Balaban et al., 2004, 2013

III Международный конгресс по профилактике ИСМП
Россия, Москва, 20 - 21 ноября 2013 г
Явление персистенции –
формы и механизмы
выживаемости популяции
Эль-Регистан Г.И.
Николаев Ю.А.
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ
ИМ. С.Н. ВИНОГРАДСКОГО РАН
1
Состояние вопроса
• Растущее распространение антибиотикорезистентности (АР)
микроорганизмов
• Инфекционные осложнения у иммунокомпрометированных пациентов
(у онкобольных - до 80%)
• Развитие УПБ в виде биопленок, обладающих АР
• Получение полных сиквенсов бактериальных геномов
• Обнаружение детерминант АР, форм молекулярного переноса АР и
переживающих антибиотикорезистентных клеток бактерий в вечной
мерзлоте Арктики и Антарктиды (сотни тыс.- млн. лет) [Tiedje et
al.,1994; Mindlin et al.,2004, 2009; Петрова с соавт., 2012]
* * *
Система адаптивной устойчивости к повреждающим воздействиям, в
т.ч. антибиотикам, сформировалась в биосфере задолго до
антропогенного давления, которое т.о. является лишь селектирующим
фактором
Феномен АР – частный случай эволюционно сформированного
адаптивного потенциала микробных популяций к постоянно
меняющимся условиям окружения
2
Терминология
• Микробная популяция (планктонная культура, колония, биопленка, др.)
– «многоклеточный» саморегулирующийся организм, стадийное
развитие которого и скоординированный ответ на внешние
воздействия контролируются факторами межклеточной коммуникации
[Иерусалимский, 1957; Shapiro, 1998; Zgur-Bertok, 2007]
• Гетерогенность моноклональной популяции – ее универсальное
системное свойство, проявляющееся в одновременном наличии
клеток различных генотипов и фенотипов на всех стадиях развития
популяции [Тимофеев-Ресовский с соавт., 1969; Zgur-Bertok, 2007]
• Персистеры – малочисленная субпопуляция клеток, выживающих при
обработке высокими дозами антибиотиков без проявления в клетках
генетических детерминант устойчивости [Lewis, 2007; Balaban et al.,
2004, 2013]
3
Эволюционные направления развития
резистетности бактерий к антибиотикам
(стрессорам)
Изменение фенотипа
Изменение генотипа
выход из клеточного цикла
- персистеры (П)
- стационарные клетки (СК)
- покоящиеся формы (ПФ)
- некультивируемые клетки (НК)
развитие генотипов с детерминантами
устойчивости (клоны)
- изменение мишеней
- активный выброс из клетки
- изменение антибиотика
механизм
выключение (прикрытие) мишеней - внутригеномные перестройки
для антибиотиков с предупрежде- -горизонтальный перенос генов АУ
- локальные мутации
нием образования токсичных
продуктов
выживание в присутствии
антибиотиков
антибиотикотолерантность
рост в присутствии антибиотиков
антибиотикоустойчивость
4
Фенотипы антибиотикотолерантности
ПI
ПII
КИ
[Grant, Hung, 2013]
5
Фенотипы антибиотикотолерантности
(образуются всегда в цикле развития любой микробной культуры)
пролиферативный покой
прекращение деления
- персистеры (ПI, ПII)
- клетки индифферентные (КИ)
- стационарные клетки (СК)
ПII
до 0.01%
СК
ПI
ПФ
100% до 1% 0.001-1.0% П,
(до 10-30%)
метаболический покой
гипометаболическое или
анабиотическое состояние
покоящиеся формы (ПФ):
- цистоподобные покоящиеся
клетки (ЦПК)
- некультивируемые клетки (НК)
- ультрамелкие покоящиеся клетки
(УмК)
[Roszak, Colwell, 1987;
Kaprelyants et al, 1999; Shan et
al., 2006; Lewis, 2007; Balaban et
al., 2004, 2013; Keren et al., 2004,
2011; Эль-Регистан с соавт.,
2006; Николаев с соавт., 2006;
Soina et al., 2007; Мулюкин с
соавт.; Лойко с соавт.; Демкина
с соавт., 2005-2013]
СК, ПФ
6
Полиморфизм цистоподобных клеток
Pseudomonas aurantiaca
[Мулюкин с соавт., 2008]
7
Ультрамелкие клетки (d<0.22 мкм)
A. oxydans К14
Клетки из фильтратов
городских почв
[Лысак с соавт., 2010]
Длина масштабной метки – 0.2 мкм
[Кряжевских с соавт., 2013]
8
Вид покоящихся клеток в вечной мерзлоте
30-40 тыс. лет
2 млн. лет
7-10 тыс. лет
30-40 тыс. лет
Масштабная метка 0.2 мкм
9
[Soina et al., 2006]
Нежизнеспособные мумифицированные
клетки
КС
Свойства:
фЦПМ
КС
ПЦ
• сильная рефрактерность и
сохранение внешней формы;
ПП
0.5 мкм
• полная утрата
жизнеспособности;
а
M. luteus
0.5 мкм
б
S. aureus
ф НМ
• деструкция клеточных мембран
СВ
0.5 мкм
0.5 мкм
P. aurantiacaг
в
л
0.5 мкм
Микомумия
дрожжей
0.5 мкм
КС
л
Микрофоссилии в
керитах (1.85 млн.лет)
[Gorlenko et al., 2000]
Л
КС
0.5 мкм
д
Л
0.2 мкм
10
S.е cerevisiae
[Сузина с соавт.,2001]
Генотипы устойчивости
(выщепление и развитие внутрипопуляционных диссоциантов - клонов,
вариантов, в том числе - антибиотикоустойчивых)
Колониально-морфологическая диссоциация при прорастании ПФ
P.aurantiaca и P.fluorescens
S
S
R
Sm
Mm
R
M
11
[ Мулюкин с соавт., 2010]
Механизмы образования фенотипов АТ
Персистеры
ПФ – НК и ЦПК
•хромосомные модули ТА (Rel •регуляция стационарной фазы
BE, Maz EF, Hip BA)
•глобальные регуляторы (Rpo
B, Rpo S, др.)
<T>A → П
•строгий ответ
>T<A → смерть
•антиоксидантная защита
•стрессовые гены (SOS,
•экспрессия spo 0 ?
холодовый, тепловой,
↓
фаговый шок)
образование НК, ЦПК
•оксидативный стресс
(от 0.01-1.0 до 10-30%)
>tna A → П
• > мутант hip A7 → >> П
↓
Индифферентные
клетки (КИ)
дефицит питания,
гипоксия, <рН
• строгий ответ (Rel A)
•> ppGpp (аллармон,
эффектор)
•альтернативные σ-Ф
•>> glg C
•< прооксидантов
↓
образование КИ (100%?)
реактивация ПФ
•генная карта (300)
• антиоксиданты
•остановка роста клетки
•Rpf-белок
•дефицит ЭН
•НЖК
•развитие АТ
•Цитокины
•устойчивость к тMe и ?
•ГСЛ
•дефицит автолизинов
•кАОБ
↓
образование интактных П [Roszak, Colwell, 1987;
Kaprelyants et al, 1999; Shan et al., 2006;
(до 1%)
Lewis, 2007; Balaban et al., 2004, 2013;
[Lewis, 2005, 2010;
Keren et al., 2004, 2011; Эль-Регистан с
Balaban et al., 2004, 2013;
соавт., 2006; Soina et al., 2007;
Allison et al., 2011; Grant et al., 2013 и
Мулюкин с соавт., 2005-2013]
др.]
[Balaban et al., 2013]
12
Механизмы толерантности
•
•
•
•
•
ТА модули – арест роста и, следовательно, мишеней для антибиотиков
SOS-ответ – общая стрессоустойчивость
Белки МЛТ персистеров «укрывают» мишени
ppGpp – общая регуляция стрессоустойчивости в т.ч. к антибиотикам
Частные механизмы устойчивости - < Kat G→ активация изониазида –
гибель клеток M. smegmatis
↓
Гетерогенная популяция персистеров:
 неделящиеся, медленнорастущие,
 индуцированные лимитом питания,
 зависящие от возраста стационарного инокулята,
 зависящие от SOS-ответа
↓
 Персистеры – гетерогенная популяция специализированных для
выживания клеток за счет множественных механизмов
 Персистеры – фенотипы, предназначенные для выживания
популяции бактерий и формирующиеся в результате процессов
цитодифференцировки
13
Популяционно-контролируемый уровень образования
фенотипов устойчивости (доказательства)
14
•А-фактор в лаг-фазе → споро- и антибиотикообразование в стационаре
Лаг-фаза как фаза опережающего развития определяет выбор фенотипов и генотипов
в онтогенезе культуры – популяции
[Хохлов, 1988; Beppu et al., 1990]
• Индол (← окислительный стресс) > образование персистеров [Lee et al., 2010; Vega et
al., 2012]
• Многократное пассирование клетками ранней log-фазы полностью предупреждает
развитие ПII, возможно ПI ? [Balaban et al., 2013]
• Белок Rpf реактивирует НК и ЦПК [Kaprelyants et al., 1996, 1999]
• ГСЛ системы QS контролируют развитие биопленочного фенотипа и экспрессию генов
патогенности и др. [O’Toole, Kolter, 1998; Donlan, Costerton, 2002]
• Стресс в лаг-фазе (дисбаланс питания) увеличивает численность ПФ (ЦПК и УмК) в 101000 раз;
длинноцепочечные АОБ индуцируют образование ЦПК;
короткоцепочечные АОБ способствуют реактивации ПФ [El’-Registan et al., 2005;
Николаев с соат., 2006; Mulyukin et al., 2010; Мулюкин с соавт.; Лойко с соавт.; Демкина
с соавт.; Кряжевских с соавт.; 2005-2013]
• Количественные закономерности образования фенотипов устойчивости (П, ПФ)
предполагают процессы не стохастические, а регулируемые
Стратегии антибактериальной защиты
 Минимизация образования персистеров и ПФ →
антиоксиданты, адаптогены, стрессопротекторы, нейромедиаторы, цитокины ?
 Принудительная реверсия П и ПФ (+ антибиотик → тиндализация)
маннит, фруктоза;
полицикл С10;
активаторы прорастания ПФ (НЖК, Rpf, кАОБ, цитокины)
[Kaprelyants, Kell, 1993, 1995; Allison et al., 2011; Bald, Koul, 2013; Бухарин с соавт., 2005]
 Предотвращение прорастания П → (предупреждение рецидивов)
дАОБ
ГСЛ?
[Vega et al., 2012; Эль-Регистан с соавт., 2006]
 Перевод ПФ в микромумии → (стерилизация)
дАОБ
[Сузина с соавт., 2001]
 Регуляция генотипических переходов → (предупреждение выщепления
вирулентных клонов)
АОБ
НЖК
[Лойко с соавт., 2006; Хабибуллин с соавт., 2007]
 Популяционно-коммуникативная регуляция образования П и ПФ →
индол
каскад регуляторов???
[Lee et al., 2010; Vega et al., 2012; Хохлов, 1988; Aaronson, 1988; Олескин, 2007; Бухарин с15
соавт., 2005]
Вопросы для теоретических исследований
1. Что является популяционным сигналом для
образования П
2. Что определяет рецепцию сигнала (фаза
клеточного цикла, ассиметричность деления, др.?)
3. Какова судьба П в онтогенезе популяции (П → ПФ?)
4. Какие фенотипы АТ ответственны за персистенцию
при бактерионосительстве и выживание в
окружающей среде
5. Каковы взаимоотношения П, ПФ и АУ-клонов
6. Чем отличаются разные фенотипы персистеров
7. Как влияет структура мембран на образование?, на
свойства? П
16
Внеклеточные (ауто)регуляторы разной химической
природы контролируют онтогенетическое развитие
микробной популяции и ее скоординированный
ответ на воздействия стрессоров, в том числе,
антибиотиков, что делает перспективным
использование регуляторов для контроля
антибиотикорезистентности бактерий
Ничто не стоит так
дешево и не ценится
так дорого, как…
17
общение.
СПАСИБО ЗА
ВНИМАНИЕ!
18