Диагностика ИППП - Кыргызская государственная медицинская
реклама
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ЦЕНТР РАЗВИТИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ЦЕНТР ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИИ ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ СИФИЛИСА, ГОНОРЕИ И ХЛАМИДИОЗА ДЛЯ ВСЕХ УРОВНЕЙ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ Бишкек 2011 Практическое руководство по лабораторной диагностике сифилиса, гонореи и хламидиоза для всех уровней здравоохранения Кыргызской Республики принято Экспертным советом по оценке качества клинических руководств/протоколов и утверждено Приказом МЗ КР № 143 от 07.04.11 г. Название документа: Практическое руководство по лабораторной диагностике сифилиса, гонореи и хламидиоза всех уровней здравоохранения Кыргызской Республики. Этапы оказания помощи: Первичная, вторичная и третичная медицинская помощь. Цель создания Целью создания данного практического руководства было предоставление полной и точной информации по лабораторной диагностике сифилитической, гонорейной и хламидийной инфекций и внедрение в практику единых клинико-лабораторных критериев диагностики ИППП, соответствующих научно-обоснованной практике и современному уровню развития медицины. Задачи: Создание единых подходов по диагностике ИППП • • Улучшение и контроль качества диагностики и выявляемости ИППП • Рациональная диагностика ИППП в целях снижения затрат больного Дата создания: Руководство разработано за период сентябрь 2009 - март 2011 гг. Планируемая дата обновления: Проведение следующего пересмотра планируется в январе 2015 года или по мере появления новых ключевых доказательств. Данное практическое руководство было разработано для врачей-лаборантов, фельдшеровлаборантов, организаторов здравоохранения. Любые комментарии и пожелания по содержанию руководства приветствуются. Адрес для переписки с рабочей группой: Кыргызстан, г. Бишкек, ул. Льва Толстого 70, Тел.: 0312 59 52 11, 0312 59 01 45 E-mail: rcdv_kg@mail.ru Издан при содействии Национальной программы по реформированию системы здравоохранения «Манас Таалими» за счет средств SWAp. 2 Состав рабочей группы по созданию руководства Настоящее практическое руководство по лабораторной диагностике сифилиса, гонореи и хламидиоза для всех уровней здравоохранения Кыргызской Республики разработано рабочей группой Республиканского центра дерматовенерологии (Кыргызская Республика) в сотрудничестве с группой по диагностике ИППП Международной сети специалистов по сексуальному, репродуктивному здоровью и правам (SRHR Network), Шведским агентством международного развития и кооперации, Уппсальским университетом, Восточно-Европейским комитетом Шведского общества охраны здоровья на основе нескольких практических руководств: Guidelines for the laboratory diagnosis Syphilis in East European countries 2009; Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in East-European countries 2009. Part 1: sampling and microscopy diagnosis; Part 2: culture, non-culture methods, determination of antibiotic resistance, and quality assurance; Guidelines for the laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections in East European countries 2009; UK National Guidelines on the Management of Syphilis 2008; UK National Guideline for the Management of Genital Tract Infection with Chlamydia trachomatis, 2006; UK National Guideline on the Diagnosis and Treatment of Gonorrhoea in Adults 2005, сommissioned by: Clinical Effectiveness Group, BASHH (British Association for Sexual Health and HIV) http://www.bashh.org. Руководитель группы Ф.И.О. Юсупова Д.М. Должность Директор РЦДВ, к.м.н. Ответственные исполнители Ф.И.О. Горбунова Е.В. Белоглазова Т.И. Бышевская А.М. Дуйшоналиева Н.З. Мамаева Г.В. Должность Зам. директора РЦДВ, врач дерматовенеролог высшей категории. Зав. централизованной лабораторией по диагностике ИППП, врачлаборант высшей категории. Зав. отделением КВО, РЦДВ. Врач-лаборант РЦДВ первой категории. Врач-лаборант РЦДВ высшей категории. Медицинские консультанты внутренние Ф.И.О. Балтабаев М.К. Койбагарова А.А. Должность Д.м.н., профессор, зав. кафедрой дерматовенерологии КГМА и кафедрой дерматовенерологии и фтизиопульмонологии КРСУ. К.м.н., доцент кафедры дерматовенерологии и фтизиопульмонологии КРСУ. Рецензенты Таирова М.М. Керималиева Ж.А. Кучук Т.Э. (по сифилису) Главный лаборант МЗ КР, к.м.н. зав.отделением цитоморфологических исследований и лаборатории генной диагностики, к.м.н. доцент кафедры лабораторной диагностики КГМИП и ПК. Зав. циклом дерматовенерологии КГМИП и ПК, к.м.н. доцент НПО «Профилактическая медицина». Руководитель республиканского научно-практического центра контроля качества лабораторной диагностики инфекционных болезней, к.м.н. 3 Медицинские консультанты внешние Ф.И.О. Марюс Домейка Баллард Рон Должность Д.м.н., профессор. Отдел медицинских наук, Уппсальский университет, Восточно-Европейский комитет шведского общества охраны здоровья. Д.м.н., профессор. Национальный центр по профилактике ВИЧ, ИППП и туберкулеза, центр по контролю над инфекционными заболеваниями (CDC), Атланта, США. Рецензенты Бартон Смит Специалист по семейной медицине, заместитель директора проекта по качественному здравоохранению ЮСАИД. Методологическая экспертная поддержка к.м.н., заведующая отделом доказательной медицины РЦРЗиИТ, Барыктабасова Б.К. методолог по разработке и оценке качества клинических руководств и протоколов. Отделом доказательной медицины Республиканского Центра развития здравоохранения и информационных технологий были проведены консультации по методологии создания практических руководств, основанных на принципах доказательной медицины. В группу по разработке практического руководства вошли представители медицинских специальностей часто соприкасающихся в своей практической деятельности с проблемами лабораторной диагностики ИППП, которые были приглашены из ведущих медицинских учреждений Кыргызской Республики. Привлечение медицинских консультантов и главных внештатных специалистов Минздрава КР в процесс разработки и оценки руководства позволило обсудить достоверность отдельных рекомендаций, для которых не было найдено доказательств, а также вопросы применимости руководства в лечебно-профилактических организациях всех уровней здравоохранения Кыргызской Республики. Протоколы согласительных заседаний мультидисциплинарной рабочей группы по разработке руководства велись на базе РЦДВ. В процессе апробации и рецензирования практического руководства были получены комментарии и рекомендации, которые были учтены при его доработке. На основе данного практического руководства по лабораторной диагностике разработаны клинические протоколы для практических врачей, содержащие основные клинико-лабораторные критерии диагностики ИППП. После апробирования и получения комментариев, рецензий данное руководство было утверждено Экспертным советом по оценке качества Министерства здравоохранения Кыргызской Республики. Конфликт интересов Все члены группы подписали декларацию об отсутствии конфликта интересов. Обучение разработчиков и техническая поддержка была оказана Республиканским объединением СПИД в Кыргызстане. 4 Список сокращений АГ Антиген АТ Антитело ВКК Внутрилабораторный контроль качества ВОК ДНК Внешняя оценка качества Дезоксирибонуклеиновая кислота ИППП Инфекции, передающиеся половым путём ИФА (ELISA) Иммуноферментный анализ КА КМ Кардиолипиновый антиген Культуральный метод КП Клинические протоколы МАНК Метод амплификации нуклеиновых кислот МГА ТР Реакция микрогемагглютинации бледных трепонем МКБ-X Международная классификация болезней десятого пересмотра ОП Оптическая плотность ПИФ ТР Прямая иммунофлюоресценция с антителами к бледной трепонеме ПЦР ПИФ Полимеразная цепная реакция Прямая иммунофлюоресценция РИТ (РИБТ) Реакция иммобилизации бледных трепонем РИФ (FTA) Реакция иммунофлюоресценции РМП Реакция микропреципитации РПГА (TPHA) Реакция пассивной гемагглютинации РПР(RPR) РЦДВ РНК Тест быстрых плазменных реагинов Республиканский центр дерматовенерологии Рибонуклеиновая кислота СМЖ Спинномозговая жидкость ТРРА УГХ FDA Разновидность РПГА с добавлением частиц латекса Урогенитальный хламидиоз Food and Drug Administration RST Нетрепонемный тест с добавлением судана чёрного TRUST Нетрепонемный тест с толуидиновым красителем USR Нетрепонемный тест с добавлением холин хлорида и других компонентов VDRL Название лаборатории разработчика (нетрепонемный тест) 5 СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений ..........................................................................................................................5 Содержание .......................................................................................................................................6 СИФИЛИС ........................................................................................................................................7 1. Введение ...................................................................................................................................... 7 2. Классификация и клиническая характеристика сифилитической инфекции........................ 10 3. Лабораторная диагностика сифилиса ....................................................................................... 13 4. Взятие и транспортировка клинического материала ............................................................... 13 5. Прямые методы исследования (используемые для установления окончательного диагноза) .......................................................................................................................................... 17 6. Непрямые методы исследования (используемые для установления предварительного диагноза) .......................................................................................................................................... 20 6.1. Нетрепонемные тесты ............................................................................................................. 22 6. 2. Трепонемные тесты ................................................................................................................ 31 7. Основные причины ложноположительных и ложноотрицательных серологических реакций............................................................................................................................................. 46 8. Алгоритмы и критерии диагностики сифилиса ....................................................................... 47 9. Система контроля качества серологических исследований.................................................... 50 10. Безопасность персонала ........................................................................................................... 51 ГОНОРЕЯ ........................................................................................................................................ 52 1. Введение ...................................................................................................................................... 52 2. Этиология .................................................................................................................................... 52 3. Основные принципы диагностики гонореи.............................................................................. 53 4. Взятие материала .........................................................................................................................55 5. Транспортировка материала .......................................................................................................59 6. Микроскопические методы исследования ................................................................................ 60 7. Культуральное (бактериологическое) исследование ............................................................... 65 8. Контроль качества бактериологического исследования на N. gonorrhoeae ........................... 74 9. Некультуральные методы диагностики гонококковой инфекции ......................................... 77 10. Определение антибиотикочувствительности и резистентности n. gonorrhoeae ................ 81 ХЛАМИДИИ ................................................................................................................................... 87 1. Введение ...................................................................................................................................... 87 2. Классификация инфекций, вызванных Chlamydia trachomatis .............................................. 88 3. Пути передачи и клиническая картина ..................................................................................... 89 4. Взятие образцов, хранение и транспортировка ....................................................................... 90 5. Методы диагностики хламидийной инфекции: ....................................................................... 94 Список литературы ....................................................................................................................... 105 6 Сифилис 1. Введение Вопросы диагностики патологии, специфической для венерологии, едва ли не самые сложные в деятельности врачей-клиницистов и лаборантов, поэтому обеспечение высокого качества лабораторных исследований, основных принципов диагностического процесса, является весьма актуальным. Актуальность этой проблемы обусловлена широким распространением венерических заболеваний, их влиянием на здоровье населения, а также социальной и медицинской значимостью результатов диагностического теста в каждом 5 клиническом случае. Заболевания, возникающие в результате сексуальных контактов - серьезная проблема в здравоохранении. Для них характерны: медленно прогрессирующее течение патологического процесса и своеобразное поражение органов и тканей. В ряде случаев у пациентов только периодически появляются субъективные и объективные симптомы болезни. Наряду с этим, лабораторные исследования, имеющие целью всестороннее изучение организма, углубленные исследования биологических особенностей возбудителей ИППП, по мере усовершенствования техники и методики лабораторного анализа, становятся все более строгими. Сифилис, по современным представлениям, является хроническим рецидивирующим заболеванием, характеризующимся периодичностью, этапностью течения и разнообразием клинических проявлений. Существует несколько путей заражения сифилисом, из которых наиболее распространенным является половой. 1.1. Эпидемиологическая ситуация по сифилису в Кыргызстане Все ключевые индикаторы показывают устойчивое снижение заболеваемости сифилиса начиная с 1998г. Ведущие национальные эксперты убеждены, что эти цифры не отражают реальной ситуации на основании того, что не все выявленные случаи сифилиса регистрируются в связи с несовершенной системой регистрации и отчетности. Основные эпидемиологические данные по сифилису приведены ниже в виде диаграмм. Уровень заболеваемости сифилисом в Кыргызстане 7 Уровень заболеваемости врожденным сифилисом Уровень заболеваемости нейросифилисом в Кыргызстане 1.2 Целевая группа, подлежащая обследованию В Кыргызстане проводится обязательное обследование следующих категорий населения: 8 Скрининговое обследование с помощью тестов: РМП или РПР (RPR) 1. Лица, подлежащие периодическим медицинским осмотрам (декретированный контингент). 2. Лица, поступающие в изоляторы временного содержания, приёмники-распределители, находящиеся в исправительно-трудовых, а также других специальных учреждениях. 3. Амбулаторные больные по нижеследующим показаниям: − клинические проявления, характерные для сифилитической инфекции; − стоматиты, различные высыпания в ротовой полости, не сопровождающиеся болями и повышением температуры; − воспалительные заболевания ЛОР-органов: катаральная ангина, фарингиты, ларингиты, без температурной реакции и болей; − лимфадениты неясной этиологии; − неврологические симптомы неясной этиологии: прогрессирующее слабоумие, афазия, ухудшение зрения, слуха в возрасте до 55 лет; − поражение сердца, аорты, почек, печени неясной этиологии; − проктиты, парапроктиты, трещины, кондиломы заднего прохода, геморрой. 4. Работники коммерческого секса. В каждом случае положительного ответа для подтверждения необходимо проводить трепонемные тесты Обследование с помощью комплекса серологических реакций: РМП или РПР (RPR) в сочетании с ИФА или РИФ, или РПГА (любая реакция на выбор) в зависимости от возможностей диагностических лабораторий: 1. Доноры крови, спермы, других биологических жидкостей и тканей; 2. Лица от 16 до 60 лет, поступающие в соматические стационары; 3. По эпидемиологическим показаниям: лица, имевшие половые, тесные бытовые контакты с больными сифилисом в течение последних 3 месяцев; 4. Больные ИППП при взятии на учёт и через 3 месяца согласно клиническим протоколам; 5. Женщины в первой и во второй половине беременности, а также направляемые на искусственное прерывание беременности; 6. Дети, родившиеся от матерей, больных сифилисом, а также имеющие положительные результаты серореакций пуповинной крови на сифилис при рождении, далее по показаниям (через 10 дней после рождения); 7. Наркоманы с внутривенным введением наркотиков; 8. Лица, направляемые следственными органами на судебно-медицинскую экспертизу; 9. Граждане, выезжающие в страны, по требованию которых необходим сертификат о прохождении освидетельствования на сифилис. Для диагностики сифилиса рекомендуется нижеследующий перечень лабораторных исследований в зависимости от уровня здравоохранения РЦДВ Городские, Отдалённые Областные ЦСМ ОМЦДВ районные ЦСМ ГСВ и ФАПы РМП или РПР, РПГА, РМП или РПР, РПГА, РИФ, ИФА, микроскопия РИФ, ИФА, микроскопия РМП или РПР, нативного препарата на нативного препарата на РПР. РПГА, ИФА. бледную трепонему в бледную трепонему в тёмном поле тёмном поле 9 2. Классификация и клиническая сифилитической инфекции характеристика Сифилис (syphilis) – это хроническое, инфекционное заболевание, характеризующееся волнообразным течением, поражающее кожу, слизистые оболочки, внутренние органы, кости и нервную систему, передающееся преимущественно половым путем. 2.1 Классификация сифилиса Таблица 1. Классификация сифилиса (МКБ-Х) А 50. Врожденный сифилис А 51. Ранний сифилис 52. Поздний сифилис А 53. Другие и неуточненные формы сифилиса А 50.0. Ранний врожденный сифилис с симптомами. А 50.1. Ранний врожденный сифилис скрытый. А 50.2. Ранний врожденный сифилис неуточненный. А 50.3. Позднее врожденное сифилитическое поражение глаз. А 50.4. Поздний рожденный нейросифилис (ювенильный нейросифилис). А 50.5. Другие формы позднего врожденного сифилиса с симптомами. А 50.6. Поздний врожденный сифилис скрытый. А 50.7. Поздний врожденный сифилис неуточненный. А 51.0. Первичный сифилис половых органов. А 51.1. Первичный сифилис анальной области. А 51.2. Первичный сифилис других локализаций. А 51.3. Вторичный сифилис кожи и слизистых оболочек. А 51.4. Другие формы вторичного сифилиса. А 51.5. Ранний сифилис скрытый. А 51.9. Ранний сифилис неуточненный. А.52.1. Сифилис сердечно-сосудистой системы. А 52.2. Нейросифилис с симптомами. А 52.3. Асимптомный нейросифилис. А 52.7. Другие симптомы позднего сифилиса. А 52.8. Поздний сифилис скрытый. А 52.9. Поздний сифилис неуточненный. А 53.0. Скрытый сифилис, неуточненный как ранний или поздний. А 53.9. Сифилис неуточненный. 2.2. Клиническая характеристика приобретенного сифилиса Первичный сифилис Инкубационный период сифилиса длится от 9 до 180 дней. Первичная стадия сифилиса характеризуется появлением пятна в месте проникновения бледной трепонемы. Затем поражение быстро преобразуется в папулу, которая при определённых условиях в последующем эрозируется и изъязвляется. Первичная сифилома (первичный шанкр) - чаще единичная эрозия или язва, безболезненная, без признаков воспаления вокруг, сравнительно плохо васкуляризирована, имеет в основании хрящевидной плотности инфильтрат с четкой границей. Первичная сифилома часто сопровождается умеренным увеличением регионарных лимфатических узлов, в случае локализации первичного шанкра в области наружных половых органов наблюдается 10 билатеральное, ограниченное увеличение паховых лимфатических узлов умеренной плотности (паховая лимфоаденопатия). Наиболее частые локализации первичного шанкра – венечная борозда, вульва, влагалище, • шейка матки, прямая кишка, язык и губы; • Первичный шанкр может остаться незамеченным при локализации в прямой кишке и шейке матки; Первичный шанкр может иметь нетипичные клинические проявления вследствие • осложнения вторичной инфекцией; • Первичный шанкр спонтанно регрессирует в течение 3-8 недель без лечения, обычно не образуя рубца; • У многих пациентов в конце первичного периода развиваются явления полиаденита. Вторичный сифилис Вторичный сифилис является наиболее заразной стадией болезни и характеризуется наличием разнообразных высыпаний на коже и слизистых оболочках: • Распространенные высыпания появляются на коже и слизистых: розеолезный, папулезный, везикулезный, пустулезный варианты сифилидов. Сыпь обычно равномерно распространена по всему телу, включая ладони и подошвы; • • Сыпь обычно появляется после разрешения первичного шанкра; • На участках тела с повышенной влажностью (например, в паховой и перианальной областях) высыпания могут образовывать плоские, вегетирующие на поверхности высыпания, называемые широкими кондиломами; • В некоторых случаях на слизистых оболочках могут появиться папулезные высыпания с мацерированной, молочно-белой, «опалесцирующей» поверхностью. Эти «слизистые бляшки» могут сливаться, образуя серпигинозные по форме высыпания; • Элементы сыпи высоко заразны, любой физический контакт – сексуальный или несексуальный – с поврежденной кожей или слизистыми оболочками больного может приводить к заражению; • Сыпь обычно проходит без лечения через несколько недель или месяцев; • Кроме высыпаний может отмечаться выпадение волос (очаговое или диффузное), нарушение пигментации (лейкодерма). При вторичном сифилисе могут наблюдаться и другие симптомы: повышение температуры, утомляемость, головная боль и увеличение всех групп лимфатических узлов. Эти симптомы могут быть очень слабо выраженными и, подобно первичной сифиломе при первичном сифилисе, исчезают без лечения. При вторичном сифилисе могут наблюдаться признаки поражения внутренних органов и нервной системы. Скрытый сифилис При неполноценном лечении заболевания или отсутствия его, а также в зависимости от иммунной системы организма, сифилис переходит в скрытую стадию. На данной стадии пациент может оставаться потенциально заразным, так как в крови циркулирует большое количество трепонем. Через 2 года число трепонем в организме снижается и пациент вступает в следующую стадию сифилиса, известную как поздний скрытый сифилис. Выделение этих стадий имеет большое значение для диагностики и лечения сифилиса. Тем не менее, необходимо иметь в виду, что часто невозможно определить точную продолжительность заболевания и, если есть сомнения относительно точного времени появления первичного аффекта, то пациент должен рассматриваться как больной с поздним скрытым сифилисом. 11 Третичный сифилис При длительном течении заболевания и неполноценном лечении пациента или отсутствия лечения заболевание может перейти в третичную стадию сифилиса. При этом может наблюдаться поражение кожи и слизистых, морфологической основой которого является гранулематозное воспаление, а клинические проявления характеризуются бугорковыми и гуммозными высыпаниями. Помимо кожи и слизистых, может поражаться сердце, печень, нервная система, опорно-двигательный аппарат, что приводит к психическому растройству, слепоте, неврологическим проблемам, болезням сердца и смерти. Нейросифилис может протекать как бессимптомно, так проявляться в форме менинговаскулярного сифилиса, спинной сухотки или прогрессирующего паралича. Кардиоваскулярный сифилис - в виде мезаортита, который нередко протекает бессимптомно и может осложняться стенозом устьев коронарных артерий, недостаточностью аортального клапана, аневризмой аорты. Третичный сифилис диагностируется на основании совокупности клинических признаков и результатов серологических реакций. Сифилис у беременных При нелеченном сифилисе у беременных инфекция может передаваться плоду: в 25% случаев беременность заканчивается мертворождением или гибелью новорожденного; в 40-70% случаев рождаются дети с врожденным сифилисом, который может протекать с симптомами или бессимптомно. При постановке беременной на учет должно быть проведено скрининговое обследование на сифилис, которое проводят в 11-12 недель беременности и 30-32 недели беременности. Если женщина не состояла на учете по беременности, обследование на сифилис проводят во время родов. Новорожденные не выписываются из родильного дома, пока не получен результат анализа на сифилис, особенно, если во время антенатального наблюдения серологический статус матери был сомнительным. Врожденный сифилис Врожденный сифилис возникает в результате инфицирования плода во время беременности трансплацентарным путем от больной сифилисом матери. Обычно внутриутробное заражение плода происходит на 4–5 месяце беременности. Бледные трепонемы проникают в организм плода тремя путями: • через пупочную вену • лимфатические щели пуповины • через поврежденную плаценту. Беременность может закончиться мертворождением, либо рождением живого ребенка с проявлениями заболевания, возникающими сразу после родов или несколько позднее. Как и приобретенная инфекция, врожденный сифилис подразделяется на ранний и поздний. Некоторые дети с ранним врожденным сифилисом могут иметь клинические проявления заболевания при рождении, но у большинства они развиваются в сроки от двух недель до трех месяцев после рождения. У некоторых новорожденных возможно скрытое течение инфекции. Клинические проявления при раннем врожденном сифилисе: кожа морщинистая, серожелтой окраски со специфическими высыпаниями, в том числе характерными только для врожденного сифилиса (сифилитическая пузырчатка, диффузные папулезные инфильтрации). К другим проявлениям раннего врожденного сифилиса относятся сифилитический остеохондрит Вегенера, лихорадка, увеличение печени и селезенки, анемия и различные 12 пороки развития. В дальнейшем (после 2 лет) могут развиться симптомы позднего врожденного сифилиса, включающие повреждение костей, зубов, глаз, органа слуха и мозга. К признакам, патогномоничным для позднего врожденного сифилиса, относят триаду Гетчинсона: паренхиматозный кератит, специфический лабиринтит (лабиринтную глухоту) и зубы Гетчинсона. 3. Лабораторная диагностика сифилиса Таблица 2. Лабораторные критерии диагностики сифилиса Диагноз Используемые методы* Возможно использование двух видов серологических тестов: Положительный нетрепонемный тест (например, RPR, РМП, VDRL) (IV, C), подтвержденный трепонемным тестом (TPHA, TP-PA, ИФА, РИФ-абс). (III, B). Выявление T. pallidum в клиническом образце при использовании Окончательный темнопольной микроскопии (III, B)(22), ПИФ-TP, а также валидированных МАНК (IIb, B) или эквивалентных им методов. * ПИФ-TP, прямая иммунофлюоресценция с антителами к Treponema pallidum; МАНК, методы амплификации нуклеиновых кислот; RPR, rapid plasma reagin test (тест на быстрые плазменные реагины); РМП, реакция микропреципитации; VDRL, Venereal Disease Research Laboratory test; TPHA, T. pallidum haemagglutination assay (реакция гемагглютинации); TP-PA, T. pallidum passive particle agglutination assay (реакция пассивной гемагглютинации); ИФА, иммуноферментный анализ; РИФ-абс, реакция иммунофлюоресценции. Предварительный ПЕРЕЧЕНЬ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА СИФИЛИС В КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ: Реакцию Вассермана и реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) стало возможным заменить на более современные и менее трудоёмкие реакции на сифилис • • • • • Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП). Тест определения быстрых плазменных реагинов (РПР (RPR)). Иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ-абс, РИФ-200. 4. Взятие и транспортировка клинического материала 4.1. Для прямых методов определения трепонем Взятие клинического материала Материалом для темнопольной микроскопии или ПИФ является серозное отделяемое с поверхности эрозии, язвы, мацерированной или экскориированной, эрозированной папулы или бляшки. Взятие материала должно проводиться после тщательной и осторожной, нетравмирующей очистки поверхности клинических проявлений с помощью марлевого тампона, смоченного физиологическим раствором. Очистка проводится с целью механического удаления трепонем – комменсалов и другой флоры, которая может затруднить исследование. Важно не травмировать поверхность и не получить кровотечения. Наличие в препарате лейкоцитов или клеточного 13 детрита, эритроцитов значительно усложняет исследование. Для получения тканевой жидкости существует несколько методов: − Метод раздражения. Исследуемый объект (твердый шанкр, мокнущая папула, широкая кондилома и т.д.) тщательно очищают ваткой или тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором. Стерильной ложкой Фолькмана или петлей производят осторожные, чтобы не вызвать кровотечения, поглаживающие движения по поверхности элемента. Через некоторое время поверхность становится блестящей в результате просачивания тканевой жидкости. Она прозрачная или слегка опалесцирует. В случае появления кровотечения его следует остановить, прижав ватный тампон к поверхности элемента, после чего продолжать поглаживания. Небольшая примесь крови к серуму допустима. − Метод сдавливания. После очистки эрозию или язву сдавливают с боков пальцами в перчатках или пинцетом, при этом стимулируется выделение серозного экссудата, который забирается с поверхности бактериологической петлей или путем аккуратного прикладывания к поверхности эрозии/язвы покровного стекла. Полученное серозное отделяемое смешивается на предметном стекле с равным количеством физиологического раствора, накрывается покровным стеклом и полученный нативный препарат исследуют под микроскопом. − Метод скарификации. К нему прибегают при исследовании сухих элементов (розеолы, лентикулярных папул, эпителизированных эрозий). Поверхность исследуемого элемента скарифицируют, при этом неизбежно появляется капиллярное кровотечение, которое останавливают, и методом раздражения скарифицированной поверхности получают серозную жидкость. Этот метод по эффективности значительно уступает предыдущим. Исследование может дать ложноотрицательный результат вследствие применения пациентом местных антисептиков, антибиотиков или при присоединении вторичной инфекции. В этом случае назначают примочки с физиологическим раствором, после чего (на следующие сутки) исследование повторяют. В некоторых случаях материал для микроскопической диагностики берут из увеличенного регионарного лимфатического узла, чаще пахового. Пункция лимфатического узла Пунктируется плотный, подвижный лимфатический узел без признаков воспаления. Место прокола обрабатывают йодом, узел фиксируют двумя пальцами левой руки, а правой вкалывают в узел иглу, соединенную с шприцем, в котором находится небольшое количество стерильного физиологического раствора. Прокол производят у одного из полюсов железы и проталкивают иглу по направлению длинной оси до противоположного полюса, при этом выпуская содержащийся в шприце физиологический раствор. Затем иглу медленно выводят из узла, одновременно оттягивая поршень из шприца. Правильность производства пункции подтверждается наличием в пунктате лимфоцитов. 4.2. Стандартные условия взятия, транспортировки, хранения и приема сыворотки крови для серологических исследований - Кровь должна быть взята натощак или не ранее 6 часов после приема пищи. - Кровь должна быть взята в положении сидя или лёжа. - Кровь должна быть взята в период физического покоя. - Необходимо учитывать все значимые лечебные процедуры у обследуемого пациента. - Необходимый объем крови составляет 5 мл. - Во избежание гемолиза кровь выпускается по стенке пробирки без излишнего напора. - Сыворотка крови может оставаться на сгустке не более 48 часов после взятия крови, поэтому должна быть доставлена в лабораторию не позже 48 часов после взятия. - Исследование гемолизированной, хилёзной сыворотки крови не проводится (!). 14 Внимание! Не оборачивать бумагой пробирки с биоматериалом (например, направлением на анализ), а также не опускать бумагу в пробирку, т.к. высока вероятность его контаминации при транспортировке. Не использовать ватно-марлевые пробки. Пробирки с кровью ничем не закупориваются и осторожно транспортируются в лабораторию в специальном закрытом контейнере при комнатной температуре. Маркировка образца - Стандартно маркировать пробирку. - Делать надписи на пробирке или другой ёмкости несмывающимся карандашом по стеклу (маркером) или на горлышко пробирки в форме флажка наклеивать листок бумаги с указанием на нём всей необходимой информации. Форма направления исследуемых образцов в лабораторию. - Необходимо придерживаться стандартных форм направлений. - Основные данные в формах направлений должны совпадать с данными маркировки биоматериала. - Важно предусмотреть, чтобы порядковые номера не повторялись в последующих направлениях. При поступлении в лабораторию свежих, не свернувшихся образцов крови без стабилизатора, пробирки сначала инкубируют в термостате при 37о С в течение 15-20 минут для образования сгустка фибрина, после чего их подвергают центрифугированию в течение 10 минут при скорости вращения ротора 3000 оборотов в минуту. При этом гель, расположенный на дне пробирки, поднимается над сгустком и отделяет его от сыворотки крови, облегчая последующее извлечение сыворотки. После центрифугирования пробирки переставляют в штативы, при этом обращают внимание на пригодность сыворотки крови для полноценного исследования. При невозможности немедленного использования в лаборатории образцы хранятся в холодильнике при 4-8°C. При исследовании образцы крови инкубируют в термостат при 37оС или при комнатной температуре для образования сгустка фибрина, затем помещают в холодильник при 4°С на 30 минут. Далее материал подвергается центрифугированию (см. выше) При необходимости хранения биологического материала в течение более длительных сроков производят замораживание сыворотки при разделении ее на несколько дублирующих аликвот по 0,5-1,0 мл в маркированных пробирках типа Эппендорф. Замораживание при температуре -18...20о С позволяет хранить образцы в течение 1-1,5 месяцев, при низких температурах -65...80о С срок их хранения практически не ограничен. Не допускают оттаивание и повторное замораживание сыворотки крови; при необходимости проведения повторного исследования используют дублирующую пробирку (Эппендорф) с образцом от этого пациента. Оттаивание сыворотки крови для проведения исследования производят при комнатной температуре. Для гомогенизации содержимого пробирки после оттаивания несколько раз тщательно перемешивают перед выполнением исследования. Перед исследованием все свежие образцы сыворотки крови подвергают инактивации при 56о С в течение 30 минут; сыворотки должны инактивироваться в день проведения исследования. При получении плазмы пробирки со стабилизированной кровью в лаборатории отстаивают перед исследованием при комнатной температуре в течение нескольких минут, в экстренных случаях - центрифугируют 7-10 минут при скорости вращения 1000-1500 об/ мин. Для исследования плазму крови набирают с помощью пастеровской пипетки или индивидуального наконечника автоматического пипеточного дозатора. Плазму крови исследуют в день получения. 15 4.3. Стандартные условия взятия, транспортировки, спинномозговой жидкости хранения и приема Свойства спинномозговой жидкости В норме спинномозговая жидкость бесцветна и прозрачна. Изменения цвета и прозрачности при заболеваниях нервной системы всегда обусловлены патологическими примесями в ликворе. Незначительные нарушения прозрачности в виде слабой опалесценции могут быть вызваны повышенным содержанием белковых субстанций, главным образом грубодисперсных, легко выпадающих в осадок фракций. Это изменение прозрачности наступает обычно после стояния жидкости на воздухе. Опалесценция определяется путем сравнения пробирки с ликвором с дистиллированной водой, налитой в пробирку такого же диаметра. Значительное помутнение жидкости обусловливается присутствием эритроцитов, лейкоцитов, большого количества микроорганизмов. Примесь крови может появляться вследствие повреждения при пункции вен эпидурального пространства. Если существуют внешние изменения ликвора при сифилитической инфекции, то следует указать какие именно. Взятие образца Спинномозговая пункция выполняется врачом-неврологом. Показаниями к проведению данного исследования являются случаи: − неврологические симптомы при любой стадии сифилиса, − сифилитическое поражение глаз, сердечно-сосудистой системы, − третичного сифилиса или врожденного сифилиса. Люмбальная пункция должна проводиться: − у всех пациентов с ВИЧ-инфекцией и положительными серологическими реакциями на сифилис, − у всех пациентов с неврологическими симптомами и подозрении на возможную этиологическую роль сифилитической инфекции в разаитии этих симптомов. Спинномозговая жидкость исследуется с использованием: − цитологических методов, − анализа на белок, − серологических реакций (РМП, VDRL или РИФ-абс). Транспортировка и хранение образцов спинномозговой жидкости Пробирки со спинномозговой жидкостью осторожно транспортируются в лабораторию, где они немедленно подвергаются цитологическому исследованию и анализу на белок. Исследования СМЖ с помощью серологических реакций может быть проведено позже, однако, замораживание/оттаивание образца должно быть однократным. 16 5. Прямые методы исследования установления окончательного диагноза) (используемые для Непосредственное выявление возбудителя заболевания – T. pallidum – является абсолютным критерием установления диагноза сифилиса. T. pallidum может быть обнаружена в образцах, полученных из поражений или инфицированных лимфоузлов при раннем сифилисе с помощью следующих методов: • Микроскопия в темном поле микроскопа, • Прямая иммунофлуоресценция, • Методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), например, полимеразная цепная реакция (ПЦР). 5.1. Микроскопия в темном поле Общие положения Исследование на бледную трепонему в темном поле зрения проводится с помощью стандартного микроскопа, снабженного конденсором темного поля. Метод темнопольной микроскопии основан на известном феномене Тиндаля: наблюдение светящихся пылинок в косом луче солнца, проникающем в темную комнату через узкую щель. Необходимые условия создаются путем замены обычного конденсора микроскопа особым конденсором, в котором центральная часть затемнена и проникновение лучей света происходит через узкую щель. Вследствие получающегося при этом бокового освещения достигается отраженное свечение всех твердых частиц, в том числе бледной спирохеты, на темном поле. Для получения темного поля необходим сильный источник света. Показания для проведения микроскопии в темном поле Темнопольная микроскопия может быть использована для диагностики первичного и вторичного сифилиса, раннего врожденного сифилиса и реже третичного сифилиса (если взять материал из глубины инфильтрата). Кроме этого, приготовить препарат для микроскопии можно из пунктата региональных лимфатических узлов, спинномозговой жидкости, амниотической жидкости. Присутствие непатогенных трепонем-комменсалов (T. refringers, T. phagedenis (reiteri) в урогенитальном тракте, T. denticola в полости рта) делает трудным и малодостоверным проведение исследования с материалом, полученным с проявлений на слизистой оболочке полости рта или прямой кишки, так как морфологически эти трепонемы сходны с T. pallidum. При необходимости проведения исследования материала, полученного из этих локализаций, лучше отдать предпочтение методу ПИФ или молекулярно-биологическим методам. Приготовление препаратов материал, полученный из места поражения на коже и слизистой, смешивают с каплей • физиологического раствора на предметном стекле при комнатной температуре, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. • Примечание: Пунктат лимфоузла не разводится. • • • • Микроскопия на верхнюю линзу конденсора поместите каплю дистил. воды для микроскопии, поместите препарат на столик микроскопа, поднимите конденсор, избегая образования пузырьков, таким образом, между конденсором и препаратом создается однородная среда, что препятствует отклонению световых лучей, исследование проводят с сухой системой, объектив 40, окуляр – 10-12. 17 Оценка результата При исследовании в темном поле бледная спирохета выглядит в виде очень нежной подвижной спирали, слабо светящейся серебристым блеском. В препарате все поле зрения усеяно массой мельчайших светящихся точек, находящихся в хаотичном броуновском движении. На темном фоне можно увидеть: • • • • нейтрофильные лейкоциты - в виде округлых, ярко светящихся зернистых образований, лимфоциты - серовато-темные, тускло светящиеся клетки округлой формы, клетки эпителия - круглые или неправильной формы клетки, значительно крупнее лейкоцитов и ярко светящиеся, эритроциты - в виде темных элементов круглой формы, окаймленных светящейся полоской. Размером чуть меньше лейкоцитов. Примечание: Если эритроцитов много, поле становится слишком светлым, трепонемы видны хуже, могут скрываться под эритроцитами. В этом случае материал лучше взять повторно. Требуется определенный опыт для распознавания в препарате T. pallidum, которая выглядит как очень тонкая спираль, длиной 6-20 мкм и толщиной 0,13-0,15 мкм, с равномерными завитками (примерно 10-13) глубиной до 0,5-0,7 мкм и может быть легко перепутана с микроорганизмами-комменсалами. T. pallidum выполняет различные виды движений, среди которых можно выделить характерные для патогенной трепонемы движения: сгибательные, чаще всего посередине, и маятникообразные. Морфологические характеристики и наличие движений, характерных для T. pallidum, являются диагностическими признаками T. pallidum. Примечание: Если после однократного исследования трепонемы не выявлены, поражения следует промыть физиологическим раствором и затем провести повторное исследование. Однако даже многократный отрицательный результат исследования на бледную трепонему не может исключить сифилис. В подобных случаях необходимо провести серологическое обследование на сифилис. Контроль качества Перед началом работы проверяется настройка темного поля: капля физиологического раствора смешивается с соскобом зубного налета здорового человека, потенциально содержащим непатогенные трепонемы. Материал просматривается в темном поле, окуляр х10, объектив х40. При хорошей настройке темного поля в проходящем свете на темном фоне хорошо видны мелкие частицы, находящиеся в броуновском движении, а также непатогенные трепонемы. 5.2. Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) Общие положения Иммунолюминесцентные методы диагностики используются для выявления антигенов хламидий, вируса простого герпеса 1 и 2 типа, аденовирусов, T. pallidum и некоторых других. Метод прямой иммунофлюоресценции предусматривает прямое выявление T. pallidum в образце при обработке материала специфическими моноклональными антителами. 18 Преимуществом метода перед темнопольной микроскопией для выявления T.pallidum является то, что при этом возможна дифференцировка патогенных трепонем от непатогенных при исследовании материала со слизистых полости рта и прямой кишки, фиксация препаратов перед транспортировкой в лабораторию. Может быть использован материал, полученный при биопсии или аутопсии. Взятие материала (см. микроскопию в темном поле) Материалы При постановке теста применяются те же расходные материалы, что и для темнопольной микроскопии. Дополнительно используются: ацетон или метанол, как фиксаторы, • • моноклональные антитела к патогенной бледной трепонеме, соединенные с FITC, • люминесцентный микроскоп, • монтирующая жидкость для препаратов. Процедура исследования • • • • • Материал фиксируется метанолом или охлажденным ацетоном в течение 5-10 минут, до окраски препарат может храниться при -20° С в течение 1 месяца, на прогретый до комнатной температуры препарат наносят 30 мкл растворенных моноклональных антител и помещают его во влажную камеру на 15 минут при температуре 20-25°С, после окрашивания препарат промывается фосфатным буфером в течение 10 секунд и высушивается на воздухе, одна капля монтирующей жидкости наносится на препарат и накрывается покровным стеклом. Препарат готов для микроскопирования. Оценка результата Препараты исследуют с использованием люминесцентного микроскопа при увеличении х200, х400 и х1000. При этом клетки окрашиваются в красно-оранжевый или желтый цвет, бледная трепонема флюоресцирует ярко-зеленым цветом, сохраняя все морфологические признаки спирохеты. Контроль качества В качестве контроля применяются «положительные» образцы, заведомо содержащие патогенную бледную трепонему, например, образцы взвеси бледных трепонем из яичка зараженного кролика. Примечание: Данный метод пока широко не используется ввиду отсутствия промышленного производства и сертификации соответствующих ингредиентов, в частности, моноклональных антител к патогенной бледной трепонеме, меченных FITC. 19 5.3. Методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) Общие положения Методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют обнаружить единственную молекулу ДНК возбудителя среди миллионов других молекул. В настоящее время не существует коммерческих тестов для выявления ДНК T. pallidum. Все in-house тесты должны быть валидированы с использованием не менее 10 положительных образцов, полученных от серопозитивных пациентов с поражениями, в которых наличие трепонем подтверждено методом темнопольной микроскопии, а также 10 отрицательных образцов, полученных от серонегативных пациентов. Материал для исследования В качестве объекта исследования методом ПЦР могут быть использованы: соскобы шанкров и других высыпаний (папул, широких кондилом и т.д.), спинномозговая, амниотическая жидкость, сыворотка крови. Контроль качества В каждой реакции должны использоваться как отрицательный, так и положительный контроли. В качестве положительного контроля может использоваться суспензия трепонем, полученная из яичек инфицированного кролика и разведенная до концентрации приблизительно 100 трепонем в мл, тогда как препарат из яичек неинфицированного кролика может использоваться в качестве отрицательного контроля. Примечание: ПЦР может быть хорошим методом для диагностики сифилиса при небольшом количестве трепонем в исследуемом материале. Хотя он высоко специфичен, чувствителен и воспроизводим при правильном проведении и подготовке образцов, применительно к диагностике сифилиса метод МАНК пока используется в исследовательских целях. Иногда используются другие, неамплификационные, молекулярные методы, такие как гибридизация нуклеиновых кислот или дот-гибридизация, однако, они менее чувствительны, чем амплификационные тесты, и применение этих методов ограничено научно-исследовательскими работами. 6. Непрямые методы исследования (используемые установления предварительного диагноза) для Общие положения Динамика специфического антителообразования при нелеченном сифилисе. Первым проявлением гуморальной иммунной реакции организма на внедрение бледной трепонемы является продукция иммуноглобулинов класса М с константой седиментации 19S. Установлено, что уже через 10–14 дней после инфицирования в крови пациента появляются IgM-антитела (АТ), направленные против основных видоспецифических белковых антигенов T. pallidum и неулавливаемые неспецифическими реакциями. Наличие трепонемоспецифических IgMантител позволяет диагностировать приобретенный сифилис в наиболее ранние сроки – иногда даже в инкубационном периоде. Несколько позже начинают вырабатываться IgМ-антитела против группо- и типоспецифических белковых детерминант, а при первичном сифилисе – против липидных антигенов (АГ) трепонемы. 20 С конца 4-й недели после заражения можно зафиксировать появление специфических IgG-антител с константой седиментации 7S, которым принадлежит основная роль в осуществлении защитной реакции организма. Количественный пик IgM при нелеченном приобретенном сифилисе приходится на 6–8-ю неделю заболевания – период массовой гематогенной диссеминации бледных трепонем и максимальной выраженности клинических проявлений. В течение последующих 6 месяцев количество IgМ-антител снижается, но они могут сохраняться в низких титрах в сыворотках нелеченных больных в течение нескольких лет и даже десятилетий. Иной представляется динамика IgG-АТ. Их количество постепенно увеличивается, достигая максимума через 1–2 года после заражения, а затем, медленно снижаясь, остается на довольно высоком уровне годы и десятки лет. Динамика специфического антителообразования после лечения сифилиса Критерием эффективности лечения раннего сифилиса в настоящее время является постепенное снижение уровня антител, определяемых в нетрепонемных серологических реакциях (в России - это реакция микропреципитации (РМП) с кардиолипиновым антигеном (КА), за рубежом – VDRL и тест быстрых плазменных реагинов (RPR)). Показателем успешности проведенного лечения раннего сифилиса является четырехкратное снижение титров антител РМП в течение года после проведенного лечения. Стойкое сохранение положительных результатов РМП без тенденции к снижению титров антител в течение 12 месяцев после окончания специфической терапии по поводу ранних форм сифилиса является основанием для повторного лечения. В противоположность этому, положительные серологические реакции в низком титре могут регистрироваться у пациентов после перенесенного позднего сифилиса длительное время. Примечание: В связи с тем, что IgM первыми появляются в ответ на внедрение в организм T. Pallidum, обнаружение этих антител у новорожденных является признаком врожденного сифилиса. В некоторых странах Восточной Европы определение IgM является признаком текущей инфекции и, в частности, используется для диагностики врожденного сифилиса. Тем не менее, тесты, применяемые для определения этого класса антител, часто имеют невысокую специфичность вследствие неспецифического присоединения большой молекулы к антигенам. В дополнение к этому, конкуренция между трепонемоспецифическими IgMи IgG-антителами за сайты связывания с имммунодетерминантами бледной трепонемы может приводить к ложноотрицательным результатам. Тем не менее, рекомендовано использовать 19S-IgM-FTA, если есть возможность выявить IgM-антитела. К сожалению, реактивы, необходимые для разделения сыворотки, доступны не во всех странах. Результаты других тестов, направленных на определение IgM-антител, должны оцениваться с осторожностью. После полноценной антибиотикотерапии специфические антитрепонемные антитела сохраняются в сыворотке больных многие годы и десятки лет, что не является свидетельством неэффективности лечения. Показателями успешности терапии сифилиса можно считать возвращение к серонегативному статусу или снижение минимум в четыре раза титров антител в РМП, RPR или VDRL в течение года после проведенного лечения. В соответствии с рекомендациями ВОЗ показателями неэффективности проведенной специфической терапии являются: • сохранение или рецидив клинических проявлений сифилиса, • устойчивое повышение в 4 раза и более по сравнению с исходными значениями титра неспецифических серологических реакций (РМП, RPR или VDRL). 21 6.1. Нетрепонемные тесты Общие положения В качестве антигена в нетрепонемных тестах применяется смесь кардиолипина, лецитина и холестерина. Эти тесты используются для скрининга большого количества людей, оценки эффективности терапии, а также для подтверждения диагноза реинфекции. В основном, эти тесты основаны на флоккуляции (продукт реакции выпадает в виде хлопьев). В данных тестах обнаруживаются IgG и IgM антитела к липидам клеточной стенки бледной трепонемы, которые появляются в крови примерно через 1 неделю после формирования твердого шанкра. Достоинствами нетрепонемных тестов является низкая стоимость, техническая простота и скорость получения результата исследования. Возможность постановки реакции в количественном варианте с определением титра антител позволяет использовать их в случае реинфекции/рецидива и для оценки эффективности терапии. Ограничением их применения является довольно низкая чувствительность и наличие ложноположительных результатов при скрининге популяций с низкой распространенностью заболевания. Характеристики наиболее часто применяемых нетрепонемных реакций: реакция микропреципитации (РМП), тест быстрых плазменных реагинов (RPR), тест VDRL представлены в таблице 3. Кроме того, разработаны и используются и другие нетрепонемные тесты, такие как TRUST, RST . Поздний Ранний скрытый Вторичный Первичый Тип реакции* Чувствительность (%) при разных стадиях заболевания сифилиса Специфичность (%) Таблица 3. Чувствительность и специфичность нетрепонемных методов серологической диагностики сифилиса Нетрепонемные: РМП 81(70-90) 91 94 (88-100) 70 (57-80) 98 (93-99) VDRL 78(59-87) 100 95 (88-100) 71 (37-94) 98 (96-99) RPR 86(77-100) 100 98 (95-100) 73 (57-85) 98 (93-99) TRUST 85 (77-86) 100 98 (95-100) - 99 (98-99) * РМП, реакция микропреципитации; VDRL, Venereal Disease Research Laboratory test; RPR, rapid plasma reagin test; TRUST, toluidine red unheated serum test. РМП является модификацией VDRL и применяется в большинстве стран Содружества Независимых Государств (СНГ). В практике РМП применяется как замена RPR теста. 22 Реакция микропреципитации (РМП) Качественный вариант РМП Общие положения • • • • • Для исследования используют плазму или инактивированную сыворотку. При добавлении к плазме, сыворотке крови или ликвору больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена (холестерин - кардиолипин - лецитинового комплекса) происходит агглютинация и образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета. Коммерческие наборы для РМП включают спиртовой раствор кардиолипинового антигена (холестерин - 0,98%, кардиолипин - 0,03%, лецитин – 0,27% в чистом этиловом спирте). РМП выполняют в лунках с округлым дном иммунологического планшета для макротитрования или в лунках с плоским полированным дном планшетов, изготовленных из органического стекла (плексигласа) толщиной 0,8-1,0 см. В маркированные лунки планшета вносят образцы исследуемой сыворотки или плазмы крови и суспензию антигена. Реакция протекает при постоянном перемешивании реакционной среды: при покачивании планшета вручную или на платформе шейкера (орбитального ротатора). При отсутствии антител в исследуемом образце внешний вид реакционной среды не изменяется: она остается опалесцирующей. Подготовка к проведению исследования: • • • • • • В начале рабочего дня или в дни, предшествующие исследованию, готовят рабочую эмульсию (суспензию) кардиолипинового антигена. При этом обращают внимание на прозрачность ампулированного раствора кардиолипинового антигена. При образовании осадка в виде кристаллов холестерина их растворяют нагреванием до 37о С в термостате. В бактериологическую пробирку вносят 2 мл свежеприготовленного физиологического раствора, затем сухой пипеткой добавляют равное количество спиртового раствора кардиолипинового антигена для РМП, быстро и тщательно перемешивают содержимое пробирки. При смешивании раствор становится непрозрачным, образуются хлопья белого цвета. Для формирования более однородных мелких хлопьев рекомендуют вносить антиген не по стенке пробирки, а непосредственно в объем физиологического раствора. Пробирку с антигеном оставляют при комнатной температуре «для созревания» в течение 30 минут, после чего подвергают центрифугированию при 15000 g в течение 10-15 минут до получения прозрачной надосадочной жидкости, которую удаляют из пробирки. К полученному осадку прибавляют 7,0 мл 10% раствора холина-хлорида. 10% раствор холина-хлорида получают из 70% концентрата путем разведения 6 объемами свежеприготовленного раствора хлорида натрия изотонического 0,9%; раствор 10% холинхлорида хранят в укупоренной таре в бытовом холодильнике при температуре 4о С и используют по мере необходимости до истечения срока годности. Производят испытание диагностических свойств приготовленной эмульсии с контрольными материалами, содержащими и не содержащими преципитирующие антитела. На пробирке с готовым к применению реагентом маркером отмечают наименование диагностикума «эмульсия кардиолипинового антигена для РМП», серию и дату приготовления. Для приготовления большего количества эмульсии рекомендуется готовить ее не в одной пробирке или большом флаконе, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл антигена. Такая методика позволяет достичь оптимальных условий перемешивания и ресуспендирования антигена, предохраняет рабочую эмульсию от загрязнения при 23 • • повторном взятии для последующих исследований, хотя и требует дополнительных усилий по определению качества (диагностических свойств) каждой отдельной порции полученного диагностикума. Приготовленную эмульсию хранят в защищенных от света условиях (например, обернув пробирки черной бумагой) в бытовом холодильнике при 4о С не более 1 недели. В день постановки необходимое количество пробирок с диагностикумом извлекают из холодильника и дают прогреться до комнатной температуры в течение 30 минут. Содержимого одной пробирки рабочей эмульсии кардиолипинового антигена (~ 7,0 мл) достаточно для качественной методики исследования в РМП от 130 до 140 образцов крови; количество исследований напрямую зависит от объемов сыворотки и антигена, применяемых для проведения реакции, от диаметра пипеточного диспенсора для раскапывания антигена. Примечание: Комплектация РМП-теста не предусматривает готовую эмульсию кардиолипинового антигена и контрольные сыворотки, так как данный тест предназначен для специализированных серологических лабораторий с наличием свежих контрольных сывороток крови. Процедура исследования: • • • • • • • Пипеточным дозатором набирают небольшое количество сыворотки или плазмы крови из пробирки и переносят по 3 капли в соответствующую лунку планшета; остаток сыворотки возвращают в исходную пробирку, при этом для каждого образца используют индивидуальный наконечник; индивидуальный наконечник после использования сбрасывают в емкость с дезинфицирующим раствором; по окончании внесения в лунки планшета всех образцов биологического материала, контрольных материалов экспертной панели и необходимых контролей во все лунки добавляют по одной капле хорошо ресуспензированной рабочей эмульсии кардиолипинового антигена; планшет помещают на платформу горизонтального шейкера для постоянного перемешивания содержимого лунок на 8-10 минут; через 10 минут во все лунки планшета вносят по 3 капли физиологического раствора и плавными покачивающими движениями планшета достигают равномерного перемешивания реакционной среды, не допуская переливания содержимого в соседние лунки. Перемешивание содержимого лунок можно получать и при размещении планшета в течение 1-1,5 минут на платформе орбитального шейкера; затем планшет оставляют на 3-5 минут в спокойном состоянии, после чего приступают к учету результатов реакции. Оценка результатов О наличии в образце биологического материала антител-преципитинов свидетельствует образование хлопьев преципитата различной величины, одновременно происходит просветление реакционной среды. Величина частиц преципитата, оцениваемая визуально, является мерой полуколичественного учета содержания антител и может быть выражена в условных единицах - от 1 до 4 плюсов. При максимальной выраженности ответа - «4+» дальнейшую полуколичественную оценку содержания антител проводят путем тестирования последовательных разведений исследуемого образца патологического материала (титрование). 24 Учет проводят при боковом освещении планшета. Планшет держат в руках и слегка покачивают; для более четкой регистрации под планшетом размещают лист черной бумаги и применяют лупу двукратного увеличения. Таблица 4. Оценка результатов реакции микропреципитации Результат Описание Крупные хлопья преципитата белого цвета распределяются Резко положительный равномерно по всему объему лунки, либо имеют тенденцию результат (4+) к расположению по периферической части лунки, при этом реакционная среда практически полностью прозрачная. Положительный результат (3+) Хлопья средней величины распределены по всему объему лунки, реакционная среда имеет белесоватый оттенок. Слабоположительный Мелкие хлопья преципитата распределены по объему лунки, результат (2+ и 1+) реакционная среда имеет белесоватый оттенок. Сомнительный результат (±) Наличие очень мелких хлопьев, сомнение в наличии преципитата; при покачивании планшета частицы антигена демонстрируют перламутровые переливы реакционной среды. При получении подобного результата рекомендуют повторное исследование данного образца биологического материала в цельном виде и в разведениях (для исключения феномена зоны) и нового образца (парные сыворотки), полученного через 7-10 дней для контроля динамики процесса. Отрицательный результат Преципитата нет, реакционная среда непрозрачная, при покачивании планшета частицы кардиолипинового антигена перемещаются, формируя перламутровые переливы белого цвета в центре лунки. Внутренний контроль • • • • Учет результатов исследования в аналитической серии начинают с оценки результатов с положительным, слабоположительным и отрицательным контролями. Получение ожидаемой картины: образование преципитата с положительным и слабоположительным контролями и отсутствие его с отрицательным контролем, свидетельствует о правильном проведении процедуры исследования. При неадекватных результатах исследования контролей: отсутствии преципитата в лунках с положительным и слабоположительным контролями или получении положительного ответа с отрицательным контролем, - результаты всего исследования регистрации не подлежат. В длинных аналитических сериях с целью определения сходимости результатов исследования рекомендуют повторять исследование контрольных сывороток через каждые 100 образцов. 25 Полуколичественная РМП Общие положения Все образцы биологического материала, показавшие при скрининге положительные результаты, необходимо исследовать в полуколичественном варианте РМП. Титрование рекомендуется провести и с теми сыворотками, которые показали неопределенный результат или даже отрицательный результат, если результаты исследования в РМП расходятся с результатами исследования с применением других параллельно проводимых в лаборатории медицинских технологий или по прямому указанию лечащего врача. Количественное исследование антител применяют для последующей ретроспективной оценки динамики патологического процесса, установлению эффективности проведенного специфического лечения. Серологическая диагностика у каждого отдельного пациента должна проводиться с использованием одного и того же метода и, желательно, в одной и той же лаборатории, так как количественные результаты двух разных тестов не могут сравниваться напрямую, например, титры RPR, как правило, немного выше титров VDRL. Процедура исследования • • • • • в лунках планшета проводят серию последовательных двукратных разведений каждого образца биологического материала. Подготовку реагентов проводят по стандартной методике, дав им прогреться до комнатной температуры (приблизительно 30 мин), в лунки планшета вносят по 3 капли (90 мкл) свежеприготовленного физиологического раствора хлорида натрия, в первую и вторую лунки ряда вносят по 3 капли (90 мкл) исследуемого образца биологического материала. Многократным пипетированием во второй лунке перемешивают содержимое и переносят 3 капли (90 мкл) полученного разведения (1:2) в третью лунку, данную операцию повторяют во всех лунках ряда, по окончании разведения из последней лунки избыток материала 3 капли (90 мкл) удаляют; таким образом, получают серию разведений: от цельного биологического материала к 1:2, 1:4, ... и до 1:128 (8 разведений) или 1:512 (10 разведений), Во все лунки каждого ряда добавляют по одной капле (30 мкл) хорошо ресуспензированной эмульсии кардиолипинового антигена, помещают планшет для постоянного перемешивания на горизонтальную площадку орбитального шейкера на 5-8 минут. По окончании процедуры во все лунки вносят по 3 капли (90 мкл) физиологического раствора и через 5 минут учитывают результаты исследования. Оценка результатов Учет производят по стандартной методике. При этом титром антител считают последнее разведение, где обнаружен преципитат. • • • • • Источники ошибок при постановке РМП исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабоположительных, неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием, бактериальное загрязнение эмульсии, нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсии, растворов, использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, планшет, растворов. 26 Примечание: Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции. Тест определения быстрых плазменных реагинов (RPR) Общие положения При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом суспензии стабилизированного кардиолипинового антигена, адсорбированного на мелкодисперсных угольных частицах, происходит образование комплексов антиген-антитело, собирающих частицы угля в более крупные агрегаты; при этом результат реакции становится возможным учитывать невооруженным глазом. Тест RPR выполняют на специальных картонных или пластиковых карточках одноразового использования, на которых выдавлены неглубокие лунки диаметром 18 мм. Перед началом исследования производят разметку карточек: ручкой или карандашом надписывают номер исследуемого образца сыворотки или плазмы крови в соответствии с записями в журнале регистрации результатов RPR теста. В лунки карточек вносят образцы исследуемой сыворотки или плазмы крови и суспензию антигена. В целях более эффективного образования комплексов «антиген-антитело» содержимое лунок перемешивают в течение 8 минут при комнатной температуре путем размещения на платформе орбитального шейкера. При отсутствии антител в исследуемом образце внешний вид реакционной среды не изменяется, она остается гомогенной. Коммерческие наборы для RPR состоят из следующих компонентов: − готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена, сорбированного на мелкодисперсных частицах угля; − положительного и отрицательного контролей (стабилизированной инактивированной сыворотки крови человека); − картонных или пластиковых карточек с выдавленными неглубокими 18-мм лунками для проведения в них реакции; − диспенсера со съемной иглой для дозированного раскапывания суспензии антигена. Качественный вариант RPR Процедура исследования − Пипеточным дозатором набирают 50 мкл сыворотки или плазмы крови из пробирки и переносят в соответствующую лунку карточки. − Этим же наконечником или индивидуальными пластиковыми или деревянными палочками распределяют образец биологического материала внутри очерченной зоны лунки. − Наконечники и палочки сбрасывают в емкость с дезинфицирующим раствором. − В каждую лунку добавляют по одной капле (или по 16 мкл) хорошо ресуспензированного кардиолипинового антигена. − Планшет помещают на платформу горизонтального шейкера (ротатора) для постоянного перемешивания содержимого лунок в течение 8 минут при скорости вращения 150 оборотов в минуту. − Через 8 минут приступают к учету результатов реакции. 27 Оценка результатов Учет результатов проводят при хорошем освещении, карточку располагают на столе или держат в руках и слегка покачивают; для более четкой регистрации применяют лупу двукратного увеличения. О наличии в образце биологического материала реагиновых антител свидетельствует образование частиц флоккулята различной величины, одновременно происходит просветление реакционной среды. Таблица 5. Оценка результатов теста на определение быстрых плазменных реагинов Результат Описание Положительный результат Крупные и средней величины агрегаты угольных частиц черного цвета располагаются по всему объему лунки либо имеют тенденцию к расположению ближе к периферической части лунки, при этом реакционная среда практически полностью прозрачная. Слабоположительный результат Редкие и мелкие агрегаты угольных частиц, хлопья преципитата распределены по периферии реакционной лунки, реакционная среда имеет гомогенную структуру. Отрицательный результат Видимые агрегаты угольных частиц в пробе отсутствуют, реакционная среда гомогенной структуры либо частицы угля собираются в центральной части лунки, формируя пятно черного цвета. Контроль качества − Учет результатов исследования начинают с оценки результатов с положительным и отрицательным контролями. − При неадекватных результатах исследования контролей, результаты всего исследования регистрации не подлежат, тест проводится заново. − Образцы сыворотки или плазмы крови, показавшие при скрининге положительные и слабоположительные результаты, исследуются полуколичественным вариантом (титрованием). − У некоторых пациентов с очень высоким содержанием антител возможно получение слабоположительного ответа в RPR тесте с неразведенным биологическим материалом (проявление «феномена прозоны»); причина этого явления заключается в том, что переизбыток антител не позволяет образоваться крупным хлопьям преципитата. В этих случаях рекомендуют исследование разведенных образцов биологического материала. Полуколичественная RPR Общие положения • • • • Полуколичественная RPR (с помощью титрования) применяется: для исследования образцов сыворотки или плазмы крови, показавших при скрининге положительные и слабоположительные результаты; если данные RPR расходятся с результатами других тестов на сифилис; в случае прямого указания лечащего врача. 28 Процедура исследования • • • • • • • • Всем реагентам в течение 25-30 минут дают прогреться до комнатной температуры. В лунки карточки со 2 по 10 вносят по 50 мкл свежеприготовленного физиологического раствора. В первую и вторую лунки карточки вносят по 50 мкл исследуемого образца биологического материала. Многократным пипетированием во второй лунке перемешивают содержимое, стараясь избежать образования пены. Переносят 50 мкл полученного разведения (1:2) в третью лунку. Данную операцию повторяют во всех лунках карточки. Таким образом, получают серию разведений: от цельного биологического материала к 1:2, 1:4, ... до 1:16 (5 лунка) или до 1:512 (10 лунка). Во все лунки карточки добавляют по 16 мкл хорошо ресуспензированной суспензии кардиолипинового антигена, помещают планшет для постоянного перемешивания на горизонтальную площадку орбитального шейкера на 8 минут. Оценка результатов Учет производят по стандартной методике. При этом титром антител считают последнее разведение, показавшее положительный результат при RPR тестировании. Контроль качества (Смотри Качественный вариант постановки RPR) Примечание: Разные производители коммерческих наборов для RPR тестирования в Восточной Европе применяют различные критерии учета реакции. Необходимо строгое соблюдение инструкций производителя. Другие нетрепонемные тесты К числу наиболее известных нетрепонемных тестов, кроме РМП и RPR, относятся: Venereal Disease Research Laboratory Test (VDRL). • Антиген и инактивированная сыворотка смешиваются в стеклянной лунке механическим вращением. Комплексы антиген-антитело в виде коротких стержневидных структур выявляют под микроскопом. Тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test, TRUST). • Стандартные частицы азокрасителя толуидинового красного добавляются к основному стабилизированному антигену. Реагенты для теста не нуждаются в хранении в холодильнике. Тест отбора реагинов (Reagin Screen Test, RST). • В стабилизированный антиген добавляется жирорастворимый краситель судан черный. Тест определения активных реагинов плазмы (Unheated Serum Reagins, USR). Антиген стабилизирован добавлением холин хлорида и ЭДТА и не нуждается в ежедневном приготовлении. Используется непрогретая сыворотка. Тест оценивается под микроскопом. 29 Оценка диагностической значимости нетрепонемных тестов Нетрепонемные тесты не являются строго специфическими реакциями на сифилис, так как проводится определение наличия антикардиолипиновых антител. В сыворотке крови людей реагиновые антитела могут транзиторно обнаруживаться при системных поражениях паренхиматозных органов (печени, почек, легких), при миокардите, атеросклерозе, острых вирусных инфекциях, включая гепатит, ветряную оспу и корь, при малярии, после вакцинации и во время беременности. Хроническая персистенция наблюдается при заболеваниях соединительной ткани, лепре, онкологии, применении внутривенных наркотиков и в пожилом возрасте. Количество ложноположительных результатов увеличивается при исследовании образцов крови пожилых людей. Теоретически, при низких положительных титрах нетрепонемных тестов (<1:8) необходимо проведение специфических трепонемных тестов, таких как РИФ-абс, ИФА, РПГА или реакция иммобилизации трепонем (РИТ). Нетрепонемные тесты используются для первоначального скрининга, они становятся положительными примерно на 6 неделе после инфицирования, и поэтому часть пациентов с положительными результатами темнопольной микроскопии (до 40%) при первичном сифилисе могут быть серонегативными. Количественные варианты тестов могут использоваться для определения эффективности терапии. Так, после адекватного лечения раннего сифилиса, титры антител в нетрепонемных тестах должны значительно снижаться или результаты тестов становяться отрицательными. Тем не менее, адекватное лечение поздних стадий заболевания может привести к стойкому сохранению титров антител, которые могут снижаться или оставаться на прежнем уровне, но никогда не увеличиваться (Схема 1). Схема 1. Реактивность нетрепонемных серологических тестов в зависимости от стадии сифилиса и влияния проведенного лечения. 30 6. 2. Трепонемные тесты Общие положения В трепонемных тестах применяется антиген трепонемного происхождения патогенная бледная трепонема (в реакциях РИФ, РИБТ) рекомбинантные белки, полученные генно-инженерным способом или пептиды, полученные путем искусственного синтеза (реакции – ИФА, РПГА, модифицированный иммуноблоттинг и тест с хроматографическими полосками). Трепонемные тесты используются для подтверждения результатов нетрепонемных тестов. В популяции с низкой распространенностью заболевания они могут использоваться для скрининга, так как в настоящее время существует возможность автоматизации ИФА. К трепонемным реакциям относятся: иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) или ее разновидность - метод микрогемагглютинации T. pallidum (МГА-TP), а также реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ или РИБТ), реакция иммунофлуоресценции (РИФ), а также метод имуноблоттинга и новый тест с использованием хромотографических полосок («анализ по месту лечения» (point-of-care) (18). Несомненными достоинствами трепонемных тестов является их высокая чувствительность и, в особенности, специфичность (таблица 6). Также часть быстрых тестов может быть поведена в местах оказания медицинской помощи. Однако эти реакции не используются для контроля эффективности лечения, т.к. даже в случае проведения адекватного лечения могут оставаться положительными в течение всей жизни. И трепонемные и нетрепонемные тесты могут давать положительный результат при невенерических трепонематозах, таких как фрамбезия и пинта. Специфичность (%) Таблица 6. Чувствительность и специфичность трепонемных методов диагностики сифилиса Поздний Ранний скрытый Вторичный Первичый Тип реакции* Чувствительность (%) при разных стадиях заболевания сифилиса Трепонемные: РИФ 84 (70-100) -абс МГА 76 (64-90) -ТР * МГА-TP, реакция иммунофлюоресценции 100 100 96 (93-100) 97 (94-100) 100 97(94-100) 97 (94-100) 99 (98-100) микрогемагглютинации-T. pallidum; РИФ-абс, реакция Количественное тестирование В некоторых странах Восточной Европы используются количественные методики, предназначенные для определения титров трепонемных антител. В западноевропейских протоколах результаты определяются как «положительный, отрицательный, слабоположительный» или, в случае РПГА или TPPA, исследуется только последнее 31 разведение 1:80. Так как трепонемные антитела находятся в сыворотке в течение многих лет, несмотря на правильно проведенное лечение сифилиса, то ценность проведения количественных тестов для определения титров специфических антител очень мала. Подъем/снижение титров происходит в течение многих месяцев/лет и не отражает активности заболевания. Общепринято, что РПГА является положительной, если агглютинация сенсибилизированных эритроцитов зафиксирована в разведении 1:80. Если агглютинация зарегистрирована только в меньших разведениях, результат теста считается отрицательным. Несмотря на то, что при диагностике сифилиса методам ИФА результат предстает в виде численного показателя – оптической плотности (ОП), по изменениям этого показателя нельзя судить об эффективности лечения и активности заболевания. Считается, что определение титров не имеет диагностической ценности и ведет к большим затратам, поэтому не рекомендуется использовать количественное определение титров специфических антител в рутинной практике. Метод разведений может применяться как часть процедуры лабораторного контроля качества. Тесты на основе метода иммунофлюоресценции (РИФ, FTA, Fluorescent Treponemal Antibody) и их модификации Принцип непрямого метода иммунофлюоресценции Исследуемая сыворотка инкубируется с целыми T. pallidum, фиксированными на предметных стеклах. Если сыворотка содержит специфические антитела, на поверхности микроорганизмов формируются комплексы антиген-антитело. Эти комплексы затем выявляются путем инкубации с иммунной сывороткой, меченой флюорохромом, и последующей визуализации микроорганизмов с помощью люминесцентного микроскопа. Тест FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody-absorption), РИФ-абс, реакция иммунофлюоресценции) рассматривается в целом, как самый чувствительный тест на сифилис и считается “золотым стандартом” для трепонемных тестов (20). В этом тесте сыворотка разводится 1:5 и обрабатывается сорбентом для удаления неспецифических антител. РИФ-абс тест используется также для выявления специфических антител в СМЖ. Вариантом РИФабс является РИФ-абс-DS тест. В этом тесте к разбавителю добавляется контрастирующая краска, обычно родамин, обеспечивающая высококонтрастный фон ярко-зеленым спиральным трепонемам. Для ранней диагностики врожденного сифилиса используются тесты на основе флюоресцирующих антител, разработанные для детекции специфических IgM. Большие молекулы IgM не способны проходить через плаценту, и они обнаруживаются в крови плода только, если плацентарный барьер нарушен или, если они активно продуцируются инфицированным плодом. По этой причине выявление специфических IgM антител в сыворотке, полученной от новорожденных детей, считается доказательством врожденного сифилиса. К сожалению, специфичность этого теста невысока, так как может происходить неспецифическое связывание конъюгата. Разработано несколько тестов для определения IgM антител, основанных на РИФ методологии: РИФ-абс-IgM – антитела к IgM человека, меченые флюоресцеином, применяются во • второй стадии теста. • 19S-IgM- РИФ-абс – содержащиеся в исследуемой сыворотке антитела разделяются на мини-колонке и тест иммунофлюоресценции проводится на фракции антител 19S (IgM). Для теста РИФ-абс необходимы: 1. Исследуемая сыворотка. 2. Антиген. Суспензию T. pallidum (штамм Nichol’s) получают из яичек инфицированного кролика через 7 дней после инокуляции. Суспензия промывается в физиологическом растворе для 32 удаления глобулинов кролика. Трепонемы также могут быть получены из других лабораторий. Кроме того, существуют коммерческие препараты – предметные стекла с нанесенными на них трепонемами. До тестирования суспензию трепонем перемешивают и исследуют в темном поле микроскопа для того, чтобы определить концентрацию микроорганизмов. При необходимости суспензию можно развести в физиологическом растворе до концентрации 40–60 трепонем при x400 увеличении. 3. Сорбент. Сорбент готовится из культур непатогенных трепонем Рейтера без добавления консерванта. Для каждой новой партии сорбента должен быть определен рабочий титр для использования в РИФ-абс тесте. Определение титра сорбента Суспензии сорбента разводятся фосфатным буфером (рН 7,2) 1:2, 1:3, 1:4 и далее. Сыворотки получают от пациентов с сифилисом: одна сыворотка должна давать сильно положительный результат (4+), две – слабо положительные результаты (2+) в РИФ-абс тесте. Пять сывороток получают от пациентов без сифилиса, при этом 3 сыворотки должны давать неспецифическое окрашивание (2+ и более). Все сыворотки разводят сорбентом 1:5, а затем делают разведения (1:2, 1:3, 1:4 и далее) в фосфатном буфере, после чего все сыворотки исследуются в реакции. После учета результатов выбирают разведение сорбента, при котором абсорбированные сыворотки, полученные от пациентов с сифилисом, сохраняют степень позитивности, аналогичную позитивности сывороток, разведенных только фосфатным буфером, и при котором все сыворотки от пациентов без сифилиса не дают флюоресценции. 4. Конъюгат, меченный флюоресцеином. Сыворотку получают от животных, иммунизированных фракцией иммуноглобулинов человека, и метят флюоресцеином. Лиофилизированный конъюгат растворяется в стерильной дистиллированной воде в соответствии с инструкцией производителя и хранится при 4°C до 1–2 месяцев. Для подавления роста микрофлоры добавляю мертиолят в концентрации 1:10000. Каждая партия конъюгата, меченного флюоресцеином, должна титроваться перед использованием. Титрование флюоресцирующей конъюгированной сыворотки Пять сывороток от пациентов с сифилисом и 5 сывороток от здоровых пациентов разводят сорбентом 1:5 (с учетом его титра) и тестируют с различными разведениями флюоресцирующей конъюгированной сыворотки. Разведение, при котором все положительные сыворотки дают хорошую флюоресценцию, а все отрицательные сыворотки не флюоресцируют, следует рассматривать как предварительный титр конъюгата. После того, как предварительный титр определен, проводят его подтверждение на большем числе положительных и отрицательных сывороток. Титр может считаться окончательным после подтверждения на 100 сыворотках, при этом по меньшей мере 20 из них должны быть получены от пациентов с сифилисом. 5. Фосфатный буфер. Фосфатный буфер, используемый в тестах непрямой иммунофлюоресценции, должен содержать 1 л дистиллированной воды, 6,8 г хлорида натрия, 1,48 г двухзамещенного фосфата натрия и 0,43 г монозамещенного фосфата кальция (рН 7,2). Готовый раствор хранится при комнатной температуре до одной недели. РИФ-абс методология Для препаратов антигена (T. pallidum) используют тонкие, обезжиренные предметные стекла, на которые стеклорезом наносят окружности диаметром 0,7 см (10 окружностей на стекло). Суспензия T. pallidum наносится внутрь каждого круга и распределяется ровным 33 слоем вращательными движениями. Препараты антигенов сушат на воздухе и фиксируют химически чистым ацетоном в течение 10 мин. Инактивированные сыворотки для тестирования разводятся 1:5 сорбентом (0,05 мл сыворотки и 0,2 мл сорбента), который разбавляют до заранее определенного титра. Разведенные сыворотки наносят на антиген так, чтобы мазок был покрыт равномерно, и выдерживают во влажной камере инкубатора при 37°C в течение 30 мин. После инкубации образцы дважды тщательно промывают в фосфатном буфере и оставляют их в буфере на 10 мин, после чего высушивают на воздухе. Затем на мазки наносят конъюгат, меченый флюоресцеином, и препараты инкубируют во влажной камере при 37°C в течение 30 мин. После инкубации образцы опять промывают в фосфатном буфере, высушивают на воздухе, наносят на мазок каплю монтирующей жидкости и покрывают его покровным стеклом. Оценка результатов Образцы исследуют с помощью люминесцентного микроскопа с кварцево-ртутной лампой при x400 увеличении. При учете реакции оценивают степень флюоресценции трепонем. Сыворотки, дающие специфическую флюоресценцию, считаются положительными в РИФабс тесте: 4+ – зелено-желтая флюоресценция – сильно положительный образец, 3+ – яркая флюоресценция – положительный, 2+ – слабая флюоресценция – слабо положительный, 1+ – видимое окрашивание – минимально реактивный, Отсутствие флюоресценции – отрицательный. В каждый РИФ-абс тест должны быть включены следующие контроли: Резко положительный контроль – сыворотка, разведенная буфером 1:5 и дающая флюоресценцию на 4+. Если такая сыворотка разводится сорбентом 1:5, она не должна терять больше 1+ флюоресценции. Слабо положительный контроль – цельная или разведенная сыворотка, полученная от пациента с сифилисом, которая дает слабую флюоресценцию (2+) при разведении буфером 1:5. При разведении сорбентом такая сыворотка должна оставаться положительной. Неспецифический контроль – сыворотка, полученная от здорового пациента, которая при разведении буфером дает слабую (по меньшей мере 2+) флюоресценцию. В случае разбавления сорбентом такая сыворотка должна утратить способность давать положительную реакцию. Примечание: К сожалению, РИФ-абс тест по своей природе является субъективным тестом, следствием чего является получение ложноположительных результатов, особенно при недостатке опыта. Ложноположительные результаты могут также регистрироваться при исследовании сывороток от пациентов с аутоиммунными заболеваниями и лепрой. Для выявления антител в СМЖ при подозрении на нейросифилис предложена модификация РИФ-абс теста. Используются тот же антиген и тот же конъюгат. Исследуемый образец СМЖ не инактивируется; его можно хранить при -20°C до двух недель. Образцы быстро размораживают (при 37°C) и 0,05 мл неразведенной СМЖ наносят на мазок антигена. Тест непрямой иммунофлюоресценции проводится как описано выше. 34 Оценка диагностической ценности РИФ-абс теста По данным ВОЗ, чувствительность РИФ-абс теста равна 70-100% при первичном сифилисе и 96-100% – при вторичном и позднем сифилисе, тогда как его специфичность составляет 94-100%. РИФ-абс тест широко используется как подтверждающий тест. Так как этот тест относительно дорогой, трудоемкий и требующий наличия в лаборатории люминесцентного микроскопа, его не рекомендуется использовать для рутинного скрининга. В опытных руках РИФ-абс тест является одним из самых чувствительных тестов для диагностики сифилиса, и в течение долгого времени он рассматривался как “золотой стандарт” трепонемного серологического теста. Для того, чтобы иметь РИФ-абс тест в своем арсенале, лаборатория должна иметь доступ к источнику живых T. pallidum или суспензий микроорганизма. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), или Treponema pallidum Haemagglutination Assay (TPHA) Общие положения При взаимодействии антитрепонемных антител, содержащихся в сыворотке крови больных сифилисом, с эритроцитами животных, сенсибилизированными антигенами бледной трепонемы, происходит видимая невооруженным глазом агглютинация эритроцитов. Для приготовления диагностикума применяют формалинизированные и таннизированные эритроциты барана или птиц (чаще куриные), которые подвергают сенсибилизации антигеном патогенной бледной трепонемы, обработанном ультразвуком или рекомбинантными белками бледной трепонемы (TpN15, ТpN17, ТpN47). Коммерческие тест-наборы для РПГА обычно включают: тест-эритроциты – эритроциты животных, сенсибилизированные антигеном патогенной бледной трепонемы, контрольные эритроциты, буфер для разведения, положительный и отрицательный контроли, иммунологические планшеты с 96 лунками для постановки реакции. В лунки (ячейки) иммунологического планшета для микротитрования с U-образным дном вносят образцы исследуемой сыворотки крови (не использовать плазму крови) и тестэритроциты. При наличии специфических антител в сыворотке крови пациента происходит их взаимодействие с антигенами бледной трепонемы и образование пространственных структур иммунных комплексов антитело-антиген-эритроцит, которые под действием сил тяжести постепенно опускаются вниз, распределяются по всей поверхности дна лунки и формируют характерную картину «перевернутого зонтика». Реакцию учитывают визуально через 60-120 минут. При использовании более крупных (ядросодержащих) эритроцитов птиц получают более четкую картину, учет результатов проводят в более ранние сроки - через 45-60 минут. В зависимости от количества иммунных антител, содержащихся в исследуемом образце, изображение «перевернутого зонтика» варьирует от максимального, занимающего всю поверхность U-образного дна лунки планшета, до небольшого участка в центральной, самой низко расположенной его части, с просветлением в центре и формированием более интенсивного кольца из осевших эритроцитов по периферии. При отсутствии в образце биологического материала специфических антител или при добавлении в реакцию интактных (контрольных) эритроцитов образования иммунных комплексов не происходит, и эритроциты постепенно собираются в самой нижней точке дна лунки, формируя фигуру в виде компактного пятна или «пуговки», иногда с незначительным просветлением в центре. 35 Примечание: В целях повышения специфичности диагностикума антитела к непатогенным видам трепонем адсорбируют водным экстрактам антигенов трепонемы штамма Рейтера, входящим в состав большинства диагностикумов. Методология РПГА Общие положения В зависимости от объема предстоящей работы готовят необходимое количество планшетов. При этом имеют в виду, что на каждую сыворотку расходуется по 3 лунки: в одной лунке производят разведение образца, в двух других - параллельное исследование с тест-эритроцитами и с контрольными эритроцитами. Для суждения об условиях проведения исследования в каждой постановке обязательно резервируют место для тестирования положительного и отрицательного контролей, входящих в набор. Большинство тест-наборов рассчитано на 100 или 200 определений, включая контроли. Разметку планшета при постановке РПГА проводят по кромке или боковой поверхности планшета спиртовым маркером и дублируют на крышке планшета. Для удобства учета результатов используют типографскую или компьютерную распечатку схемы иммунологического планшета, при этом в соответствующие клетки вписывают номер исследуемого образца в соответствии с его нумерацией в рабочем журнале, а также расположение контролей; эту схему проведения исследования впоследствии подклеивают к протоколу исследования. Рекомендуемая схема разметки планшета для проведения реакции: − вертикальные ряды 1, 4, 7 и 10 используют для предварительного разведения образцов сыворотки крови, − в вертикальных рядах 2, 5, 8 и 11 проводят постановку реакции с контрольными эритроцитами, − в вертикальных рядах 3, 6, 9 и 12 – постановку реакции с тест-эритроцитами. Разведение сывороток Процедура разведения образцов сыворотки крови и проведения исследования (для всех коммерческих тест-наборов для РПГА, кроме «Syphilis TPHA Test liquid», Human): − в лунки вертикальных рядов 1, 4, 7 и 10 с помощью пипеточного дозатора вносят буфер для разведения образцов сыворотки крови в количестве 190 мкл; − в каждую из этих лунок пипеточным дозатором добавляют по 10 мкл соответствующего образца сыворотки, перемешивают содержимое при помощи многократного (5-7 раз) нажатия и отпускания кнопки дозатора, получают разведение 1:20; − по 25 мкл разведенной 1:20 сыворотки крови вносят в лунки второго и третьего рядов. − Процедура разведения образцов сыворотки крови и проведения исследования с тестнабором «Syphilis TPHA Test liquid», Human: − лунки рядов 1, 4, 7 и 10 используют для разведения сыворотки крови, но в них вносят по 100 мкл разводящего буфера, − дополнительно, по 25 мкл разводящего буфера добавляют во все остальные лунки, где будет проводиться исследование. 36 Методика разведения сыворотки: − в первую ячейку ряда 1 вносят 25 мкл исследуемой сыворотки крови, тщательно перемешивают, получают разведение 1:5; − переносят 25 мкл разведения сыворотки 1:5 во вторую ячейку, содержащую 25 мкл буфера, и также перемешивают, получают разведение 1:10; − переносят 25 мкл разведения сыворотки 1:10 в третью ячейку с 25 мкл буфера и перемешивают, получая разведение 1:20; 25 мкл этого разведения сыворотки из лунки удаляют. Таким образом, методика постановки РПГА с тест-наборами «Syphilis TPHA Test liquid» (Human) отличается от методики применения других коммерческих наборов меньшим разведением сыворотки (1:10) для реакции с контрольными эритроцитами по сравнению с разведением (1:20) для исследования с тест-эритроцитами. При использовании тест-систем других производителей исследуемую сыворотку разводят в обоих случаях одинаково - 1:20. Внесение положительного и отрицательного контролей При подготовке к исследованию положительного и отрицательного контролей всегда обращают внимание на указания производителей о степени их разведения. При предоставлении контролей в виде цельной сыворотки подготовка их не отличается от разведения биологических образцов. В других случаях контроли предоставляют в разведении 1:20 и дополнительного их разведения не требуется. Добавление диагностикума и контрольных эритроцитов Перед началом постановки реакции содержимое флаконов с контрольными и тестэритроцитами тщательно перемешивают плавными покачивающими движениями, без резкого встряхивания. В соответствии с разметкой схемы проведения исследования во 2, 5, 8, 11 вертикальные ряды добавляют по 75 мкл контрольных эритроцитов; • в 3, 6, 9 и 12 вертикальные ряды добавляют по 75 мкл тест-эритроцитов. Таким образом, окончательное разведение сыворотки в ячейках планшета составляет 1:80 (1 часть - сыворотка крови, разведенная 1:20, и 3 части – суспензия эритроцитов). • Перемешивание и экспозиция реакции Осторожным постукиванием пальцем по боковой поверхности иммунологического планшета производят перемешивание содержимого ячеек. Планшет накрывают крышкой, оставляют при комнатной температуре и сохраняют в неподвижном состоянии, учет результатов производят через 60 минут. Оценка результатов При оценке результатов РПГА опираются на форму и характер осадка эритроцитов на дне лунок иммунологического планшета (Таблица 7). 37 Таблица 7. Оценка результата РПГА для выявления Treponema pallidum Результат Описание Резко положительный эритроциты располагаются ровным слоем по всему дну лунки – результат (4+) высокое содержание специфических антител в пробе, Положительный результат (3+) эритроциты располагаются на большей части дна лунки, при этом по периферии осадка формируется заметное кольцо из осадка эритроцитов, эритроциты располагаются на небольшой части дна лунки, Слабоположительный в центральной части формируется плотное кольцо из осадка результат (2+) эритроцитов с заметным просветлением в центральной части, Неопределенный результат (1+ и ±) наличие небольшого рыхлого осадка эритроцитов с нечеткими краями в центральной части лунки с незначительным просветом в центре на свободном от эритроцитов окружающем фоне - такие образцы рекомендуют исследовать повторно, иногда со свежей порцией сыворотки, полученной через 1-2 недели, Отрицательный результат компактный осадок в центральной части дна лунки на чистом окружающем фоне. Учет результатов постановки начинают с оценки положительного и отрицательного контролей. Получение агглютинации эритроцитов с положительным и отсутствие агглютинации с отрицательным контролем свидетельствует о правильном проведении процедуры исследования. При отсутствии агглютинации с положительным контролем или ее проявлении в лунках с отрицательным контролем результаты всего исследования учету не подлежат. Дальнейшую работу приостанавливают, выясняют причину ошибки и проводят повторное тестирование всей аналитической серии. При наличии агглютинации в лунках с контрольными эритроцитами исследование следует повторить; при повторном получении такого результата делается заключение о наличии в образце сыворотки антиэритроцитарных антител и рекомендуется исследование после предварительной инкубации с контрольными эритроцитами. Истощение сыворотки при обнаружении антиэритроцитарных антител Некоторые сыворотки крови могут содержать антиэритроцитарные антитела. В этих случаях наблюдают агглютинацию и контрольных, и сенсибилизированных эритроцитов («положительный ответ» в обеих лунках планшета, где проводят исследование этого образца сыворотки). Для истощения сыворотки по антиэритроцитарным антителам производители наборов рекомендуют методику предварительной абсорбции антиэритроцитарных антител сыворотки с контрольными эритроцитами: − в чистую пробирку вносят 1 объем исследуемой сыворотки, к ней добавляют 3 объема контрольных эритроцитов, получают конечное разведение сыворотки 1:4; − инкубируют при комнатной температуре в течение 45-60 минут; − центрифугируют при 1000 оборотах/мин в течение 5 минут; − супернатант разводят буфером в 5 раз (1 часть - инкубированной разведенной 1:4 сыворотки и 4 части – буфер для разведения образцов) для получения разведения сыворотки 1:20; 38 − проводят исследование сыворотки в полученном разведении с суспензией контрольных и тест-эритроцитов. Оценка диагностической значимости РПГА Методика РПГА проста в выполнении, не требует специального оборудования и не занимает длительного времени высоко чувствительна и специфична. Реакция становится положительной спустя 3-4 недели после появления твердого шанкра. В зависимости от стадии заболевания чувствительность РПГА колеблется: от 76% при первичном, до 100% - при вторичном сифилисе и 94-97% - при скрытых формах течения этой инфекции. Антитела-агглютинины выявляют в крови переболевших сифилисом людей в течение длительного времени, поэтому РПГА не может быть рекомендована для дифференциальной диагностики реинфекции или определения остроты инфекционного процесса (Схема 2). Преимуществами РПГА в сравнении с классическими трепонемными тестами (РИТ, РИФ) являются: использование промышленных тест-систем, отсутствие надобности в живой патогенной бледной трепонеме, возможность автоматизации реакции. Примечание: Разновидностью РПГА является TPPA (T. pallidum particle agglutination), в которой используются несенсибилизированные и сенсибилизированные частицы латекса вместо эритроцитов (реакция пассивной агглютинации с частицами латекса или TPPA). TPPA широко используется в лабораториях США и Западной Европы (5,8). Исследование проводится точно также как РПГА, но результаты легче оценивать, чем при РПГА и реагенты для постановки реакции более стабильны. Схема 2. Реактивность трепонемных серологических тестов в зависимости от стадии сифилиса и влияния проведенного лечения. 39 Иммуноферментный анализ (ИФА) или Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Общие положения Принцип реакции состоит в фиксации на поверхности лунок полистиролового планшета иммунных комплексов, образующихся при взаимодействии антител больного сифилисом с антигенами бледной трепонемы, с последующим выявлением их в цветной реакции с помощью специфических конъюгатов и соответствующих субстратно-хромогенных добавок. Специфические антигены, применяемые для ИФА, могут иметь различное происхождение (22): − обработанные ультразвуком: получают при результате разрушения бактериальной клетки T. pallidum ультразвуком или иным методом, − рекомбинантные: получают генно-инженерными технологиями путем внедрения в геном бактериальной клетки (например, E.сoli) гена, ответственного за синтез определенного антигена T.pallidum, с последующим наращиванием бактериальной массы продуцирующего микроорганизма, разрушением этих клеток, выделением и очисткой антигена, − пептидные: получают в результате последовательного химического синтеза антигенных эпитопов белков T.pallidum. − Наибольшую информативность в ИФА показали иммунодоминантные участки белков бледной трепонемы с молекулярной массой 15 кД, 17кД и 47кД. Классический (непрямой) вариант − внутреннюю поверхность лунки иммунологического планшета сенсибилизируют антигенами бледной трепонемы, − при внесении в лунки и инкубировании в них исследуемых сывороток специфические антитела образуют иммунные комплексы, которые остаются связанными после отмывания буферным раствором (І фаза), − в реакцию добавляют конъюгат, представляющий собой антитела к иммуноглобулинам человека, меченые ферментом (пероксидазой хрена) (ІІ фаза), − после повторного отмывания буфером наличие сложных иммунных «сандвич-комплексов» определяют внесением в лунки раствора перекиси водорода (субстрат), (расщепляемой ферментом конъюгата и хромогена), изменяющего цвет при взаимодействии с атомарным кислородом (ІІІ фаза), − насыщенность цвета реакционной среды пропорциональна количеству антитрепонемных антител, включившихся в реакцию, что можно измерить спектрофотометрически. Ловушечный вариант (применяют в основном для выявления антител различных классов): − поверхность лунки иммунологического планшета сенсибилизируют аффинноочищенными антителами к иммуноглобулинам человека определенного класса (например: IgM, IgG или IgA), − содержащиеся в исследуемой сыворотке иммуноглобулины соответствующего класса связываются с антителами, сенсибилизированными на стенках лунки иммунологического планшета, − присутствие среди иммобилизированных иммуноглобулинов специфических антител определяют внесением антигенов бледной трепонемы, конъюгированных с ферментом (ІІ фаза), − результаты реакции визуализируют добавлением в реакцию хромоген-субстратной смеси (ІІІ фаза). 40 Модифицированный двухфазный вариант (применяют для выявления суммарных антител специфических к определенному антигену, независимо от их класса): − специфические сывороточные антитела взаимодействуют одновременно с антигеном, фиксированным на поверхности лунок планшета для иммуноферментного анализа и тем же антигеном, меченым ферментом, при совместном инкубировании испытуемого образца и конъюгата (І фаза), − образование иммунных комплексов определяют с помощью субстрата (ІІ фаза). − Результаты ИФА оценивают при автоматическом учете результатов реакции по величине цифровых показателей оптической плотности (ОП) в лунках с испытуемыми. При каждой постановке ИФА рассчитывают критическое значение ОП и «серую зону». «Серая зона» – это интервал, лежащий в пределах ОП критической ±10%. Исследуемый образец учитывают как положительный, если ОП данного образца располагается выше «серой зоны»; как сомнительный, если ОП находится в пределах «серой зоны»; и как отрицательный, если ОП ниже «серой зоны». − К сожалению, все ИФА тест-системы невозможно привести к единому стандарту. Один и тот же образец может давать в разных тест-системах разный уровень окрашивания раствора субстрата. Это зависит от конструкции самой тест-системы используемого антигена, концентрации конъюгата и др., а также от величины ОПкрит. Примечание: Трепонемные ИФА тесты должны оцениваться только как качественные тесты. Схема проведения ИФА При использовании каждой тест-системы для ИФА-диагностики сифилиса необходимо строго следовать инструкции производителя. Пример разметки планшета для проведения исследования − Каждый планшет для иммуноферментного анализа имеет 96 лунок с плоской формой дна, маркирован цифрами 1-12 по длинной стороне и буквами А-Н по узкой стороне. − В зависимости от комплектации набора планшет может быть цельным (для однократного полного использования) или разборным (состоящим из рамки и 12 стрипов, содержащих по 8 лунок для проведения реакции, что позволяет использовать в постановке необходимое количество стрипов). − В зависимости от целей и производственных потребностей для серологической лаборатории приобретают тест-наборы с цельными или разборными (стриппированными) планшетами. Непосредственно перед началом исследования необходимое количество планшетов или стрипов извлекают из металлизированных пакетов, неиспользуемые стрипы сохраняют в фабричной упаковке с пакетиками осушающего реагента (силикагеля). − При подсчете потребности количества стрипов или планшетов исходят из того, что на каждый исследуемый образец биологического материала расходуют по 1 лунке, кроме того, на каждом полном или неполном планшете необходимо резервировать место для калибровочных и контрольных исследований. Количество контрольных и калибровочных исследований указано в инструкции по применению конкретного набора тест-системы: 41 для положительного контроля (K+) - 1-2 лунки, для контроля конъюгата (kk) - 0-1 лунка, для отрицательного контроля (K-) - 2-3 лунки. Разметку сторон планшета или порядкового номера стрипов производят по кромке или боковой поверхности планшета спиртовым маркером. На схеме планшета для иммуноферментного анализа (распечатка компьютерной заготовки или на бланке, отпечатанном типографским способом) сначала отмечают лунки для внесения контролей, после чего вписывают номера исследуемых образцов в соответствии с записями в регистрационном журнале; этот план проведения исследования является неотъемлемой составляющей протокола исследования, его хранят вместе с распечаткой результатов постановки. Приготовление рабочих разведений реагентов, применяемых при постановке ИФА Реагенты, необходимые для проведения реакции, включены в комплект тест-системы в виде концентратов. При приготовлении растворов нельзя использовать компоненты из наборов разных серий или смешивать их в процессе разведения. Все растворы необходимо отбирать новыми наконечниками, не допускать касания жидкости в наконечнике края носика пипеточного дозатора. При выпадении кристаллов в солевых концентратах буферов добиваются их полного растворения при подогревании до 37о С в термостате. Для разведения реагентов используют дистиллированную (деионизированную) воду. В зависимости от количества используемых в реакции планшетов (или стрипов) в соответствии с указаниями таблиц, приведенных в инструкции по применению каждого конкретного набора, приготавливают необходимое количество следующих ингредиентов: − буфер для разведения образцов биологического материала, − раствор для разведения положительного и отрицательного контролей, − буфер для разведения конъюгата, − отмывающий раствор (при этом делают корректировку в зависимости от применения ручного или автоматизированного способа отмывания планшетов). Растворы конъюгата, субстрата и хромогена разводят непосредственно перед внесением в лунки, так как растворы не стойки и подвергаются разложению при хранении на свету даже в течение очень короткого времени. Флаконы с реагентами после приготовления рабочих растворов плотно закрывают крышками. Неиспользуемые стрипы сразу же убирают в металлизированную фабричную упаковку, содержащую пакетики с силикагелем. Все компоненты тест-системы используют в течение 1 месяца после начала работы с наборами, их хранят в условиях бытового холодильника +2...8о С. Тесты на основе иммуноблоттинга (Western blot) Существует несколько коммерческих тестов на основе иммуноблоттинга; также разработаны in-house методики. Эти тесты состоят из стрипов, содержащих специфические компоненты грубого экстракта T. pallidum, которые разделяются электрофорезом (5). Такой стрип инкубируется с сывороткой пациента и антитела к специфическим компонентам T. pallidum связываются со специфическими участками стрипа. Для детекции участка связывания стрипы инкубируют с антителами к иммуноглобулинам человека, мечеными пероксидазой хрена. Наличие конъюгата (а следовательно, и антител к T. pallidum) определяется по действию фермента на субстрат, продуцирующий цветную реакцию. Иммуноблоттинг, специфический для IgG и IgM антител, можно выполнить с использованием специфических конъюгатов. 42 Истинные иммуноблоты трудно интерпретировать, так как они выявляют большое разнообразие антител, многие из которых являются неспецифическими. Эти тесты должны использоваться только референс-лабораториями и только в научных целях. Коммерческие модифицированные иммуноблоты (например, Innolia тест, описанный ниже) легче интерпретировать и они используются как подтверждающие тесты в случаях, когда трудно однозначно интерпретировать результаты трепонемных тестов. Модифицированный иммуноблоттинг (Innolia тест) Основу теста для проведения линейного иммуноблоттинга in vitro с целью обнаружения специфических антител против T. pallidum в образцах сыворотки или плазмы крови человека представляют нейлоновые тест-полоски (стрипы), фиксированные на подложке из нейтрального пластика. На каждый стрип в виде дискретных линий нанесены антигенные детерминанты T. pallidum: три рекомбинантных белка (TpN47, TpN17 и TpN15) и один синтетический пептид (TmpA). Кроме того, на каждом стрипе имеется четыре контрольные линии: одна анти-стрептавидиновая и три калибровочные линии, по интенсивности окрашивания соответствующие 3+, 1+, ± (cut off). Калибровочная линия, соответствующая 3+, содержит иммобилизованные антитела против IgG человека и одновременно служит контролем внесения образца биологического материала. Для проведения реакции линейного иммуноферментного анализа необходимо дополнительное оборудование: орбитальный шейкер или ротатор с определенными техническими характеристиками, которые являются критичными для оптимального проведения теста. Рекомендации для орбитального шейкера: − наличие встроенного таймера с диапазоном от 1-5 минут до 16 часов (для учета времени инкубации и отмывания стрипов), − диаметр кругового движения должен быть равен или превышать 13 мм, − рекомендуемые скорости кругового движения для 13 мм - 160 об./мин, для 20 мм - 110 об./ мин, для 24 мм - 90 об./мин. Процедура исследования − В индивидуальные маркированные лоточки, закрепляемые в поддоне, вносят по 1 мл разводящего фосфатного буферного раствора зеленого цвета, к которому добавляют по 10 мкл исследуемой сыворотки или плазмы крови и повторным пипетированием тщательно перемешивают содержимое. − При помощи пинцета в каждый лоточек погружают по одному нумерованному стрипу, размещая его мембранной стороной кверху. Поддон с лоточками заклеивают адгезивной пленкой и помещают на платформу орбитального шейкера для инкубации и постоянного перемешивания реакционной среды при комнатной температуре (+18…30оС) в течение 16±2 часов. − После инкубации, с помощью пипеточного дозатора или вакуумного аспиратора, из лоточков удаляют инкубирующий раствор, стрипы трижды отмывают путем внесения по 1000 мкл отмывающего раствора, перемешивают на платформе шейкера в течение 5 минут для последующего его удаления. − После отмывания в лоточки со стрипами вносят по 1000 мкл конъюгата, инкубируют их на платформе шейкера при комнатной температуре в течение 30±5 минут и вновь проводят троекратную процедуру отмывания стрипов. − Для визуализации результатов реакции в каждый лоточек добавляют по 1000 мкл смеси субстрата и хромогена, инкубируют на платформе шейкера при комнатной температуре в течение 30±2 минут. 43 − По завершении процесса ферментации субстратную смесь удаляют и для прекращения дальнейшего окрашивания в каждый лоточек вносят по 1000 мкл стоп-раствора, выдерживают на платформе шейкера при комнатной температуре (+18…30оС) в течение 10-30 минут. − Готовые стрипы при помощи пластикового пинцета выкладывают на фильтровальную бумагу и просушивают не менее 30 минут. При помощи скотча индивидуальные стрипы закрепляют на стандартном бланке для регистрации и последующего хранения (при комнатной температуре в защищенном от света месте). Учет и интерпретация результатов исследования Для суждения о достоверности (валидности) проведенного исследования учет реакции начинают с контролей: на стрипе, инкубированном с положительным контролем, должно происходить окрашивание всех четырех полос с трепонемными антигенами не менее чем на 1+; а на стрипе, тестированном с отрицательным контролем, не допускается окрашивания антигенных полос, возможно фоновое окрашивание слабее критического уровня. Затем приступают к оценке испытуемых образцов (Таблица 8). Таблица 8. Оценка результатов модифицированного иммуноблотинга (Innolia теста) Результат Описание Отрицательный результат все антигенные полосы на стрипе не окрашены или одна из полос окрашена с интенсивностью «±». Положительный результат две или более антигенные полосы на стрипе были окрашены с интенсивностью «±» или выше. Неопределенный результат одна антигенная полоса на стрипе окрашена с интенсивностью «1+» или выше (при получении такого ответа рекомендуется повторное исследование новой порции крови с интервалом в несколько недель). Источники ошибок при проведении иммуноблоттинга − Использование некачественных образцов сыворотки крови (гемолизированных, хилезных). − Применение реактивов с истекшим сроком годности. − Несоблюдение условий постановки реакции (нарушение кратности и длительности процедуры отмывания стрипов, сокращение времени инкубации). − Несоответствие орбитального шейкера требуемым характеристикам. − Ошибки в интерпретации результатов. Оценка диагностической значимости метода иммуноблоттинга Метод легко воспроизводим, относительно прост в исполнении и интерпретации результатов. Тем не менее, он достаточно дорог, занимает много времени и требует высокой квалификации лабораторных работников. Метод дает возможность определять спектр антител сразу к нескольким антигенам T. pallidum и оценивать вклад в общую реакцию антител различной специфичности. 44 Применение высокоочищенных рекомбинантных и пептидных антигенов снижает до минимума неспецифическую реактивность сывороток. Использование метода дает возможность отказа от трудоемких и субъективных методов, связанных с опасными для исследователя манипуляциями (перевивка штаммов T.pallidum, работа с патогенной бледной трепонемой при постановке реакции). Все это определяет предпочтение метода иммуноблоттинга другим трепонемным тестам для диагностики сифилиса, в частности, РИФ и в особенности - РИБТ. В настоящее время существуют технические возможности для инструментальной оценки интенсивности окрашивания антигенных полос на стрипах (сканирование) с автоматизацией аналитического процесса. В настоящее время возможно использование метода линейного иммуноферментного анализа в практике референсных лабораторий, в качестве дополнительного или альтернативного РИБТ и РИФ подтверждающего теста на эту инфекцию. Использование этого метода в рутинной диагностике сифилиса в настоящее время пока не рекомендуется. Быстрые тесты («Анализ по месту лечения» (point-of-care) с использованием хроматографических полосок) Недавно был разработан «анализ по месту лечения» (point-of-care) с использованием хроматографических полосок для диагностики сифилиса, позволяющий использовать цельную кровь, полученную при скарификации пальца (20). Эти недорогие тесты, по сути своей являющиеся ИФА, проводятся на плотном нитроцеллюлозном матриксе, дают результат в течение 5 минут, который при положительной реакции определяется как красная полоса или точка на устройстве (23, 24). К сожалению, имеющиеся «анализы по месту лечения» основаны на определении анти-трепонемных антител, а это значит, что положительный результат говорит о том, что человек в течение жизни имел сифилис, а необязательно болен в момент проведения тестирования. «Анализы по месту лечения», способные определять как трепонемные, так и нетрепонемные антигены, находятся в разработке и требуют дальнейшего процесса валидации. Поскольку быстрые иммунохроматографические тесты относятся к группе трепонемных тестов, предполагаемое место, которое они могут занимать в серодиагностике сифилиса, это высокочувствительный скрининг на суммарные специфические противотрепонемные антитела в ситуациях, когда отсутствуют временные или технические возможности для постановки стандартного комплекса серологических реакций, применяемых для серодиагностики сифилиса. Одной из основных областей применения быстрых иммунохроматографических тестов является их использование для тестирования групп риска в анонимных кабинетах сети кожно-венерологических диспансеров, а также для скрининга декретируемых контингентов. Целесообразно использование данных тестов для скрининга беременных, пациентов в ургентных ситуациях (хирургия, акушерство, трансфузиология, трансплантология). Возможно применение данного метода при скрининге призывников, тестировании иммигрантов, контингентов ГУИН, жертв сексуального насилия. Положительные результаты скринингового тестирования с использованием быстрых тестов должны подтверждаться в стандартном комплексе серологических реакций (сочетание нетрепонемных и трепонемных тестов), а также альтернативных подтверждающих тестов в случае расхождения результатов тестирования. Вместе с тем недопустима практика продажи и продвижения таких тестов в упаковках на один анализ для самотестирования пациентов. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ, РИТ) Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ или РИТ) является одним из классических тестов для определения специфических трепонемных антител. Живые трепонемы помещаются в сыворотку, полученную от пациента, и характерные движения трепонем 45 блокируются в присутствие специфических антител. Однако, РИБТ – достаточно сложный, трудоемкий и дорогостоящий анализ, требующий высокой квалификации персонала и наличия вивария. РИБТ обладает низкой чувствительностью, особенно на ранних стадиях сифилиса. К тому же, РИБТ не может проводиться при наличии в крови больного трепонемоцидных антибиотиков. В связи с этим не рекомендовано применение данного метода для рутинной диагностики сифилиса. Однако важно сохранение условий для проведения данной методики в референслабораториях. Примечание: Для постановки окончательного диагноза сифилиса комплекс серологических реакций проводится в централизованных лабораториях дерматовенерологической службы. 7. Основные причины ложноположительных и ложноотрицательных серологических реакций Ложноположительные результаты серологических реакций Биологические ложноположительные реакции, регистрируемые при диагностике сифилиса с помощью нетрепонемных тестов, встречаются при онкологических заболеваниях, туберкулезе, сахарном диабете, циррозе печени. В трепонемных тестах биологические ложноположительные реакции могут наблюдаться при аутоиммунных заболеваниях, ВИЧ-инфекции и во время беременности (РИФ-абс чаще, чем РПГА/микро-РПГА) (13). Основные причины биологических ложноположительных реакций: − одной из вероятных причин ложноположительных тестов на сифилис являются технические погрешности, сопровождающие сбор, доставку, хранение образцов сыворотки крови и постановку серологических реакций на сифилис; нарушения, связанные с хранением ингредиентов реакций, несоблюдением инструкций при выполнении исследований и работе на соответствующем оборудовании; − ложноположительные серологические реакции обнаруживаются при эндемичных трепонематозах, таких как эндемичный сифилис (T. pallidum var endemicum), фрамбезия (T. pertenue) и пинта (T. carateum); − пациент с положительными серологическими реакциями на сифилис из страны с эндемичными трепонематозами должен быть обследован на сифилис и получить противосифилитическое лечение в качестве профилактической меры, если он ранее не получал адекватной терапии против сифилиса; − ложноположительные результаты ИФА и РПГА могут наблюдаться у пациентов с инфекционным мононуклеозом, в особенности на фоне высокого уровня гетерофильных антител. Существует определенная взаимосвязь между ложноположительными реакциями в РИФ-абс и подтвержденным диагнозом системной, дискоидной и лекарственной красной волчанкой. В этих случаях может наблюдаться атипичная, «бисерная», флюоресценция. Для устранения этих типов ложноположительных реакций производится абсорбция сыворотки на тимусной ДНК теленка для удаления анти-ДНК антител; − ложноположительные результаты РИФ–абс могут наблюдаться из-за ошибки в выборе сорбента, используемого в данном тесте для удаления перекрестно 46 реагирующих групповых, родовых или семейственных антител; абсорбция сыворотки рейтеровской трепонемой необходима для снижения количества ложноположительных результатов. Ложноотрицательные результаты серологических реакций: − Основными причинами возникновения ложноотрицательных серологических реакций при диагностике сифилиса являются следующие: − Эффект «прозоны». Нетрепонемные агглютинационные тесты при вторичном сифилисе могут давать слабоположительную или отрицательную реакцию, обусловленную избытком антител, когда нормальная реакция антиген-антитело либо не завершается, либо блокируется. − Отрицательный результат серологических реакций на сифилис может регистрироваться у ВИЧ-инфицированных пациентов или пациентов с признаками иммунодефицита другого происхождения. − Эффект диагностического «окна». Такая ситуация обусловлена отрицательными результатами серологических реакций на сифилис, наблюдаемыми в период первичного сифилиса, и обусловлена более поздней выработкой антител. Серологическое исследование спинномозговой жидкости Ход исследования и особенности постановки реакций с ликвором изложены в соответствующих разделах данного руководства. Серологические реакции ставят с цельным ликвором. РМП с ликвором обладает высокой специфичностью, но может обладать относительно низкой чувствительностью при некоторых вариантах нейросифилиса. РИФ-абс может использоваться как исследование для исключения нейросифилиса. Некоторые лаборатории используют трепонемный ИФА для определения специфических антител в ликворе. Однако, на сегодняшний день нет опубликованных данных об использовании этого методы для диагностики нейросифилиса. Результаты такого исследования должны интерпретироваться с осторожностью. 8. Алгоритмы и критерии диагностики сифилиса Важно помнить, что единственным достоверным лабораторным критерием диагноза сифилиса является обнаружение патогенной бледной трепонемы методом прямой микроскопии, прямой иммунофлюоресценции при наличии клинических симптомов ранней стадии сифилиса. Серологические методы при наличии клинических симптомов сифилиса также достаточно достоверно подтверждают диагноз. С осторожностью следует относиться к результатам серологического обследования пациента, если клинические симптомы заболевания отсутствуют. Предлагается следующий алгоритм обследования пациента, у которого диагноз сифилиса может быть установлен впервые (на основании жалоб и объективных симптомов, свидетельствующих о возможном сифилисе, либо у лица, обследуемого по контакту с больным сифилисом): • Если у пациента есть клинические проявления ранних стадий заболевания, производится обследование на бледную трепонему в темном поле и методом прямой иммунофлюоресценции. При положительном результате устанавливается диагноз сифилиса, при отрицательном – исследование повторяется. Пациента обследуют 47 серологически по одной из предложенных выше схем. Если при этом скрининговый метод (РМП или трепонемный тест) дает положительный результат, то проводится подтверждающий трепонемный или нетрепонемный серологический тест и пациент направляется к дерматовенерологу. • Если у пациента скрытая форма сифилиса, то диагноз будет, скорее всего, установлен на основании результатов серологического обследования. Такому пациенту на первом этапе должен быть проведен количественный нетрепонемный тест и пациент направляется к дерматовенерологу для обследования, лечения и наблюдения. • Если у пациента выявлен скрытый сифилис при серологическом скрининге с использованием трепонемного или нетрепонемного теста, такому пациенту должен быть проведен количественный нетрепонемный тест, титры записаны в карту больного и пациенту назначается лечение. Повторные количественные серологические тесты проводятся на 3, 6, 9 и 12 месяц после лечения. При ранних стадиях сифилиса (первичный, вторичный или ранний скрытый) после проведенного лечения наблюдается положительный ответ при обследовании с помощью трепонемных тестов и отрицательный при обследовании с помощью нетрепонемных тестов (в случае успешного результата терапии). • Рецидив заболевания может проявляться появлением сыпи на коже или слизистых на фоне возрастания титров нетрепонемных тестов. • В случае реинфекции отмечается значительное (четырехкратное) повышение титров нетрепонемных тестов. Проведение повторного обследования с использованием трепонемных тестов не имеет диагностического значения, так как они будут положительными после первой инфекции. • При подозрении на ранний врожденный сифилис у новорожденного обследуются мать и ребенок. Критерием подтвержденного раннего врожденного сифилиса является обнаружение бледной трепонемы при темнопольной микроскопии, прямой иммунофлюоресценции. При отрицательных результатах темнопольной микроскопии о предполагаемой врожденной инфекции свидетельствуют положительные результаты трепонемных тестов на сифилис в крови ребенка (19S - IgM –FTA abs, ИФА – IgM, РИФ) и значительное (в 4 и более раз) превышение количества антител, определяемых в нетрепонемных тестах у ребенка в сравнении с матерью. • После окончания лечения больного по поводу сифилиса, проводится серологическое наблюдение (обычно через 3, 6, 9 и 12 месяцев) с постановкой РМП в количественном варианте. Критерием успешно проведенного лечения является наступающая в течение этого времени негативация нетрепонемного теста или снижение его титров не менее чем в 4 раза в сравнении с исходными. • Необходимо помнить, что у пациентов с поздними стадиями сифилиса после проведенного лечения высокие титры антител могут сохраняться и после 12 месяцев. Дополнительное лечение назначается только в случае возрастания титров нетрепонемных тестов в этот период. • По окончании лечения сифилиса пациент должен быть обследован с помощью количественного нетрепонемного теста. При этом показателем эффективности терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года наблюдения. Для оценки эффективности лечения применяют тест-систему одного и того же производителя. 48 Таблица 9. Интерпретация результатов серологических тестов на сифилис Результат серологического теста Заключение Нетрепонемный тест (+), Трепонемный тест (-) Ложноположительный результат скринингового нетрепонемного теста Нетрепонемный тест (+), Трепонемный тест (+) Нелеченный сифилис Ранее пролеченный поздний сифилис Нетрепонемный тест (-), Трепонемный тест (+) Очень ранний нелеченный сифилис Ранее пролеченный ранний сифилис Нетрепонемный тест (-), Трепонемный тест (-) Здоровый пациент Инкубационный период сифилиса Очень поздняя стадия сифилиса Сифилис у пациентов с ВИЧ инфекцией или иммуносупрессией Надёжность лабораторных данных и обоснованность клинических заключений могут быть достигнуты только при сочетании высокого качества выбранных средств лабораторной диагностики, достаточной квалификации персонала лаборатории и необходимого уровня подготовки врачей, способных к критическому анализу совокупности лабораторных и клиникоанамнестических данных. Рекомендуемый алгоритм серологического обследования на сифилис методом ИФА 49 Интерпретация результатов «ИФА-анти-Люис» ИФА-анти- ИФА-анти- Ифа-антиЛюис GM Люис M Люис G Возможные варианты Начальная стадия первичного периода сифилиса + + – Первичный, ранний скрытый, вторичный свежий, вторичный рецидивный сифилис + ± + Вторичный свежий, вторичный рецидивный, скрытый сифилис, сероконтроль после лечения + – + 9. Система контроля качества серологических исследований Получение достоверных результатов исследования с помощью серологических тестов для диагностики сифилиса возможно при соблюдении процедур внутрилабораторного контроля качества (ВКК), которые следует выполнять на всех этапах исследования. На все этапы лабораторного процесса (преаналитический, аналитический, постаналитический) в лаборатории должны быть разработаны и утверждены Стандартные операционные процедуры (СОПы). Мероприятия преаналитического этапа • Необходимо контролировать правильность получения, хранения и доставки в лабораторию биологического материала. • Необходимо контролировать правильность маркировки биологического материала. • Необходимо осуществлять контроль за правильностью подготовки материала и аккуратностью ведения медицинской документации. Мероприятия аналитического этапа • Перед проведением исследования еще раз необходимо оценить качество доставленного материала и исключить из исследования хилезные, гемолизированные сыворотки, а также материал с признаками бактериального пророста, проверить соответствие маркировки и направлений на исследование. • Необходимо осуществить «входной контроль» всех реактивов и диагностикумов, применяемых в исследовании, в особенности применяемых в первый раз: установить срок их годности, внешнее состояние и годность к использованию, наличие инструкций по применению и регистрационного удостоверения, правильность хранения. • Перед началом работы необходимо удостовериться в исправности контрольно – измерительных и других приборов, с использованием проводиться исследование. • Необходимо убедиться в соответствии показателей внешней среды: температуры воздуха, влажности, освещенности рабочего места, - тем условиям, которые необходимы для проведения исследования. 50 оборудования: которых будет • В каждое исследование должны быть включены официально зарегистрированные контрольные материалы с различным уровнем активности (отрицательные, положительные, слабоположительные сыворотки). Если тест-система предусматривает свой внутренний контроль, он также должен быть использован в соответствии с инструкцией по его применению. Использование таких образцов в качестве контрольных проб чрезвычайно важно в настоящем «переходном» периоде, когда применяется несколько различных методологий: КСР, РИФ, ИФА, РПГА, РИТ. • При учете результатов с каждым контрольным материалом следует придерживаться официально признанных критериев учета результатов. • Неотъемлемой составляющей получения достоверных результатов лабораторного анализа, наряду с качеством тест-систем, ингредиентов, оборудования и выполнением инструкций, является адекватная квалификация персонала. Мероприятия постаналитического этапа • В период после проведения исследования следует убедиться в правильности внесения результатов в бланк исследования и своевременно довести информацию до врача, назначившего исследование. В настоящее время в Кыргызской Республике для внешней оценки контроля качества диагностических лабораторий по диагностике сифилиса контрольные образцы сывороток крови с соответствующей документацией высылаются в региональные лаборатории и, несомненно, способствуют оптимизации процесса постановки диагноза, в частности, при исследовании «сомнительных» жидкостей, разночтении результатов различных реакций. 10. Безопасность персонала Соблюдение правил техники безопасности и санитарного противоэпидемического режима на рабочем месте является неукоснительным требованием для выполнения всем персоналом, допущенным к работе в лаборатории. Ответственность за организацию безопасных условий труда в подразделении возлагается в соответствии с Приказом по учреждению на руководителя подразделения или выделенное ответственное лицо. Правила техники безопасности по каждому виду работ разрабатывает заведующий подразделением совместно с ответственным сотрудником, прошедшим специальную подготовку по указанным вопросам. Инструкции по технике безопасности по каждому виду работ после согласования с комиссией местного профсоюзного комитета утверждает руководитель учреждения. Копии всех необходимых инструкций выдаются на каждое рабочее место. Комплект документов по технике безопасности подвергается регулярному пересмотру в строго установленные сроки. 51 Гонорея 1. Введение Гонорея – инфекционное заболевание, преимущественно передающееся половым путём. Поражает мочеполовые органы, выстланные цилиндрическим и железистым эпителием (уретру, цервикальный канал, нижнюю часть прямой кишки, конъюнктиву глаза и др.). В то же время вульва и влагалище в детском возрасте весьма восприимчивы к гонококковой инфекции. Бытовым путём инфекция передается менее чем в 1% случаев (через общую постель, ночные горшки, полотенца, медицинские инструменты и т. д.). Новорожденные инфицируются при прохождении через родовые пути больной матери. Социальная значимость гонореи обусловлена частыми осложнениями и неблагоприятным влиянием, которое она оказывает на демографические показатели, существенно повышая частоту мужского и женского бесплодия. Распространенность гонореи в настоящее время обусловлена его устойчивостью противомикробным средствам и их бесконтрольным приемом и самолечением: – социальными катаклизмами (локальные войны, стихийные бедствия и т. д.), – социально-экономическими факторами (увеличение численности городского населения, увеличение свободного времени, международный туризм и т. д.), – неблагоприятными экономическими условиями: безработицей, материальной необеспеченностью, недоступностью лекарственных средств из-за их высокой стоимости, – особенностями поведения и сексуальной ориентированности отдельных представителей общества: наркоманы, алкоголики, гомосексуалисты, работники коммерческого секса. Источником заражения гонореей чаще всего являются больные гонореей, не знающие о наличии у них инфекции, практикующие частую смену половых партнёров и не использующие средств индивидуальной профилактики ИППП. От 33,8 до 61% больных гонореей заражены двумя и более возбудителями инфекций, передающихся половым путём (ИППП) – смешанная инфекция. Наиболее часто выявляется гонорейно-хламидийная инфекция. Лабораторные исследования являются важнейшим компонентом диагностики ИППП. С их помощью устанавливают этиологический фактор, определяют тактику и оценивают эффективность этиотропной терапии, осуществляют научно обоснованный эпидемиологический надзор. Этиологическая диагностика ИППП требует одновременного применения различных тестов на разные инфекции, кроме того, каждую инфекцию можно установить с помощью различных тестов. Для этих методов диагностики характерны разные степени информативности и доступности для лабораторных служб различного уровня. При диагностике инфекций у лиц с симптомами предпочтение отдается экспресс-методам, дающим ответ в течение 30 минут, однако их надежность не всегда достаточна для точного диагноза. Такие тесты меньше подходят для скрининга клинически здоровых лиц. Универсальных тестов, отвечающих всем требованиям в любых ситуациях, не существует. 2. Этиология Возбудитель гонореи – Neisseria gonorrhoeae, открыт в 1879 г. А. Нейсером. Входит в семейство Neisseriaceae, род Neisseria, является грамотрицательным парным кокком длиной от 1,25 до 1,6 мкм и от 0,7 до 0,8 мкм в поперечнике, имеет форму кофейных зерен, обращенных вогнутой поверхностью друг к другу. Гонококки имеют трехслойную наружную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму с рибосомами и ядерной вакуолью. Обычно гонококки располагаются внутриклеточно группами. Гонорея относится к инфекциям, передаваемым половым путём, и в случае выявления на территории Кыргызстана подлежит обязательной регистрации. 52 3. Основные принципы диагностики гонореи Диагностика гонореи согласно уровню здравоохранения • • • • • • РЦДВ ОМЦДВ Областные ЦСМ Городские, районные ЦСМ Отдалённые ГСВ и ФАП Бактериоскопия, культуральный метод, ПЦР Бактериоскопия, культуральный метод, ПЦР Бактериоскопия Культуральный Бактериоскопия В направлении на исследование обязательно указывается: пол пациента, возраст пациента, анатомическая область, из которой получен материал, дата и время взятия материала, предполагаемый диагноз, выбранный метод лабораторной диагностики. Методы лабораторной диагностики гонококковой инфекции • • • микроскопический (бактериоскопический), культуральный (бактериологический) (В), молекулярно-биологический (IV,С). Таблица.1 Рекомендуемые методы диагностики гонореи Область взятия материала Уретра (мужчин) Метод диагностики Комментарии - основной метод диагностики гонореи у - микроскопический с мужчин с симптомами. Чувствительность и окраской метиленовым специфичность у мужчин с симптомами синим, по Граму. 90% - 95%. - культуральный. Молекулярнобиологический (ПЦР). - применяется для постановки диагноза для мужчин и женщин без симптомов, детей. - в оптимальных условиях чувствительность и специфичность до 100%. - применяется для определения чувствительности к антибиотикам. - применяется при исследовании образцов мочи или материалов из уретры. - не рекомендуется из-за низкой Цервикальный - микроскопический с чувствительности и специфичности. канал / уретра окраской метиленовым Чувствительность метода для (у женщин) синим и по Граму. эндоцервикальных проб 45-64%, уретральных – 16%. 53 - культуральный. - является основным методом диагностики. - чувствительность культуры варьирует в диапазоне от 72 до 95% в зависимости от сравнения анализа, образца пробы и популяции пациентов. - обязательно используется для обследования детей и женщин в менопаузе с симптомами гонореи. - применяется для определения чувствительности к антибиотикам. - Молекулярнобиологический (ПЦР). - бактериоскопический - культуральный. - используется диагностики. Глотка /прямая кишка Конъюнктива Моча (мужчины и женщины) Вульва/вагина (у девочек); Вагина (у женщин после экстирпации матки) как один из методов - является основным методом диагностики. - в оптимальных условиях чувствительность и специфичность до 72-96%. - применяется для выделения и идентификации нейссерий. - применяется для определения чувствительности к антибиотикам. - Молекулярнобиологический (ПЦР). - микроскопический (окраска метиленовым синим, по Граму. - культуральный. - используется диагностики. - молекулярнобиологический. - используется диагностики. - Молекулярнобиологический (ПЦР). - используется как один из методов диагностики. - бактериоскопический. - культуральный. - молекулярнобиологический. как один из методов - метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. - применяется для выделения и идентификации нейссерий. - применяется для определения чувствительности к антибиотикам. как один из методов - является основным методом диагностики. - применяется для определения чувствительности к антибиотикам. Внимание! Чувствительность и специфичность каждого из описанных выше методов в высокой степени зависит от качества взятия проб из соответствующих локализаций, соблюдения условий транспортировки образцов, качественного выполнения метода и правильной интерпретации результатов [11121,30,38]. При подозрении на диссеминированную гонококковую инфекцию, в добавление к урогенитальным и экстрагенитальным образцам, должна быть взята кровь на культуральное исследование. 54 4. Взятие материала • • • • • • • Лицо, осуществляющее взятие материала, должно гарантировать: взятие наиболее подходящего материала, в зависимости от клинических проявлений и используемого диагностического метода, качественное взятие материала, использование стерильных ватных тампонов для сбора материала для микроскопической диагностики и дакроновых – для культуральной диагностики, специальную маркировку материала с указанием в направлении и медицинской карте пациента его фамилии, пола, возраста, времени забора материала и анатомической области, откуда он получен, помещение проб, предназначенных для бактериологического и молекулярно-биологического исследования, в специально для этого предназначенные пробирки с транспортной средой или непосредственно посеяны на поверхность плотной питательной среды, своевременную транспортировку, транспортировку при адекватном температурном режиме для каждого метода. Качество результата лабораторного исследования во многом зависит от физиологического состояния пациента на момент взятия клинического материала. • • • • • Наиболее информативным может быть материал, если он получен при следующих условиях: пациент не использовал общего лечения антибактериальными препаратами в течение 7–8 суток до обследования ПЦР и в течение одного дня на культуральное обследование. Всегда необходимо учитывать, что проведение системной терапии антибактериальными препаратами может значительно повлиять на результат исследования и снизить его диагностическую ценность, пациент не использовал местного лечения минимум в течение последних 48-72 часов, у женщин при исследовании материала из урогенитального тракта, взятие образцов желательно проводить сразу после окончания менструации, пациенты должны быть информированы о необходимости задержки мочеиспускания и воздержания от полового контакта не менее 3 часов до взятия материала, обязательным является взятие образцов из наиболее подходящих анатомических зон, в зависимости от клинических проявлений и используемого диагностического метода (таблица 5). Обычно во время обследования пациента берётся несколько клинических образцов для различных лабораторных исследований, но при этом важно помнить, что: • у мужчин материал из уретры для микроскопического исследования берётся раньше всех других уретральных образцов, • образец из цервикального канала шейки матки для микроскопического исследования на гонококк берётся раньше других цервикальных образцов или сразу же после взятия мазка для культурального исследования на гонококки, причем предварительно должна быть удалена сухим тампоном слизистая пробка, а затем путём соскоба взят материал из канала, • материал из влагалища у девочек и у женщин после экстирпации матки для микроскопического исследования берётся раньше всех других вагинальных проб. Образец берётся из заднего свода влагалища, предметные стекла должны быть сухими, чистыми, не поцарапанными (оптимально • применять новые стекла для каждого нового пациента), 55 • • • • стекла должны быть помечены либо специальным карандашом, либо стойким маркером, который не смывается во время процесса окрашивания, для микроскопического исследования тампон прокатывается по поверхности предметного стекла и материал распределяется тонким слоем только на одну сторону предметного стекла; при использовании 1 мкл одноразовой бактериологической петли или ложки Фолькмана, материал наносят на стекло тонким слоем, если количество материала небольшое или необходимо поместить на одно стекло несколько образцов материала из разных анатомических очагов у одного пациента, материал должен наноситься ближе к центру стекла в заранее обозначенных областях, после нанесения материала на стекло он должен быть высушен при комнатной температуре, избегая контакта с другими стеклами. Внимание! Материал для микроскопического исследования берётся обязательно на два предметных стекла (одно для окраски по Граму, второе – метиленовым синим) 4.1. Взятие клинического материала у мужчин Взятие материала из уретры Инструменты: • пластиковая бактериологическая петля 1мклстерильный ватный/дакроновый тампон на деревянной ручке, • ложечка Фолькмана. Подготовка к взятию проб: • При наличии выделений из уретры: область наружного отверстия уретры очистить с помощью марлевого тампона, смоченного физиологическим раствором, крайнюю плоть отвести назад для предупреждения контаминации при взятии образца. • При отсутствии свободных выделений: попросить пациента слегка помассировать уретру скользящими движениями от основания пениса к его головке перед взятием уретрального материала. Взятие материала: собрать экссудат непосредственно на стерильный тампон. Если экссудат отсутствует, то осторожно ввести стерильный ватный/дакроновый тампон на алюминиевой ручке в наружное отверстие мочеиспускательного канала (на глубину 0,5-2 см) и собрать материал. 1 мкл бактериологическая петля или ложка Фолькмана вводится на ту же глубину с лёгким нажимом на нижнюю стенку уретры при выводе инструментов. С помощью ложки Фолькмана материал берётся соскобом и этот метод имеет преимущество над взятием ватным/дакроновым тампоном, так как обеспечивает более качественное взятие материала. Внимание! Детям препубертатного возраста берется мазок из наружного отверстия мочеиспускательного канала мягким зондом или собирается моча для исследования. При взятии материала из препуциального мешка используется ватный/дакроновый тампон 56 Взятие клинического материала из предстательной железы Инструменты: • Стерильный марлевый (ватный) тампон. Сбор материала: получение клинического материала рекомендуется проводить после мочеиспускания, • область наружного отверстия мочеиспускательного канала очистить с помощью стерильного ватного тампона, смоченного физиологическим раствором, провести ректальный массаж предстательной железы от периферии к центру, заканчивая • надавливанием на область центральной борозды, • клинический материал для исследования собрать из наружного отверстия уретры. • Внимание! Массаж предстательной железы противопоказан при наличии в ней острого воспаления. 4.2. Взятие клинического материала у женщин Взятие материала из уретры Во всех случаях при обследовании. Инструменты: марлевый тампон для удаления свободных выделений. стерильный ватный/дакроновый тампон на алюминиевой ручке. 1 мкл бактериологическая петля или ложка Фолькмана. Подготовка к взятию образцов: При наличии большого количества выделений: наружное отверстие очистить с помощью стерильного тампона. При отсутствии свободных выделений: провести легкий массаж уретры. Взятие материала: Oсторожно ввести стерильный ватный/дакроновый тампон на алюминиевой ручке в уретральное отверстие (0,5-2 см) и собрать материал. Ложка Фолькмана вводится на ту же глубину с лёгким нажимом на нижнюю стенку уретры при выводе инструментов. С помощью ложки Фолькмана материал берётся соскобом и этот метод имеет преимущество над взятием ватным/дакроновым тампоном, так как обеспечивает более качественное взятие материала. Взятие материала из цервикального канала Инструменты: вагинальное зеркало, ватный/дакроновый тампон на деревянной и пластиковой ручке, ложка Фолькмана или 1 мкл бактериологическая петля. Подготовка к взятию образцов: ввести гинекологическое зеркало, которое может быть предварительно смочено теплой водой, и тщательно очистить наружное отверстие цервикального канала от вагинальных выделений при помощи стерильного марлевого тампона. 57 Взятие материала: Oсторожно ввести стерильный ватный/дакроновый тампон на алюминиевой ручке в уретральное отверстие (0,5-2 см) и собрать материал. Ложка Фолькмана вводится на ту же глубину с лёгким нажимом на нижнюю стенку уретры при выводе инструментов. С помощью ложки Фолькмана материал берётся соскобом и этот метод имеет преимущество над соскобом ватным/дакроновым тампоном, так как обеспечивает более качественное взятие материала. Внимание! Цервикальные мазки не берутся у девочек препубертатного возраста, а при подозрении на гонорею в этом возрасте мазки берутся из преддверия влагалища Взятие материала из влагалища (у девочек препубертатного возраста) Инструменты: ватный/дакроновый тампон на алюминиевой ручке для меньшей травматизации. Взятие материала: стерильный ватный/дакроновый тампон на алюминиевой ручке осторожно вводится через гимениальное отверстие (зеркала не используются) во влагалище и материал берётся с задней стенки влагалища. 4.3. Взятие клинического материала у женщин и у мужчин Получение мочи Инструменты: стерильный контейнер для мочи. Сбор мочи: попросить пациента собрать только первые 10-20 мл (первую порцию) свободно выпущенной мочи. Внимание! Пациент не должен мочиться или иметь половой контакт в течение последних 3 часов до взятия проб Взятие клинического материала с конъюнктивы Инструменты: стерильный ватный/дакроновый тампон на деревянной, пластиковой или алюминиевой ручке. Подготовка к взятию образцов: при наличии гнойного отделяемого оно удаляется стерильным марлевым тампоном. Взятие материала: отводят нижнее веко и стерильным тампоном (для новорожденных используется тонкий тампон на алюминиевой ручке) проводят по поверхности конъюнктивы нижнего века по направлению к внутреннему углу глаза. Использование ложки Фолькмана не рекомендовано. 58 Взятие материала для исследования из прямой кишки Материал из прямой кишки берётся: • если есть симптомы или подозрение на принудительную содомию и в уголовных расследованиях, • при проявлениях проктита со слизисто-гнойными выделениями из прямой кишки, при наличии воспалительного процесса на коже вокруг анального отверстия, • при наличии остроконечных кондилом в перианальной области. Инструменты: • ректальное зеркало/ректоскоп, • стерильный ватный/дакроновый тампон на деревянной или пластиковой ручке (глоточные тампоны). Взятие материала: Материал для исследования из прямой кишки получают либо под контролем глаза с помощью ректоскопа или ректальных зеркал, либо «слепым» методом – из анального отверстия. Стерильный тампон на деревянной или пластиковой ручке вводят на глубину 3 см в канал и производят взятие материала со всех стенок прямой кишки круговыми движениями в течение 10 секунд. Использование ложки Фолькмана не рекомендовано. Внимание! При наличии на тампоне видимых каловых масс тампон выбрасывается и проводится повторная попытка получения материала. Взятие материала для исследования из ротоглотки Материал для исследования берётся у пациентов, имевших оральный секс или при подозрении на него. Инструменты: ватный/дакроновый тампон. Взятие материала: стерильным тампоном на алюминиевой ручке проводят по задней стенке глотки выше нижнего края мягкого неба, а также по поверхности миндалин. Использование ложки Фолькмана не рекомендовано. Внимание! При подозрении на диссеминированную гонококковую инфекцию в дополнение к урогенитальным и экстрагенитальным образцам должна быть взята кровь на культуральное исследование. 5. Транспортировка материала Для микроскопического исследования • каждое стекло с образцом помещается в контейнер для транспортировки в сопровождении соответствующего направления для исследования с указанием данных пациента, • при необходимости хранения материала более 24 часов после высушивания каждый образец отдельно фиксируют 96% этиловым спиртом в течение 3 минут. Фиксация в пламени горелки нежелательна, так как это может повлиять на результат микроскопии. В направлении должно быть указание на проведенную фиксацию препарата. 59 6. Микроскопические методы исследования Преимущества: • быстрота получения результата, • простые условия транспортировки, • несложность в выполнении, • низкая стоимость, • высокая чувствительность и специфичность мазков из уретры мужчин с симптомами. Недостатки: субъективность оценки результата - зависит от опыта специалиста, проводящего • микроскопическое исследование, качества взятия материала, качества окраски, используемого микроскопа. Внимание! Микроскопия пробы с окраской по Граму должна применяться как диагностический метод только у мужчин с уретритом. Этот метод нечувствителен и неспецифичен для диагностики гонореи у женщин, детей или бессимптомных мужчин. • • • низкая чувствительность для эндоцервикальных, вагинальных, фарингеальных и ректальных проб (см. таблицу 5), микроскопический метод не должен быть использован в решении судебных вопросов, низкая чувствительность при латентном течении инфекции. 6.1. Подготовка мазков к окраске Фиксация препаратов в лаборатории • Для окрашивания анилиновыми красителями В случае если нефиксированный препарат доставляется в лабораторию: препарат фиксируют 96% спиртом или трехкратным проведением стекла через пламя горелки. Хранение мазков: Фиксированные препараты можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней. Внимание! При фиксации над пламенем горелки чрезвычайно важно не перегреть стекло с препаратом, так как клетки, находящиеся в препарате, могут разрушиться, и препарат станет непригодным для оценки. • • • • • • • • • • Необходимые оборудование и материалы Бинокулярный микроскоп с возможностью увеличения до х1000, иммерсионное масло, 1% раствор метиленового синего, набор красителей для окраски по Граму, спирт этиловый 96% или петролейный эфир, спиртовка или газовая горелка, дозатор пипеточный переменного объема, песочные часы на 1 и 3 минуты или таймер, приспособление для окраски мазков, перчатки медицинские, 60 • • • • • • дезинфицирующие растворы, емкости для сбора и обработки стекол, предметные стекла, пластиковые пипетки на 30 мкл, стакан на 200 мл, фильтровальная бумага. 6.2. Окраска метиленовым синим Окраска метиленовым синим является ориентировочной и позволяет оценить морфологию и расположение микроорганизмов в мазке. Можно использовать водный или спиртовой растворы метиленового синего. Использование спиртового раствора позволяет сократить время фиксации препарата, не снижая качества окраски. Процедура окраски водным раствором метиленового синего • препарат высушивают на воздухе и фиксируют погружением на 1-2 мин в 96% этиловый спирт, • фиксированный препарат высушивают, затем наносят 1% водный раствор метиленового синего на 1–2 мин (в зависимости от толщины мазка), • тщательно смывают оставшийся краситель струей холодной воды. Процедура окраски спиртовым раствором метиленового синего по Леффлеру • • • • препарат высушивают на воздухе, высушенный препарат опускают в стакан с 1% метиленовым синим по Леффлеру на 10-15 сек, промывают погружением в другой стакан с водопроводной водой, высушивают на воздухе или осторожным промакиванием с помощью фильтровальной бумаги. 6.3. Окраска по методу Грама При окраске по методу Грама в препарате выявляются тинкториальные свойства бактерий. В зависимости от химической структуры клеточной стенки (наличие или отсутствие тейхоевых кислот) бактерии либо обладают способностью удерживать комплекс кристаллического фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом (грамположительные), либо нет (грамотрицательные). Процедура окрашивания по методу Грама: • • • • • • • • • препарат высушивают и фиксируют над пламенем горелки или этиловым спиртом 96% несколько секунд, на фиксированный мазок наливают 1% водный раствор кристаллического или генцианового фиолетового на 1 минуту, препарат промывают водопроводной водой, наносят раствор Люголя примерно до почернения, препарат промывают струей водопроводной воды, мазок обесцвечивают 96% спиртом до тех пор, пока стекающая с мазка жидкость не станет бесцветной. Это обычно занимает 12-20 секунд, в зависимости от толщины препарата. Излишнего обесцвечивания надо избегать, так как это может повлиять на окраску микроорганизмов, препарат вновь промывают водопроводной водой, препарат дополнительно окрашивают 1% водным раствором нейтрального красного или сафранином в течение 1 минуты, краситель сливают, препарат промывают проточной водой и высушивают на воздухе или фильтровальной бумагой. 61 6.4. Контроль качества При проведении процедуры окрашивания для микроскопического исследования каждая партия мазков должна содержать контрольные стекла с заведомо грамположительными и грамотрицательными бактериями. Проведение визуального анализа качества окрашивания препарата (оценка интенсивности окрашивания клеток. Ядра эпителиальных клеток и лейкоцитов окрашены в фиолетовый цвет, а цитоплазма – в розовый цвет). Источники ошибок: • • • • • • • • • • • неудовлетворительное техническое состояние микроскопа затрудняет оценку результата; образец взят из несоответствующего клинической ситуации анатомического места; нарушение техники взятия клинического материала; использование карандаша, не предназначенного для маркировки стекол, в процессе фиксации и окрашивания может загрязнить препарат; неправильное нанесение материала на стекло (необходимо прокатывать тампон по стеклу) может привести к повреждению клеток, вследствие чего может быть нарушена их морфология; недостаточная фиксация в пламени может привести к удалению материала со стекла во время окраски; перегрев во время фиксации может привести к окраске артефактов и повреждению клеток; использование раствора Люголя после истечения его срока годности (раствор является пригодным в течение 90 дней при хранении при комнатной температуре); при переобесцвечивании мазка грамположительные микроорганизмы могут окраситься как грамотрицательные; при недообесцвечивании мазка грамотрицательные микроорганизмы могут окраситься как грамположительные; реактивы, загрязненные другими микроорганизмами, могут давать ошибочные результаты. 6.5. Микроскопия окрашенных препаратов • • • При проведении микроскопического исследования последовательно оцениваются препараты, окрашенные двумя способами: метиленовым синим и по Граму. Заключение выносится по результатам окраски по Граму. Окраска метиленовым синим позволяет сделать заключение о наличии воспаления и выявлении морфотипа бактерий. При окраске по Граму возможно выявление грамотрицательных диплококков. При микроскопии препаратов врачом-лаборантом оценивается наличие эпителия, количество лейкоцитов, эритроцитов, морфотип бактерий (лактобациллы, кокки, коккобациллы), наличие вне - и внутриклеточно расположенных диплококков. Мазки, окрашенные метиленовым синим или по Граму, оцениваются при двух увеличениях (с применением объективов х10, х100, т.е. при увеличении, соответственно, в 100 и 1000 раз). Микроскопическое исследование следует начинать с малого увеличения (х100), позволяющего обнаружить клинический материал на стекле, оценить адекватность взятия из соответствующего анатомического участка, определить 62 • • • • • наличие «загрязнений» из других анатомических участков, выбрать участок препарата для дальнейшего исследования при большом увеличении (х1000). Микроскопия при большом увеличении позволяет выявить и оценить воспалительную реакцию и наличие микроорганизмов. При увеличении х1000 с иммерсией подсчёт лейкоцитов следует проводить, по меньшей мере, в пяти полях зрения. При этом особое внимание следует уделить поиску внутриклеточных диплококков в лейкоцитах. Диагноз уретрита у мужчин ставиться на основании обнаружения 4 и больше лейкоцитов в поле зрения микроскопа при увеличении х1000. При наличии цервицита количество полиморфноядерных лейкоцитов повышено (более 10 при увеличении х1000). При клиническом исследовании следует принимать во внимание наличие или отсутствие слизисто-гнойных цервикальных выделений (зеленовато-желтый гной со слизью на белом ватном тампоне). При исследовании вагинального мазка у женщин нужно помнить о том, что число лейкоцитов зависит от индивидуальных особенностей организма, от дня менструального цикла, наличия внутриматочной спирали и т.д. Поэтому для диагностики слизистогнойного цервицита рекомендуется использовать оба критерия, т. е. наличие клинических проявлений и воспалительный характер цервикального мазка. Диагноз уретрита у женщин подтверждается нахождением более 10 лейкоцитов в поле зрения при увеличении х1000. Следует помнить что, если во влагалище и/или шейке имеется некий патологический воспалительный процесс, и при этом наблюдаются обильные выделения из влагалища, уретральный мазок всегда «загрязнен» материалом этих выделений (клетки плоского эпителия, лейкоциты, вагинальная микрофлора) и не годится для дальнейшей оценки, поскольку он не имеет ничего общего с уретрой. Оценка результатов микроскопии окрашенных мазков На основании микроскопического исследования диагноз гонореи ставится по трем признакам гонококка: его форме, • • расположению, • окраске. Только наличие всех трех признаков позволяет поставить диагноз. Если же выпадает хотя бы один из них, требуется культуральное исследование. Форма гонококка – диплококк, имеющий форму кофейного зерна и располагающийся попарно вогнутыми сторонами друг к другу. Решающее значение при микроскопической диагностике гонореи имеет учёт расположения диплококков. Гонококки в основном располагаются внутри лейкоцитов и эпителиальных клеток. На основании обнаружения диплококков, расположенных вне клеток требуется культуральное исследование. Окраска гонококков (по методу Грама) – красно-розовая (грамотрицательный диплококк). При этом ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток окрашиваются в фиолетовый цвет. Оценка мазков, окрашенных метиленовым синим При микроскопии препарата видны: ядра клеток, окрашенные в синий цвет, цитоплазма, окрашенная в голубой цвет, бактериальная микрофлора, окрашенная в синий цвет. 63 Окраска метиленовым синим или бриллиантовым зеленым является ориентировочной и позволяет оценить морфологию (форму) и расположение микроорганизмов в мазке (внутри лейкоцита и на эпителиальных клетках). Микроскопия мазков из уретры мужчин При проведении микроскопии мазка из уретры, окрашенного метиленовым синим, можно выявить следующие морфологические объекты: слизь (фиолетово-синяя аморфная масса/пучки), цилиндрический/кубический эпителий уретры, сегментоядерные (полиморфноядерные) лейкоциты, микроорганизмы, в том числе вне- и внутриклеточные диплококки, сперматозоиды (редко), дрожжеподобные грибы (псевдомицелий, дрожжевые клетки), трихомонады (клетки с пенистой цитоплазмой голубого цвета и эксцентрично расположенным темно-синим ядром), эритроциты (редко). Микроскопия мазка из цервикального канала При проведении микроскопии мазка из цервикального канала, окрашенного метиленовым синим, можно определить следующие морфологические объекты: цилиндрический эпителий цервикального канала (в большинстве случаев видны только ядра: они овальные, мономорфны по своей окраске, такие же большие, как лейкоциты), сегментоядерные (полиморфноядерные) лейкоциты, микроорганизмы, в том числе внутриклеточные диплококки, трихомонады. Внимание! При нарушении техники взятия клинического материала в мазках определяются клетки плоского эпителия, лейкоциты, вагинальная микрофлора, что делает мазок непригодным для дальнейшей оценки. Микроскопия мазка из влагалища у детей При проведении микроскопии мазка из влагалища, окрашенного метиленовым синим, можно определить следующие морфологические объекты: слизь - фиолетово-синяя аморфная масса/пучки, которая образует фон препарата, клетки плоского эпителия (цитоплазма голубого цвета, ядро темно-синее; края клеток четкие), сегментоядерные (полиморфноядерные) лейкоциты, микроорганизмы, дрожжеподобные грибы (псевдомицелий, дрожжевые клетки), трихомонады (клетки с пенистой цитоплазмой голубого цвета и эксцентрично расположенным темно-синим ядром), эритроциты (редко). Микроскопия мазка из уретры женщин При проведении микроскопии мазка из уретры, окрашенного метиленовым синим, можно выявить следующие морфологические объекты: слизь (фиолетово-синяя аморфная масса/пучки), цилиндрический/кубический эпителий уретры, сегментоядерные (полиморфноядерные) лейкоциты, микроорганизмы, в том числе вне- и внутриклеточные диплококки, эритроциты (редко). 64 Внимание! У женщин при наличии патологического процесса во влагалище и/или цервикальном канале наблюдаются обильные выделения, что приводит к загрязнению образцов материалом этих выделений (клетки плоского эпителия, лейкоциты, вагинальная микрофлора) и делает мазок непригодным для дальнейшей оценки. Оценка мазков, окрашенных по Граму Методика оценки мазка, окрашенного по Граму, принципиально не отличается от методики оценки мазка, окрашенного метиленовым синим (см. выше). Окраска по Граму позволяет выделять в картине мазка красно-розовые (грамотрицательные) или синефиолетовые (грамположительные) элементы. Основной целью исследования является выявление грамотрицательных диплококков со специфической морфологией, а также степени выраженности лейкоцитарной реакции. При правильной окраске препарат должен быть красно-розового цвета, при этом самые тонкие места мазка окрашены в розовый цвет, наиболее толстые – в фиолетовый, а средние по толщине – в лиловый. Ядра клеточных элементов (лейкоцитов, эпителиальных клеток) должны сохранить фиолетовый цвет, в то время как гонококки, локализирующиеся в лейкоцитах и эпителиальных клетках, окрашиваются красно-розовым цветом. При неправильной окраске надо повторить взятие материала и окраску мазка. Высокое качество окраски может быть достигнуто своевременной остановкой процесса обесцвечивания. Когда обесцвечивание недостаточно, ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, и грамотрицательные бактерии могут приобрести фиолетовую окраску и, таким образом, все бактерии будут приняты за грамположительные. В этом случае процесс обесцвечивания спиртом нужно повторить. Если процесс обесцвечивания был слишком долгим, грамположительные микроорганизмы окрасятся в интенсивно красный цвет и будут неправильно расценены как грамотрицательные. • • • • • • • • • При микроскопии мазка, окрашенного по Граму, можно определить следующие морфологические объекты: слизь (красноватая аморфная масса/пучки, которая образует фон препарата), эпителиальные клетки (в большинстве случаев видны только ядра: они овальные/круглые, мономорфны по своей окраске – ярко-фиолетового цвета), сегментоядерные лейкоциты (ядра окрашены в фиолетовый цвет, цитоплазма бледнорозовая), гонококки (красно-розового цвета, расположены как в лейкоцитах, так и внеклеточно, а также на эпителиальных клетках), микроорганизмы (грамотрицательные и грамположительные), сперматозоиды (редко), дрожжеподобные грибы (псевдомицелий, дрожжевые клетки), трихомонады (клетки с пенистой цитоплазмой голубого цвета и эксцентрично расположенным темно-синим ядром), эритроциты (редко). 7. Культуральное (бактериологическое) исследование Общие положения Дополнительно к микроскопии окрашенных мазков, бактериологическое исследование на гонорею должно всегда проводиться при обследовании: • детей, так как у них встречается большое количество непатогенных нейссерий, особенно в полости рта, глотки и гениталиях, 65 • женщин, так как диагностическая чувствительность и специфичность микроскопии генитальных мазков женщин низкая, • пациентов с бессимптомной и экстрагенитальной гонореей (глотки, прямой кишки, конъюнктивы и др.), • половых контактов больных гонореей (где при микроскопии не удалось выявить возбудителя), • У пациентов с гонореей после окончания лечения (не раньше 10 дней) с целью окончательной идентификации нейссерий, • для определения чувствительности нейссерий к антибиотикам, • случае сексуального насилия, при запросе следственных органов или судебномедицинских экспертов. Ответ по результатам посева при выделении чистой культуры и ее идентификации выдается через 5 дней после взятия пробы. Посев от больного рекомендуется делать сразу на питательную среду для выделения гонококков. При невозможности этого необходимо использовать специальные транспортные среды. Принцип метода Выделение культуры Neisseria gonorrhoeae с использованием специальных питательных сред с последующей идентификацией по биохимическим и морфологическим признакам. Преимущества бактериологического метода: высокая чувствительность, • • высокая специфичность, • подходит большинство типов образцов (см. таблицу 4), • позволяет проводить исследование на чувствительность к антибиотикам. Недостатки бактериологического метода: • при нарушении технологии исследования снижается его чувствительность и специфичность, требует много времени по сравнению с ДНК/РНК методами, основанными на амплификации • нуклеиновых кислот, метод более дорогой, чем микроскопия. • Взятие материала (см. выше) Транспортировка (см. выше) Так как гонококки чувствительны к внешним факторам (высушиванию, воздействиям температуры и кислорода), рекомендуется материал, полученный от пациентов, сразу инокулировать на культуральную среду. Если это невозможно, необходимо использовать подходящую транспортную среду или среду сертифицированную и валидированную для этих целей в данной стране. Пробирки с инокулированным материалом должны быть помещены либо в холодильник, либо в инкубатор. Образцы должны быть доставлены в лабораторию как можно быстрее и, оптимально инокулированы на ростовую среду не позднее, чем через 24 часа после взятия материала (максимум – 48 часов). Транспортировка материала должна осуществляться при температуре не ниже 18°C. Питательные среды Гонококки являются весьма требовательными к составу питательных сред микроорганизмами. Они могут расти только на средах, содержащих определенные концентрации аминокислот, пуринов и пиримидинов, а также усваиваемых источников 66 энергии (т.е. глюкозы, пирувата или лактата). Для того, чтобы облегчить идентификацию гонококков, в среду для культивирования добавляют антибиотики, подавляющие рост контаминирующих бактерий и грибов, такие как линкомицин и/или ванкомицин, колистин, нистатин, анизомицин или амфотерицин В, триметоприм. Однако, в редких случаях некоторые штаммы гонококков могут быть чувствительны к используемым концентрациям ванкомицина и/или триметоприма. Для выделения патогенных видов Neisseria, т.е. N. gonorrhoeae и N. meningitidis, используются селективные культуральные среды, сертифицированные и валидированные в данной стране, которые содержат точные концентрации ингибиторов роста сопутствующей сапрофитной микрофлоры (см. ниже). В идеальном случае, в дополнение к селективной среде, используется также неселективная культуральная среда, особенно для проб, полученных из менее контаминированных сайтов, для того, чтобы идентифицировать редкие штаммы, чувствительные к ванкомицину/триметоприму. Однако, распространенность таких штаммов незначительна в большинстве стран [47]. Предлагается целый ряд коммерческих культуральных сред, которые могут значительно различаться по способности обеспечивать рост гонококков и подавлять рост других нейссерий и сопутствующей микрофлоры [45,53]. Таким образом, необходимо использовать эффективные селективные культуральные среды, которые должны быть сертифицированы в данной стране для культивирования гонококков. Токсические факторы, влияющие на рост Neisseria gonorrhoeae. На жизнеспособность гонококков могут влиять разные факторы. Применение любрикантов, спермицидных препаратов, спринцеваний, гормональных контрацептивов могут отрицательно влиять на выделение гонококков. Кроме того, тампоны для взятия материала могут обладать антибактериальными свойствами. Вата, альгинат кальция, дакрон могут быть токсичными для культуры гонококков. Ненасыщенные жирные кислоты, находящиеся в ватных волокнах, хлорсодержащие отбеливатели, смола, входящая в состав деревянных палочек, клей, используемый для соединения тампонов с крышками, также могут быть токсичными для гонококков. Быстрый посев на питательные среды рекомендуется для сокращения экспозиции материала с токсическими веществами и предотвращения высыхания материала. Ингредиенты среды, такие как крахмал, уголь, кровь и дрожжи, действуют как адсорбирующие вещества и также могут быть ингибиторами роста гонококков. • • • • • • • • • • • • • • • Оборудование и реактивы, необходимые для проведения бактериологического исследования термостат на 37°С, эксикатор, СО2 – инкубатор на 37°С, ламинарный бокс, бактериологический анализатор, световой микроскоп, перчатки, предметные стекла, набор для окраски по Граму, стерильные петли, чашки Петри, питательные среды, питательная среда для выделения нейссерий, наборы реагентов для видовой идентификации нейссерий, оксидазный реагент (1% тетраметил-фенилендиамин дигидрохлорида водный раствор). 67 • • • • • • • Источники ошибок нарушение техники взятия биологического материала для исследования, нарушение техники проведения культурального исследования, отсутствие контроля качества питательных сред, отсутствие контрольных штаммов, отсутствие контроля качества реагентов для постановки оксидазного теста, нарушение технологии окраски препарата по Граму, низкая квалификация специалиста. Проведение бактериологического анализа Культивирование нейссерий с использованием питательных сред на чашках Петри Полученный биологический материал необходимо сразу же посеять одновременно на селективную и неселективную питательную среду, поскольку некоторые штаммы гонококков чувствительны к концентрациям ванкомицина и триметоприма, входящих в состав селективной среды. Культивирование гонококков следует проводить на чашках Петри диаметром 90 мм с количеством среды не менее 20 мл на чашку или 100 мм с количеством среды 25 мл. Возможно также использование чашек диаметром 60-40 мм с количеством среды не менее 10 мл. После приготовления чашек со средой они ставятся в термостат при 36±1°С на 1 час для удаления конденсата (излишней влажности). Пересушивание среды недопустимо, т.к. это отразится на качестве роста гонококков. Готовая среда, разлитая по чашкам, хранится в холодильнике при температуре +6°С до 3 недель в герметично закрытых полиэтиленовых пакетах крышками вниз. Превышение срока хранения среды делает выращивание гонококков неэффективным. Перед проведением посева чашки необходимо прогреть в термостате при температуре +36±10 °С в течение 30 минут. Клинический материал от каждого пациента должен засеваться на отдельную чашку Петри. При использовании больших чашек (90 или 100 мм), материал из уретры и цервикального канала у женщин может засеваться на одну чашку Петри в разные ее секторы с соответствующей маркировкой. Материал из уретры мужчин должен засеваться на отдельную чашку. Взятый материал тампоном наносится на поверхность, равную примерно ¼ площади поверхности среды чашки или сектора. Затем стерильной бактериологической петлей материал распределяется по оставшейся площади поверхности питательной среды штриховыми движениями в 3-4 разных направлениях с целью создания условий для роста отдельно расположенных колоний гонококков. Чашки немедленно помещаются в анаэростат с содержанием СО2 5±2%, влажностью 70%, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±1°С. Допускается использование эксикатора, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±1°С, в эксикаторе создаются условия повышенного содержания СО2 при помощи свечи или газогенерирующих пакетов и влажности. Чашки просматриваются через 18-24 часа инкубации, в случае отсутствия роста – через 48 часов. При отсутствии признаков роста через 72 часа инкубации наблюдение прекращают. При выявлении характерных колоний проводится первичная и видовая идентификация (см. ниже). Культивирование N. gonorrhoeae с использованием коммерческой культуральной системы Biocult выполняется следующим образом: • • • дать агару нагреться до комнатной температуры, осторожно, стараясь не повредить слой агара, вынуть его из контейнера, нанести клинический материал на агар, вращая щеточку/тампон по поверхности агара, 68 с помощью стерильного пинцета вынуть CO2-генерирующую таблетку и поместить ее в контейнер, влажный воздух внутри контейнера инициирует процесс выделения CO2, что • необходимо для успешного роста гонококков, при внесении агара в контейнер нельзя прикасаться к таблетке, • • контейнер нужно промаркировать, • инкубировать пробу при 36±1°C в течение 48 часов. При обнаружении колоний с типичной для гонококков морфологией проводится предварительная идентификация (см. ниже). При необходимости проводят подтверждающую идентификацию для постановки окончательного диагноза гонореи (см. ниже). По сравнению с культивированием на больших чашках (диаметром 90 мм), содержащих подходящую культуральную среду, способность N. gonorrhoeae к росту в среде Biocult значительно ниже [45]. • Идентификация нейссерий (B). Первичная идентификация нейссерий Первичная идентификация нейссерий проводится путём: визуальной оценки вида колоний, • • окраски материала из подозрительных колоний по Граму, • проведения оксидазного теста. Оценка вида колоний Типичные колонии гонококков через 18-24 часа инкубации выпуклые, прозрачные, серо-белого цвета, имеют диаметр 0,5-1,0 мм. При дальнейшей инкубации колонии могут увеличиваться в размерах до 3,0 мм и уплощаться. Нередко на одной чашке можно встретить колонии разного вида. Большие трудности возникают при идентификации колоний гонококка в посевах из ротоглотки, так как при этом часто вырастают менингококки и непатогенные нейссерии, колонии которых сходны с колониями гонококков. Колонии менингококка выглядят голубоватыми, колонии непатогенных нейссерий – беловатыми, а гонококков – бесцветными, слизистыми, которые легко снимаются петлей с поверхности питательной среды. Размер, цвет, морфология и консистенция колоний может варьировать в зависимости от применяемой питательной среды. Идентифицировать возбудителя можно только при определении сахаролитических свойств культур или другими тестами, подтверждающими видовую принадлежность микроорганизма (см. ниже). Применение оксидазного теста Обнаружение оксидазоположительных грамотрицательных диплококков считается достаточным для их идентификации как N. gonorrhoeae при рутинной диагностике. Для определения цитохром-c оксидазы можно использовать один из рекомендованных методов: • На подозрительную колонию наносится капля оксидазного реагента (тетраметил-рфенилендиамина, 1% водный раствор). Быстрое изменение цвета реагента, обычно в течение 5-10 секунд, на сине-фиолетовый и его сохранение дольше 30 секунд позволяет считать тест положительным. Реагент, используемый в оксидазном тесте, убивает гонококки, поэтому дальнейшая работа с этими колониями будет невозможна. • Полоска фильтровальной бумаги смачивается несколькими каплями реагента, затем на нее помещается бактериологической петлей материал из подозрительной колонии. Этот способ позволяет сохранить материал на чашке для проведения дальнейших исследований. Высокая чувствительность оксидазного теста не согласуется с его специфичностью. 69 Оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, выделяющие цитохромную оксидазу, поэтому оксидазоположительные колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать микроскопически с окраской по Граму. • Имеются также коммерческие диски и полоски, содержащие диметил-p- фенилендиамна гидрохлорид. Платиновой петлей или стерильной стеклянной палочкой испытуемую культуру наносят на диск, предварительно слегка смоченный дистиллированной водой. • Учёт результата: Темно-лиловое или синее окрашивание, появляющееся через 10-30 секунд, свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Отсутствие изменения цвета – об отсутствии данного фермента. Внимание! Во избежание ложноположительных реакций не следует применять стальную или нихромовую проволоку при проведении оксидазного теста, так как возможно поверхностное окисление этих металлов. Для учёта результатов важно соблюдение временного интервала - 10-30 секунд Окраска препарата из культур по Граму Берут материал из подозрительной колонии, смешивают с небольшой каплей физиологического раствора на предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и окрашивают. При исследовании мазков из культур учитывается морфология, расположение и окраска гонококков. После 18-24 часов культивирования гонококки представляют собой скопления грамотрицательных кокков и диплококков, имеющих более компактное расположение микроорганизмов в центре и разреженное и неравномерное распределение по периферии. Наряду с интенсивно окрашенными в розово-красный цвет кокками встречаются и бледно окрашенные формы. Более старые культуры (48 часов и более) часто тяжело интерпретировать, т.к. отмечается большое количество полностью лизированных клеток. По мере старения культуры увеличивается полиморфность гонококков. Внимание! Для оценки качества окрашивания мазка необходимо оценить изменение окраски в зависимости от толщины мазка. При правильной окраске наблюдается изменение цвета от фиолетового к розовому. В первичной культуре наряду с гонококками могут встречаться штаммы стафилококков и стрептококков, которые легко теряют свою первоначальную фиолетовую окраску при обесцвечивании спиртом, и в процессе окраски по Граму приобретают розово-красный цвет. В этом случае они ошибочно могут быть приняты за гонококки. Препараты с наличием грамотрицательных кокков и диплококков из культуры должны сохраняться в лаборатории в течение 3 месяцев. Видовая идентификация Проводится при выделении оксидазоположительных грамотрицательных диплококков для окончательной диагностики N. gonorrhoeae, специально полученных из экстрагенитальных локализаций. Для подтверждающей идентификации нейссерий используются следующие тесты: изучение ферментативной активности, иммунологические тесты (прямая иммунофлюоресценция, коагглютинация), молекулярно-биологические методы (ПЦР). 70 Изучение ферментативной активности Ферментативная активность Neisseria gonorrhoeae изучается в реакции окисления сахаров. Реакция может быть ложноположительной из-за контаминации исследуемых культур гонококков другими бактериями и ложноотрицательной при использовании гонококков, культивируемых более 24 часов (вследствие аутолиза микроорганизмов) или, если некоторые ингибирующие субстанции были перенесены из чашки, использовавшейся для первичного культивирования. Для предупреждения этих возможных факторов необходимо выделить чистую культуру гонококков путём пересева типичных колоний на чашки Петри с неселективной средой (шоколадный агар). Инкубация проводится в течение 18-24 часов. Проведение видовой идентификации возможно также с использованием бактериологических анализаторов и коммерческих наборов реагентов. Внимание! Первичная культура гонококков не пригодна для изучения их ферментативной активности, т.к. она может содержать другие микроорганизмы, что может привести к ложному результату. Изучение ферментативной активности Neisseria gonorrhoeae может проводиться в росто-зависимых и росто-независимых тестах. При проведении росто-зависимых тестов сахара и другие субстраты (например, феноловый красный) вводятся непосредственно в питательную среду, на которой осуществляется рост гонококка. Однако в настоящее время эти тесты не могут быть рекомендованы, т.к. широко используемые росто-независимые тесты дают возможность получить более быстрый (в течение нескольких часов) и специфический результат, позволяя идентифицировать исключительно Neisseria gonorrhoeae и исключить другие непатогенные нейссерии. Существуют коммерческие наборы для изучения ферментативной активности Neisseria gonorrhoeae. Оценка проводится по изменению цвета среды: при ферментации сахаров – от красного к желтому (результат положительный). Энзимсубстратные тесты с использованием ферментов (орто-нитрофенил-бета-галактозидаза (ONPG), гамма-глютамил аминопептидаза (GLU-AMP), гидроксипролил аминопептидаза (PIP), гидроксипролин аминопептидаза (HPA), пролин аминопептидаза (Pro-AP)) предназначены в основном лишь для быстрой дифференциации между N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. lactamica и некоторыми штаммами N. cinerea и M. catarrhalis. Результаты теста считаются положительными, если происходит изменение цвета среды от бесцветного к желтому для ОФГ и от светло-желтого к интенсивно оранжевому – для Глю-АП и Про-АП. Однако чувствительность и специфичность этих быстрых энзимсубстратных тестов оказались неоптимальными. Результаты тестов утилизации сахаров и продукции ферментов для разных видов Neisseria и Moraxella catarrhalis представлены в таблице 2. Таблица 2 Ферментативная активность бактерий рода Neisseria и Moraxella catarrhalis Виды нейссерий Ферментативная активность Глюкоза N. + gonorrhoeae N. + meningitidis N. lactamica + ПроАП** * Мальтоза Лактоза Сазароза Фруктоза ОФГ * ГлюАП** 0 0 0 0 0 0 + + 0 0 0 0 + 0/+ + + 0 0 + 0 + 71 N. cinerea 0 0 0 0 0 N. sicca + + 0 + + N. mucosa + + 0 + + N. flava + + 0 0 + N. subflava + + 0 +/0 +/0 N. perflava + + 0 + + N. 0 0 0 0 0 flavescens M. 0 0 0 0 0 catarrhalis ∗ - ОФГ – орто-нитрофенил-бета-галактозидаза ∗∗ - Глю-АП – гамма-глютамил аминопептидаза ∗∗∗ - Про-АП – гидроксипролил аминопептидаза + - изменение цвета среды, свидетельствующее о ферментации 0 - отсутствие изменения цвета среды (отсутствие ферментации) +/0 - признак непостоянный у одного и того же штамма. Проведение видовой идентификации возможно также бактериологических анализаторов и коммерческих наборов реагентов. 0 с + использованием Иммунологические/антигенные подтверждающие тесты Иммунологические тесты рекомендуется использовать только в референслабораториях для окончательного подтверждения N. gonorrhoeae. Иммунологические тесты с использованием моноклональных антител для прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), коагглютинации и иммуноферментного анализа являются высоко чувствительными и специфичными для точной идентификации N. Gonorrhoeae [22, 44, 47]. Эти тесты могут проводиться с культурой нейссерий, выделенных при первичном посеве. При этом не требуется выделение чистой культуры гонококков и изоляты могут быть идентифицированы на 18-24 часа раньше, чем при изучении ферментативной активности N. gonorrhoeae. Однако эти тесты дороже, чем ферментативные, коммерческие тест-системы имеют меньший срок годности. Прямая иммунофлюоресценция Тест в большинстве случаев основан на использовании флуоресцирующих моноклональных антител против очищенного ProB белка наружной мембраны гонококка [17, 47], ранее называвшегося 1 или главный белок наружной мембраны гонококка. Очень важно строгое следование инструкции производителя каждого отдельного теста. Проведение анализа прямой иммунофлюоресценции • петлей берут материал из 5 типичных колоний, • взятый материал эмульгируют в капле деионизированной воды на предметном стекле, • высушивают на воздухе, • фиксируют в пламени горелки, • наносят 30 мкл моноклональных антител, • инкубируют 15 минут при 36±1◦ С во влажной камере, • промывают дистиллированной водой, • высушивают на воздухе, • наносят монтирующую жидкость (забуференный глицерин), • накрывают покровным стеклом, • просматривают с применением люминесцентного микроскопа при увеличении х1000. Положительным результатом считается яблочно-зеленое свечение типичных диплококков. 72 Специфичность и чувствительность тестов может достигать 99-100% [17]. Однако эти цифры могут изменяться в зависимости от конкретной используемой тест-системы, соблюдения инструкции производителя, различных клинических штаммов, навыков лабораторных работников. Коагглютинационные тесты Staphylococcus aureus (штамм Covan) является богатым поверхностным протеином А, который связывается с Fc фрагментом иммуноглобулина G 2 и 4 субклассов, оставляя Fab фрагмент свободным для реагирования с антигеном. Убитые прогреванием стафилококки, покрытые антигонококковыми антителами, смешивают с суспензией гонококков, что приводит к появлению хлопьев (агглютинации). Коммерческие наборы используют моноклональные антитела к белку Por B, раньше называемого белком 1 или белком наружной мембраны гонококков. Моноклональные антитела к PorB локализуются на внешней мембране N. gonorrhoeae. В высоко чувствительных и специфических коммерческих тестах моноклональные антитела к белку PorB гонококка конъюгированы с коллоидным золотом вместо протеина А стафилококка. Очень важно строгое следование инструкции производителя каждого отдельного теста. Пример проведения исследования методом коагглютинации: • • • • • • • • примерно 10 изолированных колоний суспендируют в 0,5 мл физиологического раствора, суспензия кипятится в течение 5-10 минут, капля конечного раствора наноситься на стекло, материал из колоний суспендируется на стекле с каплей физиологического раствора, добавляется капля реагента для коагглютинации, при покачивании стекла в течение 1-2 минут оценивается реакция, наличие хлопьев агглютинации свидетельствует о положительной реакции, отсутствие хлопьев агглютинации свидетельствует об отрицательной реакции. Внимание! Для реакции коагглютинации необходимо использовать 18-24-часовую культуру гонококков. Колонии после 48 часов инкубации трудно суспендировать гомогенно из-за высвобождения нуклеопротеина из аутолизированных микроорганизмов. Необходимо строго придерживаться инструкции изготовителя тест-систем для коагглютинации в вопросах проведения процедуры, использования контролей и интерпретации результатов. Некоторые штаммы N. gonorrhoeae могут давать слабую реакцию и её очень важно отличать от ложноположительной реакции, вызванной, например, спонтанной агглютинацией. Чувствительность и специфичность метода коагглютинации Чувствительность и специфичность современных методов коагглютинации составляет 98-100% [19]. Однако эти данные могут варьировать в зависимости от используемой тест-системы, строгих соблюдений инструкции производителя, возраста культуры, навыков лабораторных работников. Очень редко описываются штаммы, которые не реагируют в тестах коагглютинации, наряду с теми, которые дают слабую реакцию. Могут наблюдаться и ложноположительные реакции, связанные с перекрестными реакциями с другими видами нейссерий, такими как N. meningitidis, N. lactamica, N. cinerea. 73 Алгоритм выделения и идентификации N. gonorrhoeae Неселективная среда Клинический материал Селективная среда Инкубация 48-72 часа при 36-±1°С, при 5% СО2 Первичная идентификация: - микроскопическая - оксидазный тест Положительный результат Видовая идентификация: - ферментативная активность - биохимические свойства - иммунологические тесты - молекулярно-биологические тесты Отрицательный результат 8. Контроль качества бактериологического исследования на N. gonorrhoeae Качество культуральной диагностики гонореи определяется целым рядом факторов: • • • • • • • • • • квалификацией врачей и лабораторных работников (см. выше), соблюдением техники взятия клинического материала (см. выше), количеством участков взятия клинического материала (см. выше), соблюдением условий транспортировки (см. выше), составом и качеством питательных сред (см. выше), соблюдением условий инкубации (см. выше), реагентами и оборудованием, используемыми для идентификации выделенных нейссерий (см. выше), интерпретацией всех используемых лабораторных тестов (см. ниже), наличием контроля качества сред для культивирования (см. ниже), наличием контрольных штаммов и проведением контроля качества реагентов и тестов, используемых для культивирования и идентификации различных видов Neisseria (см. ниже). 74 Контроль качества среды Каждую новую партию среды необходимо контролировать на способность поддерживать рост гонококков. Это производится путём посева референс-штаммов гонококков. Каждая новая партия среды должна с использованием референс-штаммов быть исследована на ингибиторные свойства по отношению к другим бактериям и грибам путём использования таких референсштаммов как E. coli, S. epidermidis, N. sicca и C. albicans, а также на стерильность (путём инкубации образца среды в термостате в течение 2 дней). Контроль качества окраски по Граму Каждая новая серия реактивов для окрашивания по Граму должна быть проверена на качество при помощи грамположительных и грамотрицательных штаммов бактерий. Дополнительно, каждый раз при проведении окраски (или если в лаборатории окрашивается мало материалов, то 1 раз в неделю), те же референс-штаммы должны быть включены как контрольные. Контроль качества реактивов для оксидазного теста: Для оценки качества оксидазного реагента положительный, так и отрицательный контроли: обязательно используются как положительный контроль Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, • отрицательный контроль Staphylococcus aureus, Escherichia coli. • Контроль качества для ферментации сахаров и хромогенных энзимсубстратных тестов Каждая новая серия реактивов должна пройти контроль качества при использовании референс-штаммов соответствующих бактерий, например, N. gonorrhoeae, N. meningitides, N. sicca, N. lactamica и M. catarrhalis. Каждый раз, когда проводится видовая идентификация, те же референс-штаммы должны использоваться в качестве контроля. Контроль качества иммунологических/антигенных методов идентификации Каждая новая серия реагентов должна пройти контроль качества с использованием референс-штаммов N. gonorrhoeae (положительный контроль) и других бактерий (отрицательный контроль). Оба эти контроля должны использоваться каждый раз при проведении исследования. Некоторые проблемы культурального исследования на гонококки и способы их решения представлены в таблице 3. 75 Таблица 3 Культуральное исследование на гонококки: возможные проблемы и их решение Система Возможная проблема Решение Селективная среда Неправильная концентрация антибиотиков. Токсичность агара. Дегидратация среды. Неправильное количество среды на чашку. Взятие материала и посев на среду Неправильное взятие материала. Неправильная транспортировка образцов. Неправильное нанесение материала на среду. Поздно проведенный посев. Инкубация Концентрация СО2 слишком низкая. Слишком высокая/низкая температура. Слишком низкая влажность. Время инкубации слишком короткое. Строгое соблюдение инструкции по приготовлению и хранению среды. Контроль качества среды на пригодность для выращивания чувствительного штамма N. gonorrhoeae. Контроль качества среды на подавление роста контрольных штаммов Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Neisseria sicca Candida albicans. Строгое соблюдение инструкции по взятию материала врачом клиницистом. Строгое соблюдение инструкции по транспортировки образцов. Строгое соблюдение инструкции по правилам посева для врача лаборатории. Строгое соблюдение правил инкубации. Контроль концентрации СО2. Контроль температуры. Контроль влажности. Оценка результатов • Рост колоний, не характерных • для N. gonorrhoeae. • Рост N. meningitidis, N. lactamica и других • нейссерий. • Рост сопутствующей сапрофитной микрофлоры. • Неправильная интерпретация оксидазной реакции. • Неправильная интерпретация микроскопического исследования. 76 Строгое соблюдение правил контроля качества среды. Соблюдение инструкции по идентификации гонококков. Безопасность персонала Обеспечивается соблюдением правил работы с потенциально инфицированным материалом (использование перчаток, ламинарного бокса, дезинфектантов, ультрафиолетового облучения и документация контроля качества). Форма ответа результата бактериологического исследования • • Neisseria gonorrhoeae выделены Neisseria gonorrhoeae не выделены 9. Некультуральные методы диагностики гонококковой инфекции Молекулярно-биологические методы Общие положения Для выявления N. gonorrhoeae могут быть использованы ДНК/РНК методы (молекулярно-биологические методы, МБМ), такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), strand displacement amplification (SDA) или transcription mediated amplification (TMA), а также методы, основанные на гибридизации. Существует много коммерческих методов, позволяющих определять N.gonorrhoeae с высокой чувствительностью и в большинстве случаев с высокой специфичностью. Однако результаты, полученные при использовании этих методов, должны оцениваться в связи с клинической ситуацией, так как после проведенного лечения гонореи в некоторых случаях ДНК может определяться в образцах до 2-3 недель после лечения. Однако с целью получения живого микроорганизма и для определения чувствительности к антибиотикам проведение бактериологического исследования является необходимым у пациентов с клинической симптоматикой. Правильнее основывать лечение по известной резистентности антибиотиков в регионе. В некоторых ситуациях молекулярно-биологические методы являются более чувствительными, чем культуральный метод. Чувствительность культурального метода во многом определяется качеством питательной среды и условий транспортирования образца в лабораторию. При соблюдении условий транспортировки клинического материала в лабораторию, использовании качественных питательных сред, строгого проведения условий лабораторного исследования, бактериологическое исследование является методом выбора и наоборот. Следовательно, выбор молекулярно-биологического или культурального метода зависит от организационных условий и качества проведения лабораторного исследования, а также от эпидемиологической ситуации в популяции. В популяции с повышенным риском распространения заболевания бактериологическое исследование является методом выбора. В популяции низкого риска, для скрининга и для исследования неинвазивных образцов молекулярно-биологические методы подходят больше (к примеру, исследование мочи у мужчин и вагинальных образцов у женщин). Однако, если метод используется для исследования популяции низкого риска и он не является высокоспецифичным, возможно получение большого количества ложноположительных результатов. Пациенты с симптомами уже составляют популяцию высокого риска. Молекулярно-биологические методы являются оптимальными для исследования образцов, полученных неинвазивным способом, но их чувствительность и специфичность вариабельны. Чувствительность молекулярно-биологических методов обычно выше при исследовании образцов мочи у мужчин, по сравнению с женскими образцами. Оптимальным для женщин является исследование вагинальных материалов. При исследовании пациентов без клинических симптомов заболевания молекулярнобиологические методы обязательно должны подтверждаться бактериологическим методом. Пока еще нет лицензированных молекулярно-биологических методов для исследования ректальных или фарингеальных образцов. ДНК/РНК методы могут быть использованы для 77 видового подтверждения N.gonorrhoeae из культур. Для этой цели материал, собранный петлей из специфической колонии, может быть перенесен в пробирку типа Эппендорф или любую другую пробирку со 100 мкл забуференного физиологического раствора. Однако этот тест не исключает необходимости предварительной идентификации N. gonorrhoeae (см. выше). Для проведения молекулярно-биологических методов из клинического образца необходимо выделить ДНК в соответствии с инструкцией изготовителя. Преимущества молекулярно-биологических методов • • • • • • • • • • • • • высокая чувствительность 72-95%, высокая специфичность 72-95%, быстрота и возможность автоматизации, возможность использования неинвазивных материалов (например, мочи), возможность использования проб, полученных в домашних условиях, отсутствие необходимости в живых микроорганизмах, возможность выявления нескольких агентов в одной пробе (например, C. trachomatis и N. gonorrhoeae). Недостатки молекулярно-биологических методов проблемы со специфичностью в некоторых тест-системах (например, ложноположительные результаты из-за присутствия в пробе непатогенных нейссерий), проблемы чувствительности в некоторых тест-системах (например, из-за неправильно подобранной генетической мишени и/или присутствия ингибиторов), дорогое оборудование, риск контаминации, отсутствие эффективных протоколов для некоторых типов клинических проб, отсутствие возможности определения чувствительности к антибиотикам и характеристики штаммов. Краткая характеристика некоторых некультуральных методов диагностики, основанных на выявлении нуклеиновых кислот N. gonorrhoeae, приведена в Таблице 4. Таблица 4 Некультуральные коммерческие методы диагностики, основанные на выявлении нуклеиновых кислот N. gonorrhoeae Генетическая мишень Метод Гибридизация 16S рРНК с зондом Хромосомные и плазмидные Гибридизация последовательности с зондом Ген цитозин ДНК метилтрансферазы PCR (в том числе в формате реального времени) Гены Opa LCR 16S рРНК NASBA (в формате реального времени) 16S рРНК TMA SDA Ген pivNG (в формате реального времени) Методы предназначаются для обнаружения N. gonorrhoeae в урогенитальных пробах. В большинстве случаев молекулярно-биологические методы имеют высокую чувствительность и специфичность . Однако наличие субстанций ингибиторов в некоторых образцах, а также тот факт, что у некоторых штаммов N. gonorrhoeae может не быть последовательности, 78 являющейся мишенью для молекулярно-биологического метода, может приводить к снижению чувствительности метода. Известна недостаточная специфичность некоторых ДНК/РНК методов и получено большое количество ложноположительных результатов изза перекрестных реакций с комменсальными видами нейссерий, таких как N. lactamica, N. cinerea, N. Subflava. Высокую специфичность показали новые методы ПЦР анализа, использующие праймеры, направленные на PorA псевдоген N. gonorrhoeae. Этот ген (PorA)/ псевдоген подходит для дифференциальной диагностики N. gonorrhoeae и N. Meningitides. Для всех экстрагенитальных образцов или для определения антибиотикочувствительности должно проводиться культивирование с последующей идентификацией нейссерий до вида. Проведение анализа Выделение ДНК и проведение амплификации Проводится строго в соответствии с инструкцией производителя диагностических наборов. Необходимо строгое соблюдение инструкций по уборке помещений и обработке поверхностей. После окончания работы рабочие поверхности должны обрабатываться ДНК/ РНК деградирующими растворами для удаления ранее амплифицированных нуклеиновых кислот. Интерпретация результатов Не вызывает сомнения, что разработка и внедрение диагностических методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, позволяет существенно улучшить диагностику гонореи, также как и многих других инфекционных болезней. Однако особое внимание следует уделять правильной интерпретации результатов молекулярно-биологических тестов, даже, если в целом они имеют хорошие диагностические характеристики. Это особенно важно в случае применения этих методов для скрининга гонореи в популяциях с низкой распространенностью инфекции. Так при распространенности заболевания в популяции 50%, диагностический тест с чувствительностью и специфичностью 95% выявляет инфицированных и неинфицированных индивидуумов в 95% случаев, тогда как при распространенности инфекции 5% данный тест имеет прогностическую значимость положительного результата только 50% (процент лиц, с позитивным тестом, которые действительно инфицированы). Что касается прогностической значимости отрицательного результата, то он составляет 99,7% (процент лиц, с негативным тестом, которые действительно свободны от инфекции). (Таблица 5) Таблица 5 Прогностическая значимость положительного и отрицательного результата диагностического метода с чувствительностью и специфичностью 95% в зависимости от распространённости инфекции в «группах» пациентов с симптомами. Прогностическая Распространенность Прогностическая значимость заболевания значимость отрицательположительного (%) ного результата (%) результата (%) 1 16,1 99,9 2 27,9 99,9 5 50,0 99,7 10 67,9 99,4 20 82,6 98,7 50 95,0 95,0 75 100 98,3 100,0 83,7 79 Например, при распространенности гонореи в популяции 2%, метод с чувствительностью 90% и специфичностью 98% будет иметь прогностическую значимость положительного результата только 47,9% (Таблица 6.). Даже при чувствительности и специфичности теста 99%, прогностическую значимость положительного результата в данном случае будет 66,9%. Таблица 6 Прогностическая значимость положительного результата диагностического метода в зависимости от уровня чувствительности и специфичности при распространенности инфекции в популяции 2%. Чувствительность (%) Специфичность (%) 50 50 60 70 80 90 95 98 99 2,0 2,4 2,8 3,2 3,5 3,7 3,8 3,8 60 2,5 3,0 3,4 3,9 4,4 4,6 4,8 4.8 70 3,3 3,9 4,5 5,2 5,8 6,1 6,2 6,3 80 4,8 5,8 6,7 7,6 8,4 8,8 9,1 9,2 90 9,2 10,9 12,5 14,0 15,5 16,2 16,7 16,8 95 17,0 19,7 22,2 24,6 26,9 27,9 28,6 28,8 98 33,8 38,0 41,7 44,9 47,0 49,2 50,0 50,2 99 50,5 55,0 58,8 62,0 64,7 66,0 66,7 66,9 Эти данные подтверждают, что нужно быть очень осторожными с интерпретацией результатов в группах с низким риском инфицирования, т.к. высокий уровень ложноположительных результатов в этих случаях может повлечь за собой неоправданное привлечение к обследованию половых партнеров. Контроль качества Внутренний контроль, добавляемый на стадии выделения ДНК, позволяет судить о наличии в пробах веществ, ингибирующих полимеразную цепную реакцию, а также о качестве пробоподготовки. Для внутри- и межлабораторного контроля качества ПЦР-диагностики производители тест-систем выпускают референс-панели, представляющие собой зашифрованные контрольные образцы. Назначением панели стандартных образцов является стандартизация работы ПЦР тест-систем на основе показателей чувствительности, специфичности и воспроизводимости вне зависимости от серии набора, а также стандартизация работы ПЦР-лаборатории вне зависимости от используемых ПЦР тест-систем. Безопасность персонала • • • • • • Со всеми образцами следует обращаться как с потенциально содержащими инфекционные агенты: не пипетировать ртом, запрещается курить, есть и пить на рабочем месте, необходимо использовать одноразовые перчатки и защитную одежду, необходимо тщательно мыть руки после окончания работы, все материалы, включая использованные инструменты, реагенты и образцы, необходимо автоклавировать или замачивать в 1% растворе хлорамина. 80 Внимание! С агарозным гелем следует работать в перчатках. Бромистый этидий – сильный мутаген! Форма ответа • • ДНК Neisseria gonorrhoeae не обнаружена. ДНК Neisseria gonorrhoeae обнаружена. Серологические методы Разработано несколько серологических реакций для обнаружения антител к N. gonorrhoeae, таких как реакция связывания комплемента, латексагглютинации, иммунофлюоресценции и др. Однако ни одна из серологических реакций не позволяет отличить текущую инфекцию от инфекции, перенесенной в прошлом. Поэтому с целью диагностики гонореи серологические реакции не используются. 10. Определение антибиотикочувствительности резистентности n. gonorrhoeae и В последние десятилетия во всем мире увеличилась резистентность N. gonorrhoeae к большинству антибиотиков. Эта резистентность обусловлена хромосомами и плазмидами гонококков (пенициллины и тетрациклины). Однако имеются географические различия в резистентности гонококков и поэтому идеально, если стратегия лечения исходит из данных национального и местного мониторинга за антибиотикочувствительностью N. gonorrhoeae. Необходимо постоянное проведение эпидемиологических исследований референслабораториями для получения точной региональной и национальной информации по антибиотикорезистентности гонококков. • • • • Показания к определению антибиотикочувствительности N. gonorrhoeae: Эпидемиологическое тестирование, регулярно проводимое, например, референслабораториями, для получения данных по устойчивости гонококков к антибиотикам на местном, региональном и национальном уровнях. Отсутствие эффекта стандартной антибактериальной терапии при лечении гонококковой инфекции. Мониторинг клинической эффективности стандартных рекомендуемых стратегий для лечения гонореи. Изучение антигонококковой активности новых антимикробных препаратов. Обнаружение антимикробной резистентности, обусловленной плазмидами В последние годы появляется все больше изолятов N. gonorrhoeae, продуцирующих β-лактамазу, которая инактивирует пенициллин, ампициллин, амоксициллин и др., что приводит к неудаче терапии гонореи β-лактамными антибиотиками. Кроме того, появляются штаммы гонококков, устойчивые к тетрациклинам. Механизм резистентности к этим антибиотикам обусловлен плазмидами. С целью эпидемиологических исследований штаммы гонококков могут быть исследованы на устойчивость к пенициллину и тетрациклинам, вызванную плазмидой. β-лактамазная активность гонококков β-лактамазную активность гонококков определяют при помощи хромогенового цефалоспоринового теста, который в настоящее время является наиболее достоверным и удобным. Для постановки теста используются диски, пропитанные нитроцефином. Нитроцефин – цефалоспорин, изменяющий окраску от желтой до розовой или красной в присутствии β-лактамаз. 81 Процедура проведения тестирования: • диск с нитроцефином помещается на чистую сухую чашку Петри или предметное стекло и смачивается дистиллированной водой, или же диск может быть внесен в пробирку, содержащую 0,3 мл стерильной дистиллированной воды, • на диск бактериологической петлей помещается материал с 5-10 колоний гонококков или же суспендируется в пробирке, • за изменением цвета диска наблюдают от 5 сек до 15 мин, если применяется пробирка, то за изменением цвета наблюдают 10-30 минут при инкубации при комнатной температуре или при 36±1◦С, • при изменении цвета с желтого на розовый или красный в течение 5-15 секунд тест расценивается как положительный. При отсутствии изменения окраски через 15 минут – как отрицательный. При использовании пробирки результаты оцениваются после 10-30 минут. В качестве положительного контроля используется референс-штамм Haemophilus influenzae, в качестве отрицательного контроля – референс-штамм Enterococcus faecalis. Возможно использование и других тестов (ацидометрический, йодометрический), однако они более сложны в техническом исполнении. Внимание! Для проведения теста необходимо использовать суточную культуру гонококков (не более 24 часов инкубации). Если используются коммерческие тесты, то необходимо строго следовать инструкции производителя. Резистентность к тетрациклинам, обусловленная плазмидой Плазмидную резистентность гонококков к тетрациклинам определяют дискодиффузионным методом, используя диск с концентрацией тетрациклина 30 мкг. Методика описана ниже. Отсутствие зоны задержки роста или ее очень маленький диаметр (< 19 мм) свидетельствует о плазмидной резистентности гонококков к тетрациклинам. Методы, рекомендуемые для определения чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам Общие положения В связи с тем, что в настоящее время нередко встречаются изоляты гонококка, устойчивые к большинству используемых для лечения гонореи препаратов, в ряде случаев возникает необходимость в проведении теста с определением антибиотикочувствительности выделенных гонококков. Однако определение чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам не рекомендуется использовать в качестве рутинного исследования при лечении гонореи у всех пациентов. Определение чувствительности N. gonorrhoeae к антибактериальным препаратам проводится одним из нескольких методов: диско-диффузионным, методом серийных разведений в агаре, с использованием Е-теста. Диско-диффузионный метод, а также молекуляоно-биологические методы, позволяющие определить генетические маркеры, кодирующие резистентность гонококков к определенным классам антибиотиков, относятся к качественным тестам. К количественным тестам определения чувствительности относятся методы разведения в агаре и Е-тест, которые позволяют выявить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика, т.е. наименьшую концентрацию антибиотика, при которой подавляется видимый рост тестируемого микроорганизма. 82 Минимальный набор антибактериальных препаратов для определения антибиотикочувствительности гонококков должен состоять из наиболее характерных представителей различных групп, применяемых для лечения гонореи: пенициллин, цефтриаксон, ципрофлоксацин, спектиномицин, азитромицин, тетрациклин. Рекомендуемый перечень антибактериальных препаратов чувствительности / резистентности N. gonorrhoeae: для определения препараты группы пенициллина: бензилпенициллин, ампициллин; препараты группы тетрациклина: тетрациклин, доксициклин; препараты группы макролидов: эритромицин, азитромицин, джосомицин; препараты группы фторхинолонов: ципрофлоксацин, офлоксацин, моксифлоксацин; препараты группы цефалоспоринов: цефтриаксон, цефотаксим, цефиксим; препараты группы аминогликозидов: канамицин, гентамицин, спектиномицин. К числу обязательных относятся антибактериальные препараты, принадлежащие к разным классам антибиотиков, применяемых для лечения гонореи, то есть диски с цефтриаксоном/цефиксимом, ципрофлоксацином/офлоксацином, спектиномицином. Дополнительно для эпидемиологических целей в референс-лабораториях используют бензилпенициллин/ампициллин, цефотаксасим, тетрациклин/доксициклин, азитромицин/ эритромицин, канамицин/гентамицин. Перечисленные антибиотики являются основными в терапии гонококковой инфекции, поэтому диски с этими препаратами целесообразно использовать при рутинном лабораторном исследовании, и информация о результатах исследования должна передаваться лечащему врачу. Диско-диффузионный метод Общие положения Диско-диффузионный метод может выполняться в любой лаборатории, проводящей культивирование гонококков. Этот метод основан на способности антибиотиков диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост гонококков, посеянных на поверхности среды. Для определения чувствительности к антибиотикам используется та же среда, что и для выделения гонококков. Для определения чувствительности гонококков к антибиотикам следует использовать только стандартизированные качественные диски. Для применения диско-диффузионного метода можно использовать любые производимые промышленностью диски стандартного размера и соответствующей концентрации. Рабочий запас дисков с антибиотиками следует хранить при 6±20С. Диски с бета-лактамными антибиотиками должны храниться замороженными (при -200С). После извлечения из холодильника упаковка с дисками выдерживается при комнатной температуре в течение 1 часа. Процедура проведения исследования диско-диффузионным методом При определении чувствительности используют стандартное разведение гонококков, соответствующее по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащее примерно 1,0х108 КОЕ/мл. Исследование рекомендуется проводить в 90-100 мл. чашках Петри, содержащих 25 мл среды для получения гомогенного роста. Разведение гонококков следует использовать в течение 15 минут после приготовления. 83 Нанесение взвеси гонококков на чашки Петри. Для нанесения взвеси гонококков на чашки Петри можно использовать один из двух способов: Нанесение взвеси гонококков с использованием коммерческих стерильных ватных тампонов. Для этой процедуры рекомендуется использовать тампоны из хлопковой ваты на деревянных палочках. Тампоны из синтетического материала не впитывают суспензию в достаточном количестве для посева по всей поверхности чашки. Тампон погружают в стандартную суспензию, затем избыток удаляют отжатием тампона о стенки пробирки. Нанесение суспензии проводят штриховыми движениями в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 600. Тампоном обрабатывают поверхность агара 3-4 раза. Нанесение взвеси гонококков с использованием пипетки. На поверхность чашки Петри с питательной средой в объеме 1-2 мл, равномерно распределяют по поверхности агара покачиванием, после чего удаляют избыток пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Через 5-10 мин. на поверхность агара наносят диски с антибиотиками. Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 90-100 мм следует помещать не более 6 дисков. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом. Не следует один из дисков располагать в центре чашки. Диск, нанесенный на поверхность питательной среды нельзя перемещать на новое место. Сразу после нанесения дисков чашки Петри помещают в анаэростат с концентрацией СО2 5±2% и инкубируют в термостате при температуре 36±1о С в течение 20-24 часов. Увеличение интервала времени между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации может привести к искажению результата. Учёт результатов проводится путём измерения диаметра (мм) зоны полного подавления видимого роста гонококков. Не следует обращать внимания на очень мелкие единичные колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста. В таблице 11 представлена интерпретация результатов определения чувствительности N. gonorrhoeae диско-диффузионным методом. Внимание! Для постановки теста необходимо использовать суточную культуру гонококков (не более 24 часов инкубации). Метод серийных разведений в агаре Общие положения Принцип метода заключается в приготовлении ряда последовательных разведений антибиотиков в питательной среде с внесением во все разведения исследуемой культуры гонококков. По подавлению роста бактерий определенной концентрацией антимикробного препарата судят о степени чувствительности данного штамма. Определение чувствительности N.gonorrhoeae методом разведения в агаре является референтным методом определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика. Этот метод используется в референс-лабораториях для проведения эпидемиологических исследований с целью получения информации об антибиотикорезистентности гонококков и мониторинга ситуации в регионах, для мониторинга клинической эффективности стандартных рекомендованных методик лечения гонореи, для изучения эффективности новых антимикробных препаратов. 84 Процедура проведения метода серийных разведений в агаре На первом этапе необходимо подготовить чашки Петри с необходимой концентрацией антибиотиков. Готовые чашки Петри с различными концентрациями антибиотиков в питательной среде не должны храниться в холодильнике более одной недели из-за возможной потери антимикробной активности. Для определения чувствительности используют стандартное разведение гонококков, соответствующее по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащее примерно 1,0х108 КОЕ/мл. После приготовления суспензии в течение не более чем 15 минут проводят посев культуры на чашки с разными концентрациями антибиотиков. На одну чашку можно поместить несколько штаммов гонококков при помощи специального репликатора. В первую очередь произвести посев: на чашку со средой, не содержащей антибиотика (отрицательный контроль), далее проводится последовательный посев на чашки Петри со средой, в порядке возрастания концентрации антибиотика, последней засевается еще одна чашка со средой без антибиотика (второй отрицательный контроль) для исключения контаминации в процессе посева, кроме тестируемых штаммов гонококков обязательно проводится посев референс-штамма N.gonorrhoeae с известной чувствительностью к тестируемым антибиотикам, Сразу после проведения посева чашки Петри помещают в эксикатор со свечей и инкубируют в термостате при температуре 36±1о С в течение 24 часов или в СО2- инкубатор с концентрацией СО2 5% . По истечению 24 часов проводят оценку результата. Минимальной подавляющей концентрацией считается наименьшая концентрация антибиотика, при которой отсутствует рост гонококка. В таблице 9 представлены данные по МПК для различных антибиотиков. Е-тест Общие положения Определение чувствительности N.gonorrhoeae с использованием Е-теста может быть проведено в лабораториях, осуществляющих культуральную диагностику гонореи. Метод похож на диско-диффузионный, при этом методе используются бумажные полоски с различными концентрациями антибиотиков на одной полоске. Сущность метода заключается в способности антибиотиков диффундировать из пропитанных ими бумажных полосок в питательную среду, угнетая рост гонококков, посеянных на поверхности агара. Процедура проведения Е-теста: Используется стандартное разведение гонококков, соответствующее 0,5 стандарту МакФарланд содержащее примерно 1.0x108 ИФЕ/мл. Используют чашки Петри диаметром 90-100 мл (25 мл среды) или 140-150 мл (60 мл среды) для получения гомогенного роста. Приготовленная суспензия гонококков должна использоваться в течение 15 минут со времени ее приготовления. Процедура посева культуры гонококков проводится аналогично методике, описанной для диско-диффузионного метода. Полоски E-теста, содержащие градиенты концентрации различных антибиотиков, наносятся на поверхность агара с помощью стерильного пинцета. Полоски должны быть нанесены равномерно и плотно прилегать к агару, для этого их нужно аккуратно пригладить пинцетом в направлении от низкой концентрации к высокой. После того, как полоска нанесена, она не должна передвигаться на другое место. На чашку диаметром 90-100 мм наносится одна 85 полоска. На чашку диаметром 140-150 мм можно нанести до 4 полосок, укладывая их по радиусу чашки. Сразу после инокуляции чашки помещаются в инкубатор, содержащий 5±2% CO2, приблизительно 70% влажности, с температурой 36±1ºC на 16-18 часов (для этой цели также могут быть использованы эксикатор со свечой и обычный инкубатор с температурой 37°C). Результат учитывается по зоне задержки роста гонококков и оценивается по МПК каждого тестируемого антибиотика. Важно На результаты тестирования чувствительности к антибиотикам значительно влияют такие микробиологические параметры, как размер инокулята из свежей культуры, состав и объем культуральной среды, качество антибиотиков/дисков/стрипов для Е-теста, условия инкубации, а также применяемые критерии ингибирования. В связи с этим оптимизация, стандартизация и контроль качества используемой процедуры тестирования N. gonorrhoeae к антибиотикам имеют решающее значение. Критерии интерпретации (чувствительный, промежуточный и резистентный) необходимо оптимизировать для каждого метода. Кроме того, на регулярной основе с применением всех методов необходимо анализировать референс-штаммы N. gonorrhoeae, для которых установлена их чувствительность/резистентность к тестируемым антибиотикам. Сохранение выделенных культур N.gonorrhoeae При необходимости жизнеспособную культуру N.gonorrhoeae можно поддерживать ежедневными пересевами на питательной среде. На короткий период времени (не более одного месяца) свежую культуру можно сохранять в холодильнике при – 200 С. Длительное хранение при этой температуре не желательно, так как гонококки могут быстро терять жизнеспособность. Для более длительного хранения (в течение нескольких месяцев – 3-5 лет) культуру в среде для замораживания поместить в холодильник при – 40-70о С. Штаммы гонококка могут также сохраняться путём лиофилизации или заморозки в жидком азоте (более 5 лет). Контроль качества Постоянно проводимая программа контроля качества должна быть частью постоянной работы каждой микробиологической лаборатории. На качество работы по диагностике гонореи могут повлиять качество и состав питательных сред, реагенты, оборудование и лабораторный персонал. Во всех лабораториях должны быть единые принципы работы с клиническим материалом и результаты исследований, выполняемых по одним и тем же методикам, должны быть сопоставимы. Этой цели служат разработанные международные стандарты по контролю качества. 86 Хламидии 1. Введение Данное руководство создано с целью предоставления современной информации о лабораторной диагностике хламидийной инфекции, передаваемой половым путем (ИППП) в Кыргызстане. Chlamydia trachomatis является основным возбудителем урогенитальных инфекций среди сексуально активных подростков и людей молодого возраста. Основными осложнениями нелеченной урогенетальной хламидийной инфекции у женщин являются воспалительные заболевания органов малого таза (до 40%), что, в свою очередь, часто приводит к развитию трубного бесплодия или эктопической беременности. Нелеченная хламидийная инфекция во время беременности может приводить к развитию конъюнктивита или пневмонии у новорожденного. У мужчин последствием длительной нелеченной хламидийной инфекции является эпидидимит. Инфекции генитального тракта, вызванные C. trachomatis, независимо от пола пациента, могут приводить к реактивным артритам. Расходы национальных систем здравоохранения на лечение последствий хламидийной инфекции являются существенными. Исследования экономической эффективности в развитых странах показали, что лучшей стратегией в данном случае является диагностика и лечение первоначальной неосложненной инфекции. Однако, большинство случаев хламидийной инфекции, особенно у женщин, протекает бессимптомно. Это влечет за собой определенные трудности. На основании жалоб пациента и клинической картины нельзя поставить окончательный диагноз генитальной хламидийной инфекции, поэтому необходимо использовать эффективную лабораторную диагностику. Целевая группа, подлежащая обследованию Лица с ИППП Таблица 1 Основные клинические показания для обследования на хламидийную инфекцию Показания Пациенты Мужчины Женщины • слизистые или слизисто-гнойные выделения из уретры, • симптомы дизурии, а также мужчины младше 35 лет с симптомами эпидидимита. • • • цервикальные и/или вагинальные выделения, симптомы аднексита, сексуально активные лица, имеющие много половых партнеров в возрасте <25 или лица, занимающиеся коммерческим сексом. • новорожденные от матерей, больных хламидийной инфекцией во время беременности и не получивших лечение до родов, а также новорожденные с симптомами конъюнктивита. • • • • половой контакт с больным хламидийной инфекцией, при обследовании на другие ИППП, отягощённый акушерско-гинекологический анамнез, привычное невынашивание. Новорожденные Другие показания 87 Факторы риска развития хламидийной инфекции: лица, занимающиеся коммерческим сексом, сексуально активные лица, имеющие много половых партнёров, ранее перенесенные ИППП, половой контакт с больным хламидийной инфекцией или/и уретритом/цервицитом. • • • • В направлении на обследование должно быть указано: идентификационные данные пациента, пол и возраст пациента, анатомическая область взятия материала, дата взятия материала, предварительный диагноз, выбранный метод лабораторной диагностики. • • • • • • 2. Классификация инфекций, вызванных Chlamydia trachomatis Таблица 2. Классификация инфекций, вызванных Chlamydia trachomatis, в соответствии с международной классификацией болезней (МКБ - X). A55 Хламидийная лимфогранулема (венерическая). A56 Другие хламидийные болезни, передающиеся половым путем. A56.0 Хламидийные инфекции нижних отделов мочеполового тракта. A56.1 Хламидийные инфекции органов малого таза и других мочеполовых органов. A56.2 Хламидийная инфекция мочеполового тракта неуточненная. A56.3 Хламидийная инфекция аноректальной области. A56.4 Хламидийный фарингит. A56.8 Хламидийные локализации. инфекции, передающиеся половым путем, другой Chlamydia trachomatis Порядок Chlamydiales представлен грамотрицательными, облигатными внутриклеточными бактериями с характерным двухстадийным циклом развития. Инфицирование начинается с эндоцитоза элементарных телец, устойчивых к воздействию внешней среды, которые затем внутри включений, ограниченных мембраной клетки, трансформируются в более крупные и хрупкие ретикулярные тельца, которые в свою очередь размножаются путем бинарного деления, что в конечном счете приводит к увеличению количества инфекционных элементарных телец (см. схему ниже). Представители порядка Chlamydiales не могут расти на бесклеточной среде. Порядок имеет несколько семейств. Особенный интерес представляет семейство Chlamydiaceae, которое включает в себя два рода: Chlamydia и Chlamydophila, члены которых больше чем на 90% имеют гомологичную последовательность 16S рРНК и характерный KDO-трисахарид в составе эндотоксина. Внутри рода Chlamydia, бактерии вида C. trachomatis являются основными возбудителями хламидийной 88 инфекции генитального тракта у человека. В классификации порядка Chlamydiales описаны последовательности 16S и 23S рРНК, характерные для семейства, рода и вида. Более того, Chlamydia trachomatis может быть серологически типирована примерно на 18 сероваров на основании характерных антигенных участков основного протеина наружной мембраны. Серовары от A до С вызывают классическое заболевание глаз – трахому, тогда как серовары от D до K изначально вызывают генитальную инфекцию и поражение глаз, а серовары L1, L2 и L3 – более инвазивные формы инфекции, передающиеся половым путем, - венерическую лимфогранулему с характерным поражением лимфатических узлов. 3. Пути передачи и клиническая картина Chlamydia trachomatis передается главным образом при тесном контакте между слизистыми оболочками урогенитального тракта, анального канала или орофарингеальной области во время сексуального контакта. Новорожденные дети могут заразиться во время прохождения через инфицированные родовые пути, что приводит к развитию конъюнктивита или атипично протекающей пневмонии. У мужчин инфекция чаще всего проявляется уретритом, у женщин она чаще всего вызывает развитие эндоцервицита. Бессимптомное течение инфекции наблюдается у мужчин приблизительно в 40 – 50% случаев, у женщин – в 70 – 80%. При отсутствии лечения восходящая хламидийная инфекция генитального тракта у женщин может приводить к транзиторному эндометриту и последующему воспалению и блокаде/дисфункции фаллопиевых труб, в результате чего могут возникнуть воспалительные заболевания органов малого таза, эктопическая беременность или бесплодие. Основные симптомы, клинические проявления и осложнения хламидийной инфекции представлены в Таблице 3. 89 Таблица 3. Клинические проявления неосложненной и осложненной хламидийной инфекции Пациенты Женщины Мужчины Новорожденные и младенцы Клинические симптомы цервикальные и /или вагинальные слизистогнойные выделения, дизурия, боли внизу живота, нерегулярные вагинальные и/или цервикальные кровянистые выделения, диспареуния. слизисто-гнойные выделения из уретры, дизурия, боль при мочеиспускании, боли в мошонке. Конъюнктивит, пневмония с атипичным течением в первые шесть месяцев жизни. Дети Мужчины и женщины Клинические проявления цервицит, уретрит, воспалительные заболевания органов малого таза. эпидидимит уретрит. Осложнения воспалительные заболевания органов малого таза, синдром хронических тазовых болей, перигепатит, бесплодие, эктопическая беременность, конъюнктивит, реактивный артрит. орхит, конъюнктивит, реактивный артрит. конъюнктивит, пневмония в первые шесть месяцев жизни. уретрит, вульвовагинит, проктит, конъюнктивит. бессимптомная инфекция. проктит, фарингит, бленнорея с включениями, реактивный артрит. 4. Взятие образцов, хранение и транспортировка Общие положения Для диагностики методами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК): тампон помещается в транспортную среду, предоставленную производителем. Если производитель не предоставил транспортной среды, может быть использована среда 2SP с добавлением антибиотиков, таких как ванкомицин, гентамицин или амфотерицин В. Исследования показали, что при транспортировке тампона в лабораторию в сухом виде результаты диагностических тестов были такими же, как при транспортировке в транспортной среде. 90 Для прямой иммунофлюоресценции: тампон прокатывается по поверхности предметного стекла. Предпочтительнее использовать предметные стекла с лунками посередине. На стекле должен быть тонкий слой клинического материала. Для культурального исследования: материал собирается в специальные пробирки с транспортной средой (например, 2SP с добавлением антибиотиков, таких как ванкомицин, гентамицин или амфотерицин В). Тампон помещается в пробирку, обламывается о край пробирки и оставляется внутри. Если тампон сделан из нетоксичных материалов или не содержит веществингибиторов, то такой тампон можно также оставлять в пробирке для последующего анализа МАНК (если он запланирован). Взятие клинического материала для диагностики Chlamydia trachomatis Клинический материал берется при следующих условиях: • • • пациент не использовал антибиотики в течение последних 48-72 часов, если возможно, не проводить взятие образцов во время менструаций у женщин, у мужчин и женщин взятие образцов из уретры и сбор мочи необходимо проводить не ранее 2 часов после мочеиспускания. Инструменты для взятия материала • • • • • ложка Фолькмана, ватные/дакроновые тампоны, специальные щёточки, ватный тампон для удаления выделений из цервикального канала, контейнер для мочи или эякулята. Тампоны для взятия материала могут содержать остатки волокон, стержня и клея, поэтому могут повлиять на качество исследования и рост культуры (быть токсичными для культуры клеток и подавлять рост C. Trachomatis и т.д.). Пластмассовые или металлические стержни лучше, чем деревянные. Дакрон, искусственный шелк и волокна полиэтилентерефталата предпочтительнее альгината кальция. Цитощетки на проволочном или пластмассовом стержне являются превосходным средством для получения материала из цервикального канала. Внимание! Противопоказано использование щеток во время беременности. Уретра у мужчин (C) − ввести тампон в уретру (на 2-4 см), − тампон слегка повращать в уретре в течение нескольких секунд, затем вынуть из уретры. Уретра у женщин − при наличии большого количества выделений наружное отверстие очистить с помощью марлевого тампона, − ввести тампон в уретру (на 1-2 см), − тампон слегка повращать в уретре в течение нескольких секунд, затем вынуть из уретры. *Детям препубертатного возраста брать материал из уретры не рекомендуется. Экссудат берется исключительно из наружного отверстия мочеиспускательного канала маленьким тампоном или собирается моча для исследования методами определения ДНК/РНК. 91 Эндоцервикс (B) − тщательно очистить наружное отверстие цервикального канала от вагинальных выделений при помощи большого ватного тампона, − очистить наружное отверстие цервикального канала от вагинальных выделений стерильным ватным тампоном или большим марлевым тампоном, − ввести тампон в цервикальный канал на 1-2 см, повращать его в цервикальном канале в течение 15 секунд и вынуть. *Цервикальные мазки не берутся у девочек препубертатного возраста. При подозрении на хламидийную инфекцию в этом возрасте мазки берутся из преддверия влагалища, а также собирается моча для исследования. Влагалище (например, взятии образца самим пациентом*, и у девочек препубертатного возраста) (C) − зеркала не используются, − тампон осторожно вводится во влагалище и материал берется с задней стенки влагалища. Беременные женщины могут проходить обследование на хламидии на любом сроке беременности. Взятие материала проводится из уретры и цервикального канала. Где доступно берется моча на ПЦР. * МАНК для диагностики хламидийной и гонококковой инфекции при исследовании влагалищных образцов, полученных самими пациентами, высоко чувствительны и специфичны, а сама процедура получения материала хорошо воспринимается пациентами Дополнительное исследование образцов, полученных из уретры женщин, может привести к искусственному увеличению количества положительных проб по сравнению с исследованием только эндоцервикальных образцов. Конъюнктива отводится нижнее веко и тампоном проводится по поверхности конъюнктивы нижнего века по направлению к внутреннему углу глаза, при наличии гнойного отделяемого оно удаляется стерильным ватным тампоном. Прямая кишка тампон вводят на глубину 2 – 3 см в канал и получают материал со всех стенок прямой кишки по направлению изнутри кнаружи, а затем круговыми движениями. Материал для исследования из прямой кишки получают с помощью: − ректоскопа или − ректальных зеркал, либо − «слепым» методом – из анального канала. При использовании ректоскопа риск контаминации каловыми массами ниже и сбор материала производится под контролем глаза. 92 Таблица 4 Рекомендации по транспортировке и хранению образцов, используемых для разных диагностических методов. Метод исследования Методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) Прямая ммунофлюоресценция (ПИФ) Иммуноферментный анализ (ИФА) Культуральный метод (КМ) Условия Во время транспортировки материала в лабораторию образцы должны находиться в сумкехолодильнике при +6±2оC. Образцы мочи могут храниться при +6±2оC в течение одной недели и их не надо замораживать. Образцы могут транспортироваться и храниться в транспортной среде, предоставленной производителем, в других случаях (для большинства тестов) - в среде 2 SP (с добавлением антибиотиков) или сухими. Образцы для ПИФ необходимо в тот же день доставить в лабораторию. При необходимости материал должен быть фиксирован в течение 1-2 минут холодным ацетоном и его можно хранить при +6±2оC в течение 3 дней, при – 20оС – в течение 1 месяца. Комментарии необходимо четко соблюдать инструкцию производителя. В случае несоблюдения правил взятия и условий доставки биологического материала (разбитые, не промаркированные, склеенные друг с другом стекла, отсутствие материала на стекле) образцы не подлежат исследованию, об этом сообщается врачу, направившему биологический материал на исследование; разбитые стекла подлежат уничтожению. материал должен собираться в необходимо четко специально предназначенную соблюдать инструкцию транспортную среду. производителя. до транспортировки материал следует поместить в специальную транспортную среду (например, 2SP с добавлением антибиотиков) и хранить в холодильнике при +6±2оC и в течение 24 часов, доставить в лабораторию в сумке-холодильнике, исследование требует сохранения живых хламидий, и изменение температуры при 93 Хламидии очень требовательные микроорганизмы, поэтому условия транспортировки должны соблюдаться очень точно. транспортировке может быть решающими для получения достоверного результата, в лаборатории пробы хранятся при +6±2оC в течение 24 часов. В случае необходимости более длительного хранения, пробы замораживают до минус 70°С. 5. Методы диагностики хламидийной инфекции: • • • • методы определения нуклеиновых кислот: определение специфических последовательностей нуклеиновых кислот C. Trachomatis, методы выявления антигенов (прямая иммунофлюоресценция – ПИФ, иммуноферментный анализ – ИФА), быстрые тесты или тесты у постели больного, культуральный. Таблица 5 Методы, рекомендуемые для диагностики хламидийной инфекции Метод диагностики ПЦР (МАНК) ПИФ ИФА Комментарии Предпочтительный метод диагностики. Для анализов может использоваться образец из любой области взятия материала. Чувствительность и специфичность достаточны для рутинной диагностики. Может применяться при отсутствии молекулярно-биологических методов. Чувствительность ниже, чем МАНК и сравнима/или выше, чем при культуральном исследовании. Доступный метод в Кыргызстане. Воспроизводимость методов низка и нет согласованных стандартов. У некоторых людей иммунный ответ на хламидийную инфекцию может быть отсрочен или даже отсутствовать после перенесенной хламидийной инфекции. Серологическое исследование не рекомендуется для рутинной диагностики хламидийной инфекции. ИФА метод в диагностике УГХ и контроле его терапии на сегодня допустимо применять только в комплексе с более информативными прямыми методами идентификации «ИФА+ПИФ или ИФА+ПЦР». 94 Культуральный Имеет трудности транспортировки, сложные условия стандартизации проведения исследования, результат значительно зависит от условий проведения, процедура исследования сложна и требует времени. Не рекомендован для рутинного использования. Рекомендуется в качестве контроля излеченности и для судебномедицинской экспертизы. В редких случаях для проведения теста на антибиотикочувствительность. Большинство доступных коммерческих тест-систем не предназначены для исследования образцов из некоторых анатомических локализаций (глотка, конъюнктива, прямая кишка) и существует большая вероятность ингибирования. Таким образом, предварительная очистка/выделение ДНК может повысить чувствительность метода. 5.1. Метод определения нуклеиновых кислот Метод гибридизации нуклеиновых кислот Все методы диагностики хламидий с определением нуклеиновых кислот основаны на гибридизации, но здесь речь идет о тех методах, в которых нет предшествующей амплификации определяемых нуклеиновых кислот. Лучшим примером такого метода является GenProbe PACE 2 тест, одобренный FDA и впервые появившийся в 1988 году, до сих пор широко используемый. Его чувствительность основана на тщательной оптимизации и на том факте, что мишенью является рРНК, находящаяся в клетках хламидий в большом количестве копий, что эффективно используется как природная пре-амплификация. Учитывая, что рРНК обычно одно-цепочечная молекула, нет необходимости в термической денатурации для разъединения цепей перед гибридизацией, которая происходит в течение 60 минут при температуре 60ºC. Зонд, помеченный акридиновым эфиром, генерирует световой сигнал, считываемый при помощи обычного люминометра.. Преимущества ДНК гибридизации Популярность теста основывается на том, что он прост в исполнении, достаточно быстрый (2 часа) и может быть использован для исследования большого количества образцов. Комбинация простоты и низкой стоимости делает использование этого метода привлекательным в разных условиях. Недостатки ДНК гибридизации Чувствительность неамплификационных зондовых тестов значительно ниже, чем ведущих методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот. 5.2. Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) Основной мишенью для амплификационных тестов на C. trachomatis также является мультикопийный генный продукт, такой как криптическая плазмида хламидий или ген, кодирующий рибосомальную РНК. Клиники и лаборатории, рассматривающие идею начать использовать эти тесты, должны подумать не только о чувствительности, специфичности и клинических требованиях, но также о соответствии оборудования и помещений, технологических процессов в лаборатории, персонала и количества образцов для данного исследования. 95 Преимущества МАНК Основным преимуществом методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, для диагностики инфекций, вызванных C. trachomatis, является их исключительная чувствительность в совокупности с высокой специфичностью. Данные тесты показывают высокий уровень выявления C. trachomatis у пациентов, имеющих жалобы и клинические проявления, и адекватный уровень у пациентов с бессимптомным течением (у которых количество хламидийных телец часто меньше). Эти методы позволяют также использовать клинический материал, полученный неинвазивным путем, например, первую порцию мочи или влагалищный материал, взятый самим пациентом. Недостатки МАНК Недостатком МАНК является их стоимость, которая значительно выше по сравнению со стоимостью метода гибридизации и методов выявления антигенов. Очень высокая чувствительность этих методов и связанный с этим риск случайной контаминации образцов продуктами амплификации (ампликонами) являются главной проблемой, с которой сталкиваются разработчики тест-систем, технологических процессов в лаборатории и работники лаборатории. Ложноотрицательные результаты могут появиться из-за веществ, содержащихся в клиническом материале и ингибирующих процесс амплификации нуклеиновых кислот или вследствие ненадлежащего выделения нуклеиновых кислот. Данные методы требуют высоко квалифицированного лабораторного персонала, что означает невозможность проведения этих методик в условиях лаборатории и исключает возможность получения пациентом результата исследования во время первого приема у врача. Внимание! Для установления диагноза хламидийной инфекции рекомендуются диагностические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) и одобренные FDA. Их чувствительность и специфичность достаточны для рутинной диагностики. Использование для скрининга В ряде исследований показано, что программы скрининга с использованием МАНК и направленные на популяцию с высоким риском хламидийной инфекции, могут быть экономически эффективны за счет предотвращения развития осложнений заболевания. К сожалению, в Восточной Европе проведено незначительное количество таких исследований. Уменьшение стоимости скрининговых программ может быть достигнуто путем пулирования клинических образцов и только в случае выявления положительного образца в пуле каждый образец из этого пула должен быть исследован отдельно. Уровень экономии средств зависит от распространенности инфекции. Качественная ПЦР Общие положения Roche Amplicor® CT PCR для выявления C. trachomatis была первой коммерческой тестсистемой, использующей принцип амплификации нуклеиновых кислот, представленной на рынке для диагностики хламидийной инфекции. Позже были разработаны мультиплексные тесты, позволяющие проводить одновременную ПЦР с ампилификацией ДНК-мишени C. trachomatis (CT) и N. gonorrhoeae (NG), а также ДНК внутреннего контроля. Этот тест представлен в двух основных формах: Roche Amplicor CT/NG MWP (multi well plate) PCR и полностью автоматизированный Roche COBAS® Amplicor PCR. 96 Таблица 6. Чувствительность, специфичность и прогностическая значимость результатов для цервикальных образцов, исследованных при помощи Roche Amplicor в популяциях с разным уровнем распространенности инфекции (данные из инструкции производителя). Распространенность (%) Чувствительность (%) Специфичность(%) Прогностическая значимость положительных результатов (%) Прогностическая значимость отрицательных результатов (%) 1 93.4 96.7 22.5 99.9 5 93.4 96.7 60.2 99.6 10 93.4 96.7 76.1 99.2 20 93.4 96.7 87.8 98.3 Преимущества Преимуществом теста является легко приспосабливаемый формат, возможность использовать для тестирования цервикальные образцы, взятые для цитологического скрининга и наличие внутреннего контроля амплификации. Недостатки • • Два основных недостатка: во-первых, в образцах мочи у женщин наличие бета-хорионического гонадотропина, кристаллов и других компонентов мочи может ингибировать амплификацию, приводя к увеличению количества ложноотрицательных результатов. Данную проблему позволяет обнаружить использование внутреннего контроля. во-вторых, недавно в Скандинавии появились варианты C. trachomatis, у которых в связи с детекцией отсутствует участок на криптической плазмиде, который является мишенью для данного МАНК. Эти штаммы не определяются с помощью традиционной тест-системы Amplicor CT. Это может стать поводом для беспокойства, если эти или похожие варианты C. trachomatis станут более распространенными. К настоящему времени всего лишь несколько таких мутированных штаммов найдено за пределами Скандинавии. За обнаружение этих вариантов в Восточной Европе сейчас нет, хотя проведенные исследования являются недостаточными. Амплификация со смещением цепочки (strand displacement): the Becton Dickinson BDProbeTec®ET Общая информация Эта система использует изотермическую амплификацию ДНК со смещением нити, при которой, в отличие от традиционной ПЦР, не тратится время на повторяющиеся термические циклы. Мишенью является криптическая плазмида хламидий. Клинический материал помещается в лизирующий раствор и нагревается для освобождения нуклеиновых кислот. Образцы мочи собираются в пластиковые стерильные контейнеры, куда добавляются специальные реагенты, поставляемые производителем, чтобы удалить вещества, ингибирующие амплификацию. Для выявления C. trachomatis каждый 96-луночный планшет содержит один положительный контроль (который также является контролем для реагентов), один отрицательный контроль и до 46 клинических образцов. Каждый из этих 46 97 образцов имеет парную лунку с амплификационным контролем, ориентированным на разные последовательности ДНК, для определения содержания в образце ингибиторов амплификации. При одновременном выявлении хламидий и гонококков планшет содержит: положительный контроль, отрицательный контроль и до 30 образцов. Каждый из 30 образцов и 2 контроля требуют по 3 лунки: одну для C. Trachomatis, одну для гонококка и одну для амплификационного контроля. Амплификация и детекция продуктов амплификации занимает один час, в течение которого зонды, помеченные флюорохромом, связываются с продуктами амплификации по мере их появления. Считывание результата происходит в реальном времени путем измерения флюоресценции с помощью специального ридера. Результат теста будет положительным при наличии в образце от 10-15 клеток гонококков или элементарных телец C. trachomatis. Тестирование занимает 1 час, за который можно исследовать достаточно большое количество образцов. С практической точки зрения данное исследование имеет сходные характеристики с другими МАНК, но оно более чувствительно к ингибиторам, содержащимся в образцах мочи у женщин. Амплификация, основанная на транскрипции: ”GenProbe Aptima” Общие положения Проблема наличия ингибиторов амплификации в клиническом образце может быть преодолена путем предварительного выделения нуклеиновой кислоты из образца. Этот процесс захвата мишени использован во втором поколении тест-систем GenProbe Aptima-Combo 2. Клинический образец растворяется в транспортной среде. Затем добавляются специфические захватывающие олигонуклеотиды, которые при повышенной температуре связываются с мишенью – мультикопийной рибосомальной РНК хламидий. При возвращении к комнатной температуре, захватыающий гибрид нуклеотида с его поли dA цепочкой связывается с поли dT-мечеными магнитными частицами, содержащимися внутри емкости для проведения реакции и при помощи магнита, находящегося снаружи, удерживаются. Захваченная мишень готова для амплификации, основанной на транскрипции (TMA). Этот процесс сложный и не будет здесь описан, в нем используется обратная транскриптаза для создания комплементарной ДНК-матрицы, которая затем при помощи РНК-полимеразы используется для получения 100-1000 копий РНК ампликонов. Каждая из пар, обратная транскриптаза и праймер, производят двухцепочечную ДНК копию. В результате за 60 минут амплификации образуется более миллиарда копий из начального количества 1000 молекул-мишеней мультикопийной РНК. Для детекции продуктов амплификации используется сложный двойной кинетический тест, который включает в себя зонды с различными кинетическими характеристиками света: быстрый «импульсный» зонд для C. trachomatis и медленный «раскаленный» зонд для N. gonorrhoeae. Программируемый люминометр рассчитывает вклад каждого из этих зондов в суммарную люминесценцию. Преимущества Преимущества данной тест-системы: 1. Клинические образцы могут храниться в транспортной среде при комнатной температуре до месяца; 2. За счет захвата мишени можно убрать вещества-ингибиторы, присутствующие в клиническом материале; 3. Рибосомальная РНК изначально находится в клетке в большом количестве копий; 4. TMA запускает множественную амплификацию; 5. Гонококки и хламидии могут выявляться в одной реакции; 6. Легко приспосабливаемый формат. Имеется полностью автоматизированная версия с высокой пропускной способностью для больших референс-лабораторий. 98 Контроль качества При каждом выделении ДНК и последующем исследовании образцов необходимо иметь внутренний положительный контроль, позволяющий выявить вещества, ингибирующие амплификацию, контроли качества пробо-подготовки и отрицательный контроль. В идеале для внутри- и межлабораторного контроля качества ПЦР диагностики должны использоваться сертифицированные и зарегистрированные референсные панели, содержащие закодированные контрольные образцы. Использование панелей образцов является стандартным способом проверки эксплуатируемых тест-систем. Они являются индикаторами чувствительности, специфичности и воспроизводимости независимо от используемых тест систем. Форма заключения на основании результатов ПЦР: Нуклеиновые кислоты, специфичные для Chlamydia trachomatis, обнаружены. Нуклеиновые кислоты, специфичные для Chlamydia trachomatis, не обнаружены. • Безопасность персонала Со всеми образцами следует обращаться как с потенциально содержащими инфекционные агенты. Валидация диагностических тестов Общие критерии валидации диагностических тестов были опубликованы группой экспертов по диагностике ВОЗ/TDR. Эти критерии обязательны и выходят за рамки большинства индивидуальных групп. Однако американское Общество Микробиологии (ASM) и их издание Cumitech выпустили протоколы минимальных требований для валидации нового или модифицированного теста. • • • • Основываясь на этих принципах, для валидации новых тестов для хламидийной инфекции рекомендуется: валидация предложенного теста должна проводиться в сравнении с Roche Amplicor, Becton Dickinson BDProbeTecET или GenProbe Aptima CT; должно быть протестировано как минимум 50 положительных клинических образцов (по заключению референсного теста) и 100 отрицательных образцов; должны быть тоже включены слабоположительные образцы. Повторно разведенные сильно положительные образцы тоже должны быть включены в исследование для оценки воспроизводимости теста при малом числе копий ДНК; чувствительность и специфичность предложенного теста не должны быть более чем на 5% ниже выбранного референсного теста Использование МАНК, не одобренных FDA Процесс государственного регулирования должен обеспечить гарантии качества и характеристик диагностических тестов. Несмотря на это, меньше половины стран во всем мире имеют регулирующую систему для in vitro диагностики инфекционных заболеваний и еще меньше требуют предоставить данные клинических испытаний. Не существует утвержденных международных протоколов для оценки диагностических тестов. Поставщики тест-систем могут говорить о высокой чувствительности и специфичности, при этом не существует требований предоставлять информацию об объеме выборки или доверительных интервалах. Тест-системы Roche Amplicor, Becton Dickinson BDProbeTec и GenProbe Aptima прошли FDA контроль, но только для некоторых типов образцов. Последующие исследования могут показать, что эти тест-системы пригодны и для других 99 типов образцов, таких как влагалищные образцы, взятые самим пациентом, фарингеальные, ректальные или образцы, полученные из препуциального кармана или поверхности полового члена. Настоятельно рекомендуется, если это возможно, для диагностики инфекции генитального тракта, вызванной C. trachomatis, использовать тест-системы, одобренные FDA. Если такой возможности нет, и необходимо использовать тест-систему местного производства не одобренную FDA, то в этой ситуации рекомендовано, чтобы пригодность предложенного теста для местных требований была подтверждена валидацией тестсистем. В некоторых странах Восточной Европы подтверждающие тесты находятся в процессе валидации. Критерии валидации представлены ниже. 5.3. Метод выявления антигенов Общие положения С появлением методов определения нуклеиновых кислот наличие жизнеспособных хламидий не является обязательным, и поэтому условия транспортировки клинического материала и стабильность взятого образца менее важны, чем при культуральной диагностике. Антиген C. trachomatis в клиническом материале определяется либо прямой микроскопией с использованием метода прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), либо опосредовано, методом иммуноферментного анализа (ИФА). Специфичность этих методов значительно возросла с появлением антиген-специфичных моноклональных антител. Чувствительность также возросла в связи с оптимизацией методики и появлением сигнальных амплификационных методов. Но, несмотря на это, чувствительность этих методов значительно ниже по сравнению с методами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот. Иммуноферментный анализ может быть автоматизирован, что позволяет обрабатывать большое количество образцов. Метод микроскопии, используемый в ПИФ, достаточно утомителен, но именно он является важным преимуществом перед ИФА и многими другими методами, т.к. позволяет оценить адекватность клинического образца. В современных коммерческих тест-системах чувствительность ИФА сравнима или немного выше, чем у культурального метода, а специфичность адекватна для использования метода в популяции со средней и высокой распространенностью инфекции, например, ≥5%. Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) Контроль качества взятия клинического материала для ПИФ Для оценки качества взятия материала просматривают несколько полей зрения, используя увеличение люминесцентного микроскопа ×400. В одном поле зрения микроскопа должно быть более 5 клеток цилиндрического эпителия. Критерии, используемые для оценки, включают размер элементарных телец (ЭТ) – 200-300 нм, их яблочно-зеленый цвет и правильную округлую форму. Если в препарате содержится достаточно эпителиальных клеток и видны специфические флюоресцирующие элементарные тельца (более 5ЭТ в препарате), результат считается положительным. Источники ошибок • • • Неправильное и неадекватное взятие клинического материала может привести к неправильной интерпретации результата исследования. Использование карандаша, не предназначенного для маркировки стекол, в процессе фиксации и окрашивания может загрязнить препарат. Неправильное нанесение материала на стекло (необходимо прокатывать тампон по стеклу) может привести к повреждению клеток, вследствие чего может быть нарушена их морфология. 100 Препарат не должен оцениваться, если: • • • • при микроскопии в 4 полях зрения менее 5 клеток цилиндрического эпителия, в препарате только клетки плоского эпителия, в препарате только эритроциты, в препарате много слизи, артефактов или имеет место неспецифическая флюоресценция. Иммуноферментный анализ (ИФА) Существует ряд доступных коммерческих тест-систем для ИФА. Методы тестирования варьируют от прямого обнаружения антигена до захвата антигена с использованием или без использования ферментной амплификации с целью увеличения чувствительности метода. Тест-системы для ИФА предназначены для исследования большого количества образцов. В целом, чувствительность и специфичность этих двух методов (ПИФ и ИФА) сходны. При этом чувствительность ИФА ниже, чем МАНК. Источники ошибок ИФА основан на определении липополисахарида (ЛПС) хламидий, который, как известно, перекрестно реагирует с ЛПС других микроорганизмов, что может приводить к ложноположительным результатам. Многочисленные исследования показали связь между хламидийной инфекцией, например, воспалительными заболеваниями органов малого таза/трубным бесплодием и присутствием высоких титров антихламидиальных антител. Это привело к предположению, что обнаружение и количественный анализ антител к хламидиям полезны для диагностики хламидийной инфекции, даже учитывая то, что было несколько попыток объяснить присутствие высоких уровней антител у здоровых людей. Антитела к хламидиям могут использоваться в эпидемиологических исследованиях как совокупный показатель контакта исследуемой популяции с возбудителем. Однако выявление антител к хламидиям чревато проблемами. Воспроизводимость методов, таких как микроиммунофлюоресцентный тест, низка и нет никаких согласованных стандартов. У некоторых людей иммунный ответ на хламидийную инфекцию может быть отсрочен или даже отсутствовать после перенесенной хламидийной инфекции. В случаях, где ответ есть, антитела часто сохраняются в течение длительного времени после выздоровления. Таким образом, выявление антител к хламидиям не пригодно для рутинной диагностики хламидийной инфекции генитального тракта. Внимание! Серологическое исследование не рекомендуется для рутинной диагностики хламидийной инфекции. Диагноз должен быть основан на прямом выявлении этиологического агента. ИФА метод в диагностике УГХ и контроле его терапии на сегодня допустимо применять только в комплексе с более информативными прямыми методами идентификации «ИФА+ПИФ или ИФА+ПЦР». Наибольшая достоверность лабораторного исследования на УГХ обеспечивается использованием расширенного золотого стандарта «КМ + ПЦР+ ПИФ». Адекватными и доступными способами контроля излеченности хламидийной инфекции являются ПИФ и ПЦР, выполненные, соответственно, не ранее, чем через 2 недели и через 30-40 дней после окончании терапии. Эталонным методом контроля излеченности УГХ остается КМ. Надёжность контроля терапии, как и надёжность диагностики УГХ, существенно повышают сочетания методов, наиболее эффективными из которых считаются «КМ+ПЦР», «КМ+ПИФ», «ПИФ+ПЦР». 101 5.4. Быстрые тесты у постели больного Быстрые иммунохроматографические тесты, такие как Unipath Clearview и другие, которые можно использовать в качестве Bed Side (у постели больного), направлены на технологиях антигенной детекции. Данные тесты должны применяться только в случаях, когда лабораторные службы не доступны. Тесты у постели больного не обладают достаточной чувствительностью по сравнению с методами амплификации нуклеиновых кислот, хотя приемлемая чувствительность была доказана для Chlamydia Rapid Test. Форма заключения на основании результатов использования методов выявления антигенов: Антиген, специфичный для Chlamydia trachomatis, выявлен. Антиген, специфичный для Chlamydia trachomatis, не выявлен Внимание! Быстрые диагностические тесты у постели больного недостаточно чувствительны, поэтому при наличии соответствующей лабораторной службы они не рекомендуются для использования. 5.5. Культурная диагностика инфекций, вызванных C. TRACHOMATIS Общие положения До начала 1980-х годов основным методом, подтверждающим предварительный диагноз хламидийной инфекции, был культуральный метод, основанный на выделении хламидий после заражения чувствительных живых клеток тканевых кульутр, центрифугирования клинического материала и выявления типичных хламидийных включений. Считалось, что этот метод имеет 100% специфичность, так как результат был очевидным при выявлении в клетках характерных для C. trachomatis включений. Таким образом, это был изначальный «золотой стандарт», с которым сравнивали новые, не связанные с жизнеспособностью микроорганизма, методы диагностики хламидийной инфекции. Выделение хламидий методом культуры клеток сейчас редко используется для диагностики в Северной Америке и Западной Европе и не рекомендовано для рутинной диагностики в странах Восточной Европы, за исключением случаев судебно-медицинской экспертизы, случаев сексуального насилия над детьми или, когда культура живых хламидий необходима для исследовательских целей, например, для определения антибиотикорезистентности хламидий in vitro или для контроля излеченности. Проблема культуральной диагностики состоит в том, что необходима быстрая транспортировка клинического материала в холоде (6+2ºС), чтобы сохранить жизнеспособность даже небольшого количества хламидий, которое находится в клиническом материале. Более того, это сложная и требующая времени процедура, для которой нет ни строго стандартизированных методов, ни материалов. Такие факторы, как каждая партия сыворотки телят, разная чувствительность различных вариантов одной и той же клеточной линии и качество микроскопии, являются важными составляющими, которые трудно стандартизировать. Чувствительность и специфичность Специалисты пришли к единому мнению, что выделение хламидий в культуре клеток является значительно менее чувствительным диагностическим методом по сравнению с новыми методами, основанными на амплификации нуклеиновых кислот. Более того, изменилось мнение о том, что специфичность культурального метода равна 100%; достаточно на момент потерять бдительность и культура клеток будет контаминирована. Чувствительность – 60-80% , специфичность. 102 Токсические факторы На культивирование хламидий могут влиять разные факторы. Например, применение гинекологических любрикантов, спринцеваний, спермицидов могут отрицательно влиять на выделение хламидий. Вата, альгинат кальция, дакрон, входящие в состав тампонов для получения клинического материала, могут быть токсичными для культуры клеток и хламидий. Это происходит из-за того, что ненасыщенные жирные кислоты, находящиеся в ватных волокнах, хлорсодержащие отбеливатели, смола, входящая в состав деревянных палочек, клей, используемый для соединения тампонов со стержнями, также могут быть токсичными. Источники ошибок: • • • • • • • • • • • • Неправильное получение биологического материала для исследования. Неправильная транспортировка образцов. Неправильное проведение культурального исследования. Условия приготовления и последующего хранения питательных сред. Качество клеточных линий (нечувствительные или инфицированные микоплазмами клеточные линии). Отсутствие контроля качества приготовленных питательных сред. Отсутствие контрольных штаммов Chlamydia trachomatis. Концентрация СО2. Качество моноклональных антител. Качество микроскопа. Качество транспортной среды. Квалификация специалиста, осуществляющего методику культивирования и оценку полученных результатов. Оценка результатов Результаты культурального исследования должны быть получены на 3-5 день. Результат считается положительным, если обнаруживается хотя бы одно хламидийное внутрицитоплазматическое включение, и нет причин подозревать контаминацию другим положительным образцом. Если такое подозрение есть, анализ необходимо повторить, используя оставшийся клинический материал, кроме того, в этом случае желательно еще использовать другой альтернативный диагностический метод. Внимание! Используемый раннее в Кыргызстане метод микроскопического исследования мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе (выявление включений в эпителиальных клетках соскобов) в современной диагностике урогенитального хламидиоза (УГХ) является абсолютно неприемлемым. Безопасность персонала Безопасность лабораторных работников обеспечивается соблюдением правил работы с потенциально инфекционным клиническим материалом (использование перчаток, ламинарного бокса, дезинфицирующих средств, УФ облучения и т.д.). 103 Хранение выделенных культур C. Trachomatis Выделенную культуру C. trachomatis низкотемпературной морозильной камере (-700С). можно хранить в среде 2SP в Форма заключения лабораторного исследования на основании результатов культурального метода: Chlamydia trachomatis выделены. Chlamydia trachomatis не выделены. Заключение • Используемый раннее в Кыргызстане метод микроскопического исследования мазков окрашенных по Романовскому-Гимзе (выявление включений в эпителиальных клетках соскобов) в современной диагностике УГХ является абсолютно неприемлемым. • Для установления диагноза хламидийной инфекции рекомендуются диагностические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) и одобренные FDA. Их чувствительность и специфичность достаточны для рутинной диагностики. • Если для повседневной практики нет доступных тестов, одобренных FDA, то рекомендуется любой альтернативный МАНК тест, оцененный (валидированный) по отношению к тестам, рекомендованным и одобренным FDA. • Для контроля качества ПЦР необходимо использовать референсные панели, содержащие контрольные образцы. • Быстрые диагностические тесты у постели больного недостаточно чувствительны, поэтому при наличии соответствующей лабораторной службы они не рекомендуются для использования. • ИФА метод в диагностике УГХ и контроле его терапии на современном этапе допустимо применять только в комплексе с более информативными прямыми методами идентификации «ИФА+ПИФ или ИФА+ПЦР». • Надёжность лабораторных данных и обоснованность клинических заключений могут быть достигнуты только при сочетании адекватного качества выбранных средств лабораторной диагностики, достаточной квалификации персонала лаборатории, необходимого уровня подготовки врачей, обладающих навыками критического анализа совокупности лабораторных и клинико-анамнестических данных. • Выбор диагностического теста должен осуществляться на основании ряда условий: доступности, стоимости, приспособленности к местным рабочим процессам, пропускной способности. 104 Список литературы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Banoo S, Bell D, Bossuyt P, Herring A, Mabey D, et all; TDR Diagnostics Evaluation Expert Panel. Evaluation of diagnostic tests for infectious diseases: general principles. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec;4(12 Suppl):S2032. Butylkina R, Juseviciute V, Kasparaviciene G, Vagoras A, Pagirskas E, Unemo M, Domeika M. Pooling of urine specimens allows accurate and cost-effective genetic detection of Chlamydia trachomatis in Lithuania and other low-resource countries. Scand J Infect Dis. 2007; 39 (3): 209-12. CDC. Sexually Transmitted Disease Surveillance, 2004. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, CDC, National Center for HIV, STD, and TB Prevention; 2005 Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2006. MMWR, 2006, Vol 55, 94 p. Domeika M, Hallen A, Drulyte O. Genital Chlamydia trachomatis infections in Lithuanian women invited for screening via newspaper advertisement: a pilot study. Sex Transm Infect. 2000 Jun;76(3):216 Domeika M, Litvinenko I, Smirnova T, Gaivaronskaya O, Savicheva A, Sokolovskiy E., Ballard R. C., Unemo M. Laboratory Diagnostics for Non-Viral Sexually Transmitted Infections in St Petersburg, Russia: Current Situation and Hallmarks for Improvements. 2007, JEADV (in press) European Community. Commission Decision No 2002/253/EC of 19 March 2002 laying down case definitions for reporting communicable diseases to the Community network under Decision No 2119/98/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Communities 3.4.2002. 86:44-62. Everett KD, Bush RM, Andersen AA. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int J Syst Bacteriol. 1999 Apr;49 Pt 2:415-40 Faur, Y. C, M. H. Weisburd, M. E. Wilson, and P. S. May PS. 1973. A new medium for the isolation of pathogenic Neisseria (NYC medium). I. Formulation and comparisons with standard media. Health Lab. Sci. 10:44-54. Frigo N., Rotanov S.1, Domeika M. Laboratory diagnosis of treponema pallidum infection in the Russian Federation. Abstract book of 23rd IUSTI-Europe Conference on Sexually Transmitted Infections, 19-21 October 2006, Dubrovnik, Croatia, 2007, 71 p Gaydos, С. А., Т. С Quinn, D. Willis, A. Weissfeld, E. W. Hook, D. H. Martin, D. V. Ferrero, and J. Schachter. 2003. Performance of the APTIMA Combo 2 assay for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in female urine and endocervical swab specimens. J. Clin. Microbiol. 41:304-309. Goh BT, Van Voorst Vader PC. European guideline for the management of syphilis. Ed.: K. Radcliffe. European STD guidelines. Int J STD AIDS, 2001, 12(Suppl 3): 14-22 Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae infections in Eastern European countries - results of an international collaboration. Euro Surveill. 2007 Dec 6; 12(12):E071206.3. Herring A, Ballard R, Mabey D, Peeling RW; WHO/TDR Sexually Transmitted Diseases Diagnostics Initiative. Evaluation of rapid diagnostic tests: syphilis. Nat Rev Microbiol. 2006, 4(12 Suppl):S33-40. Herring A, Ballard R, Mabey D, Peeling RW; WHO/TDR Sexually Transmitted Diseases Diagnostics Initiative. Evaluation of rapid diagnostic tests: chlamydia and gonorrhoea. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec;4(12 Suppl):S41-8. Hjelmevoll, S. O., M. E. Olsen, J. U. Sollid, H. Haaheim, M. Unemo, and V. Skogen. 2006. A fast real-time polymerase chain reaction method for sensitive and specific detection of the Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene. J. Mol. Diagn. 8:574-81.and Neisseria gonorrhoeae in swab specimens by the Hybrid Capture II and PACE 2 nucleic acid probe tests. Sex. Transm. Dis. 26:303-308. 48 (56) Hobbs MM, van der Pol B, Totten P, Gaydos CA, Wald A, Warren T, Winer RL, Cook RL, Deal CD, Rogers ME, Schachter J, Holmes KK, Martin DH. From the NIH: Proceedings of a Workshop on the Importance of Self-Obtained Vaginal Specimens for Detection of Sexually Transmitted Infections. Sex Transm Dis. 2008 Jan;35(1):8-13. Hook, E. W., and H. H. Handsfield. 1999. Gonococcal infections in the adult, p. 451-466. In K. K. Holmes, P. A. Mardh, P. F. Sparling, S. M. Lemon, W. E. Stamm, P. Piot, and J. Wasserheit (ed.), Sexually Transmitted Diseases, 3rd ed. McGraw Hill Book Co., New York, N. Y. Hunter EF, Deacon WE, Meyer PE. An improved FTA test for syphilis, the absorption procedure (FTA-ABS). Public Health Report, 1964, 79, 410-2. Jephcott, A. E., M. N. Bhattacharyya, and D. H. Jackson. 1976. Improved transport and culture system for the rapid diagnosis of gonorrhoea. Br. J. Vener. Dis. 52:250-252. Kellogg JA, Seiple JW, Klinedinst JL, Stroll ES, Cavanaugh SH. Improved PCR detection of Chlamydia trachomatis by using an altered method of specimen transport and high-quality endocervical specimens. J Clin Microbiol. 1995 Oct;33(10):2765-7; Kellogg Jr, D. S., and E. M. Turner. 1973. Rapid fermentation confirmation of Neisseria gonorrhoeae. Appl. 105 Microbiol. 25:550-552. 23. Kellogg, J. A., and L. K. Orwig. 1995. Comparison of GonoGen, GonoGen II, and MicroTrak direct fluorescentantibody test with carbohydrate fermentation for confirmation of culture isolates of Neisseria gonorrhoeae. J, Clin. Microbiol. 33:474-476. 24. Koek AG, Bruisten SM, Dierdorp M, van Dam AP, Templeton K. Specific and sensitive diagnosis of syphilis using real-time PCR for Treponema pallidum. Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2006, 12: 122140. 25. Kucinskiene V, Juseviciute V, Valiukeviciene S, Milasauskiene Z, Unemo M, Domeika M. Home sampling and pooling of vaginal samples are effective tools for genetic screening of Chlamydia trachomatis among high school female students in Lithuania. Scand J Infect Dis. 2007 Sep 6;:1-6; 26. Larsen SA, Pope V., Johnson RE, Kennedy EJ Jr. A Manual of Tests for Syphilis. Washington DC: American Health Association, 1998. 27. Lawton, W. D., and G. J. Battaglioli. 1983. Gono Gen coagglutination test for confirmation of Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Microbiol. 18:1264-1265. 28. Lewis DA, Young H. Syphilis. Sex Transm Infect, 2006, 82 (Suppl IV): 13-15. 29. Little, M. C, J. Andrews, R. Moore, S. Bustos, et all. 1999. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system, BDProbeTecET. Clin. Chem. 45:777-784. 30. Mabey D, Peeling RW, Ballard R, Benzaken AS, Galbán E, Changalucha J, Everett D, Balira R, Fitzgerald D, Joseph P, Nerette S, Li J, Zheng H. Prospective, multi-centre clinic-based evaluation of four rapid diagnostic tests for syphilis. Sex Transm Infect, 2006, 82(Suppl 5): 13-6. 31. Mahilum-Tapey, L., Laitila, V., Wawrzyniak, J. J., Alexander, S., Ison, C., Swain, A., Barber, P., Ushiro-Lumb, I. & Gih, B. T. (2007). New point of care Chlamydia Rapid Test--bridging the gap between diagnosis and treatment: performance evaluation study. British Medical Journal 335, 1190 - 1194. Epub 2007 Nov 30. 32. Mahony, J. В., X. Song, S. Chong, M. Faught, T. Salonga, and J. Kapala. 2001. Evaluation of the NucliSens Basic Kit for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genital tract specimens using nucleic acid sequence-based amplification of 16S rRNA. J. Clin. Microbiol. 39:1429-1435. 33. Mahony, J., S. Chong, D. Jang, K. Luinstra, M. Faught, D. Dalby, J. Sellors, and M. Chernesky. 1998. Urine specimens from pregnant and nonpregnant women inhibitory to amplification of Chlamydia trachomatis nucleic acid by PCR, ligase chain reaction, and transcription-mediated amplification: identification of urinary substances associated with inhibition and removal of inhibitory activity. J. Clin. Microbiol. 36:3122-3126. 34. Martin Jr, J. E., and A. Lester. 1971. Transgrow, a medium for transport and growth of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis. HSMHA Health Rep. 86:30-33. 35. Martin, D. H., С Cammarata, B. Van Der Pol, R. B. Jones, Т. С Quinn, C. A. Gaydos, K. Crotchfelt, J. Schachter, J. Moncada, D. Jungkind, B. Turner, and C. Peyton. 2000. Multicenter evaluation of AMPLICOR and automated COB AS AMPLICOR CT/NG tests for Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Microbiol. 38:3544-3549. 36. Martin, J. E., J. H. Armstrong, and P. B. Smith. 1974. New system for cultivation of Neisseria gonorrhoeae. Appl. Microbiol. 27:802-805. 37. Mirrett, S., L. B. Reller, and J. S. Knapp. 1981. Neisseria gonorrhoeae strains inhibited by vancomycin in selective media and correlation with auxotype. J. Clin. Microbiol. 14:94-99. 38. Miyada, С G., and T. L. Born. 1991. A DNA sequence for the discrimination of Neisseria gonorrhoeae from other Neisseria species. Mol. Cell Probes. 5:327-335. 39. Modarress, K. J., A. P. Cullen, W. J. Jaffurs Sr., G. L. Troutman, N. Mousavi, R. A. Hubbard, S. Henderson, and A. T. Lorincz. 1999. Detection of Chlamydia trachomatis 40. Morré S. Catsburg A., Dommelen L, Smelov V, Vries H.J.C. de, Savitcheva A., Domeika M., Herrmann B., Ouburg S., Hoebe CJPA, Nilsson A., Savelkoul PHM, Morre SA. TaqMan Assay for Swedish Chlamydia trachomatis Variant. Emerging Infectious Diseases. 2007, Vol. 13, No. 9, 1432-4 //Available at: www.cdc.gov/ eid // 41. Morse, S. A., and L. Bartenstein. 1976. Adaptation of the Minitek system for the rapid identification of Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Microbiol. 3:8-13. 42. Norris SJ, Pope V., Johnson RE, Larsen SA. Treponema and other human host-assciated spirochetes. In Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH, eds. Manual of Clinical Microbiology. Washington DC: American Society for Microbiology, 2003:995-71. 43. Olsen, C. C, J. R. Schwebke, W. H. Benjamin Jr, A. Beverly, and К. В. Waites. 1999. Comparison of direct inoculation and Copan transport systems for isolation of Neisseria gonorrhoeae from endocervical specimens. J. Clin. Microbiol. 37:3583-3585. 44. Ostergaard LJ, Andersen BS, Olesen F, Møller JK. Detection of Chlamydia trachomatis infection among young people. The effect of home-sampling and mailing the samples. Ugeskr Laeger. 1999 Aug 9;161 (32):4514-8. Danish. 45. Palmer HM, Higgins SP, Herring AJ, Kingston MA. Use of PCR in the diagnosis of early syphilis in the United 106 Kingdom. Sex Transm Infect, 2003, 79: 479-483. 46. Palmer, H. M, H. Mallinson, R. L. Wood, and A. J. Herring. 2003. Evaluation of the specificities of five DNA amplification methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Microbiol. 41:835-837. 47. Pancratov O. Laboratory Diagnosis of STIs. In.: Syphilis in Pregnant women and Children, “IPATI”, Minsk, Belarus, 2007, pp.:231-51 (Rus) 48. Pang T, Peeling RW. Diagnostic tests for infectious diseases in the developing world: two sides of the coin. Trans R Soc Trop Med Hyg 2007, 101:856-7. 49. Panke, E. S., L. I. Yang, P. A. Leist, P. Magevney, R. J. Fry, and R. F. Lee. 1991. Comparison of Gen-Probe DNA probe test and culture for the detection of Neisseria gonorrhoeae in endocervical specimens. J. Clin. Microbiol. 29:883-888. 50. Peeling RW., Smith PG., Bossuyt PMM. A guide for diagnostic evaluations. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec;4(12 Suppl):S 52-56. 51. Philip, A., and G. C. Garton. 1985. Comparative evaluation of five commercial systems for the rapid identification of pathogenic Neisseria species. J. Clin. Microbiol. 22:101-104. 52. Ratnam S. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2005 Jan;16(1):45-51. 53. Ripa KT, Mårdh PA.Cultivation of Chlamydia trachomatis in cycloheximide-treated McCoy cells. J Clin Microbiol. 1977 Oct;6(4):328-31. 54. Ripa T, Nilsson PA. A Chlamydia trachomatis strain with a 377-bp deletion in the cryptic plasmid causing falsenegative nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis. 2007 May;34(5):255-6. 55. Robinson AJ, Ridgway GL. Modern diagnosis and management of genital Chlamydia trachomatis infection. Br J Hosp Med, 1996, 55: 388-93 56. Sandven, P., O. Solberg, K. Odegaard, and G. Myhre. 1982. Improved medium for the transportation of gonococcal specimens. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. В 90:73-77. 57. Savage EJ, Ison CA, van de Laar MJ; ESSTI network.Results of a Europe-wide investigation to assess the presence of a new variant of Chlamydia trachomatis. Euro Surveill. 2007 Oct 1;12(10):E3-4. 58. Savicheva A., Sokolovsky E., Frigo N., Priputnevich T., Brilene T., Deák J., Ballard R., Ison C., Hallén A., Domeika M., Unemo M. Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in East-European countries. Part 2: culture, non-culture methods, determination of antibiotic resistance, and quality assurance. Acta Medica Lituanica, 2007, Vol 4, No 2, 123-34 //Available at: http://images.katalogas.lt/maleidykla/Act72/ Act_123_134.pdf // 59. Schachter J. Which test is best for chlamydia? Curr Opin Infect Dis. 1999 Feb; 12(1):41-5. 60. Schmidt BL, Edjlalipour M, Luger A. Comparative evaluation of nine different enzyme-linked immunosorbent assays for determination of antibodies against Treponema pallidum in patients with primary syphilis. J Clin Microbiol. 2000 Mar;38(3):1279-82. 61. Sexually Transmitted Diseases. Third Edition. Eds. K.K. Holmes, P. F. Sparling, P.-A. Mardh, S. M. Lemon, W.E. Stamm, P Piot, J. N. Wasserheit. McGraw Hill, 1999, 1454 p. 62. Shalepo K, Savicheva A, Shipitsyna E, Unemo M, Domeika M. Diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia-in-house PCR assays may be effective but overall optimization and quality assurance are urgently needed. APMIS. 2006 Jul-Aug;114(7-8):500-7. 63. Shipitsyna E, Shalepo K, Savicheva A, Unemo M, Domeika M. Pooling samples: the key to sensitive, specific and cost-effective genetic diagnosis of Chlamydia trachomatis in low-resource countries. Acta Derm Venereol. 2007;87(2):140-3 64. Shipitsyna E., Zolotoverkhaya E., Agne-Stadling I., Krysanova A., Savicheva A., Sokolovskiy E., Domeika M., Unemo M. First evaluation of six nucleic acid amplification tests (NAATs) widely used in the diagnosis of Сhlamydia trachomatis in Russia. JEADV, 2008 (in press) 65. Sparling, P. F., and H. H. Handsfield. 2000. Neisseria gonorrhoeae, p. 2242-2258. In G. L. Mandell, J. E. Bennett, and R. Dolin (ed.), Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th ed. Churchill Livingstone, Inc., Philadelphia, Pa. 66. Taylor, E., and 1. Phillips. 1980. Assessment of transport and isolation methods for gonococci. Br. J. Vener. Dis. 56:390-393. 67. Thayer, J. D., and J. E. Martin Jr. 1966. Improved medium selective for cultivation of N. gonorrhoeae and N. meningitidis. Public Health Rep. 81:559-562. 68. The web site www.chlamydiae.com contains extensive reviews of chlamydial infections and their diagnosis, hyperlinked to the original literature. 69. Thompson, D. S., and S. A. French. 1999. Comparison of commercial Amies transport systems with in-house Amies medium for recovery of Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Microbiol. 37:3020-3021. 70. Tyagi S, Bratu DP, Kramer FR. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 1998 Jan;16(1):49-53 71. Unemo M, Olcén P, Agné-Stadling I, Feldt A, Jurstrand M, Herrmann B, Persson K, Nilsson P, Ripa T, Fredlund H. Experiences with the new genetic variant of Chlamydia trachomatis in Orebro county, Sweden - proportion, 107 characteristics and effective diagnostic solution in an emergent situation. Euro Surveill. 2007 Apr 1;12(4):E5-6 72. Unemo, M., A. Savicheva, O. Budilovskaya, E. Sokolovsky, M. Larsson, and M. Domeika. 2006. Laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in St Petersburg, Russia: inventory, performance characteristics and recommended optimisations. Sex. Transm. Infect. 82:41-44. 73. Unemo, M., H. M. Palmer, T. Blackmore, G. Herrera, H. Fredlund, A. Limnios, N. Nguyen, and J. Tapsall. 2007. Global transmission of prolyliminopeptidase (PlP)-negative Neisseria gonorrhoeae strains - implications for changes in diagnostic strategies? Sex. Transm. Infect. 83:47-51. 74. van der Pol, В., D. H. Martin, J. Schachter, Т. С Quinn, С A. Gaydos, R. B. Jones, K. Crotchfelt, J. Moncada, D. Jungkind, B. Turner, С Peyton, J. F. Kelly, J. B. Weiss, and M. Rosenstraus. 2001. Enhancing the specificity of the COBAS AMPLICOR CT/NG test for Neisseria gonorrhoeae by retesting specimens with equivocal results. J. Clin. Microbiol. 39:3092-3098. 75. Van Dyck E, Meheus AZ, Piot P. Syphilis. In. Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. WHO, Geneva, year, pp. 36-49. 76. Van Dyck, E., A. Z. Meheus, and P. Piot. Gonorrhoea. In: Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. World Health Organization (WHO), Geneva; 1999:1-21. 77. Warford A., Cgernesky M., Peterson E. M., Gleaves C.A. Laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Cumulative techniques and procedures in clinical microbiology. 19A. ASM Press, Washington, 1999, 18p. 78. Wheeler HL, Agarwal S, Goh BT. Dark ground microscopy of treponemal serological tests in the diagnosis of early syphilis. Sex Transm Infect 2004;80:411–4 79. Whiley, D. M., J. W. Tapsall, and T. P. Sloots. 2006. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge. J. Mol. Diagn. 8:3-15. 80. Whiley, D. M., P. P. Buda, K. Freeman, N. I. Pattle, J. Bates, and T. P. Sloots. 2005. A real-time PCR assay for the detection of Neisseria gonorrhoeae in genital and extragenital specimens. Diagn. Microbiol. Infect. Dis, 52:1-5. 81. Whiley, D. M., T. P. Anderson, K. Barratt, M. H. Beaman, P. J. Buda, M. Carter, K. Freeman, P. Hallsworth, E. Athena Limnios, G. Lum, F. Merien, F. Vernel-Pauillac, J. W. Tapsall, M. J. Witt, M. D. Nissen, and T. P. Sloots. 2006. Evidence that the gonococcal porA pseudogene is present in a broad range of Neisseria gonorrhoeae strains; suitability as a diagnostic target. Pathology. 38:445-448. 82. WHO. Infections with a predominantly sexual mode of transmission, Certain Infectious and Parasitic Diseases, International Classification of Diseases, 10 revision, 2007. Availabe at: http://www.who.int/classifications/apps/ icd/icd10online/ 83. Young A, Mc Millan A. Syphilis and the endemic treponematoses. In: McMillan A., Young H., Ogilvie M.M., Scott G.R. Clinical Practice In: Sexually Transmissible Infections. Elsevier Science Limited, London, 2002, p. 395-459 84. Г.А. Дмитриев, Н.В. Фриго. Сифилис. Дифференциальный клинико-лабораторный диагноз. М: Медицинская книга, 2004; 363. 85. Дробченко С.Н., Носков Ф.С., Кальво А. Лабораторная диагностика хламидийной инфекции// IX Всерос. съезд дерматовенерологов – М., 2005 г Т. 2.- С.40. 86. Мавров Г.И., Ярошенко А.А. «Современные методы лабораторной диагностики ИППП» Дерматология и венерология (4) 2006. Отпечатано в Издательском Доме «Колор Микс», тел.: (0312) 935240, e-mail: colormix@mail.ru 108
