ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМА «АБ-АН» ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОБЛИГАТНОАНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ Тест-система «АБ-АН» для определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов к антибиотикам однократного использования служит для определения чувствительности облигатноанаэробных микроорганизмов к антибиотикам в полужидкой среде после 18-48 ч инкубации. Учѐт чувствительности возможен визуально или инструментально с помощью анализатора иммуноферментного Ф300ТП и компьютера с программным обеспечением «Sensitiv». В культуральную среду добавляется бактериальная взвесь, которые затем вносятся в лунки планшета, содержащего лиофильно высушенные антибиотики. После инкубации производится визуальный или инструментальный учѐт. Резистентные штаммы растут в лунке, делая среду непрозрачной, а если штамм чувствителен к антибиотику – среда остаѐтся прозрачной. НАЗНАЧЕНИЕ Тест-система «АБ-АН» для определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов к антибиотикам предназначена для определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов к антибиотикам. Область применения тест-системы – клиническая медицина. СОСТАВ НАБОРА Компоненты тест-системы «АБ-АН» для определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов к антибиотикам: 96-луночный плоскодонный планшет – 1 шт; Среда АБ для культивирования облигатно-анаэробных бактерий (4+0,1)мл – 4 флакона; Стерильный раствор хлорида натрия с массовой долей 0,9%, (5+0,1) мл, в ампуле – 4 ампулы; Наконечники полипропиленовые стерильные для автоматических дозаторов вместимостью 200 мкл – 4 шт; Планшет содержит 96 лунок (12 колонок и 8 рядов, по 2 ряда - 24 лунки для определения чувствительности одного штамма микроорганизма). Всего планшет позволяет определять чувствительность к 12 антибиотикам четырех штаммов микроорганизмов. Последняя лунка каждого четного ряда не содержит антибиотика и служит для определения положительного контрольного роста. Остальные 23 лунки содержат антибиотик в 2-х пороговых концентрациях, исключая тикарциллин. 2.3 Концентрации антибиотиков в лунках планшета (в мкг/мл или г/л после внесения питательной среды) представлены в таблице 1. Таблица 1. Концентрации антибиотиков в лунках планшета (в мкг/мл или г/л после внесения питательной среды) Обозначения антибиотиков для рядов: - A, С, E, G - B, D, F, H Номер лунки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Пен 0,5 Пен 2 А+К 4 А+К 8 Т+К 32 Т+К 64 Цеф 16 Цеф 32 Ими 4 Ими 8 Мер 4 Мер 8 Клин 2 Клин 4 Хлор 8 Хлор 16 Мет 8 Мет 16 Мок 2 Мок 8 Амо 2 Амо 4 Тик 32 К Сокращѐнные названия антибиотиков с концентрациями устойчивости представлены в таблице 2. и примечаниями по определению Таблица 2. Сокращѐнные наименования антибиотиков с концентрациями и примечаниями по определению устойчивости Антибиотик Сокращѐнное название Концентрация 1, мкг/мл Концентрация 2, мкг/мл Пенициллин Амоксициллин/ клавуланат Тикарциллин/ клавуланат Цефокситин Имипенем Пен А+К Т+К Цеф Ими 0,5 4/2 32/2 16 4 2 8/4 64/2 32 8 Меропенем Мер 4 8 Клиндамицин Хлорамфеникол Метронидазол Моксифлоксацин Амоксициллин Тикарциллин Контрольная лунка Клин Хлр Мет Мок А Тик К 2 8 8 2 2 32 0 4 16 16 8 4 - ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ Флаконы со средой и планшеты должны быть выдержаны при температуре от 18 до 30 °С 20 минут. Работа с планшетом должна проводиться в стерильном боксе после 30 минут обработки ультрафиолетовым облучением. Необходимое лабораторное оборудование: - холодильник; - термостат электрический для выращивания бактерий с автоматическим терморегулятором до температуры 37,6 °С с ценой деления 0,1 °С; - спиртовая или газовая горелка; - дозаторы автоматические с погрешностью 1 % объѐмом от 5 до 20 мкл и от 20 до 200 мкл; - денситометр, спектрофотометр или стандартный образец оптической плотности 4 оптические единицы McFarland ; - анализатор иммуноферментный АИФ М/340 или Ф 300ТП; - программное обеспечение «Sensitiv»; - IBM совместимый компьютер. МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ В стерильный флакон внести 2 мл стерильного раствора хлорида натрия с массовой долей 0,9 %. Приготовить взвесь бактерий. Для этого бактериологической петлей внести одну или более колоний бактерий, выращенных в течение 18-48 ч при 37°С на среде для анаэробов, в стерильный флакон с 2 мл стерильного раствора хлорида натрия с массовой долей 0,9 %. Оптическая плотность взвеси в пробирке после внесения микроорганизма должна соответствовать 4 оптическим единицам McFarland. Этого можно достичь путем: измерения на денситометре или на спектрофотометре при длине волны 550 нм – 1 OD (составляет 9 1,2х 10 КОЕ/мл); сравнения со стандартом оптической плотности 4 McFarland; Перенести в ампулу с питательной АБ средой для культивирования облигатно-анаэробных бактерий 200 мкл приготовленной взвеси бактерий и тщательно перемешать. Внести в каждую лунку планшета по 135 мкл питательной среды АБ для культивирования облигатноанаэробных бактерий с микроорганизмами (2,9 х 108 КОЕ/мл). Планшет накрыть крышкой. Инкубировать 18-48 ч при 37 °С в термостате в строго анаэробных условиях. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Резистентные штаммы растут в лунке, делая среду непрозрачной, а если штамм чувствителен к антибиотику – среда остаѐтся прозрачной. При отсутствии роста в контрольной лунке – тест считается недействительным, и его необходимо повторить. Визуальный учет Для антибиотиков, представленных в двух концентрациях Визуальный учет Результат Исследуемые штаммы -ая -ая 1 конц. 2 конц. с С ○ прозрачная ○ прозрачная Ч (S) Чувствительный ● мутная ○ прозрачная + П (I) Промежуточный ● мутная ● мутная + + Р (R) Резистентный Для антибиотиков, представленных в одной концентрации Визуальный учет Результат ○ прозрачная Ч (S) ● мутная + Р (R) Исследуемые штаммы Чувствительный Резистентный Ч (S) При отсутствии роста в лунках с 1-ой и 2-ой концентрацией антибиотика штамм чувствителен П (I) При наличии роста в лунке с 1-ой концентрацией, но отсутствии в лунке со 2-ой концентрацией штамм обладает промежуточной чувствительностью При наличии роста с 1-ой и 2-ой концентрацией, штамм считать устойчивым Р (R) Инструментальный учет Измерение оптической плотности проводят на иммуноферментном анализаторе Ф300ТП с помощью программного обеспечения «Sensitiv». При отсутствии роста в контрольной лунке – тест считается недействительным, и его необходимо повторить. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА Тест-система должна храниться при температуре плюс (4+2) °С на протяжении всего срока годности, указанного на упаковке. Флаконы со средой и планшеты перед постановкой опыта должны быть выдержаны при температуре 20-30 ºС 20 минут. Для исследования необходимо использовать только 18-48 ч культуру микроорганизма. Количество вносимого инокулята должно быть стандартным. Поэтому обязательно необходимо пользоваться денситометром или стандартом оптической плотности. Для отбора и добавления реагентов необходимо использовать полуавтоматические пипетки со сменными наконечниками, аттестованные на точность по значению средней дозы и воспроизводимость результатов пипетирования. Инкубация планшета должна производиться в строго анаэробных условиях и только в температурном режиме 35 -37 0С. При повышении или понижении температуры возможен некорректный результат. Большое количество пузырьков в культуральной среде может изменить результаты автоматического учѐта чувствительности. Собранный материал и бактериальные культуры следует считать потенциально опасными, что требует опытного и квалифицированного обращения. После использования все планшеты, флаконы и наконечники должны быть простерилизованы в паровом стерилизаторе при температуре (120+2) °С давлении (0,11+0,02) мПа (1,1+0,2) кгс/см2 в течении (45+3) мин, сожжены или дезинфицированы погружением в раствор хлорамина Б с массовой долей 0,5 % с экспозицией 30 мин. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора. ФОРМА ВЫПУСКА Планшет позволяет определять чувствительность к 12 антибиотикам четырех штаммов микроорганизмов. Компоненты тест-системы в виде комплекта, включающего 1 планшет с антибиотиками, 1 пакетик с силикагелем , 4 флакона питательной среды АБ (4+0,1) мл, 4 флакона стерильного раствора хлорида натрия с массовой долей 0,9 % (5+0,1) мл, 4 наконечника стерильных для автоматических дозаторов вместимостью 200 мкл, лист с комплектностью (таблица 2) и инструкция по применению помещаются в коробку из картона коробочного. В тару с тест-системами, направлением в каждый адрес по требованию заказчика вкладывается 1флакон стандартного образца оптической плотности 4 оптические единицы McFarland, объемом (4+0,1) мл. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ Хранение тест-системы должно производиться при температуре плюс (4+2) °С на протяжении всего срока годности. Транспортирование тест-системы осуществлять при температуре плюс (4+2) °С в сухих, чистых, крытых транспортных средствах (ГОСТ 17768). Срок годности тест-системы - 12 месяцев с даты изготовления. При нарушении условий хранения, транспортирования и схемы постановки опыта рекламации не принимаются. В остальных случаях рекламации на качество тест-системы направляются по адресу изготовителя: 211309, Республика Беларусь, Витебская обл., Витебский р-н, д. Должа, ул. Советская, 26А. Тел/факс +375212-20-94-10. Открытое акционерное общество «БелВитунифарм».