окраска по Граму - Камчатский государственный технический

Министерство сельского хозяйства Российской федерации
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ
КАМЧАТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ
КАФЕДРА БИОЛОГИИ И ХИМИИ
ХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ ВОДЫ
ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ОКРАСКА ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Методическое указание к лабораторной работе для студентов специальности 320600
«Комплексное использование и охрана водных ресурсов»
ПЕТРОПАВЛОВСК-КАМЧАТСКИЙ, 2004 г
УДК
ББК
С. 22
Составитель: Саушкина Л.Н., доцент
Рецензент: Березовская В.А.., профессор, д.г.н.
Учебно-методическое указание разработано в соответствии с рабочей программой дисциплины «химия и микробиология воды» для студентов специальностей 320600 «Комплексное использование и охрана водных ресурсов».
Учебно-методическое указание обсуждено и одобрено на заседании кафедры биологии и химии КамчатГТУ протокол №___ от ___ ____ 2005 г
1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить методы приготовления и окраски препаратов микроорганизмов. Приобрести
навыки работы с микроскопом. Закрепить теоретический материал по теме морфология бактерий.
2. ЗАДАНИЕ
2.1. Ознакомиться с приготовлением препаратов бактерий в «раздавленной» и «висячей»
капле.
2.2. Ознакомиться с красителями и способами их приготовления.
2.3. Ознакомиться с простыми и сложными методами окраски бактериальных препаратов.
2.4. Приготовить и окрасить бактериальный препарат по методу Грамма.
3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
При работе с микроорганизмами рабочее место должно быть оборудовано определенным образом. На столе следует держать предметы первой необходимости: спиртовку, бактериологическую петлю, набор красок, микроскоп, кедровое масло, пинцет, полоскательницу с
мостиком, сосуд с водой, карандаш по стеклу, фильтровальную бумагу. Предметные и покровные стекла используемые для приготовления препаратов должны быть совершенно чистыми.
По окончании работы рабочее место приводят в порядок, а стол дезинфицируют.
Одним из методов микробиологического исследования является микроскопический метод, который позволяет изучать микроорганизмы в окрашенном или неокрашенном виде с
помощью микроскопа. Предварительно необходимо приготовить препарат, пригодный для
микроскопирования.
Препарат типа «раздавленная» капля готовят для изучения микроорганизмов в живом
состоянии. Для этого на середину предметного стекла наносят каплю водопроводной воды
(или другой прозрачной жидкости) и в нее вносят немного микроорганизмов. Каплю осторожно накрывают («раздавливают») покровным стеклом. Капля должна тончайшим слоем
заполнить все пространство между покровным и предметным стеклом, но не выступать за
края покровного стекла. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой;
при недостатке жидкости ее добавляют, подпуская стеклянной палочкой под покровное стекло.
При исследовании бактерий и дрожжей, выращенных на плотной питательной среде,
небольшая их масса берется бактериологической петлей, тщательно размешивается в капле
воды, нанесенной на предметное стекло.
При исследовании грибов и их культур берется небольшой кусочек мицелия с помощью
двух препаровальных игл. Мицелий на предметном стекле осторожно расправляют иглами,
стараясь как можно лучше разъединить гифы. В качестве жидкости используют смесь спирта
и глицерина (1:1).
Если исследуемые микроорганизмы находятся в жидкой среде, то на предметное стекло
наносят каплю этой суспензии (взвеси) без добавления при этом воды или другой жидкости.
Суспензию берут стеклянной палочкой или бактериологической петлей. Бактерии и дрожжи
микроскопируют с объективом х40, грибы с объективом х8 и х40. Можно микроскопировать
их и с объективом х90, но при этом необходимо использовать особо тонкое покровное стекло,
на поверхность которого наносят иммерсионное масло.
Препарат типа «висячая» капля используют для исследования микроорганизмов в живом виде для наблюдения их подвижности, прорастания спор и др. Для этого небольшую каплю суспензии (взвеси) микробных клеток наносят на покровное стекло и осторожно накладывают на него предметное стекло с лункой так, чтобы капля свободно помещалась в центре
углубления. Края лунки предварительно смазывают вазелином, препарат переворачивают и
микроскоприруют.
Способы окрашивания препаратов микроорганизмов делятся на простые и сложные.
При простом способе окрашивания используется один краситель чаще всего фуксин Пфейфера или метиленовый синий. Этот способ применяется для ознакомления с морфологией бак-
терий. При сложных способах окрашивания применяют два или более красящих веществ.
Кроме красящих используют различные обесцвечивающие вещества (спирт). К сложным методам относятся, например, окраска по Грамму, окраска спор, капсул и др. Такое окрашивание применяют с целью диагностики, выявления отличительных структур микробов в случаях, когда последние не окрашиваются простыми способами.
При любом способе окрашивания на начальном этапе методика приготовления препарата состоит из следующих операций: приготовление мазка, его высушивание и фиксация. Затем при простом способе окрашивания на охлажденный фиксированный мазок наносят 2-3
капли карболового фуксина Циля. Выдерживают мазок в краске в течение 20-24 секунд и затем краску смывают слабой струей воды из промывалки. Промытый препарат тщательно просушивают фильтровальной бумагой, прикладывая ее к мазку. На препарат наносят каплю
иммерсионного масла и микроскопируют с объективом х90.
Окраска спор бактерий производится с применением протравы (кислот, щелочей) для
разрыхления оболочки спор, что облегчает проникновение в них краски. Для этого предварительно готовят мазок, но не фиксируют его. На высушенный мазок наносят 1-2 капли 0,5%-го
раствора соляной кислоты и подогревают 1-2 минуты над пламенем горелки (до выделения
паров). Затем кислоту сливают, мазок промывают водой, высушивают и фиксируют. После
этого на охлажденный фиксированный мазок наносят 1-2 капли фуксина Циля и подогревают
до выделения пара (не допуская подсыхания краски). Затем краситель смывают водой, и препарат погружают на 20-40 секунд в стаканчик с 5%-ным раствором серной кислоты, а затем
промывают водой (при этой операции протоплазма клеток обесцвечивается, а споры остаются окрашенными). На промытый препарат наносят 2-3 капли метиленовой сини Лефлера. Через 3-5 минут краску смывают и просушивают препарат фильтровальной бумагой. Споры при
этом окрашиваются в красный цвет, а клетки в голубой.
Окраска бактерий по методу Грамма имеет большое значение для их распознавания
Одни бактерии окрашиваются по этому методу и называются грамположительными (грам +),
другие не окрашиваются и называются грамотрицательными (грам -)
Сущность метода заключается в том, что магниевые соли рибонуклеиновой кислоты,
содержащиеся в цитоплазме целого ряда микробов (грамположительных) вступают в реакцию с генцианвиоолетом и йодом и образуют стойкое соединение, не разрушающееся при
последующем воздействии спирта. Грамотрицательные микробы, имеющие иной состав цитоплазмы, прочного соединения с генцианвиолетом не образуют и при обработке спиртом
обесцвечиваются, а при дополнительной окраске водным раствором фуксина окрашиваются в
розово-красный цвет.
Шаровидные формы микробов 9кокки0 в большинстве своем красятся по Грамму положительно, извитые формы - отрицательно. Среди палочковидных форм микробов встречаются и грамположительные и грамотрицательные (палочки, образующие споры, окрашиваются
обычно положительно)
4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
4.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКА
На середину чистого предметного стекла нанесите маленькую каплю воды и введите в
нее немного бактерий, взятых с плотной питательной среды кончиком стерильной бактериологической иглы. Тщательно перемешайте. При этом получается слабомутная бактериальная
суспензия. Распределите (размажьте) ее тонким слоем по поверхности предметного стекла на
площади 2-3 см2.
4.2. ВЫСУШИВАНИЕ МАЗКА
Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе или (для ускорения) в токе теплого воздуха над небольшим пламенем газовой горелки, не допуская нагрева
стекла. Стекло при этом держат большим и указательным пальцами мазком вверх. Средний
палец помещают под стекло, чтобы контролировать степень нагревания.
ВНИМАНИЕ! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.
4.3.ФИКСАЦИЯ МАЗКА
Стекло с сухим мазком проводят 3-4- раза над пламенем газовой горелки, слегка прикасаясь к нему той стороной, где мазок отсутствует.
Фиксация мазка имеет целью убить клетки бактерий и закрепить (зафиксировать) мазок
на стекле. Мертвые клетки прокрашиваются лучше, чем живые.
4.4. ОКРАШИВАНИЕ МАЗКА
4.4.1. На мазок нанесите 2-3 капли раствора красителя генцианвиолета и через 2-3 минуты окрашивания краску смойте водой.
4.4.2. Нанесите на окрашенный мазок 2-3 капли раствора Люголя (раствор йода в йодиде
калия) и через 2 минуты смойте водой.
4.4.3. Препарат погрузите в стаканчик с 96%-ным этиловым спиртом на 30-40 секунд и
затем быстро промойте водой.
ВНИМАНИЕ! На обесцвечивание мазка спиртом следует обратить особое внимание.
При недостаточной обработке все клетки сохраняют окраску, при избыточной – обесцвечиваются.
4.4.4. На препарат нанесите разбавленный раствор фуксина и смойте его водой через 2
минуты. Просушите препарат фильтровальной бумагой.
Грамположитльные бактерии будут фиолетовыми, а грамотрицательные – красными,
т.к. обесцвеченные спиртом они воспринимают дополнительную окраску фуксином.
4.5. МИКРОСКОПИРОВАНИЕ МАЗКА
Микроскопируйте препарат с объективом х90 (используя иммерсионное масло). Зарисуйте увиденное под микроскопом. Определите видовую принадлежность (по форме) бактерий (рис. 1.).
Рис. 1. Формы бактерий
Шаровидные: 1- микрококки; 2-стрептококки; 3-диплококки и тетракокки; 4-стафилококки; 5-сарцины;
Палочковидные: 6-палочки без спор; 7-палочки со спорами;
Извитые: 8-вибрионы; 9-спириллы; 10-спирохеты
5. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
5.1. В каких случаях и как готовят препарат «раздавленная» капля?
5.2. В каких случаях и как готовят препарат «висячая» капля?
5.3. Чем отличается простой способ окрашивания бактериальных препаратов от сложного?
5.4. С какой целью при окрашивании спор бактерий используется раствор 5% серной
кислоты.
5.5. Сущность окраски по методу Грамма.
5.6. В какой цвет окрашиваются грамположительные и грамотрицательные бактерии?
5.7. В чем состоит методика окрашивания бактериальных препаратов по Грамму?
5.8. Для чего при окрашивании препаратов их обрабатываю этиловым спиртом?
5.9. С какой целью и как проводят фиксацию мазка?
5.10. На какие три группы по внешнему признаку делятся бактерии?
5.11. Чем отличаются по строению микрококки от стрептококков?
5.12 Перечислите формы кокков.
5.13. Каким способом размножаются бактерии?
6. РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
6.1. Возная Н.Ф. Химия и микробиология воды. – 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш.
шк., 1979. С 314.
6.2. Вольф И.В., Ткаченко Н.И. Химия и микробиология природных и сточных вод. - Л.:
Изд-во Ленииград. ун-та, 1973.
6.3. Микробиология очистки воды /М.Н. Ротмистров, П.И, Гвоздяк, С.С, Ставская. - Киев: Наук. думка , 1978. С. 267.
6.4. Таубе П.Р., Баранова А.Г. Химия и микробиология воды. - М.: Высш. шк., 1983. С
280.
6.5. Вербина Н.М. Гидромикробиология с основами общей микробиологии. – М.: Пиш.
пром-ть, 1980. С.288.
6.6. Карюхина Т.А., Чурбанова И.Н. Химия воды и микробиология. – 2-е изд., пераб. и
доп. М.: Стройиздат, 1983. С. 169.