Полимеразная цепная реакция - EU
реклама
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) М.Сомма, М.Кверчи WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 2 Содержание Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Введение 3 Компоненты, структура и репликация ДНК 3 Принципы ПЦР 9 Аппаратура и компоненты для постановки ПЦР 12 Конструирование праймеров для ПЦР 18 Специализированные методы ПЦР 22 ПЦР на практике 24 Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 3 Введение Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) К.Муллисом (K.Mullis) и его сотрудниками в 1985 году революционизировало молекулярную биологию и молекулярную медицину (Saiki et al., 1985). Полимеразная цепная реакция – это метод in vitro, используемый для того, чтобы ферментативно амплифицировать (умножить) специфический участок ДНК, расположенный между двумя участками ДНК с известной последовательностью. В то время, как прежде можно было получить только минимальные количества специфического гена, теперь с использованием ПЦР даже единичная копия может быть амплифицирована до миллиона копий за несколько часов. Методика ПЦР стала необходимой для многих обычных процедур, таких как клонирование специфических фрагментов ДНК, выявление и идентификация генов в диагностике и в судебной медицине, а также в процессе изучения характера экспрессии генов. В последнее время метод ПЦР позволил проводить исследования в новых областях, таких как контроль аутентичности пищевых продуктов, анализ наличия генетически модифицированной ДНК или микробиологического заражения. Для понимания принципов метода ПЦР и его применения, прежде всего, необходимо рассмотреть природу молекулы ДНК, поэтому в следующем разделе будет описана структура и репликация ДНК. Компоненты, структура и репликация ДНК Компоненты. Молекула ДНК состоит из двух параллельных комплементарных закрученных цепей из чередующихся элементов, состоящих из фосфорной кислоты и дезоксирибозы, перекрестно связанных пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, что приводит к образованию право-закрученной спиральной структуры, несущей генетическую информацию, закодированную в последовательности оснований. В клетках эукариот большая часть ДНК содержится в ядре и называется хромосомной ДНК. Она отделена от содержимого клетки (цитоплазмы) с помощью двуслойной мембраны (ядерной оболочки). В дополнение к этому, внехромосомная ДНК может быть обнаружена в митохондриях и хлоропластах. Кирпичики, из которых строится ДНК, называемые нуклеотидами, это: • dATP – (дАТФ) дезоксиаденозинтрифосфат • dGTP – (дГТФ) дезоксигуанозинтрифосфат • dTTP – (дТТФ) дезокситимидинтрифосфат • dCTP - (дЦТФ) дезоксицитидинтрифосфат. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Для удобства, эти 4 четыре дезоксинуклеозидтрифосфаты). нуклеотида Нуклеотид называют состоит из трех dNTPs (дНТФ основных – частей: пуринового основания (аденина, А, и/или гуанина, G), либо пиримидинового основания (цитозина, С и/или тимина, Т), молекулы сахара пентозы (дезоксирибозы) и трифосфатной группы. Как показано на Рисунке 1, пуриновое или пиримидиновое основание связано с пентозным кольцом с помощью N-гликозидной связи, а фосфатная группа связана с 5’атомом углерода с помощью диэфирной связи. В рибонуклеиновой кислоте, РНК, тимин заменен урацилом (U), а молекула дезоксирибозы заменена рибозой. Рисунок 1. Компоненты нуклеотидов. (Схема: Andy Vierstraete, 1999) Структура. На рисунке 2 показано, как нуклеотиды образуют цепь ДНК. ДНК образуется спариванием нуклеотидов между фосфатной группой одного нуклеотида (которая позиционирована у пятого атома углерода молекулы сахара) и гидроксильной группой третьего атома углерода молекулы сахара предыдущего нуклеотида. Для достижения этого дифосфатная группа отщепляется (с освобождением энергии). Это означает, что новые нуклеотиды всегда добавляются на 3’-конце цепи. Как показано на Рисунке 3, ДНК является двухцепочечной (за исключением некоторых вирусов), и две цепи спариваются друг с другом с помощью очень четкого механизма. Каждое основание одной цепи будет спариваться только с одним типом основания, расположенным напротив него на противоположной цепи, с образованием пары Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 5 оснований (bp): А всегда спаривается с Т с помощью двух водородных связей; а С всегда спаривается с G с помощью трех водородных связей. Таким образом, две цепи комплементарны друг другу, и одна цепь может служить матрицей для создания другой. Рисунок 2. Образование цепи ДНК из индивидуальных нуклеотидов (Схема: Andy Vierstraete, 1999) Основания образуют гидрофобное ядро внутри двойной спирали. Сахара и фосфатные группы (в форме анионов) создают внешний гидрофильный слой молекулы. При физиологических условиях спираль двухцепочечной ДНК более стабильна, чем спираль одноцепочечной ДНК. Репликация. ДНК содержит полную генетическую информацию, которая определяет структуру и функционирование организма. Три различных процесса ответственны за передачу генетической информации: • репликация; • транскрипция; • трансляция. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 6 В процессе репликации двухцепочечная нуклеиновая кислота дуплицируется с образованием идентичных копий. Этот процесс увековечивает генетическую информацию. В процессе транскрипции сегмент ДНК, который представляет собой ген, прочитывается и транскрибируется в одноцепочечную последовательность РНК. РНК перемещается из клеточного ядра в цитоплазму. Наконец, в процессе трансляции, последовательность РНК транслируется в аминокислотную последовательность, образуя белок (Alberts et al., 1983). Рисунок 3. Структура ДНК в клетке (Схема: Andy Vierstraete, 1999) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 7 Репликация ДНК – это процесс, на котором основана амплификация в ПЦР, поэтому она будет описана в деталях. В процессе репликации молекула ДНК раскручивается, при этом каждая цепь становится матрицей для синтеза новой, комплементарной цепи. Каждая дочерняя молекула, состоящая из одной старой и одной новой цепи ДНК, является точной копией родительской молекулы. Рисунок 4. Вилка репликации Для раскручивания двойной спирали и синтеза новой цепи ДНК необходимо несколько ферментов. Топоизомераза и хеликаза ответственны за раскручивание ДНК путем разрушения суперскрученной структуры и надкусывания одной цепи ДНК. Затем примаза (часть комплекса белков, называемого примеосомой), присоединяет к одноцепочечной ДНК небольшой праймер РНК, который будет исполнять роль 3’ОН конца, от которого ДНК полимераза начинает синтез. Этот РНК праймер со временем удаляется с помощью РНКазы Н, и разрыв заполняется с помощью ДНК полимеразы I. На этой стадии ДНК полимераза продвигается вдоль одноцепочечной молекулы ДНК, привлекая водородных свободные связей дезоксинуклеозидтрифосфаты с соответствующими им (dNTPs) для комплементарными образования dNTP на одноцепочечной молекуле (А с Т, и G с С), образуя ковалентную фосфоэфирную связь с предыдущим нуклеотидом на той же цепи. Энергия, накопленная в трифосфате, используется для ковалентной связи каждого нового нуклеотида с растущей второй цепью. Существуют различные формы ДНК полимераз, но именно ДНК полимераза III ответственна за поступательный синтез новой цепи ДНК. ДНК полимераза действует только от 5’ к 3’-концу. Так как одна цепь двойной спирали ориентирована с 5’ к 3’Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 8 концу, а другая - от 3’ к 5’-концу, ДНК полимераза синтезирует вторую копию цепи, ориентированной от 5’ к 3’-концу (отстающая цепь), по частям (фрагменты Оказаки) (Ogawa and Okazaki, 1980). Синтез новой копии цепи, ориентированной от 5’ к 3’концу, продемонстрирован на Рисунке 4. Другая цепь, лидирующая, может синтезироваться напрямую от 5’ к 3’-концу по мере раскручивания спирали. ДНК полимераза не может начать синтез ex novo на обнажившейся одиночной цепи, но нуждается в праймере со свободной 3’ОН группой, к которой она может присоединить dNTP. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи, формируя пока еще несоединенные, но лежащие рядом 3’ОН группу и 5’-фосфат. Это может заполнить разрыв, остающийся после удаления РНК праймера. Не стоит думать, что белки, связывающие одноцепочечную ДНК, необходимы для поддержания стабильности вилки репликации. Одноцепочечная ДНК очень лабильна, или нестабильна, поэтому такие белки связываются с ней, пока она остается одноцепочечной, защищая ее от деградации. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 9 Принципы ПЦР Метод ПЦР основан на механизме репликации ДНК in vivo: двухцепочечная ДНК (dsДНК) раскручивается до одноцепочечных ДНК (ssДНК), дуплицируется и снова закручивается. Эта методика состоит из повторяющихся циклов: • Денатурация ДНК путем плавления при повышенной температуре для превращения двухцепочечной ДНК в одноцепочечную ДНК • Отжиг (гибридизация) двух олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров для целевой ДНК • Удлинение цепи ДНК, начиная от праймеров, путем добавления нуклеотидов с использованием ДНК полимеразы в качестве катализатора и в присутствии ионов Mg2+ Олигонуклеотиды обычно состоят из относительно коротких последовательностей, которые отличаются друг от друга и комплементарны сайтам узнавания, фланкирующим (обрамляющим) сегмент целевой ДНК, которую предполагается амплифицировать. Этапы денатурации матрицы, отжига праймера и удлинения праймера составляют один «цикл» в методологии амплификации с использованием ПЦР. Рисунок 5 иллюстрирует три основных этапа в процессе ПЦР амплификации. Рисунок 5. Этапы ПЦР амплификации (Схема: Andy Vierstraete, 1999) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 10 После каждого цикла, вновь синтезированная цепь ДНК может служить матрицей в следующем цикле. Как показано на Рисунке 6, основной продукт экспоненциальной реакции – это олигонуклеотидных праймерами. сегмент dsДНК, праймеров, Продуктами а успешного концы которого длина определяется первого раунда определяются 5’-концами расстоянием амплификации между являются гетерогенные по размеру молекулы ДНК, длина которых может превышать расстояние между сайтами (участками) связывания двух праймеров. Во втором раунде, эти молекулы генерируют цепи ДНК определенной длины, которые будут накапливаться экспоненциальным образом в последующих циклах амплификации и образуют доминирующие продукты реакции. Таким образом, амплификация, как конечное число копий целевой последовательности, выражается следующим уравнением: (2n –2n)x (1), где n – это число циклов, 2n – это первый продукт, полученный после первого цикла и второй продукт с неопределенной длиной, полученный после второго цикла, х – это число копий исходной матрицы. Потенциально, после 20 циклов ПЦР, будет 220кратная амплификация, если допустить 100% эффективность в каждом цикле. Эффективность ПЦР будет варьировать от матрицы к матрице, и в соответствии со степенью оптимизации, которая была проведена. Детальное описание трех этапов ПЦР амплификации (денатурация матрицы, отжиг праймера и удлинение цепи) приводится в следующем параграфе (Sambrook et al., 1989) Рисунок 6. Экспоненциальная амплификация ДНК в методе ПЦР Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 11 Денатурация матрицы Во время денатурации двойная цепь плавится, открывая одноцепочечные ДНК, и все ферментативные реакции останавливаются (в том числе, удлинение цепи предыдущего цикла). Две комплементарные цепи разделяются путем повышения температуры. Это известно как денатурация. Для того, чтобы добиться денатурации ДНК, температуру обычно повышают до ~ 93 - 96° С. Таким образом, сильные водородные связи разрываются, и увеличивается число неспаренных оснований. Реакция завершена, когда все двухцепочечные ДНК (dsДНК) становятся одноцепочечными (ssДНК). Температура, при которой половина dsДНК становятся одноцепочечными, известна как температура плавления, Tm. Тип раствора, концентрация соли и используемый рН влияют на процесс денатурации. Например, при низкой концентрации соли, высоком рН, и в присутствии органических растворителей, таких как формальдегид, температура плавления, Tm, снижается. Концентрации G/C и T/A также могут влиять на величину Tm. Температура плавления ДНК со структурой, содержащей повышенное количество G/C выше по сравнению с ДНК, обогащенными T/A. Например, ДНК Serratia marecescens содержит около 60% G/C и имеет температуру плавления приблизительно 94° С, в то время как ДНК Pneumococcus имеет около 40% G/C и температуру плавления приблизительно 85° С. Отжиг праймера Отжиг, или ре-гибридизация цепей ДНК происходит при более низкой температуре (обычно 55 - 65° С). Как только температура снижается, две комплементарные ssДНК начинают воссоздавать dsДНК молекулу. На этой стадии праймеры плавают в реакционной среде, и между одноцепочечным праймером и одноцепочечной матрицей постоянно образуются и разрушаются ионные связи. Более стабильные связи существуют немного дольше (праймеры, которые точно подходят к матричной ДНК), и на этом маленьком отрезке двухцепочечной ДНК (матрица и праймер), полимераза может присоединиться и начать копировать матрицу. Как только пристроятся несколько оснований, ионные силы между матрицей и праймером становятся настолько сильными, что не разрываются. Удлинение праймера На этом этапе праймеры разрастаются вдоль целевой последовательности с использованием термостабильной ДНК полимеразы (часто – Taq ДНК полимеразы) в присутствии dNTPs, что приводит к дупликации исходного целевого материала. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 12 Идеальная рабочая температура для Taq полимеразы 72° С. Когда праймеры прирастут на несколько оснований, они начинают обладать более сильным ионным притяжением для матрицы, что снижает вероятность обратного процесса. Праймеры, которые не являются строго комплементарными, снова высвобождаются (вследствие более высокой температуры) и не обеспечивают удлинения фрагмента. Основания (комплементарные матрице) спариваются с праймером на 3’-конце (полимераза добавляет dNTPs в направлении с 5’ к 3’, прочитывая матрицу от 3’ к 5’ концу). Длительность этапа наращивания праймера может быть увеличена, если участок ДНК, который подлежит амплификации достаточно длинный, однако, для большинства ПЦР-экспериментов время удлинения цепи, равное 1 минуте, является достаточным для того, чтобы получить полное удлинение цепи. Аппаратура и компоненты для постановки ПЦР Приборы Два основных достижения позволили сделать процесс ПЦР полностью автоматизированным: a. Использование термостабильных ДНК полимераз, которые устойчивы к инактивации при высокой температуре. Таким образом, исходная аликвота полимеразы может существовать на протяжении множественных циклов, согласно методическому протоколу. b. Разработка термальных бань, которые могут быстро переключать температуру вверх и вниз, в автоматизированном, программируемом режиме. Они известны как термоамплификаторы (thermal cyclers) или ПЦР машины. Использовалось несколько конструкций для устройства термоамплификаторов. Например, нагрев и охлаждение с помощью потоков жидкости, нагрев с помощью электрического сопротивления и охлаждение потоками, а также нагрев с помощью электрического сопротивления и охлаждение с помощью полупроводников. Типичный температурный профиль амплификации для трехэтапного методического протокола продемонстрирован на Рисунке 7. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 13 Рисунок 7. Температурный профиль амплификации при ПЦР. Параметры термальной амплификации, такие как денатурация, отжиг праймера и удлинение праймера, уже упоминавшиеся ранее, также как используемые компоненты и число циклов, описываемые в последующих параграфах, являются критическими для успешного осуществления ПЦР. Целевая ДНК В принципе, ПЦР амплификация может быть осуществлена, если имеется, по крайней мере, одна интактная копия целевого гена. Большее число копий целевой последовательности повышает вероятность успешной амплификации ДНК. Любое повреждение, такое как насечка («надкус») в целевой ДНК, будет блокировать ПЦР амплификацию. Размер целевой последовательности может быть такого порядка: от < 0.1 до нескольких тысяч оснований. Суммарное количество ДНК, обычно используемое для ПЦР, - от 0.05 до 1.0 мкг; это позволяет выявлять единичные копии целевой последовательности. Даже если образец не должен быть высокоочищенным, некоторые примеси, такие как гепарин, гем, формалин, Mg 2+ - хелатные агенты, а также детергенты должны быть удалены, чтобы избежать ингибирования процесса амплификации. Праймеры В основном, используют праймеры длиной 16 – 30 нуклеотидов, что позволяет применять достаточно высокую температуру отжига. Следует избегать в структуре Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) праймеров протяженных 14 участков последовательности, состоящих из одного основания (например, poly dG), либо повторяющихся мотивов – они могут гибридизоваться несоответствующим образом на матрице, следует избегать инвертированных повторов, чтобы не допустить образования вторичной структуры в праймере, которая может мешать гибридизации с матрицей. Следует также избегать последовательностей, комплементарных другим праймерам, используемым в ПЦР, чтобы предотвратить гибридизацию между праймерами, либо образование димеров праймеров (в особенности, это важно для 3’-конца праймера). Если возможно, 3’-конец праймера должен быть богат G и С основаниями для повышения эффективности отжига этого конца праймера, который будет прирастать. Расстояние между праймерами должно быть менее 10 тысяч оснований. Обычно, существенное снижение выхода продукта наблюдается, когда праймеры отдалены друг от друга приблизительно более, чем на 3 тысячи оснований. Обычно, в ПЦР олигонуклеотиды используют в концентрации 1 мкМ. Этого достаточно, по крайней мере, для 30 циклов амплификации. Присутствие более высоких концентраций олигонуклеотидов может привести к амплификации нежелательных, нецелевых последовательностей. В противоположность этому, недостаточная концентрация праймера делает метод ПЦР неэффективным. ДНК полимераза Оригинальный метод ПЦР использовал фрагмент Кленова ДНК полимеразы I E.coli (Saiki et al., 1985). Этот фермент, однако, денатурируется при температуре более низкой, чем это требуется для большинства матричных дуплексов. Таким образом, в ранних экспериментах, свежий фермент следовало добавлять в реакцию после каждого цикла. В дополнение, образцы следовало перемещать из одной термальной бани в другую, чтобы обеспечить осуществление отдельных этапов – денатурации, отжига и полимеризации. Использование термостабильной ДНК полимеразы совершенно очевидно облегчило процесс, так как добавление фермента после каждого этапа денатурации, больше не является необходимым. Обычно, ДНК полимеразы способны присоединять нуклеотиды только с 3’-конца полинуклеотида. Первой использованной термостабильной ДНК полимеразой была Taq ДНК полимераза, выделенная из бактерий Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988). Хотя этот фермент, возможно, является наиболее широко применяемым для ПЦР, имеются в продаже и некоторые другие ДНК полимеразы. В Таблице 1 приведены свойства некоторых термостабильных ДНК полимераз, используемых в настоящее время для ПЦР (Newton and Graham, 1994). Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 15 Таблица 1. Характеристика некоторых ДНК полимераз, используемых для ПЦР. Taq/ AmpliTaq® Thermus aquaticus Источник Taq: природное AmpliTaq: для генетической инженерии Применение Т ½ активности при 95° С (мин.) 5’ к 3’ экзонуклеазная активность 3’ к 5’ экзонуклеазная активность Продуктивность Скорость удлинения цепи (нукл./сек) Полученные концы ДНК Мол.вес в кДа Vent™ Thermococcus litoralis Для генетической инженерии DeepVent™ Pyrococcus GB-D Pfu Tth UITma™ Pyrococcus furiosus Thermus thermophiluis Thermofoga maritima Для генетической инженерии Природное Для генетической инженерии Для генетической инженерии 40 1380 400 > 120 20 > 50а да нет нет нет да нет нет да да да нет да 50-60 ? 7 ? 30-40 ? 75 ? > 80 60 > 33 ? 3’A > 95% тупых ? > 95% тупых ? ? 3’A Тупые 92 94 70 94 Taq/AmpliTaq® ДНК полимераза Как уже отмечалось, этот фермент был выделен из бактерий Thermus aquaticus, живущих в горячих источниках в Йеллоустонском Национальном парке США при температуре, близкой к 85°С. Оптимальная рабочая температура этого фермента 70 - 80° С. При этой температуре бактерии синтезируют ДНК со скоростью 35 – 100 нуклеотидов/сек. Среднее количество нуклеотидов, которое фермент включает в ДНК прежде, чем отсоединится от матрицы, называют производительностью. AmpliTaq® ДНК полимераза – это генетически модифицированный фермент, экспрессированный в E.coli. Поскольку AmpliTaq® является рекомбинантным белком, чистота и продуктивность данного фермента выше, чем у фермента дикого типа. Однако, в процессе ДНК амплификации возможно потенциальное загрязнение гомологичными последовательностями E.coli. В этом случае, рекомендуется использование ДНК полимеразы, которая не экспрессировалась в E.coli в качестве организма-хозяина. И Taq, и AmpliTaq® ДНК полимераза обладают 5’ – 3’ экзонуклеазной активностью, которая удаляет нуклеотиды впереди от растущей цепи. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 16 Vent™-, DeepVent™-, Pfu- и UITma™- ДНК полимеразы Эти ферменты обладают 3’ – 5’ экзонуклеазной активностью, которая позволяет удалять неспаренные основания, пока не образуется правильно спаренный по основаниям конец цепи. Однако, 3’ – 5’ экзонуклеазная активность может быть причиной разрушения праймера. Вследствие этого, фермент следует добавлять только после того, как началась реакция, либо в качестве альтернативы следует использовать химически модифицированные праймеры. AmpliTaqGold™ДНК полимераза Этот фермент состоит из AmpliTaq ДНК полимеразы, неактивной при комнатной температуре, и может быть активирован только в процессе инкубационного периода при 94° С. В этом случае программа термоамплификатора должна включать период пред-инкубации при температуре 92 95° С. Для время-сберегающего метода ПЦР, пред-инкубация может быть исключена, но тогда потребуется по крайней мере на 10 циклов больше, чем при классическом ПЦР. Реакционные буферы и MgCl2 в реакциях ПЦР В дополнение к реагентам, непосредственно участвующим в реакции, метод ПЦР требует подходящего буфера. Состав буфера зависит от типа и характеристики фермента, который предполагается использовать, и большинство поставщиков обычно предоставляют 10х (десятикратный) буфер для использования с соответствующим ферментом. Наиболее обычный реакционный буфер, используемый с Taq/AmpliTaq® ДНК полимеразой содержит: • 10 mM Tris, pH 8.3 • 50 mM KCl • 1.5 – 2.5 mM MgCl2 Присутствие дивалентных катионов является критическим для ПЦР. Концентрация MgCl2 в конечной реакционной смеси обычно находится в пределах от 0.5 до 5.0 mM, и оптимальная концентрация определяется эмпирически (Innis and Gelfand, 1990). Mg2+ ионы: • образуют растворимый комплекс с dNTP, который необходим для присоединения нуклеотидов, • стимулируют полимеразную активность, Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) • увеличивают Tm 17 взаимодействия праймер/матрица (и, следовательно, стабилизируют взаимодействие дуплекса). В целом, низкая концентрация Mg2+ приводит к снижению выхода продукта (или к его полному отсутствию), в то время как высокая концентрация Mg2+ приводит к накоплению неспецифичных продуктов вследствие неправильной работы праймера. Важно избегать высокой концентрации хелатных агентов, таких как ЭДТА или отрицательно заряженных групп, таких как фосфатные, в растворе матричной ДНК. В современной литературе ведутся дискуссии относительно различных буферов для ПЦР и добавок, таких как DMSO, PEG 6000, формамид, глицерин, спермидин и неионные детергенты, используемых для повышения специфичности реакции или ее эффективности (Roux, 1995). Некоторые ДНК полимеразы действительно достигают оптимального уровня активности (Rolfs et al., 1992) только в присутствии таких добавок. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты Для синтеза ДНК необходимы свободные дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTPs). Концентрация dNTPs для ПЦР должна быть от 20 до 200 мкМ для каждого dNTP, причем все четыре dNTPs должны использоваться в эквивалентных концентрациях для минимизации ошибок присоединения (Innis et al., 1988). Высокоочищенные dNTPs могут быть получены от ряда производителей, как в виде индивидуальных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.. так и Базовые в виде растворы смеси всех dNTPs четырех (обычно с концентрацией 100 mM) должны быть доведены до рН 7.0 – 7.5 с помощью 1M NaOH, чтобы обеспечить рН конечной реакции не ниже 7.1 (Sambrook et al., 1989); однако, многие базовые растворы dNTPs теперь поставляются уже с подведенным рН. Количество циклов и эффект плато Число циклов амплификации, необходимое для получения видимой полосы продукта в геле, в значительной степени зависит от исходной концентрации целевой ДНК. Для того, чтобы амплифицировать 50 целевых молекул, рекомендуется 40 – 45 циклов, в то время как для того, чтобы амплифицировать 3х105 молекул до такой же концентрации, достаточно 25 – 30 циклов (Innis and Gelfand, 1990). Такая непропорциональность происходит из-за так называемого эффекта плато, который является затуханием экспоненциальной скорости накопления продукта на поздних стадиях ПЦР, когда продукт достигает 0.3 – 1.0 нM. Причиной этого может быть Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 18 деградация реактантов (dNTPs, ферментов), истощение реактантов (праймеров, dNTPs – в первом случае возникнет проблема коротких продуктов реакции, во втором случае – проблема длинных продуктов), а также ингибирование конечным продуктом (образование пирофосфата), конкуренция с неспецифическими продуктами за реактанты, конкуренция за связывание праймера путем ре-отжига концентрированного (10 нM) продукта (Innis and Gelfand, 1990). Если желаемый продукт не получен за 30 циклов, следует отобрать небольшую пробу (1мкл) амплифицированного продукта, перемешать и ре-амплифицировать в течение 20 – 30 циклов в новой реакционной среде, а не продолжать последующие циклы первого прогона. В некоторых случаях, когда концентрация матрицы ограничена, такая ре-амплификация может привести к получению хорошего продукта, в то время как продолжение первого прогона до 40 циклов и более не дает такого эффекта. Конструирование праймеров для ПЦР Возможно, наиболее критический параметр для успешного проведения ПЦР – это конструкция праймеров. При прочих равных условиях, плохо сконструированный праймер может привести к ПЦР реакции, которая не даст результата. Последовательность праймера определяет целый ряд показателей, таких как позиция и длина продукта, его температура плавления и, безусловно, выход продукта (Innis and Gelfand, 1994). Плохо сконструированный праймер может привести к малому количеству продукта, амплификации и/или или его образования отсутствию, димера вследствие праймера, неспецифической который может стать конкурентным настолько, что будет подавлять образование продукта. Эти указания по применению приводятся для того, чтобы обозначить правила, которые следует принимать во внимание, при конструировании праймеров для ПЦР. Более всеобъемлющие сведения по данному вопросу можно найти в различных публикациях (Dieffenbach et al., 1995). Выбор праймера При конструировании праймеров для ПЦР следует принимать во внимание несколько переменных. Среди них есть наиболее критические: • длина праймера • температура плавления (Tm) • специфичность • комплементарная последовательность праймера Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) • 19 G/C содержание и полипиримидиновые (Т, С) или полипуриновые (A, G) протяженные участки • 3’-концевая последовательность Каждый из этих критических элементов будет обсуждаться в следующих разделах. Длина праймера Поскольку специфичность, температура и время отжига частично зависят от длины праймера, этот параметр является критическим для успешного осуществления ПЦР. В целом, олигонуклеотиды длиной от 18 до 24 оснований являются особенно последовательность-специфичными, при том, что температура отжига оптимальна. Длина праймера также пропорциональна эффективности отжига. Если меньшее количество матриц на каждой стадии обеспечено праймерами, это может привести к значительному снижению выхода амплифицированного продукта. Праймеры, однако, не должны быть слишком короткими, если это только специально не требуется для особого применения. Как будет обсуждаться ниже, надо ставить цель сконструировать праймер с температурой отжига по крайней мере 50°С. Отношение между температурой отжига и температурой плавления является одним из «черных ящиков» ПЦР. Общее практическое правило заключается в том, чтобы использовать температуру отжига, которая на 5°С ниже, чем температура плавления. Часто температура отжига, определенная таким образом, не оказывается оптимальной, и требуется проведение специальных экспериментов для определения оптимальной температуры эмпирическим путем. Это наиболее легко выполнить, используя градиентный термоамплификатор. Температура плавления (Tm) Важно помнить, что существуют два праймера, которые добавляют в ПЦР реакцию, ориентимрованную на конкретный сайт, или целевую последовательность. Оба олигонуклеотидных праймера следует конструировать таким образом, чтобы они имели одинаковую температуру плавления. Если праймеры не совпадают в отношении Tm, амплификация будет менее эффективной, или может вовсе не сработать, так как праймер с более высокой Tm будет неправильно работать при более низкой температуре, а праймер с более низкой Tm может не работать при более высокой температуре. Температура плавления олигонуклеотидов наиболее точно рассчитывается с использованием наиболее подходящих термодинамических расчетов по формуле: Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 20 Tmprimer = ΔH [ΔS + R In (c/4)] – 273.15°С + 16.6 log 10 [K+] (2) где Н – это энтальпия, и S – энтропия для образования спирали, R – молярная газовая константа, а с – концентрация праймеров. Самое простое для исполнения – воспользоваться программным обеспечением для конструирования праймеров, имеющимся в продаже (Sharrocks, 1994). К счастью, достаточно хорошо работает приблизительный расчет этой величины (в целом, пригодный для олигонуклеотидов в пределах 18 – 24 оснований), с использованием следующей формулы: Tm = 2(А+Т) + 4(G+C) (3) А, Т, G, С – пуриновые и пиримидиновые основания. Таблица 2 демонстрирует величины, рассчитанные для праймеров различной длины, с использованием этого уравнения (известного, как формула Уоллеса (Wallace), допуская, что содержание GC составляет 50% (Suggs et al., 1981). Таблица 2. Расчет длины праймера с помощью уравнения Wallace. Длина праймера Tm = 2(А+Т) + 4(G+C) Длина праймера Tm = 2(А+Т) + 4(G+C) 4 12°С 22 66°С 6 18°С 24 72°С 8 24°С 26 78°С 10 30°С 28 84°С 12 36°С 30 90°С 14 42°С 32 96°С 16 48°С 34 102°С 18 54°С 36 108°С 20 66°С 38 114°С Величины температур, рассчитанные с помощью правила Wallace, являются неточными для крайних значений этой таблицы. При расчете температуры плавления праймера, следует убедиться, что температура плавления продукта достаточна низка, Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 21 чтобы при 92°С произошло его 100% расплавление. Этот параметр поможет гарантировать более эффективное действие ПЦР, но он не всегда необходим для успешного ПЦР. В общем, продукт в пределах между 100 – 600 нуклеотидных пар эффективно амплифицируется во многих разновидностях реакций ПЦР. Если существует сомнение, Tm продукта можно рассчитать, используя следующую формулу: Tm = 81.5 + 16.6 [K+] + 0.41 (%G+C)-675/длина (4) Специфичность Как уже упоминалось выше, специфичность праймера, по крайней мере частично, зависит от длины праймера. Очевидно, что существует гораздо больше уникальных олигонуклеотидов из 24 оснований, чем из 15 оснований. Таким образом, праймеры следует выбирать так, чтобы они имели уникальную последовательность, находящуюся внутри матричной ДНК, которую предполагается амплифицировать. Праймер, сконструированный так, что он содержит высокоповторяющуюся последовательность, в результате даст размазанное пятно при амплификации геномной ДНК. Однако, тот же самый праймер может дать и единичную полосу, если амплифицируется единичный клон из геномной библиотеки. Вследствие того, что Taq ДНК полимераза активна в широком диапазоне температур, удлинение праймера будет происходить при более низких температурах отжига. Если температура слишком низка, может происходить неспецифическое функционирование праймера, который может расти под действием полимеразы, если имеется короткая гомология у 3’ конца. В целом, температура плавления в 55° - 72°С дает наилучшие результаты (следует отметить, что это относится к длине праймера в 18 – 24 оснований, при использовании правила Wallace). Комплементарная последовательность праймера Праймер следует конструировать так, чтобы в нем абсолютно отсутствовала внутренняя гомология, превышающая 3 нуклеотидные пары. Если праймер имеет такой участок само-гомологии, могут создаваться частично двухцепочечные структуры, типа “обратного схлопывания” или “шпилек”, которые будут мешать отжигу с матрицей. Другая относительная опасность – это гомология между праймерами. Частичная гомология в центральных участках двух праймеров может помешать гибридизации. Если гомология встречается у 3’ конца любого праймера, будет происходить Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 22 образование димера, который, чаще всего будет противодействовать образованию желаемого продукта путем конкуренции. G/C содержание и полипиримидиновые (Т, С) или полипуриновые (A, G) протяженные участки Состав оснований в праймере должен быть между 45% и 55% содержанием GC. Последовательность праймера должна быть выбрана таким образом, чтобы не было поли-G или поли-C протяженных участков, которые могут способствовать неспецифическому отжигу. Поли-А и поли-Т протяженных участков тоже следует избегать, так как они будут «дышыть» и раскрывать протяженные участки комплекса праймер-матрица. Это может снизить эффективность амплификации. Не следует допускать также образования полипиримидиновых (Т, С) или полипуриновых (A, G) протяженных участков. Идеально, праймер должен содержать почти случайную смесь нуклеотидов, иметь содержание GC – 50% и длину ~ 20 оснований. Это даст Tm в пределах 56° - 62°С (Dieeeffenbach et al., 1995). 3’-концевая последовательность Хорошо известно, что 3’ концевая позиция в праймере для ПЦР очень существенна для предотвращения неправильной работы праймера. Проблема гомологии праймера, встречающейся в этих участках уже рассматривалась. Другая переменная, которую следует рассмотреть, это включение G или С остатков на 3’конце праймера. Это «GC» схлопывание помогает обеспечить правильное связывание на 3’ конце вследствие существования более сильных водородных связей между G и С остатками. Это также помогает увеличить эффективность реакции путем минимизации любого «дыхания» структуры, которое может происходить. Специализированные методы ПЦР В дополнение к амплификации целевой последовательности ДНК с помощью обычной процедуры ПЦР, которая уже описана, было разработано несколько специализированных типов ПЦР для специальных целей. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 23 Гнездовой метод ПЦР Гнездовой набор праймеров может быть использован для улучшения выхода последовательности целевой ДНК (Newton and Graham, 1994). ПЦР с гнездовыми праймерами осуществляется за 15 – 30 циклов с одним набором праймеров, а затем в течение дополнительных 15 – 30 циклов со вторым набором праймеров, – к внутреннему участку первого амплифицированного ДНК продукта. Таким образом, наибольший фрагмент, полученный после первого раунда ПЦР, используется в качестве матрицы для второго раунда ПЦР. Использование гнездового метода ПЦР может резко повысить чувствительность и специфичность амплификации ДНК. В особенности, повышается специфичность, так как в этой методике почти всегда удаляются любые побочные, неспецифические продукты амплификации. Это происходит потому, что после первого раунда ПЦР любые неспецифические продукты скорее всего не будут в достаточной степени комплементарны гнездовым праймерам, и не смогут служить матрицей для дальнейшей амплификации, таким образом, желательная целевая последовательность амплифицируется предпочтительным образом. Однако, повышенный риск загрязнения является недостатком, связанным с высокой чувствительностью метода, и следует предпринимать существенные меры предосторожности при постановке такого рода ПЦР, в особенности, в диагностической лаборатории. Мультиплексный метод ПЦР В то время как в стандартном методе ПЦР обычно используют одну пару праймеров для амплификации специфической последовательности, в мультиплексном методе ПЦР используется множество пар праймеров для амплификации многих последовательностей одновременно. Наличие в одной пробирке многих ПЦР праймеров может порождать много проблем, таких как увеличение образования продуктов, полученных в результате «неправильной» работы праймера, «димеров праймеров», а также дискриминация амплификации более длинных фрагментов ДНК (Atlas and Bey, 1994). Для этого типа ПЦР амплификации выбирают праймеры с близкой температурой отжига. Длина продуктов для амплификации должна быть также сходной; большая разница в длине целевых ДНК будет способствовать амплификации более коротких целевых последовательностей в ущерб более длинным, и это приведет к различному уровню выхода продуктов амплификации. В дополнение, буфер для мультиплексного ПЦР содержит добавки для Taq полимеразы, которые уменьшают конкуренцию между Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 24 ампликонами и дискриминацию более длинных фрагментов ДНК в процессе мультиплексного ПЦР. Продукты мультиплексного ПЦР можно впоследствии гибридизовать с ген- специфичными зондами для проверки. ПЦР на практике Как уже было продемонстрировано в предыдущем разделе, ПЦР широко применяется и является мощным аналитическим и препаративным приемом. Однако, вследствие природы этой процедуры, следовые количества примесей ДНК могут служить матрицами, приводя к амплификации ложно-целевой нуклеиновой кислоты (ложно положительный ответ). Таким образом, критическим моментом в ПЦР амплификации является ее проведение в свободной от ДНК среде. Обеспечение физической изоляции рабочей зоны с помощью специального оборудования снижает риск загрязнения. Строгое следование требованиям обеззараживания (очистка от примесей нуклеиновых кислот, предотвращение попадания аэрозолей и т.д.) – является важнейшей предпосылкой сведения до минимума ложно-положительных результатов. Попадание примесей в среду ПЦР может происходить за счет следующих источников: • Лабораторные столы, оборудование и приспособления для пипетирования, которые могут быть загрязнены предыдущими препаратами ДНК, или очищенными рестрикционными фрагментами • Перекрестное загрязнение, происходящее между образцами • Продукты предыдущей серии амплификации методом ПЦР В данном разделе даются некоторые рекомендации, с целью определения рутинных требований для установления и поддержания чистой окружающей среды для любой системы на основе ПЦР, независимо от количества анализируемых образцов (Roth et al., 1997). Физические методы профилактики загрязнения Лабораторное оборудование. Для того, чтобы избежать загрязнения, необходимо создать физическую изоляцию рабочей зоны в соответствии со следующими требованиями: 1. Зона приготовления образцов Это помещение состоит из зоны, где осуществляются все этапы, предшествующие амплификации матричной ДНК (то есть, выделение и очистка ДНК). Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 25 2. Помещение для постановки ПЦР Это «чистое» помещение предназначено для процедур, связанных с подготовкой реакции ПЦР (в том числе, приготовления основного раствора, разведения праймеров и т.д.) 3. Пост-ПЦР зона Эта зона предназначена для амплификации целевой последовательности ДНК, а также для детекции и анализа ПЦР продуктов. В дополнение, следует соблюдать следующие общие правила: • Все помещения должны содержать предназначенное для них оборудование (халаты, перчатки, реагенты и материалы). • Реагенты и прочие необходимые приспособления должны быть маркированы, с указанием содержания и даты приготовления. • Используйте только однонаправленную систему перемещения ингредиентов, то есть никогда не переносите материалы, образцы или оборудование из пост-ПЦР зоны в помещения, где идет подготовка к ПЦР. • Используйте одноразовые реакционные пробирки для ПЦР, свободные от ДНКаз и РНКаз. • Используйте специальные, устойчивые к аэрозолям наконечники пипеток и специально предназначенный (используемый только для ПЦР) набор пипеток, предпочтительно одноразовых. • Если возможно, проводите ПЦР реакции под вытяжкой, оборудованной УФ лампой Под вытяжкой следует хранить и микроцентрифугу, и одноразовые перчатки, используемые только для ПЦР. • Периодически мойте столы и полки 10% хлорной известью, а затем 70% этанолом. Подготовка проб • Используйте стерильную технику и всегда надевайте свежие перчатки, когда работаете в зонах, описанных выше. Чаще меняйте перчатки, особенно, если вы подозреваете, что они могли быть загрязнены растворами, содержащими матричную ДНК. • Всегда используйте новую и/или стерильную посуду, изделия из пластика и пипетки для приготовления реагентов для ПЦР и матричной ДНК. • Автоклавируйте все реагенты и растворы, которые можно автоклавировать, не нарушая их активности. Конечно, праймеры, dNTPs и Taq ДНК полимеразу нельзя автоклавировать. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) • Имейте свой 26 собственный набор ПЦР реагентов и растворов, которые используются только для ПЦР, и храните эти реагенты небольшими порциями. • При пипетировании ДНК, избегайте создания аэрозолей, которые могут нести загрязнения. • Всегда включайте в план эксперимента контрольные реакции, например, отрицательный («без ДНК») контроль, который содержит все реакционные компоненты, за исключением матричной ДНК, а также положительный контроль, который был успешно использован в предыдущих ПЦР. Методы биохимической профилактики и контроля. Урацил-ДНК-гликозилаза Полимеразная цепная реакция (ПЦР) может амплифицировать единичную молекулу более чем в миллиарды раз. Таким образом, малейшие количества примеси могут быть амплифицированы и приведут к появлению ложно-положительного результата. Такие примеси часто являются продуктами предыдущей ПЦР амплификации (перенесенное загрязнение). Поэтому, следует разрабатывать методы, позволяющие избежать этого загрязнения. Одним из общих приемов является замена dTTP на dUTP в процессе ПЦР амплификации, для того, чтобы образовалась урацил-содержащая ДНК (U-ДНК) (Longo et al., 1990). Обработка последующих ПЦР реакций смесью, содержащей урацил-ДНК-гликозилазу (uracil-DNA Glycosylase - UNG) перед ПЦР амплификацией и последующее отщепление пиримидиновых полинуклеотидов при высокой температуре (95°С) и в щелочных условиях (в процессе первоначального этапа денатурации) удалит примесь U-ДНК из образца (см. Рисунок 8). Рисунок 8. Реакция урацил-ДНК гликозилазы Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 27 Этот метод, конечно, требует, чтобы все реакции ПЦР в лаборатории проводились с dUTP вместо dTTP. При использовании dU-содержащих продуктов в последующих этапах, следует отметить следующее: • Продукты ПЦР, содержащие dU, функционируют также хорошо, как и продукты, содержащие dT, при использовании в качестве гибридизационных мишеней, либо в качестве матриц для дидезоксинуклеотидного метода секвенирования. • Продукты ПЦР, содержащие dU, могут быть сразу клонированы, если они трансформированы в клетки UNG – бактериального хозяина. • Субстраты, содержащие dU, легко перевариваются некоторыми из обычных ферментов-рестриктаз (например, EcoR I и BamH I), в то время как некоторые другие рестриктазы проявляют пониженную активность в отношении этих субстратов (например, Hpa I, Hind II, Hind III). • Использование dU содержащей ДНК не рекомендуется для изучения связывания белков, либо ДНК-белкового взаимодействия. ДНКаза I, экзонуклеаза III. Другие биохимические методы основаны на обработке загрязненной примесями ДНК с помощью ДНКазы I, экзонуклеазы III, либо рестрикционных ферментов, содержащих последовательность узнавания внутри целевой ДНК. Однако, вследствие того, что они требуют жестких условий реакции, недостатком этих ферментов является снижение эффективности ПЦР амплификации. Приготовление реакционной смеси для ПЦР реакции (основной смеси). Необходимыми реакционными компонентами для ПЦР являются вода, реакционный буфер, термостабильная ДНК полимераза, олигонуклеотидные праймеры, дезоксинуклеотиды (dNTPs), матричная (целевая) ДНК, а также ионы магния (Mg 2+ ). В общем, все реагенты (за исключением матричной ДНК), смешиваются в одной пробирке в достаточном объеме, в соответствии с числом реакций, которые предполагается поставить (основная смесь). Затем из основной смеси отбирают аликвоты в отдельные пробирки и добавляется матричная ДНК. Использование основного раствора снижает риск загрязнения и улучшает прохождение ПЦР реакции по следующим причинам: • Унифицированное качество раствора гарантировано для всех реагентов для серий анализа • Снижается риск загрязнения материнского и конечного растворов Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 28 • Возможно пипетировать большие объемы • Меньше стадий, связанных с пипетированием, таким образом, сберегается время Успешная амплификация представляющих интерес участков последовательности, зависит от количества и качества матричной ДНК. Необходимое количество матрицы зависит от сложности образца ДНК. Принимая во внимание, что размер ядерного генома различен для различных организмов, концентрация ДНК должна поддерживаться постоянной (обычно, 10 нг/мкл). Сравнение размера генома различных видов растений, часто используемых для трансформации растений, и соответствующее количество геномных копий в определенном количестве ДНК, приводится в Таблице 3. Таблица 3. Сравнение размера генома некоторых видов растений и числа соответствующих геномных копий в определенном количестве ДНК. Образец 5 х 109 н.п. Число геномных копий в 1 мкг ДНК 1.85 х 105 Число геномных копий в 1 нг ДНК 185 Соя 1.55 х 109 н.п. 5.98 х 105 598 Табак 3.8 х 109 н.п. 2.43 х 105 245 4 х 108 н.п. 2.31 х 106 2310 Кукуруза Рис Размер генома Например, в плазмиде, размером 4 тыс.н.п., содержащей вставку в 1 тыс.н.п., 25% вводимой ДНК является целевой последовательностью. В противоположность этому, ген размером в 1 тыс.н.п. в геноме кукурузы (5 х 109 н.п.) представляет приблизительно 0.00002% внесенной ДНК. Приблизительно в 1 000 000 раз больше геномной ДНК кукурузы требуется для поддержания того же числа копий целевой последовательности для реакции. Для оптимизации результатов, >104 копий целевой последовательности следует использовать в качестве исходной матрицы для получения сигнала через 25 – 30 циклов. Даже если на практике может быть амплифицировано менее 10 копий целевой последовательности, в этом случае может потребоваться большее количество циклов ПЦР, для того, чтобы можно было уловить сигнал при гель-электрофорезе. Общий протокол, который обычно используют, рассматривает количество циклов в диапазоне между 30 и 40. Нужно внимательно относиться к дальнейшему увеличению количества циклов, так как это может привести к увеличению неспецифической амплификации. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 29 Контроли. Как уже указывалось в предыдущем разделе, потенциальный источник загрязнения может быть найден в лаборатории. Образцы, сотрудники лаборатории, система кондиционирования воздуха, оборудование и реагенты – все может быть источником загрязнения. Среди таких загрязняющих факторов можно отметить: 1. Перенос примесей амплифицированной целевой ДНК из предыдущих серий ПЦР 2. Перекрестное загрязнение между образцами, приводящее к переносу целевой ДНК от одного образца к другому 3. Геномная ДНК из прежних образцов 4. Продукты деградации из реакций деконтаминации В то время как первые три формы контаминации дают ложно-положительные результаты, последний тип приводит к получению ложно-отрицательного ответа. Эта форма контаминации, впервые наблюдавшаяся Нидерхаузером (Niederhauser) и сотрудниками в 1994 г., приводит к ингибированию реакции ПЦР (Niederhauser et al., 1994). Фактически, деконтаминация с использованием метода UNG, способствует образованию комплексов с праймерами. Для того, чтобы получить надежные результаты, всегда следует использовать как положительные, так и отрицательные контроли при проведении реакции ПЦР. В Таблице 4 указаны некоторые наиболее обычные контроли, используемые для обеспечения надлежащего проведения процедуры амплификации нуклеиновых кислот. Таблица 4. Контроли, которые следует включать в анализ с использованием ПЦР. Контроль Загрязнение реагента целевой ДНК Специфичность реакции Развитие реакции и ее чувствительность Целостность реакционной смеси ПЦР Метод ПЦР без ДНК матрицы (только реакционная смесь) - отрицательный контроль Контроли на выявление вторичных и неспецифических продуктов Положительный/отрицательный контроли для подтверждения того, что выполняются желательные условия, и обеспечивается желательный выход продукта ПЦР с ДНК положительным контролем Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 30 Положительные контроли Эффективность выделения ДНК и ее амплификации должны проверяться с помощью положительных контролей. В идеале, пределы детекции должны быть даны в геномных эквивалентах, которые позволяют получить определенные контроли чувствительности, с малым числом копий. Как правило, должны быть доступны эталонные препараты, содержащие известную концентрацию исследуемой целевой ДНК. Отрицательные контроли Загрязнение (перенос амплифицированных продуктов или нуклеиновых кислот) может происходить в процессе выделения и очистки целевой ДНК, также как и во время приготовления реакционной смеси для амплификации. Вследствие этого, требуется вводить и отрицательный контроль с реакционной смесью для амплификации. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 31 Литература Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Watson, J.D. (1983). Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Inc., New York. Atlas, R.M. and Bej, A. K. (1994). Polymerase Chain Reaction. In: Gerhardt, P., Murrey, R.G.E., Wood, W.A. and Krieg, N.R., (Eds.) Methods for general and molecular bacteriology. Washington, D.C.: American Society for Microbiology, pp. 418–435. Dieffenbach, C.W., Lowe, T.M.J. and Dveksler, G.S. (1995). General Concepts for PCR Primer Design. In: Dieffenbach, C.W, and Dveksler, G.S. (Eds.) PCR Primer: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, pp. 133–155. Innis, M.A. and Gelfand, D.H. (1990). Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., and White, T.J. (Eds.) PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press, pp. 3–12. Innis, M.A., and Gelfand, D.H. (1994). Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., and White, T.J. (Eds.) PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. London: CRC Press, pp. 5–11. Innis, M.A., Myambo, K.B., Gelfand, D.H. and Brow, M.A. (1988). DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 85, 9436-9440. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. (1990). Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reaction. Gene 93, 125– 128. Newton, C.R. and Graham, A. (1994). PCR. BIOS Scientific Publishers, Limited, Oxford. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 32 Niederhauser, C., Höfelein, C., Wegmüller, B., Lüthy, J. and Candrian, U. (1994). Reliability of PCR Decontamination Systems. PCR Methods and Applications 4, 117–123. Ogawa, T. and Okazaki, T. (1980). Discontinuous DNA replication. Annual Review of Biochemistry 49, 421–457. Roux, K.H. (1995). Optimization and troubleshooting in PCR. PCR Methods and Applications 4, 185-194. Rolfs, A., Schuller, I., Finckh, U. & Weber-Rolfs, I. (1992). Substances affecting PCR: Inhibition and enhancement, 51-58. In: PCR: Clinical diagnostics and research, Springer. Roth, A., Mauch, H. and Göbel, U. (1997). Nucleic Acid Amplification Techniques – Recommendations for Employing Molecular Methods in Diagnostic Routine Microbiology Laboratories and Measures for Internal Quality Assurance. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart. Saiki, R.K., Scharf, S.J., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350. Saiki, R.K. et al. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction. In: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, chapter 14. Sharrocks, A.D. (1994). The design of primers for PCR. In: Griffin, H.G. and Griffin, A.M (Eds.) PCR Technology: Current Innovations. London: CRC Press, pp. 5–11. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 33 Suggs, S.V., Hirose, T., Miyake, E.H., Kawashima, M.J., Johnson, K.I., and Wallace, R.B. (1981). Using Purified Genes. In ICN-UCLA Symp. Developmental Biology, Vol. 23, Brown, D.D. Ed., Academic Press, New York, 1981, 683. Дополнительная литература Gayer-Herkert, G., (1992). Molekularbiologische Methoden für den Nachweis von Mikroorganismen in Mischpopulationen – eine Literaturstudie. Bioengineering 5 + 6, 55–64. Horton, H., Moran, L., Ochs, R., Rawn, J. and Scrimgeour, K., (1994). Principes de Biochimie. De Boeck – Wesmael, S.A., Bruxelles. Knippers, R. (1995). Molekulare Genetik. Georg Thieme Verlag, Stuttgart. Kwok, S., Kellog, D.E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C. and Sninsky, J.J. (1990). Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: Human Immunodeficiency Virus 1 model studies. Nucleic Acids Research 18, 999–1005. Larzul, D. (1993). Le PCR: un procédé de réplication in vitro. Tec & Doc-Lavoisier, Paris. Stryer, L. (1991). Biochemie. Spektrum Akademischer Verlag, GmbH, Heidelberg. Watson, D.J., Hopkins, N., Roberts, J., Steitz, J. and Weiner, A. (1988). Molecular Biology of the Gene. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., New York. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 6
