удк 581.175.14 отработка технологии микроклонального

УДК 581.175.14
ОТРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО
РАЗМНОЖЕНИЯ ХВОЙНЫХ ПОРОД РАСТЕНИЙ
Бектемирова Резеда С.
Студент, Евразийский Национальный Университет имени Л.Н. Гумилева, г. Астана
Научный руководитель – кандидат биологических наук Турпанова Р. М.
Актуальность темы
Хвойные обладают рядом важных свойств, которые определяют их
лесохозяйственное значение и коммерческую ценность для декоративного озеленения.
Прежде всего, это качественная древесина, высокая декоративность и разнообразие форм
кроны. Гармоничное сочетание различных форм и оттенков окраски хвои позволяют
создавать уникальные декоративные композиции для ландшафтного озеленения.
Немаловажно, что насаждения хвойных выполняют также фитосанитарную роль, выделяя
эфирные масла и фитонциды, рассеивают слишком яркий свет, служат фильтром для пыли и
других загрязнителей воздуха.
Они могут быть рекомендованы для посадки в рекреационные зоны, вдоль
автомагистралей. Все это обуславливает актуальность размножения ценных форм хвойных
пород и создания их плантационных посадок.
Хвойные породы являются одними из наиболее сложных объектов для
культивирования in vitro. Однако использование методов культуры ткани необходимо как
для сохранения и быстрого размножения элитных генотипов и форм хвойных, так и для
улучшения растений методами генной инженерии, в сравнительно небольшие сроки и
независимо от сезона позволяют получить массовое количество генетически выровненного,
оздоровленного, ювенилизированного посадочного материала.
На современном этапе согласно указу Президента Республики Казахстан о
государственной программе социально-экономического развития города предусматривается
производство лесонасаждений вокруг города Астана площадью 25 тыс. га. В «Послании
Президента Республики Казахстан Нурсултана Назарбаева народу Казахстана» ставится вопрос о
развертывании программы «Жасыл ел» по озеленению страны. В этой связи ученым
и производственникам республики предстоит важная задача – выполнение задач
поставленных Президентом и Правительством.
В успешном решении данных направлений немаловажное значение имеет разработка
и внедрение в лесное хозяйство Республики Казахстан принципиально новых методов и
способов размножения лиственных и хвойных древесных пород, кустарников и цветов,
основанных на современных методах сельскохозяйственной биотехнологии. Сегодня в
лесоразведении республики используются традиционные методы размножения растений –
семенное и вегетативное. Однако данные методы имеют весьма серьезные недостатки. Для
12
большинства видов, и в первую очередь, для древесных пород проблема размножения,
несмотря на интенсивные научные разработки в этой области, остается до конца еще не
решенной. Это обусловлено следующими причинами:
- не все виды пород, даже в ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным
способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);
- практически невозможно при помощи традиционных методов размножать многие
виды древесных пород в возрасте 10-15 лет (сосна, ель);
- на основе данных методов размножения не всегда удается получать качественный
посадочный материал (присутствует возможность накопления и передачи инфекции);
- трудоемкость и сложность операций при размножении древесных растений с
помощью прививок;
- неэффективность разработанных технологий для получения достаточного
количества генетически однородного материала в течение одного года.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Достижения в области биотехнологии растений привели к созданию принципиально
нового метода вегетативного размножения – клонального микроразмножения (получение в
условиях in vitro неполовым путем растений генетически идентичных исходному материалу).
В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать
присущую ей генетическую информацию – тотипотентность, т.е. способность клетки под
влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Данный
метод, имеет ряд серьезных преимуществ перед существующими традиционными способами
размножения:
- получение генетически однородного посадочного материала;
- освобождение от вирусов и других заболеваний;
5
6
- высокий коэффициент размножения (10 -10 – для травянистых, цветочных
5
4
4
растений, 10 -10 – для кустарниковых и древесных, 10 – для хвойных);
- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
- размножение растений, которые с трудом или совсем не размножаются
вегетативно традиционными способами;
- возможность проведения круглогодичных работ при экономии площадей,
необходимых для выращивания посадочного материала;
- возможность автоматизации процесса выращивания.
Метод длительного микроклонального размножения in vitro является одним из путей
упрощения и повышения эффективности размножения ценных хвойных пород, в частности
можжевельника сибирского. Можжевельник сибирский относится к уникальным видам,
представляющим интерес для озеленения, а также при получении ценных биологически
активных веществ для фармакологической промышленности. Главное значение имеют
можжевеловые посадки. Ценность их в том, что они выделяют фитонцидов в 6 раз больше,
чем другие хвойные породы и в 15 раз больше, чем лиственные. В некоторых источниках
[Интернет сайт.WWW.Rambler. ru.] приводятся данные о том, что один гектар
можжевеловых посадок за одни сутки выделяет около 30 тонн мощных фитонцидов. Такого
количества достаточно для отчистки от вредных бактерий большого города. Эти свойства
можно использовать при оформлении санаториев, особенно легочных.
Традиционные способы размножения можжевельника сегодня не обеспечивают его
высокую востребованность. В этой связи отработка технологий ускоренного и эффективного
размножения растений можжевельника сибирского является весьма актуальной задачей для
озеленения и получения практически значимых биологически активных веществ для
парфюмерной промышленности.
Целью наших исследований являлась отработка оптимальных параметров
микроклонального размножения растений можжевельника сибирского.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
13
1.подобрать оптимальные условия для эксплантов можжевельника сибирского с
целью введения в культуру;
2.изучить возможность размножения можжевельника сибирского методом индукции
развития пазушных меристем с последующим их черенкованием in vitro;
3.изучить возможность микроклонального размножения методом дифференциации
адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.
Результаты исследований 1. Микроклональное
размножение растений можжевельника сибирского
Можжевельник сибирский является уникальным видом, представляющим интерес для
озеленения и получения ценных биологически активных веществ (подофиллотоксин и др.).
Традиционные способы восстановления и переработки можжевельника не обеспечивают
высокие потребительские свойства производимой продукции.
В этой связи на сегоднящний день создание ресурсосберегающей технологии
микроклонального размножения можжевельника в условиях in vitro, обеспечивающее
высокий коэффициент размножения является актуальной задачей.
Микроклональное размножение можжевельника проводили согласно стандартным
методикам двумя путями:
- методом индукции развития пазушных меристем с последующим их
черенкованием in vitro;
- методом дифференциации адвентивных почек в первичной и пересадочной
каллусной ткани.
1.1 Микроклональное размножение методом развития пазушных меристем с
последующим их черенкованием in vitro
1.1.1 Введение в культуру Juniperus sibirica В.
Обязательным условием для микроклонального размножения является использование
объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность. Этому условию
удовлетворяют пазушные почки органов стеблевого происхождения. В качестве эксплантов
для получения изолированных культур были взяты вершины побегов Juniperus sibirica В.
Стерилизацию побегов проводили в стерильном ламинар-боксе. В качестве стерилизующего
агента использовали 0,1%-й раствор диацида с добавлением твина-80 (1-2 капли на 1 л),
продолжительность экспозиции 25 мин. Далее побеги отмывали в дистиллированной воде
трижды по 15 мин.
Стерильные экспланты помещали в пробирки со стерильной питательной средой,
содержащей макро- и микроэлементы по МS с добавлением 0,2 мг/л ― Вирозола ‖, 30 г/л
сахарозы, витаминов – пиридоксина (В6) в количестве – 1 мг/л, тиамина хлорида (В1) – 1 мг/л
и ниацина – 1 мг/л. Содержание агара в среде составляло 7 г/л. Экспланты культивировались
0
при фотопериоде: 16 ч день и 8 ч ночь, при температуре 20 -25 С.
На начальном этапе исследования важно было подобрать оптимальные условия для
стерилизации эксплантов Juniperus Sibirica В. В результате эксперимента было установлено,
что наиболее эффективным стерилизующим раствором оказался 0,1 %-й раствор диацида с
добавлением твина-80 (1-2 капли на 1 л) при продолжительности экспозиции эксплантов
можжевельника сибирского в течение 25 мин. Эффективность стерилизации при этих
условиях составила 97,50 %. При проведении дальнейших экспериментов использовали эти
условия стерилизации.
Стерильные однолетние побеги Juniperus sibirica В. вводили на агаризованные
питательные среды с минеральным составом по Murashige and Skoog (1962), Schenk and
Hildebrandt (1972), Uata (1939), Кnop (1865) и Sierlis (1964) без добавления гормонов.
Полученные результаты эксперимента показали, что наиболее благоприятной для
культивирования эксплантов оказалась питательная среда, содержащая соли по Murashige
and Skoog (МS) с добавлением 30 г/л сахарозы и витаминов: пиридоксина (В6), тиамина
хлорида, ниацина в количестве по 1 мг/л.
14
Следующим важным моментом в процессе микроклонального размножения было
подавление апикального доминирования у эксплантов Juniperus sibirica В. и стимуляция
роста пазушных почек. Для достижения этой цели вводили в питательную среду гормоны
ауксинового и цитокининового типа.
На всех средах с содержанием 6-БАП в концентрации от 0,1-1,0 мг/л происходила
стимуляция роста пазушных почек. В зависимости от концентрации гормона 6-БАП в среде
развитие пазушных почек происходило либо у основания экспланта, либо по всему
экспланту. Наибольшее количество побегов было получено на среде с макро- и
микроэлементами по MS с добавлением 0,1 мг/л 6-БАП.
1.1.2. Собственно микроразмножение
На следующем этапе полученные микропобеги в стерильном боксе отделяли
скальпелем от экспланта и помещали на свежую питательную среду. Для выращивания
побегов в среду MS были добавлены регуляторы роста в различных концентрациях и
сочетаниях. Наибольший прирост побегов (1,8 см) в высоту наблюдался на питательной
среде с содержанием α-НУК (0,1 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л).
В работе по стимуляции ризогенеза у побегов J. sibirica В. варьировали
концентрацией гормонов и составом питательных сред. Ризогенез наблюдали на побегах J.
sibirica В., культивируемых сначала на среде Uata с добавлением ИУК (0,05 мг/л) в течение
месяца, затем на среде МS/2 в течение трех месяцев. Появление первых корней на
эксплантах J. sibirica В. отмечали к концу 15-й недели (рисунок 1д). Образование корней
происходило на безэпитальной части побега. Максимально достигнутый процент укоренения
побегов J. sibirica составил 17,50 %
1.1.3 Адаптация пробирочных растений к условиям in vivo
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является сложной
операцией. Поэтому при пересадке растений-регенерантов были созданы условия,
идентичные с их развитием в условиях in vitro.
Развившиеся из почек побеги в стерильном боксе отделяли скальпелем от экспланта и
помещали на агаризованную среду в пробирки для выращивания. Питательная среда
содержала макро- и микроэлементы по МS с добавлением витаминов, сахарозы, агара и
регуляторов роста 6-БАП (0,5мг/л) и α-НУК (0,1 мг/л). Побеги культивировали на данной
питательной среде в течение двух месяцев. Для индукции ризогенеза использовали
двухстадийную систему культивирования. На первой стадии культивировали на стандартной
среде Uata с добавлением ИУК (0,05 мг/л) в течение месяца, затем MS/2 в течение трех
месяцев. Процент укоренившихся в условиях in vitro побегов составил 17,50 %.
Полученные растения осторожно вынимали из пробирок, корневую систему побегов
отмывали от агара дистиллированной водой, помещали в горшочки для рассады, на 1/3
заполненные торфо-перлитной смесью в соотношении 1: 2, и накрывали полиэтиленовыми
изоляторами. Горшочки с растениями помещали в теплицу с температурным режимом (22 
0
1) С и относительной влажностью 60 %. Количество адаптированных растений на данном
этапе составило 91,60 %.
1.2. Микроклональное размножение диффференциацией адвентивных почек в
первичной и пересадочной каллусной ткани можжевельника сибирского
Влияние способа культивирования на рост каллусной ткани Juniperus Sibirica В.
Известно, что наиболее важными компонентами питательной среды, определяющими
каллусогенез, являются регуляторы роста. Модификации подвергается в первую очередь
гормональная составляющая питательной среды, в связи с этим основной целью этого этапа
было изучение влияния экзогенных регуляторов роста на каллусогенез и рост культуры
клеток можжевельника сибирского.
1.2.1 Исследование каллусообразования на средах MS с различным содержанием
фитогормонов
15
При исследовании роли гормонов в индукции каллусогенеза было исследовано 25
модификаций питательной среды MS, которые отличались качественным составом и
количественным содержанием фитогормонов .
Начало каллусообразования на различных средах варьировало от 8 до 27 сут. На
среде, не содержащей регуляторов роста, инициации каллусной ткани не наблюдалось.
Присутствие в питательной среде экзогенного регулятора 2,4-Д оказало наибольшее влияние
на процесс инициации каллусогенеза.
Для получения каллусной культуры были использованы экспланты разных органов
растения. Каллусогенез инициировали из эксплантов хвои, почек, сегментов стебля и
побегов на средах с различными концентрациями 2,4-Д.
Результаты эксперимента показали, что первичный каллус удалось получить из всех
типов эксплантов, но не на всех средах. Инициирование каллусной ткани из хвои Juniperus
sibirica B. наблюдали только на среде с добавлением 2,4-Д в количестве 0,6 мг/л.
Каллусогенез из эксплантов почек и побегов можжевельника сибирского наблюдался на
многих средах (рисунок 1).
Влияние концентрации и вида гормонов в среде на инициацию побегов
Juniperussibirica В
.
Рисунок 1
Таким образом, в результате проведенного эксперимента установлено, что
эффективность каллусообразования зависит не только от вида эндогенного регулятора роста
и его концентрации, но и от типа экспланта. Лучшими эксплантами для индукции каллуса
оказались побеги и почки J. sibirica B., менее эффективными – сегменты стебля.
Динамика роста каллусной ткани можжевельника сибирского на средах с различным
содержанием гормонов
250
Масса
каллус
а
, мг
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
0
Продолжительность культивированияя, сут
4
8
12
16
20 24
28
Рисунок 2
16
32
36
40
44 48
Динамика роста каллусной ткани в зависимости от продолжительности
культивирования приведена на рисунке 6. В качестве контроля была использована
безгормональная среда. В процессе культивирования в течение 44 сут среднее увеличение
массы произошло в 2,7 раза. В результате проведенного эксперимента установлено, что
отсутствие в питательной среде цитокининов, в данном случае кинетина, не приводило к
остановке роста ткани (рисунок 2).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что данную культуру, как и
большинство других культур клеток, можно отнести к ауксинозависимой. Однако наличие в
среде кинетина имело важное значение, так как взаимодействие ауксина (2,4-Д) с
цитокинином (кинетином) обеспечивало более интенсивный рост культуры, чем присутствие
в среде только 2,4-Д. Максимальное накопление сырой биомассы за ростовой цикл
наблюдалось на среде, содержащей 0,2 мг/л 2,4-Д + 0,2 мг/л кинетина, и составило 228,5 мг
на пробирку.
1.3 Исследование динамики роста каллусной ткани на агаре и пенополиуретане
Известно, что большое влияние на накопление продуктов вторичного метаболизма в
условиях in vitro оказывают способы культивирования растительной ткани. Была
исследована динамика роста каллусной ткани при поверхностном культивировании на агаре
и инертном носителе - пенополиуретане с периодическим омыванием ткани питательной
средой. Чувствительность клеток растений к механическому, осмотическому и
трофическому стрессам, а также к температуре, рН, давлению и к химически активным
веществам существенно ограничивает выбор методов и инертного носителя для
иммобилизации клеток растений.
Выбор пенополиуретана в качестве инертного носителя для выращивания тканей
Juniperus sibirica В. был обусловлен существенными преимуществами этого материала. Это
дешевизна, удобство манипулирования, возможность многократно использовать носитель.
Пористость этого материала обусловливает хороший доступ веществ питательной среды к
клеткам
Рост культивируемых на пенополиуретановых подложках растительных клеток
отличался по сравнению с культурой на агаре.
Наблюдалась более короткая лаг-фаза и более раннее вступление в фазу
экспоненциального роста (16-18 сут.) и еѐ большая продолжительность. Увеличение
клеточной биомассы в 10 раз происходило примерно на 32-е сутки. Очевидно, что при
культивировании на пенополиуретановых подложках улучшаются условия кислородного
обмена и обмена элементами питательной среды.
2. Экономическое обоснование семенного и микроклонального размножения
хвойных пород
При определения показателей эффективности выращивания сеянцев были учтены
следующие основные затраты; подготовка посадочного материала, уход за ними, подготовка
почвы и высадка в открытый грунт. Однако наибольшую трудность в организации
биотехнологической лаборатории для микроклонирования представляет высокая стоимость
не только оборудования и приборов, но, главное, необходимых реактивов для приготовления
питательных сред.
Экономические затраты на выращивание хвойных растений в культуре in vitro
превосходят стоимость семенного посадочного материала, однако использование технологии
микроразмножения для высокопродуктивных безвирусных селектированных клонов и видов
позволяет получить высокую рентабельность. Кроме того, постепенное совершенствование
методов клонального микроразмножения обеспечат широкое внедрение в реализацию
программ генетического улучшения хвойных пород в Республике Казахстан.
3. Личное мнение об актуальности проделанной работы
17
Подводя итог, хочу смело сказать, что клональное микроразмножение является
перспективным способом вегетативного размножения растений, позволяющим получать
генетически однородный, оздоровленный посадочный материал.
Человечество современного мира в первую очередь должно задаваться глобальным
вопросом: Выживет ли оно спустя десятки, тысячи лет на земле, где сейчас твориться
хаос? Ведь спустя некоторое время у нас могут иссякнуть водный запас, исчезнуть многие
виды растений и животных, что поведет к нарушению пищевой цепочки, а атмосфера
станет полностью загазованной. Поэтому каждый должен сделать вклад, чтобы избежать
такую ситуацию. В нашем случае хочется сказать об озеленении земной поверхности
древесно-кустарниковыми растениями именно хвойных пород.
Так как они лучше выполняют фитосанитарную роль, нежели лиственные деревья
и кустарники. Исходя из актуальности темы, думаю, нужно глубже внедрять, развивать и
усовершенствовать технологию микроклонального размножения в нашем Государстве.
Заключение
На основании полученных данных научно-исследовательской работы были сделаны
следующие выводы:
1.Подобраны оптимальные условия для введения в культуру in vitro эксплантов
можжевельника сибирского.
Наиболее высокий процент калусогенеза (до 100%) наблюдался при использовании
в качестве эксплантов почек и побегов. Установлено, что наилучшей средой,
обеспечивающей процессы жизнедеятельности эксплантов можжевельника сибирского
является стандартная среда с минеральной основой по Murashige and Skoog.
2.Установлено, что для черенкования in vitro можжевельника сибирского наиболее
оптимальной питательной средой является среда МС с добавлением α-НУК (0,1 мг/л) и 6БАП (0,5 мг/л). Успешное укоренение происходило на среде Uata с добавлением ИУК
(0,05 мг/л) в течение месяца, затем на среде МS/2 в течение трех месяцев. Максимальный
процент укоренения побегов составил 17,50 %. Количество адаптированных растений на
торфо-перлитных смесях в соотношении 1: 2,составило 91,60 %
3.Разработаны
оптимальные
параметры
технологии
микроклонального
размножения можжевельника сибирского в условиях in vitro.