УДК 579.678 ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS ИЗ ОБЪЕКТОВ

УДК 579.678
ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS ИЗ ОБЪЕКТОВ
ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОГО НАДЗОРА
Турутина Е.С., Шаталин А.Ю., Феоктистова Н.А., Васильев Д.А.
ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная
академия имени П.А. Столыпина»
THE SELECTION OF BACTERIA BACILLUS SUBTILIS OF OBJECTS
OF VETERINARY-SANITARY SUPERVISION
Turutina E.S., Shatalin A.Yu., Feoktistova N.A., Vasilev D.A.
FSBEI HPE "Ulyanovsk state state agricultural Academy named after P.A.
Stolypin"
В последние годы исследователи уделяют большое внимание проблеме
обнаружения
патогенных
микроорганизмов
в
объектах
ветеринарно-
санитарного надзора: в воде, пищевых продуктах, кормах для животных. Эти
субстраты представляют собой потенциальную угрозу, так как могут быть
контаминированы
пищевые
почвенными
отравления, и
сапрофитами,
поэтому в
вызывающими
острые
эпидемиологическом отношении
заслуживают особого внимания. Поэтому разработка и внедрение в практику
простых
и
надежных
методов
индикации
бактерий
вида
B.subtilisобнаружения данного возбудителя в объектах санитарного надзора
не теряют своей актуальности.
Прежде чем приступить к выделению бактерий вида B.subtilisиз
пищевых продуктов, мы провели индикацию бактерий данного вида из
объекта санитарного надзора - воды,
искусственно контаминированной
бактериями вида B.subtilis, разработав таким образом модель исследования.
Пробы водопроводной воды в объеме 10 мл вносили в колбы и
контаминировали бактериями B. subtilis 6633 (заливали МПБ из расчета
1:10). Брали колбу с пробой воды, необсемененной бактериями вида B.
subtilis(контроль).Содержимое всех колб встряхивали в течение 15 минут,
затем в течение 10 минут отстаивали. После культивирования в термостате
при температуре 370С в течение 24
часов содержимое каждой колбы
прогревали при 700С в течение 45 мин и высевали
на МПА по методу
Дригальского для выделения чистой культуры B. subtilis, а затем
производили посевы на следующие среды (согласно схеме Gordon`a):1%
глюкозный бульон,среду Кларка, мясо-пептонныйагар, среду Гаузе № 2,
картофельный агар, кровяной агар, желточно-солевойагар.Инкубировали
посевы в условиях термостата в течение 24 часов в условиях термостата при
37 0С. Затем выросшие колонии пересевали на МПБ и инкубировали в
условиях термостата в течение 5 часов в условиях термостата при 37 0С.
Для более точной дифференциации выделенных бацилл мы нашли в
литературе биохимические тесты, по которым можно идентифицировать
выделенные бациллы: глюкоза – реакция положительная, лактоза – реакция
отрицательная, сахароза – реакция положительная, сорбит – реакция
положительная, адонит – реакция отрицательная, манноза – реакция
положительная, арабиноза – реакция положительная, триптофандезаминаза –
реакция отрицательная, фенилаланиндезаминаза – реакция отрицательная,
лизиндекарбоксилаза – реакция отрицательная, аргининдегидролаза –
реакция положительная, уреаза – реакция положительная, маннит – реакция
положительная, желатин – реакция положительная, молоко - реакция
положительная.
В результате проведенных исследований было установлено, что
выделенный нами из водопроводной воды штамм бактерий рода Bacillus
относится к виду B. subtilis.
Вторым этапом наших исследований является выделение бактерий
B.subtilisиз пищевых продуктов.
Нами
было исследовано на наличие бактерий B. subtilis10 проб
пищевых продуктов, купленных на продовольственных рынках г.Ульяновска:
свежая и мороженая рыба, копченая рыба, мясо свинина и говядина,
пряности (перец горошком, корица, гвоздика, куркума, кориандр), творог,
молоко.
Исследуемые пробы измельчали в ступке при помощи пестика, вносили
в физиологический раствор в соотношении 1:10 и прогревали на водяной
бане при температуре 700С в течение 45 минут.
Далее исследовали пробы согласно схеме Gordon (1973):т.е. высевали
на элективную среду, после 24ч инкубирования в термостате при 370С,
пересевали на МПА, среду Гаузе 2, ставили в термостат на 24 ч, при 370С.
Выделенные в результате бактерии окрашивали по Граму, делали тесты
на каталазную активность и подвижность. Затем сделали пересев с МПА в
МПБ, и через 4-5 часов инкубирования в термостате при 370С посеяли на
среды: среда Кларка, 1% глюкозный агар, картофельный агар, МПБ с яичным
желтком, бульон с мочевиной, мясо-пептонная желатина, бульон с
нитратами. Оценка результатов посевов проводилась через 24 часа
инкубирования в термостате (37°C).
В результате исследований было выделено 10 штаммов бацилл, которые
были проверены по морфологическим, тинкториальным, биохимическим
свойствам для их идентификации.
Изучение морфологических свойств выделенных бактерий
Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла мы
наносили небольшую каплю воды и с помощью бактериальной петли
помещали в нее исследуемый материал. Материал равномерно распределяли
на стекле таким образом, чтобы образовался тонкий мазок круглой или
овальной формы размером 1-2 см2. Затем препарат высушивали над
пламенем горелки. Высушенный мазок подвергали фиксации, вследствие
чего он прикрепляется к стеклу (фиксируется), микробы инактивируются и
становятся безопасными, возрастает их восприимчивость к окраске.
Применяют различные способы фиксации. Наиболее простым и самым
распространенным способом является фиксация жаром - нагреванием на
пламени горелки (препарат несколько раз проводим через наиболее горячую
часть пламени горелки). После фиксации производили окраску мазка по
методам Грама, Ольта.
Все выделенные нами бактерии – это грамположительные тонкие
палочки, располагаются одиночно, в виде нитей или цепочек. Они содержат
овальные споры, не превышающие в поперечнике ширины микробной клетки.
Капсулу не образуют.
Для дальнейших исследований отбирались колонии, которые на плотной
питательной среде образовывали колонии мучного цвета, мелко складчатые,
на мясо-пептонном бульоне растущие в виде морщинистой пленки.
Изучение биохимических свойств выделенных бактерий, а также
проведенные нами дополнительные тесты свидетельствуют, что 9 из 10
исследованных проб пищевых продуктов оказались
контаминированы
бактериями вида B.subtilis(таблица 4).
В результате проведенных исследований нами были выделены из
пищевых продуктов культуры бактерий, которые мы классифицировали по
биологическим свойствам (на основании тестов, описанных в литературных
источниках и результатах изучения биохимических свойств штамма B.subtilis
6633, полученного из музея НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА
им. П.А. Столыпина») и отнесли их к видуB.subtilis.
На основании тестов схемы Gordon (1973) и дополнительно введенных
нами биохимических тестов мы утверждаем,
что выделенные нами 9
штаммов относятся к виду B.subtilis.
В
последнее
время
исследователи
обращают
внимание
на
встречаемость в пищевых продуктах токсигенных культур этой группы,
наличие у них факторов патогенности. Однако вследствие недооценки
возможной роли бацилл в патологии человека и животных большинство
авторов не исследовали токсичность выделенных культур.Бактерии вида
B.subtilisдостаточно
хорошо
изучены,
но
при
ознакомлении
с
литературными источниками мы пришли к выводу, что в настоящее время
очень малое количество авторов занимается разработкой схем выделения
бацилл данного вида, поэтому единой схемы выделения бактерий вида
B.subtilisне существует. В своей работе мы использовали схему выделения
бактерий вида B.subtilisпо Gordon (1973), дополнив ее еще рядом
дополнительных тестов:глюкоза, лактоза, сахароза, сорбит, адонит, манноза,
арабиноза,
триптофандезаминаза,
лизиндекарбоксилаза,
аргининдегидролаза,
фенилаланиндезаминаза,
уреаза,
маннит,
желатин,
молоко.Идентификация бактерий рода Bacillusпо такой схеме дает точные
результаты в довольно краткий срок.
Библиографический список:
1.
Мустафин,
А.Х.
Методика
выделения
Bacillussubtilis/
А.Х.Мустафин, Н.А. Феоктистова // Актуальные вопросы аграрной науки и
образования: материалы международной научно-практической конференции
посвященной 65-летию УГСХА. − Ульяновск: УГСХА, 2008. − Ч.IV. − С.100–
104.
2.
Сбойчаков, В.Б. Санитарная микробиология / В.Б. Сбойчаков.− М.:
Изд. группа «ГЭОТАР-Медиа», 2007. − С. 98.
3.
Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов:
справочник / М.А. Сидоров. − М.: Колос, 1995. − С.104–112.
4.
Смирнов, В.В. Методические рекомендации по выделению и
идентификации бактерий рода Bacillusиз организма человека и животных /
В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова. − Киев: Наукова думка, 1983. −
С. 51.
5.
Семанин А.Г., Скорик А.С., Суркова Е.И., Васильева Ю.Б.,
Марьина
О.Н.
АНАЛИЗ
РАСПРОСТРАНЕНИЯ
БОРДЕТЕЛЛЕЗА
ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ // Материалы V Международной студенческой
электронной научной конференции «Студенческий научный форум» URL: <a
href="http://www.scienceforum.ru/2014/645/2957">www.scienceforum.ru/2014/6
45/2957</a>
6.
Суркова Е.И., Скорик А.С., Семанин А.Г., Васильева Ю.Б.,
Мастиленко
А.В.
УСТОЙЧИВОСТЬ
БАКТЕРИЙ
BORDETELLA
BRONCHISEPTICA К НЕКОТОРЫМ ХИМИЧЕСКИМ СРЕДСТВАМ //
Материалы
V
конференции
Международной
«Студенческий
студенческой
научный
электронной
форум»
научной
URL:
<a
href="http://www.scienceforum.ru/2014/645/2954">www.scienceforum.ru/2014/6
45/2954</a>
7.
Голоушкина А.С., Зимукова С.Э., Феоктистова Н.А., Лыдина
М.А., Васильев Д.А. РАЗРАБОТКА ФАГОВОГО БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ
ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ПРОТЕЙНОЙ ИНФЕКЦИИ // Материалы V
Международной
студенческой
научный
«Студенческий
электронной
научной
форум»
конференции
URL:
<a
href="http://www.scienceforum.ru/2014/645/2960">www.scienceforum.ru/2014/6
45/2960</a>
8.
Пирюшова А.Н., Журавкова Ю.А., Феоктистова Н.А., Васильев
Д.А. ФАГОИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS //
Материалы
V
конференции
Международной
«Студенческий
студенческой
научный
электронной
форум»
научной
URL:
<a
href="http://www.scienceforum.ru/2014/645/2964">www.scienceforum.ru/2014/6
45/2964</a>
9.
Галушко И.С., Еремина Т.А., Барт Н.Г. ВЫДЕЛЕНИЕ ФАГОВ
БАКТЕРИЙ РОДА PROVIDENCIA ИЗ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ И
ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА // Материалы V Международной
студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный
форум»
URL:
<a
href="http://www.scienceforum.ru/2014/666/2961">www.scienceforum.ru/2014/6
66/2961</a>
10.
Воротников
А.П.,
Молофеева
Н.И.
ИЗУЧЕНИЕ
БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ESCHERICHIA COLI
О157 // Материалы V Международной студенческой электронной научной
конференции
«Студенческий
научный
форум»
URL:
<a
href="http://www.scienceforum.ru/2014/666/2967">www.scienceforum.ru/2014/6
66/2967</a>
11.
Кудряшова К.В., Феоктистова Н.А., Васильев Д.А. МЕТОДИКА
ВЫДЕЛЕНИЯ
Международной
«Студенческий
ФИТОПАТОГЕННЫХ
студенческой
научный
БАЦИЛЛ
электронной
форум»
Материалы
//
научной
V
конференции
URL:
<a
href="http://www.scienceforum.ru/2014/666/2963">www.scienceforum.ru/2014/6
66/2963</a>