Основы полимеразной цепной реакции

реклама
Основы полимеразной
цепной реакции
Национальная научная лаборатория
биотехнологии коллективного пользования
Шевцов А.Б.
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
ЧтоЧто служит основой ПЦР реакции?
ция ДНК — процесс синтеза
дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой
кислоты на матрице родительской молекулы
ДНК.
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Открытию ПЦР послужило
Основные принципы использования праймеров
(коротких искусственно синтезированных молекул
ДНК) и состав ингредиентов, входящих в
реакционную смесь для получения копий ДНК
впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году
[K., Ohtsuka E., Kleepe R, Molineux R., Khorona R.. Studies on polynucleotides.
XCVI. Repair replication of short synthetic DNA’s as catalysed by DNA
polymerases // J. Mol. Biol. - 1971. – Vol. 56. – P. 341-346.].
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Kleppe K., Ohtsuka E., Kleepe R, Molineux R., Khorona R.. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replication of s
Кто это сделал
Полимеразная цепная реакция была открыта в 1983
году Кэри Маллисом (Kary Mullis). Его целью
было создание метода, который бы
позволил амплифицировать ДНК в ходе
многократных последовательных удвоений исходной
молекулы ДНК с помощью фермента ДНК
полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой
идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую
премию.
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Определение
•
Полимеразная цепная реакция – это экспериментальный
метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного
увеличения малых концентраций определённых фрагментов
нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК) в биологическом материале (пробе).
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Год
Число
публикаций
1985
1
1986
3
1987
8
1988
139
1989
698
1990
2 668
1995
11 890
2000
16 430
2004
20 075
Компоненты ПЦР реакции
ДНК-матрица,
Два праймера, комплементарные противоположным концам
разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию
полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР
должна сохранять активность при высокой температуре
длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из
термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза),Pyrococcus
furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и
другие.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия
реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий
сывороточный альбумин.
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
ДНК - линейный сополимер
ортофосфорной кислоты и
дезоксирибозы, связанный с
нерегулярно-повторяющимися
нуклеиновыми основаниями,
выделенный Ф. Мишером в 1869
из ядер лейкоцитов
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
5’конец
3’конец
5’конец
3’конец
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Tимин
Пиримидины
Aденин
T
Пурины
Гуанин
Цитозин
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Цитозин Гуанидин
Тимиин - Аденин Пурины
Пиримидины
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012





Длина праймеров 18-30
нуклеотидов
GC-состав 45-55%, близок к GCсоставу матрицы
Разница в температурах отжига не
более 5оС
Не должны формировать шпилек
на 3-конце
Не должны формировать димеры
по 3-концам
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Некоторые характеристики ДНК-полимераз
Полимеразы
Время
полужизни
при 95С
(min)
Экзонуклеазная Экзонуклеазна
активность 5'-3' я активность
(+/-)
3'-5' (+/-)
Достройка
3'-концов
Taq
40
+
-
А-он
Tth
20
+
-
A-он
Pfu
120
-
+
blunt ends
Vent
400
-
+
blunt ends
1300
-
+
blunt ends
50
-
+
blunt ends
120 при
100С
-
+
blunt ends
Deep Vent
UlTma
Pwo
Стадии ПЦР
Цикличность реакции:
Существует 3 больших ступени в пцр, которые
повторяются 20-40 раз. Эти циклы проходят в
аппарате – термоциклере , который может повышать
и снижать температуру в реакционной смеси за очень
короткое время.
Денатурация – около 94°C :
Во время денатурации двойная цепь ДНК плавится и
образуются одноцепочечные ДНК (все
энзиматические реакции останавливаются).
Аннеалинг (отжиг) – около 54°C :
Водородные связи постоянно формируются и
разрушаются между одиночными праймерами и
одноцепочечной ДНК. Если праймер садится на
комплементарный участок ДНК, водородные связи
настолько сильны, что праймер остается на матрице.
Удлинение (элонгация) – около 72°C :
Полимераза присоединяет dNTP‘s начиная с 3‘-конца
праймера строго комплементарно матрице и
двигается по матрице от 5‘конца к 3‘концу.
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Стадии ПЦР
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Стадии ПЦР
Экспоненциальное увеличение количества копий в течение ПЦР
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Старый добрый ПЦР амплификатор
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Taq полимераза
Taq-полимераза была впервые охарактеризована русским биохимиком
Алексеем Калединым в 1980 году. Стоит отметить что Taq-полимераза самый
дорогой компонент пцр смеси.
Важно знать, что любая полимераза работает только с комплексом
элонгации, который состоит из праймера и матрицы.
Йеллоустоун (национальный парк)
Thermus aquaticus
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Современные ПЦР амплификаторы
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Детекция пцр продуктов
Варианты детекции:
1.Гель – электрофорез
2.Гибридизация
Гель-электрофорез в агарозном или
полиакриламидном геле
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Оптимизация ПЦР
Оптимизация по температуре
ПЦР очень сильная техника, если нет результатов имеет
смысл оптимизировать состав реакционной смеси
Основные изменяемые параметры ПЦР:
-Концентрация матрицы, нуклеотидов, ионов Mg2+ и
полимеразы, смена используемой полимеразы (Taq,
Vent , Pfu)
Оптимизация по ионам Mg2+
-Добавление ДМСО, бетаина, формамида
-Подбор температуры отжига праймеров
-Использование HotStart
-Дизайн праймеров
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Дизайн и подбор праймеров
Основные правила подбора праймеров для ПЦР
Возможно наиболее важным для успешной амплификации является
Правильный подбор праймеров
Выбор праймеров:
- Длина праймера
- Температура плавления (Tm)
- Специфичность
- Cостав G/C оснований
- Последовательность 3’-конца
Длина праймеров
- Специфичность и температура отжига напрямую зависят от длины
праймера
- Праймеры с длиной 20-30 оснований обладают высокой специфичностью
- Праймер не должен быть коротким – это снижает специфичность
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Дизайн и подбор праймеров
Комплементарность
- 4 или более 3´-концевых нуклеотида не должны быть комплементарны самому себе
или другому праймеру в пробе
- С 5´конца праймера может быть присоединена некомплементарная матрице
последовательность.
G/C состав
- в идеале праймер должен иметь случайную смесь нуклеотидов с 50% GC
содержанием
- не должно быть на концах поли-G или поли-C чтобы предотвратить образование
непецифичных продуктов
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Дизайн и подбор праймеров
Температура плавления (Tm)
-Температура плавления праймера – это температура при которой половина молекул
свободна, а другая половина молекул гибридизована с матрицей
-Для расчета температуры плавления наиболее проста и популярна формула Уоллеса :
Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C
- a general rule-of-thumb is to use an annealing temperature that is 5°C lower
than the melting temperature
Температура отжига (Ta)
-Температура отжига праймера – это характеристика реакционной смеси, она
рассчитывается следующим образом:
Tа ≈ Tm -5 °C
-Оба праймера должны быть подобраны так, чтобы иметь сходные температуры
плавления.
-Праймеры с низкой Tm не будут работать при высоких температурах отжига
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Дизайн и подбор праймеров
программное обеспечение для дизайна праймеров:
•OLiGO (Molecular Biology Insight Inc.)
•GeneRunner (Hustings Software)
•Primer Select/DNASTAR (DNASTAR Inc.)
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Hot start ПЦР
•Добавление одного из компонентов пцр смеси позже , при
высоких температурах
•Разделение барьером
•Ингибирование активности полимеразы антителами
•Химическая модификация полимеразы термо- или рН
лабильными химическими группами
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Преимущества ПЦР
•Специфичность
• Воспроизводимость
•Чувствительность
•Достоверность
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Разновидности ПЦР
•Nested PCR (гнездная – пцр со вложенными праймерами.
•RT-PCR – пцр , где в качестве матрицы используется РНК, реакция
идет с обратной транскрипцией
•Real time PCR – пцр в режиме реального времени
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Вещества улучшающие специфичность и выход
пцр продукта
•Влияющие на Tа ДНК и праймеров – формамид,
диметилсульфоксид (ДМСО), сперимидин.
•Влияющие на конформацию ДНК (белок SSB, белок 34
фага Т4)
•Вляющие на свойства полимеразы (бетаин, БСА,
желатин, глицерин)
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Вещества улучшающие специфичность и
выход пцр продукта
Вещество
Используемая концентрация
Механизм действия
Acetamide
~5%
Повышение растворимости
Betaine Na
0,5-2М
Стабилизация фермента,
выравнивание Tm AT- и GCбогатых последовательностей
DMSO
2-15%
Повышение растворимости
Formamide
1-5%
Glycerol
5-20%
Стабилизация фермента
Twin 20, Triton X-100
0,1-0,5%
Стабилизация фермента
BSA
0,1
Стабилизация фермента
TMA chloride
0,01-0,1
Повышение специфичности
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Вещества ингибирующие ПЦР
•Гепарин
•Ацетилированный БСА
• NaCl
•Изопропанол
•РНК
•Гемоглобин
•Ацетат натрия при>5mM.
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Стадии ПЦР анализа
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!
Ваши вопросы???
Современные проблемы
биологии, ЕНУ, Астана, 2012
Скачать