Электрофорез в агарозном геле.

Электрофорез в агарозном геле.
Принцип метода электрофореза.
Электрофорез – метод разделения макромолекул, различающихся
по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пр остранственная конфигурация, вторичная структура и элек трический заряд.
Принцип метода:
Физический принцип метода заключается в следующем. Наход ящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым су ммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависит от
рН среды. Если через этот раствор, зак люченный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала
установится определенный градиент напряжения, т.е. сформируется
электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью поте нциалов по концам канала, отнесен ной к его длине (В/с). Под действием
поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом м игрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окр ужающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от в еличины заряда и размеров молекулы приобретают различные скорости.
Постепенно исходный препарат, состоящий из различных молекул, ра зделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой
скоростью. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем,
наличие сетки которого вносит важную дополнительную деталь в эле ктрофоретическую миграцию молекул. Фракционируемые молекулы
сталкиваются с нитями полимера, образующую сетку геля, что увел ичивает сетку геля и снижает скорость движения молекул. Препятствия
для миграции становятся особенно серьезными, если средний размер
пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами ма кромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую
подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает
соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация,
когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот в ообще не могут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекр атиться.
В настоящее время используют ПААГ и агарозный гель. В арьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень шир оким
диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрич еские
заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигур ацию
путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все
это придает методу электрофореза исключительную гибкость.
В ходе электрофореза зоны макромолекул остаются невид имыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют
краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же зн а1
ка, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними.
Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде
окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость м играции наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у
молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки,
электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их дифф узии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной
формы и вымачивают в смеси, кислоты выпадают в осадок в том мес те,
где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации
(или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачив ания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или
нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.
Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких
пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие
пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно
фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного
края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат ра зделяется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя
свой набор зон. Кроме того, поскольку гель заливают в форму для п олимеризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содерж ание добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следовательно,
плотность тока и напряжение электрического поля также одинаковы.
Это обеспечивает строго идентичные условия фракционирования ра зных препаратов и дает возможность достоверного сопоставления их с остава путем сравнения положения полос в параллельных треках.
Особенности агарозного геля.
Агароза – это особо чистая фракция природного линейного пол исахарида агара, который получают из морских красных водорослей
(Gracilaria, Gelidium, Ahnfeltia).
Агароза состоит из строго чередующихся остатков 3-Озамещенной-β-D-галактопиранозы и 4-О-замещенной 3-6-ангидро-α-Lгалактопиранозы. Молекулярная масса ее составляет 10 4 -10 5 . Гелеобразование идет путем связывания в пространственную сетку пучков нитей
за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обр азуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.
При температурах 84-96 o (а у специальных типов – уже при 70 o )
раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10 -15 с П,
что примерно соответствует вязкости 50% -ного раствора сахарозы при
комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выр аженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значител ьно более низких температурах (36-42 o ). У легкоплавких типов агарозы
2
эта температура снижается до 30 o . Такая особенность облегчает ман ипуляции с расплавленной агарозой - можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную агарозу пре дварительно охлаждают до 50-55 o и уже при этой температуре заливают
в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных те пловых деформаций.
Гели агарозы не вполне прозрачны, что обусловлено «кристалл изацией» геля.
Затвердевший гель представляет собой н е вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жи дкость. Температура плавления и гелеобразования зависят от с одержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3 -4%.
Наличие этих групп затрудняет гелеоб разование.
В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Чем
меньше в агарозе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электр остатического отталкивания между молекулами полимера и выше их
способность к связыванию водородными связями. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания
гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры
серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе
в гелях агарозы явление эндосмоса, суть которого в след ующем: отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с
полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные
ионы, находясь в водной фазе под действием электрического поля м игрируют в направлении катода. Их место занимают катионы, которые
увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и
вместе с ней – растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Эле ктрофорезом в агарозном геле чаще всего разделяют отрицательно зар яженные макромолекулы, а эндосмос направлен в про тивоположную
сторону и ухудшает разделение. Поэтому агарозу подвергают спец иальной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах
не превышает 0,5%.
Рис. 1. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер
фракционирования двунитевых ДНК одина кового размера [Johnson et al., 1980]
3
1 — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — кольцевая; степень эндосмоса увеличивается слева направо
Типы агарозы, отличающиеся слабо выраженным эндосмосом, с одержат менее 0,3% сульфата. В случае необходимости мо жно провести
дополнительную очистку агарозы от сульфата обработкой 1М NаОН в
0,05%-ном боргидриде натрия и переосаждением 50% -ным этанолом.
Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и не специфическую сорбцию белков на агарозе, в результате чег о полосы расплываются с образованием «хвостов». Степень эндосмоса колич ественно оценивают с помощью коэффициента относительной миграции
(-m r ) – представляющего собой отношение скоростей миграции незаряженного полимера (за счет только эндосмоса) и сходного с ним по
структуре полианиона при электрофорезе в агарозе данного типа.
Некоторые типы агарозы по номенклатуре фирмы « Miles»:
тип LE – малая степень эндосмоса -m r =0,1-0,15;
тип HE – сильно выраженный эндосмос -m r =0,23-0,26.
Агароза с повышенными температурами плавления и гелеобразования (тип HGT) имеет -m r <0,1, именно она чаще всего используется
для обычного электрофореза. Специальная технологическая обработка
(введение оксиэтильных групп) позволяет получать агарозу с малой
степенью эндосмоса и пониженными температурами плавления и затвердевания, например тип LGT, 1%-ный раствор такой агарозы остается жидким при физиологической температуре (37º); кроме того плавл ение геля можно осуществить при температуре более низкой, чем темп ература денатурации ДНК. Для иммуноэлектрофореза, при котором и ммуноглобулины мигрируют к катоду и эндосмос способствует, а не
препятствует их разделению, была разработана специальная агароза
типа HEEO с сильно выраженным эндосмосом (-m r >0,3) , но не за счет
увеличения сульфатов, б лагодаря чему неспецифической сорбции белков на агарозе этого типа почти не происходит.
Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентр ации навеску порошка растворяют в соответствую щем буфере и нагревают до 90-95 o . Перед заливкой в форму раствор агарозы охлаждают
до 50 o .
Выбор концентрации агарозы, т.е. пористости ее геля, диктуется
размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2% ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически
упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с
более высоким содержанием агарозы используют для гель -фильтрации.
При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для м олекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрич еском поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют аг а4
розные гели с концентрацией 0,4 -2%. Ниже представлены примерные
концентрации гелей агарозы (в %) для некоторых распространенных
объектов фракционирования:
Высокомолекулярная ДНК вирусов и пла з-
0,4
мид
Рестрикты ДНК (5-20 тыс. пар оснований)
мРНК, денатурированная
Реовирусная двунитевая РНК (500 -5000 пар
оснований)
Рибосомная РНК
Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100 -1000
пар оснований)
Концентрация агарозы, %
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
2,0
Длина
фрагментов
ДНК, т.п.н.
5-60
1-20
0,5-7
0,4-6
0,2-3
0,1-2
Концентрация акриламида, %
3,5
5
8
12
15
20
0,7
1,0
1,5
1,75
2,0
Длина
фрагментов
ДНК, п.н.
1000-2000
80-500
60-400
40-300
25-150
6-100
Разновидности электрофореза в агарозном геле.
Современные варианты электрофореза используют пластинки или
колонки с агарозным гелем.
В зависимости от цели исследований эоектрофорез в агарозном
геле может быть аналитическим и/или препаративным.
Аналитический электрофорез в агарозном геле имеет целью электрофоретическое разделение макромолекул с последующей визуализ ацией и анализом полученных результатов.
Агарозный электрофорез применяют в препаративных целях. Для
извлечения из геля разделенных компо нентов используют несколько
способов: агарозный гель подвергают элюции буферными растворами,
центрифугированию, замораживанию и оттаиванию.и др.
Аппаратура
Вертикально расположенные трубки
Вертикальное расположение гелей и меет то преимущество, что
препарат, наносимый на гель сверху, при любом его объеме равномерно
покрывает всю рабочую поверхность геля. Затруднение при вертикал ь5
ном расположении могут возникать при недостаточной сцепле нности
геля со стеклом, он будет сползат ь вниз.
Все приборы для с вертикальным расположением гелей ко нструктивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположением,
т.к. верхний электродный резервуар должен быть поднят над гелем.
Необходимо уплотнение в местах сочленения его с трубками или пл астинами.
Трубки (12-18штук) с уже заполимеризованным в них гелем
вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верхние концы
выступали над дном резервуара. Если используют не все трубки, то на
их место ставят заглушки. Собранный вместе с трубками в ерхний электродный резервуар устанавливают на нижний так, чтобы концы трубок
оказались на некотором расстоянии от дна последнего и заполняют
нижний резервуар электродным буфером до такого уровня, что трубки
оказываются почти полностью погруженными в буфер. Это делается
для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза. С этой же целью
нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой или вводят допо лнительную охлаждающую систему. Оба резервуара цилиндрической или
прямоугольной формы изготавливают из плексигласа , что позволяет
следить за продвижением фронта красителя. В резервуарах должны
быть закреплены электроды из платиновой проволоки. Нижний эле ктрод при этом должен располагаться так, чтобы поднимающиеся от н его пузырьки газа не попадали на нижние торцы трубо к, что создавало
бы помехи протекания через них тока. Объемы электродных резерву аров достаточно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изм енялся под влиянием продуктов электролиза.
Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок з аклеивают парафильмом и устанавливают строго вертикально в штатив.
Заливают гель. Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный
резервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее конца
оставляют свободной, и туда при заливке попадает буфер. Затем под
него, на поверхность геля, пипеткой наслаивают препарат, в который
добавляют предварительно 5-10% сахарозы. При любом варианте эле ктрофореза надо быть уверенным в том, что исходный препарат своб оден от взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соб ираться на торце геля и однородность тока по его сечению, что повлечет
за собой деформацию разделяющихся зон. В этом случае препарат сл едует отфильтровать или очистить центрифугированием.
По окончанию электрофореза гель из трубки извлекают. В
большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и зату пленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов трубки, кр уговыми движениями отслаивая гель от ее стенок. Если необходимо т акую операцию проводят и с другого конца. Через иглу при этом пост упает вода из закрепленного выше резервуара. Если гель отслаивается с
трудом, в воду можно добавить 0,5 -1% раствор детергента. Во избеж а6
ния поломки следует дать гелю возможность выскользнуть из трубки в
сосуд с водой, над которым проделывают эти манипуляции. Иногда д ля
удаления геля из очень длинных трубок по его периферии с концов
впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой из присоединя емого к трубке шприца. Если гель высокой концентрации вынуть не уд ается, его приходится замораживать, а трубку разбивать моло тком. Иногда можно решить проблему путем вымачивания трубки с гелем в мет аноле: гель постепенно съеживается и отстает от стенки.
Основным недостатком электрофореза в трубках является з атрудненный отвод тепла даже при диаметре 5мм. На оси геля темпер атура оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности.
Это приводит к изгибу зон и соответственно окрашенных полос, п оскольку электрофоретическая подвижность зависит от температуры. В
условиях хорошего теплоотвода можно вести микроэлектрофорез в к апиллярах диаметром 0,7-1,5мм.
Вертикально расположенные пластины
Для электрофореза белков обычно используют пластины ш ириной 8-14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 -28 см.
Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а затем
и электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зе ркального стекла толщиной 5-6мм. Расстояние между пластинами зад ается толщиной прокладок из тефлона или плексигласа («спейсеров») и
определяет толщину геля. Прокладки шириной 10 -15мм устанавливают
вдоль боковых краев стекол. Эти же прокладки можно использовать и
для уплотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердевш его геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно такой же
толщины по нижнему краю стекол и плотно прижимают ее к фрезер ованным торцам боковых прокладок.
При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить
проще - заклеить торцы стекол липкой лентой. Нижнюю прокладку при
этом можно не устанавливать. Уплотнение не будет совершенным, но
агароза в контакте с прокладками и лент ой быстро застынет и заметного ее вытекания не будет. Для надежности можно сначала залить н ебольшой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а п отом залить остальной ее объем.
Собранную и уплотненную форму устанавливают вертикал ьно и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную аг арозу.
В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут
электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно затем с опоставить при идентичных условиях разделения. Сопоставляемые пр епараты фракционируют в параллельных друг другу «треках». В ходе
полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых
углублений прямоугольной формы - «карманов», в которые затем вн осят исследуемые препараты. Для этого в еще незаполимеризовавшийся
7
гель или горячую агарозу вставляют гребенку из тефлона или плекс игласа. Прямоугольные зубцы гребенки и формируют карманы.
Гель или агарозу заливают между пластинами с таким расч етом, что при опускании гребенки до упора жидкий гель заполнил пр омежутки между ее зубцами. Гребенку начинают вставлять с некоторым
перекосом, чтобы под ее зубцами не задерживались пузырьки воздуха.
Когда гель готов, вынимают нижнюю прокладку или снимают липкую
ленту и осторожно вытаскивают гребенку. При работе с концентрир ованным ПААГ гель может прилипать к зубцам гребенки и нижние
плоскости карманов могут оказаться неровными. Это ухудшает условия
формирования исходных полос в геле. В таком случае имеет смысл вв ести еще один слой геля пониженной концентрации, и гребенку устана вливают в него.
Для проведения электрофореза чаще всего используются
приборы конструкции, предложенной Стадиером. Верхний и нижний
резервуары прямоугольной формы соединены вертикальной стенкой, в
которой имеется вырез, ведущий в полость верхнего резе рвуара. Такой
же вырез имеет и одна из двух стеклянных пластин, меду которыми п олимеризуется гель. Пластины прижимаются пружинными зажимами к
вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпадали. Буфер в верхний
резервуар заливают до такого уровня, чтобы он через в ырез покрывал
верхний торец геля. При этом вторая, не вырезанная, стеклянная пл астинка выступает в роли передней стенки резервуара. В месте совм ещения двух вырезов, между стеклянной пластиной и стенкой, должно
быть осуществлено уплотнение, препятствующее вытеканию верхне го
буфера. В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой пр оволоки. При установке в прибор форму с гелем частично погр ужают в
буфер нижнего резервуара, так что она опирается на разнесенные по
сторонам выступы и ее нижний торец оказывается приподнят ым над
дном резервуара. После погружения необходимо удалить пузырьки
воздуха.
По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаивая
одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают между пласт инами со стороны карманов и слегка поворачивают. Со вто рой пластины
гель снимают руками и переносят в ванночку для фиксации или окр аски. Необходимо проводить манипуляции в перчатках, т.к. случайное
прикосновение кожи рук к рабочей поверхности геля при современных
чувствительных методах окрашивания может остави ть на геле артефактное белковое пятно.
Горизонтально расположенные пластины
Преимущество-отсутствие проблемы уплотнения. Оба эле ктродных буфера находятся в резервуарах, расположенных ниже уровня
горизонтального столика, на который кладут гель.
8
Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке
или плашке из плексигласа, помещают на столик открытой поверхн остью кверху, поскольку препарат вносят не с торца, а в ряд специал ьных «колодцев», расположенных на некотором расстоянии от края.
Электрофорез проводят в форезных камерах. Препараты вносят в «к олодцы» вместе с красителем - бромфеноловым синим, содержащим
также глицерин, который «прижимает» краситель и препарат, не позв оляя им диффундировать в геле или в буфере.
Пластины для горизонтального элект рофореза в агарозе можно
приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально установленную (по
уровню) плоскость кладут тонкое стекло определенного размера и на
него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем
надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной
толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать.
Фирма LKB рекомендует наносить препараты прямо на поверхность
агарозы через прорези наложенного на пластину специального шаблона
со щелями. Препарат объемом 2 — 4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравнительно пр остое приспособление, смонтированное на столике для заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при заливке агарозы образовать колодцы для
препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфере в течение суток.
Итак, электофорез в агарозном геле позволяет идентифицировать
большое количество белковых фракций. Пример – электрофоретическое
разделение белков сыворотки крови.
Электрофорез проводят в 1%-ном агарозном геле в мединалвероналовом буфере рН=8,6 с ионной силой 0,05. Все белки сыворотки
крови при рН=8,6 заряжаются отрицательно заряд и движутся от катода
к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую
молекулярную массу, затем располагаются  1 -,  2 -, - и -глобулины.
Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на н есколько подфракций. Первоначальная оценка результатов электрофор етического разделения сывороточных белков (выявление нормы или п атологии) должна проводиться визуально, путем сравнения с картиной
нормальной сыворотки, а количественные данные предназначены тол ько для документирования результатов и динамического наблюдения.
Для электрофореза белков используются различные аппараты, как
ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены
микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в
большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных
мембран или гелевых пластинок (определения относительного колич ества белков в каждой фракции) используется электронный цветной ск а9
нер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность
и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает во зможность усредненного расчета оптической плотности отдельных
фракций путем автоматического определения границ "дорожек" и мн огократного сканирования каждой из них в нескольких "разрезах", что
позволяет исключить ошибки из-за локальных микродефектов и неро вного положения носителя, а также до определенной степени нивелир овать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной
отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график - денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций.
При необходимости маркеры границ фракций на графике можно ско рректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их
показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофор еграмм; их можно в любое время извлечь и просмотреть. Электрофорез
белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико химические характеристики, помогает выявить заб олевания печени и
почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразов ания (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетически е поломки
и др
Методика электрофореза в агарозном геле.
Для приготовления агарозного геля в СВЧ-печи или на водяной бане расплавляют смесь агарозы, буфера и воды. Охлажденную до 50-60оС смесь тонким
слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле лунки
для нанесения образца. Исследуемый препарат (раствор белка, ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля - полужидкой среды с сетчатой пространственной структурой (обычно для электрофореза используют тонкие пластины
геля). Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым
суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический
ток, они перемещаются в электрическом поле. Молекулы одинакового размера (и
одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся. Постепенно исходный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки. За ходом электрофореза следят по перемещению в геле красителя - заряженного низкомолекулярного вещества, которое
вносят в каждую лунку перед началом электрофореза. Когда краситель достигает
конца пластины, электрофорез останавливают, а гель окрашивают красителем,
прочно связывающимся с белками или нуклеиновыми кислотами. Если образец
представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после
электрофореза получается набор четких полос, расположенных одна под другой.
Если же распределение молекул по размеру более или менее непрерывно, то получается смазанная картина. По интенсивности окраски полос можно судить о концентрации макромолекул в образце. Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез
маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров
10
должен охватывать весь диапазон молекулярных масс в данной системе. Образец
маркерных молекул вносят в отдельную лунку, расположенную вблизи одного из
краев пластинки (или в две лунки у двух разных краев). Логарифм относительной
молекулярной массы маркера линейно связан с его электрофоретической подвижностью Rf — величиной, равной отношению расстояний, пройденных маркерной
молекулой и красителем (фронтом растворителя). Построив график зависимости
логарифма относительных молекулярных масс маркеров от Rf, можно найти относительную молекулярную массу каждого компонента образца. Относительная
мол. масса белков измеряется в дальтонах, двухцепочечных нуклеиновых кислот в числе пар нуклеотидов, одноцепочечных — в числе нуклеотидов.
Напряжённость электрического поля.
Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для
высококачественных или препаративных форезов: ~2V/cm. Для анал итических форезов приемлемое качество сохр аняется до ~6V/cm.
Буфер для внесения. Выбор красителя:
 Бромфеноловый синий и ксиленцианол - могут заметно мешать
наблюдению фрагментов под UV.
 Cresol red - совместим с ферментативными реакциями, пра ктически не мешает наблюдению под UV.
 OrangeG – наиболее подвижный краситель, практически вс егда находится вне "рабочей зоны". Заметен под UV.
Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко з аметен в лунке и в геле.
Буфер для внесения 10х:
SDS
0.5%
EDTA, pH8.0
0.1M
глицерол
50%
H2O
Особенно широко агарозные гели применяются для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот.
Нуклеиновые кислоты обладают значительным по величине отр ицательным зарядом, величина которого мало зависит от рН окружа ющей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для
всех нуклеиновых кислот. Поэтому фракционирование идет за счет ра зличия в размерах молекул. Выбор буфера в данной ситуации не играет
11
существенной роли. Используют 0,089М Трис -боратный, 0,05 Трисфосфатный и Трис-ацетатный буфер.
Широкий диапазон молекулярных масс исследуемых фра гментов нуклеиновых кислот определяет широкий диапазон концентр ированности ПААГ и агарозного геля. Примеры определения процентн ости гелей приведены выше в соответствующем разделе. Однако необ ходимо отметить, что обычные варианты гель -электрофореза не позволяют разделить фрагменты ДНК, размер которых превышает 50 т.п.н.
Данное затруднение удалось преодолеть после того, как в 1984г. Был
разработан метод гель-электрофорез с пульсирующим полем ( pulsed
field gel electrophoresis, PFGE), называемый также пульс-электрофорез.
Показано, что если с некоторой частотой менять определенным образом
направление электрического поля, то молекулы ДНК размером до
10млн. п.н. приобретают способность переориентирова ться и проходить
через поры в обычном агарозном геле. Гель помещается в ячейку, им еющую форму шестиугольника, на каждой стороне которого расп оложено по 4 электрода. Периодическое изменение направления вектора
электрического поля под углом 120 0 обеспечивает возможность разделения гигантских молекул ДНК. Пульс -электрофорез явился новым
мощным методом изучения молекулярной организации гигантских
ДНК. Редкощепящие рестриктазы, узнающие последовательность из
8п.н., гидролизуют ДНК, как правило, с образованием оч ень крупных
фрагментов, которые удается разделить только с помощью этого мет ода. Эти фрагменты можно переносить из геля на нитроцеллюлозную
мембрану по Саузерну. Для этого ДНК фрагментируют в геле, облучая
после окраски бромистым этидием или расщепляя хими чески. Объединение пульс-электрофореза с блоттингом по Саузерну позволяет карт ировать гены, анализировать перестройки в хромосомах, выявить инт еграцию чужеродных последовательностей в определенные хромосомы,
изучать библиотеки клонирования крупных фрагмент ов ДНК и т.д.
Электрофорез нуклеиновых кислот сильно зависит от вт оричной структуры. Двунитевая молекула имеет более жесткую структ уру, труднее изгибается, проходя через пространственную сетку геля.
Однако для молекул с молекулярной массой больше 3,5млн.д альтон ситуация обратная: двунитевая молекула обладает достаточной гибк остью, чтобы проходить через сетку геля, в то время как однонитевая
молекула той же длины сворачивается в хаотический клубок такого
размера, что ее продвижение затрудняется. Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий могут иметь
структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого
кольца - «сверхскрученое». Кольцо в целом сворачивается в «жгут»,
что сильно увеличивает его компактность (форма1). Ес ли же хотя бы в
одной нити кольца имеется единичный разрыв, то жгут разворачивается
и силами электростатического отталкивания фосфатных групп кольцо
расправляется. Компактность молекулы становится меньше, размеры
12
увеличиваются (форма2). Форма1 при электроф орезе всегда мигрирует
быстрее формы2. Линейная двунитевая молекула ДНК (форма3) может
мигрировать быстрее или медленнее, чем сверскрученое кольцо один аковой с ней молекулярной массы, в зависимости от среднего размера
пор геля. Для крупнопористого геля име ет значение размер молекулы, а
для мелкопористого - большая гибкость линейной молекулы. Чем
больше напряженность электрического поля, тем при более низкой
концентрации геля агарозы проявляется преимущество гибкости фо рмы3. Скорость миграции линейных двун итевых молекул ДНК уменьшается с увеличением их молекулярной ма ссы, но лишь до определенного
предела. При молекулярной массе более 5млн. в 1,6% -ном геле агарозы
и более 12млн. в 0,8%-ном геле линейные молекулы ДНК мигрируют с
одинаковой скоростью независимо от их молекулярной массы и, след овательно, не могут быть разделены электрофорезом. Это происходит
вследствие гибкости длинных мол екул ДНК, их противоположные ко нцы мигрируют в электрическом поле независимо друг от друга, и вся
молекула, извиваясь, проходит через гель одинаково при всей ее длине.
Для разделения таких молекул используется уже рассмотренный выше
пульс-электрофорез.
РНК может иметь существенно более нев ыгодную для миграции в геле втори чную структуру, чем ДНК. У крупных молекул РНК эта структур а представлена многочисленными, то рчащими во все стороны «шпильками». Такая молекула не может прох одить через поры геля «извиваясь ужом». Поэтому, например, РНК с
массой 0,7млн. дальтон даже не входит в 5% -ный ПААГ. Нечто аналогичное может происходить и при частичной денатурации ДНК.
Во многих случаях электрофореза бывает желательно оц енить молекулярные размеры фракционируемых нуклеиновых кислот.
Для этого удобно иметь набор молекул того же типа, но известной дл ины. В настоящее время имеется большое количе ство коммерческих
маркеров на основе фага лямбда или DNA ladders, дающие при электрофорезе ряд последовательных полос на треке, соответствующих
фрагментам определенной массы. В качестве лидирующих красителей
используют бромфеноловый синий и ксиленцианол.
Так, для регистрации продуктов реакции амплификации ДНК и спользуют электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого
этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое
соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при
облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290 -330 нм.
В лунки геля наносится амплификат, уже содержащий лидиру ющий краситель. Форму с гелем, содержащим нанесенные образцы пер еносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру по дключают к источнику питания (напряжение 10-15 В/см длины геля), и
проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в
13
направлении от катода к аноду. Контроль за электрофоретическим ра зделение осуществляется визуально по движению полосы красителя. По
окончании электрофоретического разделения вынимают гель из формы
и просматривают в ультрафиолетовом свете с помощью УФ трансиллюминатора (желательно фотографируют). Фрагменты анализ ируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево -красных полос.
Рис.2. Электрофорез продуктов амплификации ДНК.
Рис.3 Картирование сайтов рестрикции. А. Результаты гельэлектрофореза фрагментов ДНК, полученных ее расщеплением указа н14
ными ферментами. Очищенную ДНК гидролизовали рестриктазами
EcoRI и BamHI раздельно, а затем их смесью, проводили гель электрофорез и визуализировали продукты о крашиванием бромистым
этидием. Числа слева от горизонтальных полос -длина фрагментов в
парах оснований.
Б. Рестрикционная карта, построенная по электрофоретическим
данным. Числа — расстояние между сайтами узнавания соответству ющих ферментов.
Преимущества агарозного геля в качестве твердого носителя
для электрофореза:
 прочность агарозного геля;
 крупнопористость (позволяющая разделять особенно крупные молекулы, в частности нуклеиновые кислоты);
 агарозный гель является очень мягким носителем (т.е. в о тличие от электрофореза на бумаге, например, при нем не
происходит инактивации белков, что позволяет определять
активность отдельных фракций белков после проведения
электрофореза);
 приготовление агарозного геля значительно проще, чем
крахмального и полиакриламидного;
 относительно небольшая продолжительность электрофореза
(сильно варьирует в зависимости от варианта метода);
 относительная дешевизна метода.
Таким образом, электрофорез в агарозном геле в различных мод ификациях широко применяется как метод разделения макромолекул в
биологии и медицине.
15