Выделение и идентификация возбудителя некробактериоза

УДК 619:616.98:579.852.13:636.2
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ
НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ
ПОМОЩИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И – ПЦР
ДИАГНОСТИКИ
Макаев Х.Н. – д.в.н., профессор; Фаизов Т.Х. – д.б.н., профессор; Потехина Р.М. –
к.б.н., с.н.с.; *Каримова А.З. – к.б.н.; Мухамметшин Н.А. - соискатель
ФГБУ «ФЦТРББ-ВНИВИ», e-mail: vnuvi@mail.ru
*Казанский кооперативный институт
Ключевые слова: некробактериоз, крупный рогатый скот.
Key words: necrobacteriosis, cattle.
Некробактериоз – инфекционное заболевание, сопровождающееся
гнойно- некротическими процессами в основном в области пальца, но
могут поражаться также слизистая оболочка ротовой полости, половых
органов и кожа вымени. Заболевание наблюдается как у млекопитающих и
птиц, так и у пресмыкающихся. Заболевание чаще регистрируется ранней
весной и поздней осенью.
У всех сельскохозяйственных животных при данном заболевании
поражается кожа пальцевой части конечности на волярной (плантарной)
стороне.
Первичным агентом в возникновении данного заболевания является
Fusobacterium
necrophorum
–
грамотрицательная,
полиморфная,
неподвижная палочка, растущая в строго анаэробных условиях, не
образующая спор и капсул. Болезнь причиняет экономический ущерб из-за
снижения многих показателей, в том числе молочной продуктивности на
25-40%, интенсивности роста на 20-30%. Наиболее распространенным
способом диагностики некробактериоза крупного рогатого скота является,
бактериологический: микроскопия мазка, посев на среды Кита-Тароцции и
на другие питательные среды в аэробных условиях.. Но на сегодняшний
день бактериологическое исследование не дает достаточно точных
результатов, так как из очагов поражения можно выделить не только
Fusobacterium necrophorum, обладающий вирулентностью, но и другие
патогенные: стафилококки, микрококки, кишечная палочка, в тоже время,
в рубце животных могут находится и атипичные формы которые не
вызывают заболевание, но по морфологическим признакам очень похожи с
вирулентными типами, такие как: Fusobacterium pseudonecrophorum.
Вследствие этого точно установить диагноз некробактериоз за короткие
сроки не представляется возможным, потому что для выделения
91
возбудителя и идентификации Fusobacterium necrophorum уходит от 10-16
суток.
На сегодняшний день наиболее чувствительными и специфичными
признаны методы, основанные
на выявлении фрагментов генома
возбудителя в биологическом материале с помощью полимеразой цепной
реакции. Данный метод позволяет обнаруживать возбудитель при очень
низких его концентрациях и
сократить сроки диагностических
исследований в 10-15 раз в сравнении с бактериологическими методами.
Целью наших исследований являлось в сравнительном аспекте
провести исследования по выделению и идентификации возбудителя
(Fusobacterium necrophorum) некробактериоза крупного рогатого скота
при помощи бактериологических исследований и – ПЦР диагностики при
массовом проявлении заболевания дистальной части конечностей.
Материалы и методы. Для исследования биологические образцы
брали в обычных фермах и мегакомплексах Республики Мордовии,
Татарстана, где регистрировали массовое заболевание крупного рогатого
скота с признаками поражения дистальной части конечностей. Пробы
отбирали по клиническим показателям: хромота, язвы между пальцами с
серым налетом и с характерным неприятным запахом, свищи в копытном
роге с гнойным истечением или без него.
Материал отбирали из пораженных участков, после удаления
омертвевших некротизированных тканей на границе здоровой и
пораженной ткани размером 2 см × 1 см готовили мазки отпечатки,
окрашивали по Грамму и микроскопировали.
На основании результатов микроскопии выбирали пробы, где
находили морфологически сходные с возбудителем некробактериоза,
бактерии и из них осуществляли посевы в среду Китта-Тароцци.
Для проведения ПЦР пробы измельчали в ступке со стерильным
кварцевым песком с добавлением МПБ из расчета 1:10.
Полученную суспензию использовали для постановки ПЦР- анализа
и параллельно ставили биопробу на мышах и кроликах. Полученную
суспензию вводили по 0,2; 0,4; 0,6. Суспензию вводили подкожно белым
мышам в корень хвоста, а кроликам в область основания ушной раковины.
Для контроля специфичности полимеразой цепной реакции
использовали референтные депонированные штаммы Fusobacterium
necrophorum № «8ТS630501», «12TK630501», выделенных от крупного
рогатого скота.
Выделение геномной ДНК возбудителя из биологических образцов
проводили в 2- вариантах: в первом – депротеинизацию проводили с
помощью протеиназы
к (10мг/мл) с экстракцией смесью фенолхлороформа (1:1) и осажденным этанолом, во втором – для
депротеинизации применяли 10% раствор СТАВ.
92
Определение последовательности и синтеза олигонуклеотидных
праймеров приводили по алгоритму выравнивания последовательностей
ДНК транспозонов в программах Alignment Service V.4.0 и GENCNER, а
для анализа праймеров по уровню свободной энергии использовали
программу OLIGO 4.0. Химический синтез специфических и
произвольных праймеров был осуществлен амидофосфитным методом на
автоматическом синтезаторе ASM-102U.
Постановку полимеразой цепной реакции осуществляли на
амплификаторах «Терцик» (Россия).
О результатах реакции судили по размеру синтезированного
фрагмента к ДНК, мигрирующего в 0,8%-м геле агарозы при силе тока 3540мА в течение 30-40 мин. Маркером служила ДНК pUC 18.
гидролизированная эндонуклеазой AluI. Документирование полученных
результатов
проводили
с
помощью
цифровой
фотокамеры,
секвертирование ампликонов- по двум цепочкам ДНК,
используя
общепринятые методики Маниатис Т., Фрич Э. и др.
Результаты исследований. После посева полученной суспензии на
среду Китта-Тароцци через 24-48 часов регистрировали появление мути и
хлопьевидного осадка на дне пробирки. При микроскопии мазков
окрашенных по Грамму в пробах обнаруживали тонкие нити и клубочки,
что характерно для Fusobacterium necrophorum. При подкожном введении
белым мышам и кроликам суспензии бактерий выращенных в среде КиттаТароцци на 4-6 сутки образовался воспалительный очаг с некрозом тканей.
При посеве материала из очага воспаления на среду Китта-Тароцци
получали чистую культуру Fusobacterium necrophorum.
ПЦР проводили на наличие гена лейкоцидина, возбудителя
некробактериоза, диагностической ПЦР тест системой для индикации ДНК
Fusobacterium necrophorum – производства «НИВИ Сибири и Дальнего
Востока» согласно методике производства ПЦР тест системы.
ПЦР ставили в два этапа с наружными и гнездовыми праймерами, в
формате. Для установки диагноза при помощи ПЦР потребовалось 6
часов.
Вероятность диагностирования составляет 98%.
Выделение ДНК осуществлялась набором «ДНК сорб производства
ЦНИИ Эпидемиологии РФ, согласно инструкции производителя.
Анализ результатов проведенных исследований свидетельствует что
в трэках 9 (проба №10), 11 (проба №12), 15 (шт. 8), 16 (шт. 12)
наблюдается характерный паттерн. Это говорит о наличии в данных
пробах ДНК возбудителя некробактериоза.
93
Результаты ПЦР- анализа проб патологического материала из Мордовии
на наличие ДНК возбудителя некробактериоза
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
15 16
Примечания:
1 трэк – отрицательный контроль;
2 – 14 – трэки – исследуемые пробы с 1 по 13;
15 трэк – 8 штамм;
16 трэк – 12 штамм.
Заключение. В результате выполненной работы точно установить
диагноз некробактериоз за короткие сроки не представляется возможным,
потому что для выделения возбудителя и идентификации Fusobacterium
necrophorum уходит от 10-16 суток. При помощи ПЦР- диагностики можно
поставить диагноз в течении 6-7 часов.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Самоловов А.А. Лечение крупного рогатого
скота при разных стадиях некробактериозного процесса / А.А. Самоловов,
С.В. Лопатин, В.А. Цурбанов// Эпизоотология, диагностика, профилактика
и меры борьбы с болезнями животных. – Новосибирск, 1997. – С.122-124.
2. Самоловов А.А. Некробактериоз крупного рогатого скота / А.А.
Самоловов // - Новосибирск,1998.-140с. 3. Сидорчук А.А. Проблемы
борьбы с некробактериозом: заблуждения и реальность / А.А. Сидорчук,
Л.В. Кириллов, С.Д. Панасюк// Ветеринария -2006.-№2.- С.5-6. 4. Каврук
Л.С. Эффективность нового химического препарата «Барьер-1»,
используемого для лечения и профилактики некробактериоза коров./ Л.С.
Каврук// РЖ Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии –
2009.-№1. С53-58.
94
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ НЕКРОБАКТЕРИОЗА
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ ПОМОЩИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ И – ПЦР ДИАГНОСТИКИ
Макаев Х.Н., Фаизов Т.Х., Потехина Р.М., Каримова А.З.,
Мухамметшин Н.А.
Резюме
Исследовали биологические образцы в мегакомплексах и обычных
фермах, где регистрировали массовое заболевание крупного рогатого скота
с признаками поражения дистальной конечности при помощи
бактериологических исследований и – ПЦР диагностики.
CATTLE NECROBACTERIOSIS PATHOGEN ISOLATION AND IDENTIFICATION
USING BACTERIOLOGICAL STUDY AND PCR – DIAGNOSTICS
Makayev Kh.N., Fazilov T.Kh., Potekhina R.M., Karimova A.Z.,
Mukhametshin N.A.
Summary
The cattle biological sample were investigated in large modern farms and
common farm and mass disease with signs of distal finites defeat was registered
using bacteriological studies and PCR- methods.
УДК 636.5.004.82+619:579.8
ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ ПТИЧЬЕГО ПОМЕТА МИКРОМИЦЕТАМИ
Матросова Л.Е. – к.б.н.
ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань, e-mail: vnivi@mail.ru
Ключевые слова: микроорганизмы, помет, обезвреживание,
удобрение.
Key words: microorganisms, manure, decontamination, fertilizer.
Актуальной проблемой современности является охрана окружающей
среды, значительную опасность для которой представляют всевозможные
органические отходы сельскохозяйственных предприятий. Вторичное
сырье птицеводческих, животноводческих предприятий, в частности помет
и навоз содержат достаточное количество питательных элементов и
представляют
ценный
сырьевой
материал
для
получения
высокоэффективных удобрений. Одним из основных ограничений для
непосредственного внесения органических отходов в почву является
95