ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА М. Искандеров, канд. вет. наук, А. Фёдоров, канд. биол. наук, М. Альбертян, д-р вет. наук, ВИЭВ им. Я. Р. Коваленко В системе противобруцеллезных мероприятий большое значение имеет диагностика. Только на основе полноценных исследований возможно выявление и локализация очагов инфекции, определение ее распространения, оздоровление неблагополучных хозяйств, пополнение или формирование стад. В настоящее время для этого используют клинические, бактериологические, серологические и аллергические методы. Для выявления ДНК бруцелл в биологическом материале применяют молекулярно-генетическую диагностику, а клиническая имеет только вспомогательное значение. Массовые аборты у крупного и мелкого рогатого скота, хромота и бурситы у коров, орхиты и эпидидимиты у баранов, воспаления и абсцессы холки у лошадей и другие характерные признаки дают основания лишь к подозрению на бруцеллез, но могут быть вызваны и другими причинами. В частности, аборты у крупного и мелкого рогатого скота нередко обусловлены иерсиниозной, паратифозной или кампилобактериозной инфекциями, неправильным содержанием и кормлением животных и другими факторами. Бактериологической диагностике подлежит патматериал от животных с клиническими признаками бруцеллезной инфекции. Результат исследования предполагает индикацию и идентификацию возбудителя, которые определяются бактериоскопическим, бактериологическим и биологическим методами. При бактериоскопическом исследовании бруцеллы обнаруживают в желудке и других органах абортированного плода, некротических участках плацент, вагинальных истечениях и содержимом абсцессов, вымени, бурситов и др. Мазки окрашиваются по Граму, Стампу, Козлов- 28 скому или Шуляку-Шину. Этот метод особенно ценен при исследовании абортированного плода или плаценты, когда требуется быстрее поставить диагноз, а также при поступлении обеззараженного или разложившегося материала. Выделение культуры бруцелл – самый объективный метод для подтверждения бруцеллеза и в ряде случаев единственный способ определения этиологии патологического процесса. Неоспоримое доказательство бруцеллеза – выделение бруцелл из патматериала, но их отсутствие в бактериологических посевах еще не означает отсутствия самого заболевания. Биологический метод (биопроба) необходим в тех случаях, когда материал загрязнен посторонней микрофлорой или концентрация возбудителя незначительна. Результат считается положительным, если зараженные лабораторные животные начинают реагировать на бруцеллез серологически с титром антител 1:10 и выше. Для получения культуры возбудителя дополнительно проводят бактериологическое исследование. Для серологического анализа применяют реакции агглютинации в пробирках (РА), связывания комплемента (РСК) или длительного связывания комплемента (РДСК), реакцию иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатую реакцию агглютинации с розбенгал антигеном – розбенгал пробу (РБП), кольцевую реакцию с молоком (КР) и др. ВЕТЕРИНАРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ • 04 • 2011 ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ РА, предложенная Райтом и Симплом в 1897 г., до настоящего времени считается одним из основных диагностических методов. Ведь агглютинины, как правило, появляются в крови в ранние сроки после заражения. Уровень антител, выявляемых в РА, подвержен значительным колебаниям в зависимости от стадии инфекционного процесса. РСК – достоверный, но более трудоемкий метод серологической диагностики бруцеллеза – позволяет обнаруживать как ранние, так и хронические формы заболевания. Комплементсвязывающие антитела появляются в сыворотке крови животных позже, чем агглютинины, но сохраняются дольше. РДСК – модификация РСК – проводится в условиях пониженной температуры (4–10 °С) и в некоторых случаях более чувствительна и специфична. В свежих очагах бруцеллеза крупного рогатого скота сыворотка крови может не реагировать в РА и РСК, а в РДСК даст положительный результат. При усовершенствовании РА в пробирках была предложена, как казалось вначале, более специфичная, чувствительная, экономичная по времени постановки и средствам пластинчатая РА на стекле. Однако при исследовании длительно хранившихся проб сыворотки крови в пластинчатой РА появлялись неспецифические реакции. Одна из модификаций пластинчатой РА – реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальским розовым и суспендированным в забуференном физиологическом растворе с рН 3,65. Неспецифические агглютинины при низкой величине рН теряют активность, а специфические полностью сохраняют ее. Пластинчатая реакция агглютинации с плазмой крови и окрашенным антигеном разработана в США. Ее модификация с сывороткой крови, розбенгал пластинчатый тест или РБП предложена английскими исследователями. В настоящее время она нашла широкое применение при диагностике бруцеллеза как специфическая, быстрая и простая реакция, по чувствительности не уступающая и даже несколько превосходящая РА, РСК и РДСК. Однако результаты РБП позволяют судить только о наличии специфических антител в сыворотке крови, исключая количественную оценку. 04 • 2011 • ВЕТЕРИНАРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ КР – быстрый, легкий и довольно точный метод для определения бруцеллеза. По некоторым данным, КР с молоком сравним с суммарными результатами исследований в РА и РСК и даже превосходит реакцию агглютинации, но ограничен применением только в дойных стадах. Эффективно комплексное использование аллергического и серологических методов. Аллергическая диагностика основана на выявлении специфических изменений реактивности организма к возбудителю. Этот метод с использованием бруцеллина ВИЭВ широко применяли для исследования бруцеллеза крупного рогатого скота (1969–1970 гг.), а сейчас – и свиней. Бруцеллин ВИЭВ изготавливается из штамма В. abortus В-1, находящегося в RS-форме, и вызывает аллергическую реакцию у животных, инфицированных как типичными, так и измененными формами бруцелл. В ветеринарной практике для диагностики бруцеллеза используют и реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (РИД). Этот метод с растворимым поли-В антигеном позволяет дифференцировать больных бруцеллезом от привитых животных и инфицированных возбудителями, имеющими антигенное родство с бруцеллами. В. М. Чекишев с соавторами получили О-ПС антиген для РИД с несколько иными свойствами. Производственное испытание с О-ПС антигеном ИЭВСиДВ показало, что реакция уступает по чувствительности классическим РА и РСК, но дает возможность оценивать благополучие хозяйств, в которых животные многократно иммунизированы противобруцеллезными вакцинами. Разработаны и с положительными результатами апробированы и другие реакции: Кумбса – для определения неполных антител (РК), преципитации (РП), иммунофлюоресценции (РИФ), непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА). И это далеко не полный список методик. В последнее время в ветеринарную практику внедряют молекулярно-генетическую диагностику, определяющую ДНК бактерий в биологическом материале. Это высокочувствительные, специфичные, достаточно простые и быстрые для получения результата методы. Один из них – ПЦР – все чаще применяется для исследования инфекционных болезней, выявляет ДНК 29 ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ из патматериала, содержащего менее 100 клеток бруцелл. Использование метода ДНК. ДНК гибридизации показало, что бактерии рода Brucella – компактная, хорошо обособленная группа микроорганизмов. Уровень гомологии ДНК очень высокий, составляет 90–100 % независимо от степени диссоциации. Ученые обсуждают и такое предложение: на основе гомологии ДНК бруцелл объединить все их виды в один – В. melitensis и рассматривать как биовары. Однако Г. Ф. Коромыслов и С. К. Артюшин сообщают о различиях в профиле фрагментов ДНК при анализе рестрикционным методом (ПДРФ), основанным на применении эндонуклеаз. Исследование ДНК бруцелл с помощью ПДРФ выявляет межвидовые и даже межштаммовые различия. Молекулярно-генетическая идентификация ДНК разных видов бруцелл в значительной степени разрешает проблему диагностики бруцеллеза, в том числе и прижизненную. Из серологических методов, не вошедших в Наставление по диагностике бруцеллеза в нашей стране, следует отметить РНГА. Изучение ее специфичности и чувствительности при бруцеллезе людей, крупного рогатого скота, овец и лабораторных животных показало значительное превосходство над РА, РСК, реакцией Хеддельсона и др. РНГА была предложена и для дифференциации реакций у больных бруцеллезом и вакцинированных животных. Одна из модификаций РНГА – реакция нейтрализации антител (РНАТ), которая применяется как ускоренный метод индикации возбудителей многих инфекционных заболеваний. РНАТ основана на том, что вследствие образования комплекса антител с гомологичным антигеном сыворотка утрачивает способность агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные этим антигеном. Диагностическое значение РНАТ при различных инфекциях высоко оценено многими исследователями. Широко известна высокая чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа (ИФА). Стабильность реагентов (до двух лет), простота метода регистрации результатов, возможность автоматизации и применения в стационарных и передвижных лабораториях обусловливает целесообразность использования 30 ИФА при диагностике инфекционных болезней. С помощью ИФА можно выявлять отдельные классы и субклассы противобруцеллезных антител (IgM, IgGi, IgG2). Сравнение титров IgM и IgG позволяет разграничивать острую и хроническую формы болезни, а также дифференцировать бруцеллез от иерсиниоза, вызванного Y. enterocolitica. Многие методы диагностики бруцеллеза (РИФ, РБП, ИФА, РНГА, РСКК и др.) предлагали как универсальные, позволяющие обходиться только одной реакцией, результаты которой совпадают с суммарными данными РА, РСК и РДСК. Однако на практике это не оправдалось, потому что патогенез бруцеллеза характеризуется волнообразным течением, что отражает и старое название болезни – ундулирующая лихорадка. После внедрения возбудителя заболевание чаще развивается в острой форме, потом сменяется хронической и латентной с временными обострениями. Значимость серологических и аллергических методов неоднозначна в разные периоды. В острый, сразу после заражения, в сыворотке крови появляются агглютинирующие антитела преимущественно IgM-класса, которые сменяются комплементсвязывающими, в основном IgG-класса, выявляемыми в РСК и РДСК. Одновременно у больных животных развивается сенсибилизация к гомологичному антигену, что показывает аллергическая реакция на бруцеллин. РСК и аллергическая реакция на бруцеллин более стабильны и сохраняются дольше РА, которая в поздние сроки заболевания периодически появляется и исчезает, особенно при обострении латентной формы бруцеллеза. Метод его провокации введением антигенов, в том числе неагглютиногенных, способствует более полному выявлению больных животных. По этой причине все предложенные методы диагностики применяются в комплексе. В связи с неодинаковой чувствительностью и специфичностью, а также стадией инфекционного процесса каждый конкретный метод в отдельности выявляет разное количество положительно реагирующих животных. Некоторые методики (РДСК, РИФ, ИФА, РНГА, РНАТ и др.) позволяют обнаруживать не только антитела в сыворотке крови, но и антигены бруцелл в патматериале, а также дифферен- ВЕТЕРИНАРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ • 04 • 2011 ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ цировать реакции у больных и вакцинированных животных (РНГА, РИД). Иммунологические реакции при бруцеллезе (особенно серологические) показывают главным образом иммунологическую реактивность организма и не отражают степени его невосприимчивости. Следовательно, все перечисленные методики не могут быть использованы для изучения напряженности и длительности иммунитета, тем более что наметилась тенденция разработки слабоагглютиногенных и неагглютиногенных вакцин. Бруцеллез – одно из немногих заболеваний с таким богатым арсеналом диагностики. Однако при выявлении больных животных и оздоровлении неблагополучного стада сказы- вается несовпадение интересов ветеринарных и хозяйственных служб. Сдерживает энтузиазм специалистов и само разнообразие методов, которые периодически то внедряются, то отменяются. Так, аллергический метод, применявшийся раньше практически на всех видах животных, сейчас используется только на свиньях. Примерно то же происходит и с РБП. Все это снижает доверие практиков к предлагаемым решениям, осложняет толкование результатов исследований, особенно на фоне использования агглютиногенных вакцин. Есть надежда, что молекулярно-генетическая диагностика бруцеллеза, которая в последнее время внедряется в ветеринарную практику, позволит избавиться от этих проблем. Коротко о важном ЭКСПЕРТЫ ООН ПОМОГУТ СЕВЕРНОЙ КОРЕЕ СПРАВИТЬСЯ С ЯЩУРОМ Группа экспертов ООН и Всемирной организации здоровья животных помогает Северной Корее погасить вспышку ящура у свиней и рогатого скота, сообщает «Радио ООН». Эта болезнь обычно поражает также коз, овец, бизонов и легко передается от одного животного к другому. Хотя ящур не представляет прямой угрозы для человека, он способен лишить фермеров дохода. Ведь больных животных нельзя использовать для полевых работ, не подлежат продаже и молочные продукты зараженных коров, овец и коз. Группа международных экспертов проведет оценку ситуации и даст рекомендации о том, как сдержать распространение заболевания и предотвратить возникновение новых вспышек ящура. ЗАРАЖЕННОЕ МЯСО ИЗ ГЕРМАНИИ МОЖЕТ ПОПАСТЬ В РОССИЮ В настоящее время санитарная служба России ждет от немецких специалистов результатов расследования заражения мяса диоксином, сообщает «Русская служба новостей». «Нас интересуют данные о результатах расследования: где находятся изготовленные на основе технических масел и контаминированные диоксином корма; объемы забракованной животноводческой продукции; уничтожена ли она; причины, по которым до сих пор не открыты животноводческие фермы», – сказал глава Роспотребнадзора Г. Онищенко. По его словам, соответствующее письмо направлено в Министерство сельского хозяйства Германии, однако немецкие службы тянут с ответом. «ЕС также не в состоянии дать ответы на наши вопросы. Все это выглядит как двойные стандарты на фоне постоянных претензий к российской стороне по поводу нашей системы обеспечения безопасности пищевой продукции», – заявил Г. Онищенко. «Нас все это волнует из-за опасности возникновения криминальных схем попадания этой продукции на российский рынок», – сообщил он. Ранее Россия ввела запрет на ввоз свиней из Германии. В корма мог попасть диоксин. Агентство «АгроФакт» 04 • 2011 • ВЕТЕРИНАРИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 31