ГБОУ ВПО «ОМСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНЗДРАВА РОССИИ ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ Рациональный подход к диагностике актуальных инфекций проф. Т.И. Долгих Омск – 2013 Модернизация –платформа для стандартизации и централизации микробиологических исследований Стандартизация лабораторных исследований (ГОСТ Р ИСО • • • • • • • • 15289-2009 «Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности» ) Логистика Жизненные циклы лаборатории микробиологии Процессный подход Обеспечение долабораторного преаналитического этапа Автоматизация производства Интеграция Компьютеризация с расширением информационных технологий • Порядок взаимодействия профильной комиссии по КЛД Минздрава России по обеспечению Порядков оказания медицинской помощи с другими профильными комиссиями для разработки единой стратегии в формате диагностики,лечения и лекарственного мониторинга Использование стандартизованных технологий (утверждены по бакисследованию мочи) Направления научно-практических исследований ________________________________________________________ 1. Методологические и методическое сопровождение диагностического процесса и профилактических программ: • Этиологическая расшифровка инфекций, в т.ч. оценка вклада различных возбудителей и их ассоциаций (вируснобактериальных, вирусно-грибковых и др.) в развитие патологии • Изучение антибиотикорезистентности и поиск путей ее преодоления; • Внедрение новых методов для оценки факторов риска (в т.ч. копрологические исследования) 2. Участие в разработке моделей прогнозирования 3. Использование молекулярно-генетических методов в микробиологии 4. МАСС-спектрометрия : уникальные возможности лаборатории 5. Комплексный подход к решению клинических задач - реализуется совместно с клиницистами и врачами других лабораторий (КДЛ, ПЦР-лаборатория, иммунологическая) I. Перинатальная патология В России подтвержденная частота перинатальной смертности в результате инфекционно-воспалительных процессов составляет 10-18%. Развитие гнойновоспалительных заболеваний в послеродовом периоде в 72% случаев ассоциировано с вирусно-бактериальными инфекциями. В 25,7% – ассоциации 2-4 микроорганизмов. ЧАСТОТА БАКТЕРИАЛЬНЫХ АССОЦИАЦИЙ Монокультуры (67,6%) Ассоциации (32,4%) МИКРОФЛОРА ПОЛОСТИ МАТКИ У РОДИЛЬНИЦ (АСПИРАТ) U. urealyticum (35,1%) Enterococcus spp (29,7%) Staphylococcus ssp (24,3%) E. coli (8,1%) P. aeruginosae (5,4%) M. hominis (5,4%) 5% 5% 8% 32% 32% 23% 68% 28% Результаты обследования женщин высокого инфекционного риска (родильницы) __________________________________ Интраамниальная инфекция вирусно- бактериальной этиологии - 52% Интраамниальная инфекция вирусной этиологии - 18,3% % 15,8 47,8 18,5 20,5 HPV 28,6 EBV 42,8 CMV CMV HSV-1/2 HSV-1/2 EBV 28,6 Что делать дальше с учетом резистентности микроорганизмов? Научный поиск : Разработка способа лечения женщин с гнойновоспалительными заболеваниями на основе использования наноматериалов сорбирующего действия Изучение процесса модифицирования углеродной поверхности сорбента поли-Nвинилпирролидоном растровой электронной микроскопией г) в) а) б) Электронно-микроскопические снимки гранул и углеродной поверхности исходного (а) и модифицированного (б-г) образцов 6 Герпесвирусные инфекции (лабораторная диагностика) Исследуемый материал Метод Назначение метода Лабораторные маркеры инфекций, вызываемых HSV-1/2, CMV, EBV, HHV-6 -Соскобы из очага инфекции - Лейкоцитарная взвесь ПЦР Детекция ДНК вирусов РИФ Выявление антигенов вирусов - Ликвор (при наличии показаний) - Ткани элиминированных плодов - Плацента - Сыворотка крови (ИФА, ИБ) - IgM, IgG, ИА- IgG ИФА Иммуноблот - IgA (!) (мониторинг) - Антитела к отдельным белкам вируса (ИБ) - В ликворе IgG (LSQ/CSQ) Токсоплазмоз (лабораторная диагностика) Исследуемый материал Назначение метода Метод Этиологическая расшифровка Кровь, ликвор, би оптаты, ткани погибших плодов, пл ацента ПЦР или РИФ ИФА, Иммуноблот (фазы I, II, III,IV) Детекция ДНК /антигенов Выявление антител: IgM, IgA, IgG - IgG низкоавидные - IgA и IgG-avidity к ROP1, MAG1, GRA7,GRA8, SAG1 ИФА (ликвор) - IgG LSQ/CSQ = IgG/(ликвор) / IgG (сыворотка) (>1,5 !) Патология ЖКТ: как реализовать диагностический потенциал? Использование современных методов и тестов в клинической практике (количественное определение кальпротектина, фекального трансферрина и гемоглобина) Включение тестов высокой информативности в клинические рекомендации, стандарты и порядки оказания медицинской помощи. Проведение эпидемиологических исследований (изучение распространенности патологий ЖКТ в различных возрастных группах с выделением региональных особенностей) и принятие адекватных мер с учетом уровней профилактики Выделение групп высокого риска по развитию патологий и мониторинг (с приоритетом использования неинвазивных методов) Разработка новых способов диагностики и лечения II. Некротизирующий энтероколит новорожденных (НЭК) – проблема века Этиологическая расшифровка и поиск потенциальных биомаркеров НЭК Некротическим энтероколитом (НЭК) заболевают около 5% новорожденных, поступающих в отделения интенсивной терапии по поводу различных неотложных состояний. Некротизирующий энтероколит – «болезнь выживших недоношенных» Принципиальное значение при НЭК имеет выделение бактерий и вирусов (коронавирусы, ротавирусы, вирусы Коксаки типа В2, цитомегаловирус). Роль строгих анаэробов? Необходимы станции для выделения анаэробов В Омске в 2011-2012 гг. в структуре летальных исходов (новорожденные) на НЭК приходилось 40% Кальпротектин- маркер воспаления слизистой ЖКТ _____________________________________________________________________ _ 1. Этиологическая расшифровка? Кальпротектин - основной белок цитозола, связывающий кальций и цинк, с молекулярной массой 36 кДа, продуцируется полиморфноядерными нейтрофилами, моноцитами и плоским эпителием, кроме эпителия кожи. После связывания с кальцием становится устойчивым к расщеплению под действием лейкоцитарных и микробных ферментов. Конкурируя с различными ферментами за ограниченное количество цинка, кальпротектин способен ингибировать многие цинкзависимые ферменты и убивать микроорганизмы. Вызывает апоптоз, проявляет хемотаксическую активность. Лабораторный контроль Устойчив к ферментному расщеплению, стабилен в кале в течение 7 дней при комнатной температуре. Концентрация кальпротектина достигает максимальных значений у пациентов с сочетанным поражением толстой и подвздошной кишки и тотальным поражением желудочнокишечного тракта. Опыт применения тестов. Клинические примеры Случай 1. Ребенок Р. (девочка, возраст - 2 дня). Летальный исход. Однодневный метод. Кальпротектин 30,26 (↑ в 3,0 раза) Гемоглобин Трансферрин 120,0 (↑ в 2,4 раза) 37202,0 (↑↑↑ в 1 488 раз) Случай 2. Ребенок К. (мальчик, возраст - 2 дня). Двухдневный метод. Кальпротектин Гемоглобин Трансферрин 1 день 0,75 11,0 98,0 (↑ в 3,9 раза) 2 день 0,68 42,0 271,0 (↑ в 10,8 раза) Группы риска Новорожденные с экстремально низкой, очень низкой и низкой массой плода составляют группу риска по развитию патологии кишечника Проведенные совместно с детскими хирургами ОДКБ исследования показали: исследование кала на кальпротектин и особенно в сочетании с количественным определением фекального трансферрина позволяет диагностировать НЭК на ранних стадиях и провести необходимые лечебные мероприятия. r=-0,33 r=-0,51 r=0,63 Кишечные инфекция (диагностика, мониторинг после перенесенной инфекции) Лабораторный мониторинг В 2009 в г. Омске была зарегистрирована вспышка инфекции E. coli O157 (с обнаружением веротоксина): 17 детей в возрасте от 5 мес до 2,5 лет с кишечной инфекцией, осложненной гемолитико-уремическим синдромом. У 12 детей с ГУС– были очень высокие показатели фекального кальпротектина, которые снизились в 3-6 раз, однако не достигли нормальных значений в течение 2-х лет. ___________________________________________________ В настоящее время совместно с инфекционистами проводится обследование паицентов, перенесших кишечные инфекции (эшерихиоз, ротавирусную инфекцию и др.) Кальпротектин - в 72,3% случаев, Трансферрин - в 49,8; Гемоглобин - в 28,5% Результаты анализа Проведен количественный мета-анализ с определением чувствительности, специфичности и диагностического отношения шансов. Выполнен анализ подгрупп с оценкой Calp и (Calp+ Tf (на автоматическом дискретном анализаторе кала «NS -15 Plus») Построена ROC-кривая (график зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов) Чувствительность Специфичность Площадь под ROC-кривой ВЗК 0,95 (95% ДИ 0,92-0,97) 0,92 (95% ДИ 0,85-0,992) 0,95 НЭК (Calp+ Tf) 0,95 (95% ДИ 0,93-0,98) 0,91 (95% ДИ 0,86-0,90) 0,92 (95% ДИ 0,76-0,90) Заключение За счет количественного кальпротектина была повышена чувствительность диагностической системы на 19,8% и специфичность – на 15,6%, а при параллельном использовании трансферрина (Tf) и кальпротектина – на 23,6%. Таким образом, использование неинвазивного метода определения фекального биомаркера кальпротектина и особенно в сочетании с фекальным трансферрином расширяет диагностические возможности и позволяет оптимизировать лечение больных с патологией ЖКТ. Благодарю за внимание