection of T cell determinants of foot-and-mouth disease virus in cattle // Immunology. 1995a. № 84. P. 79–85. 123.Glass E. J., Oliver R. A., Collen T., Doel T. R., Di Marchi R., Spooner R. L. MHC Class II restricted recognition of FMDV peptides by bovine T cells // Immunology.1991. № 74. P. 594–599. 124.Van Lierop M. J., van Maanen K., Meloen R. H., Rutten V. P., de Jong M. A., Hensen E. J. Proliferative lymphocyte responses to foot-and-mouth disease virus and three FMDV peptides after vaccination or immunization with these peptides in cattle // Immunology. 1992. № 75(3). P. 406–413. 125.Van Lierop M. J., van Noort J. M., Wagenaar J. P., Rutten V. P., Langeveld J., Meloen R. H., Hensen E. J. T cell-stimulatory fragments of foot-and-mouth disease virus released by mild treatment with cathepsin D // J. Gen. Virol. 1994. № 75. P. 2937-2946. 126.García-Briones M. M., Russell G. C., Oliver R. A., Tami C., Taboga O., Carrillo E., Palma E. L., Sobrino F., Glass E. J. Association of bovine DRB3 alleles with 131 immune response to FMDV peptides and protection against viral challenge // Vaccine. 2000. № 8.19(9-10). P. 1167-1171. 127.Beck E., Feil G., Strohmaier K. The molecular basis of the antigenic variation of foot-and-mouth disease virus // EMBO J. 1983. № 2. P. 555–559. 128.Gerner W., Hammer S. E., Wiesmüller K. H., Saalmüller A. Identification of major histocompatibility complex restriction and anchor residues of foot-and-mouth disease virus-derived bovine T-cell epitopes // J. Virol. 2009. № 83(9). P. 40394050. 129.Blanco E., Garcia-Briones M., Sanz-Parra A., Gomes P., De Oliveira E., Valero M. L., Andreu D., Ley V., Sobrino F. Identification of T-cell epitopes in nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. 2001. № 75(7). P. 3164-3174. 130.Pena L., Moraes M. P., Koster M., Burrage T., Pacheco J. M., Segundo F. D., Grubman M. J. Delivery of a foot-and-mouth disease virus empty capsid subunit antigen with nonstructural protein 2B improves protection of swine // Vaccine. 2008. № 23.26(45). P. 5689-5699. 131.Moraes M. P., Segundo F. D., Dias C. C., Pena L., Grubman M. J. Increased efficacy of an adenovirus-vectored foot-and-mouth disease capsid subunit vaccine expressing nonstructural protein 2B is associated with a specific T cell response // Vaccine.. 2011. № 28.29(51). P. 9431-9440. 132.Domingo E., Mateu M. G., Martı´nez M. A., Dopazo J., Moya A., Sobrino F., Applied virology research: Virus Variation and Epidemiology, Genetic Variability and Antigenic Diversity of Foot-and-Mouth Disease Virus / In P. Kurstak E., Marusyk R. G., Murphy S.A., Van Regenmortel M. H. V. (Eds.). New York:. Plenum. vol. 2. 133.Collen T., Baron J., Childerstonn A., Corteyn A., Doen T. R., Flint M., Garcı´aValca´rcel M., Parkhouse R. M. E., Ryan M. D. Heterotypic recognition of recombinant FMDV proteins by bovine T-cells: the polymerase (P3Dpol) as an immunodominant T-cell immunogen // Virus Res. 1998. № 56. P. 125–133. 132 134.Cedillo-Baron L., Foster-Cuevas M., Belsham G., Lefevre F., Parkhouse M. E. Induction of a protective response in swine vaccinated with DNA encoding footand-mouth disease virus empty capsid proteins and the 3D RNA polymerase // J. Gen. Virol. 2001. № 82. P. 1713–1724. 135.Gerner W., Denyer M. S., Takamatsu H. H., Wileman T. E., Wiesmüller K. H., Pfaff E., Saalmüller A. Identification of novel foot-and-mouth disease virus specific T-cell epitopes in c/c and d/d haplotype miniature swine // Virus Res. 2006. № 121(2). P. 223-228. 136.Berger H. G., Straub O. C., Ahl R., Tesar M., Marquardt O. Identification of footand-mouth disease virus replication in vaccinated cattle by antibodies to nonstructural virus proteins // Vaccine. 1990 № 8(3). P. 213-216. 137.Barfoed A. M., Rodriguez F., Therrien D., Borrego B., Sobrino F., Kamstrup S. DNA immunization with 2C FMDV non-structural protein reveals the presence of an immunodominant CD8+, CTL epitope for Balb/c mice // Antiviral Res. 2006 № 72(3). P. 178-89. 138.Itakura K., Hirose T., Crea R., Riggs A. D., Heyneker H. L., Bolivar F., Boyer H. W. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin // Science. 1977. № 4321. Vol. 198. PP. 1056-1063. 139.Studier F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures // Protein Express Purif. 2005. № 41. Р. 207-234. 140.Evangelista R. L., Kusnadi A. R., Howard J. A., Nikolov Z. L. Process and economic evaluation of the extraction and purification of recombinant betaglucuronidase from transgenic corn // Biotechnol. Prog. 1998. № 14(4). P. 607614. 141.Giddings G., Allison G., Brooks D., Carter A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals // Nat. Biotechnol. 2000. № 18(11). P. 1151-1155. 142.Fischer R., Hoffmann K., Schillberg A., Emans N. Antibody production by molecular farming in plants // J Biol Regul Hemeost Agents. 2000. № 14. Р. 83– 92. 133 143.Liénard D., Sourrouille C., Gomord V., Faye L. Pharming and transgenic plants // Biotechnol Ann. Rev. 2007. № 13. P. 115–147. 144.Streatfield S. J. Mucosal immunization using recombinant plant-based oral vaccines // Methods. 2006. № 38(2). P. 150-157. 145.Tacket C. O. Plant-derived vaccines against diarrheal diseases // Vaccine. 2005. № 23 P. 1866–1869. 146.Bevan M. W., Flavell R. B., Chilton M. D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation // Nature. 1983. № 304. P. 184– 187. 147.Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. № 342. P. 76–78. 148.Barta A., Sommengruber K., Thompson D., Hartmuth K., Matzke M. A., Matzke A. J. M. The expression of a napoline synthase human growth hormone chimeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant. Mol. Biol. 1986. № 6. P. 347–357. 149.Hood E. E., Witcher D. R., Maddock S., Meyer T., Baszczynski C., Bailey M. Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant production, processing, extraction and purification // Mol. Breed. 1997. № 3 P. 291–306. 150.Mason H. S., Warzecha H., Mor T., Arntzen C. J. Edible plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine // Trends Mol. Med. 2002. № 8 P. 324–329. 151.Tiwari S., Verma P. C., Singh P. K., Tuli R. Plants as bioreactors for the production of vaccine antigens // Biotechnol. Adv. 2009. № 27(4). P. 449-467. 152.Horn M. E., Woodard S. L., Howard J. A. Plant molecular farming: systems and products // Plant Cell Rep. 2004. № 22. P. 711–720. 153.Sijmons P. C., Dekker B. M., Schrammeijer B., Verwoerd T. C., van den Elzen P. J., Hoekema A. Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants // Biotechnology. 1990. № 8. Р. 217–221. 134 154.Edelbaum O., Stein D., Holland N., Gafni Y., Livneh O., Novick D., Rubinstein M., Sela I. Expression of active human interferon-b in transgenic plants // J. Interferon Res. 1992. № 12. Р. 449-453. 155.Kusnadi A. Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations // Biotechnology and Bioengineering. 1997. № 56. Р. 473-484. 156.Nandi S., Yalda D., Lu S., Nikolov Z., Misaki R., Fujiyama K., Huang N. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain // Transgenic Res. 2005. № 4(3). P. 237-249. 157.Rybicki E. P. Plant-produced vaccines: promise and reality // Drug Discov. Today. 2009. № 14(1-2). P. 16-24. 158.Meyers B., Zaltsman A., Lacroix B., Kozlovsky S. V., Krichevsky A. Nuclear and plastid genetic engineering of plants: comparison of opportunities and challenges // Biotechnol. Adv. 2010. № 28(6). P. 747-756. 159.Ruf S., Karcher D., Bock R. Determining the transgene containment level provided by chloroplast transformation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. № 104. P. 6998–7002. 160.Sadhu L., Reddy V. S. Chloroplast expression of His-tagged GUS-fusions: a general strategy to overproduce and purify foreign proteins using transplastomic plants as bioreactors // Mol. Breed. 2003. № 11. P. 49–58. 161.Oey M., Lohse M., Kreikemeyer B., Bock R. Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic // Plant J. 2009. №.5. P. 436–445. 162.Molina A., Veramendi J., Hervás-Stubbs S. Induction of neutralizing antibodies by a tobacco chloroplast-derived vaccine based on a B cell epitope from canine parvovirus // Virology. 2005. № 25.342(2). P. 266-275. 163.Fernandez-San Millan A. Human papillomavirus L1 protein expressed in tobacco chloroplasts self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic // Plant Biotechnol. J. 2008. № 6. P. 427–441. 135 164.Oey M. Plastid production of protein antibiotics against pneumonia via a new strategy for highlevel expression of antimicrobial proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. № 106. P. 6579–6584. 165.Bally J., Nadai M., Vitel M., Rolland A., Dumain R., Dubald M. Plant physiological adaptations to the massive foreign protein synthesis occurring in recombinant chloroplasts // Plant Physiol. 2009. № 150. P. 1474–1481. 166.Singh A. K., Verma S. S. Plastid transformation in eggplant (Solanum melongena L.) // Transgenic Res. 2010. № 19. P. 113–119. 167.Kapila J., De Rycke R., van Montagu M., Angenon G. An agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves // Plant Sci. 1997. № 122. P. 101–108. 168.Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants // Nat. Biotechnol. 2005. № 23. Р. 718–723. 169.Gleba Y, Klimyuk V., Marillonnet S. Viral vectors for the expression of proteins in plants // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. № 18(2). P. 134-141. 170.Turpen T. H., Reinl S. J., Charoenvit Y, Hoffman S. L., Fallarme V., Grill L. K. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobaccomosaic virus // Biotechnol. 1995. № 13. P. 53–57. 171.Palmer K. E., Benko A., Doucette S. A., Cameron T. I., Foster T., Hanley K .M., McCormick A .A., McCulloch M., Pogue G. P., Smith M. L., Christensen N. D. Protection of rabbits against cutaneous papillomavirus infection using recombinant tobacco mosaic virus containing L2 capsid epitopes // Vaccine. 2006. № 29.24(26). P. 5516-5525. 172.Kohl T., Hitzeroth I., Stewart D., Varsani A., Govan V. A., Christensen N. D., Williamson A. L., Rybicki E. P Plant-produced cottontail rabbit papillomavirus L1 protein protects against tumor challenge: a proof-of-concept study // Clin. Vaccine Immunol. 2006. № 13. P. 845-853. 136 173.Avesani L., Marconi G., Morandini F., Albertini E., Bruschetta M., Bortesi L., Pezzotti M., Porceddu A. P. Stability of potato virus X expression vectors is related to insert size: implications for replication models and risk assessment // Transgenic Res. 2007. № 16(5). P. 587-597. 174.Klimyuk V., Marillonnet S., Knaeblein J., McCaman M., Gleba Y. Modern Biopharmaceuticals: Production of recombinant proteins in plants / Edited by Knaeblein J; WILEY-VCH P. Verlag: GmbH & Co. KGaA, 2005.PP. 893-917. 175.Gils M., Kandzia R., Marillonnet S., Klimyuk V., Gleba Y. High-yield production of authentic human growth hormone using a plant virus-based expression system // Plant Biotechnol. J. 2005. № 3. Р. 613-620. 176.Santi L., Giritch A., Roy C. J., Marillonnet S., Klimyuk V., Gleba Y., Webb R., Arntzen C. J., Mason H. S. Protection conferred by recombinant Yersinia pestis antigens produced by a rapid and highly scalable plant expression system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. № 103. Р. 861-866. 177.Dorokhov Y. L., Sheveleva A. A., Frolova O. Y., Komarova T. V., Zvereva A. S., Ivanov P. A., Atabekov J. G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves // Tuberculosis (Edinb). 2006. №61. Р. 342-541. 178.Yusibov V., Hooper D., Spitsin S., Fleysh N., Kean R., Mikheeva T., Deka D., Karasev A., Cox S., Randall J., Koprowski H. Expression in plants and immunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine // Vaccine. 2002. № 20. Р. 3155-3164. 179.Massa S., Franconi R., Brandi R., Muller A., Mett V., Yusibov V. Anti-cancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine // Vaccine. 2007. № 25. P. 3018– 3021. 180.Mett V., Musiychuk K., Bi H., Farrance C. E., Horsey A., Ugulava N., Shoji Y, de la Rosa P., Palmer G. A., Rabindran S., Streatfield S. J., Boyers A., Russell M., Mann A., Lambkin R., Oxford J. S., Schild G. C., Yusibov V. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge // Influenza Other Respi. Viruses. 2008. № 2(1). P. 33-40. 137 181.Wagner B., Hufnagl K., Radauer C., Wagner S., Baier K., Scheiner O., Wiedermann U., Breiteneder H. Expression of the B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in tobacco mosaic virus-infected Nicotiana benthamiana plants and its characterization as mucosal immunogen and adjuvant // J. Immunol. Methods. 2004. № 287. Р. 203–215. 182.McCormick A. A., Reddy S., Reinl S. J., Cameron T. I., Czerwinkski D. K., Vojdani F. Plantproduced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: safety and immunogenicity in a phase I clinical study // Proc. Natl .Acad. Sci .USA. 2008. № 105. P. 10131–10136. 183.http P. //www.fraunhofer-cmb.org/ 184.Yusibov V., Rabindran S., Commandeur U., Twyman R. M., Fischer R. The potential of plant virus vectors for vaccine production. Drugs R. D. 2006. № 7(4). P. 203-217. 185.Brennan F. R., Gilleland L. B., Staczek J., Bendig M. M., Hamilton W. D., Gilleland H. E. Jr. A chimaeric plant virus vaccine protects mice against a bacterial infection // Microbiology. 1999. № 145. P. 2061-2067. 186.Franconi R., Massa S., Illiano E., Mullar A., Cirilli A., Accardi L. Exploiting the plant secretory pathway to improve the anticancer activity of a plant-derived HPV16 E7 vaccine // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2006. № 19. P. 187–197. 187.Pogue G. P., Lindbo J. A., Garger S. J., Fitzmaurice W. P. Making an ally from an enemy: plant virology and the new agriculture // Annu. Rev. Phytopathol. 2002. № 40. P. 45-74. 188.Hamilton A. J., Baulcombe D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 1999. № 286. P. 950–952. 189.Kasschau K. D., Carrington J. C. A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing // Cell. 1998. № 95. Р. 461-470. 190.Voinnet O., RivasS., Mestre P., Baulcombe D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus // Plant J. 2003. № 33. P. 949–956. 138 191.Perlak F. J., Fuchs R. L., Dean D. A., McPherson S. L., Fischhoff D. A. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. № 88(8). P. 3324–3328. 192.Hamada A., Yamaguchi K. I., Ohnishi N., Harada M., Nikumaru S., Honda H. High-level production of yeast (Schwanniomyces occidentalis). phytase in transgenic rice plants by a combination of signal sequence and codon modification of the phytase gene // Plant Biotechnol. J. 2005. № 3. P. 43–55. 193.Rouwendal G. J., Mendes O., Wolbert E. J. H., Boer A. D. Enhanced expression in tobacco of the gene encoding green fluorescent protein by modification of its codon usage // Plant Mol. Biol. 1997. № 33(6). P. 989–099. 194.Kawabe A., Miyashita N. T. Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species. // Genes Genet Syst. 2003. № 78(5). P. 343–352. 195.Sullivan M. L., Green P. J. Post-transcriptional regulation of nuclear-encoded genes in higher plants: the roles of mRNA stability and translation // Plant Mol. Biol. 1993. № 23 (6). P. 1091–1104. 196.Mishra S., Yadav D. K., Tuli R. Ubiquitin fusion enhances cholera toxin B subunit expression in transgenic plants and the plant-expressed protein binds GM1 receptors more efficiently // J. Biotechnol. 2006. № 127. P. 95-108. 197.Usha R., Rohll J. B., Spall V. E., Shanks M., Maule A. J., Johnson J. E., Lomonossoff G. P. Expression of an animal virus antigenic site on the surface of a plant virus particle // Virology. 1993. № 197(1). P. 366-374. 198.Wu L., Jiang L., Zhou Z., Fan J., Zhang Q, Zhu H., Han Q, Xu Z. Expression of foot-and-mouth disease virus epitopes in tobacco by a tobacco mosaic virus-based vector // Vaccine. 2003. № 1.21(27-30). P. 4390-4398. 199.Yang C. D., Liao J. T., Lai C. Y, Jong M. H., Liang C. M., Lin Y. L., Lin N. S., Hsu Y. H., Liang S. M. Induction of protective immunity in swine by recombinant bamboo mosaic virus expressing foot-and-mouth disease virus epitopes // BMC Biotechnol. 2007. № 27.7. P. 62. 139 200.Dus Santos M. J., Wigdorovitz A., Trono K., Ríos R. D., Franzone P. M., Gil F., Moreno J., Carrillo C., Escribano J. M., Borca M. V. A novel methodology to develop a foot and mouth disease virus (FMDV). peptide-based vaccine in transgenic plants // Vaccine.. 2002. № 15.20(7-8). P. 1141-1147. 201.Carrillo C , Wigdorovitz A , Oliveros J. C. Protective immune response to footand-mouth disease virus with VP1 expressed in transgenic plants // J. Virol. 1998. № 72. Р. 1688–1690. 202.Wigdorovitz A., Carrillo C., Trono K. Induction of a virus-specific antibody response to foot and mouth disease virus using the structural protein VP1 expressed in transgenic potato plants // Virol. Immunol. 2001. № 14. 49–57. 203.Carrillo C., Wigdorovitz A., Trono K., Dus Santos M. J., Castañón S., Sadir A. M., Ordas R., Escribano J. M., Borca M. V. Induction of a virus-specific antibody response to foot and mouth disease virus using the structural protein VP1 expressed in transgenic potato plants // Viral Immunol. 2001. № 14(1). P. 49-57. 204.Wang D. M., Zhu J. B., Peng M., Zhou P. Induction of a protective antibody response to FMDV in mice following oral immunization with transgenic Stylosanthes spp. as a feedstuff additive // Transgenic Res. 2008. № 17. Р. 63-70. 205.Li Y., Sun M., Liu J., Yang Z., Zhang Z., Shen G. High expression of foot-andmouth disease virus structural protein VP1 in tobacco chloroplasts // Plant Cell Rep. 2006. № 25(4). P. 329-333. 206.Sun M., Qian K., Su N., Chang H., Liu J., Shen G. Foot-and-mouth disease virus VP1 protein fused with cholera toxin B subunit expressed in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast // Biotechnol Lett. 2003. № 25(13). P. 1087-1092. 207.Wang Y., Shen Q., Jiang Y., Song Y., Fang L., Xiao S., Chen H. Immunogenicity of foot-and-mouth disease virus structural polyprotein P1 expressed in transgenic rice // J. Virol Methods. 2012. № 181(1). P. 12-17. 208.Pan L., Zhang Y., Wang Y., Wang B., Wang W., Fang Y., Jiang S., Lv J., Wang W., Sun Y., Xie Q. Foliar extracts from transgenic tomato plants expressing the structural polyprotein P1-2A., and protease 3C., from foot-and-mouth disease virus 140 elicit a protective response in guinea pigs // Vet Immunol Immunopathol. 2008. № 15.121(1-2). P. 83-90. 209.Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. Second edition. New York: P. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 546 р. 210.Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. № 96. Р. 8-23. 211.Марданова Е. С., Котляров Р. Ю., Равин Н. В. Повышение эффективности продукции рекомбинантных белков в растениях за счет оптимизации трансляции РНК вируса-вектора // Молекулярная биология. 2009. №3 (43). C. 568-571. 212.Folimonov A. S., Folimonova S. Y., Bar-Joseph M., Dawson W. O. A stable RNA virus-based vector for citrus trees // Virology. 2007. № 10.368(1). P. 205-216. 213.Grubman M. J., Morgan D. O., Kendall J., Baxt B. Capsid intermediates assembled in a foot-and-mouth disease virus genome RNA-programmed cell-free translation system and in infected cells // J. Virol. 1985. № 56(1). P. 120-126. 214.Dus Santos M. J., Carrillo C., Ardila F., Ríos R. D., Franzone P., Piccone M. E., Wigdorovitz A., Borca M. V. Development of transgenic alfalfa plants containing the foot and mouth disease virus structural polyprotein gene P1 and its utilization as an experimental immunogen // Vaccine. 2005. № 7.23(15). P. 1838-1843. 215.Chayen N. E. Turning protein crystallisation from an art into a science // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. № 14(5). P. 577-583. 216.Schein C. H. Production of soluble recombinant proteins in bacteria // Biotechnology. 1989. № 7. P. 1141–1148. 217.Arnau J., Lauritzen C., Petersen G. E., Pedersen J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins // Protein Expr. Purif. 2006. № 48(1). P. 1-13. 218.Waugh D. S. Making the most of affinity tags // Trends Biotechnol. 2005. № 23(6). P. 316-20.
