Фенотипические характеристики кокковой микрофлоры кожи при

‘4 (23) октябрь 2007 г.
Тема номера: ПУЛЬМОНОЛОГИЯ. АЛЛЕРГОЛОГИЯ
41
Фенотипические характеристики кокковой
микрофлоры кожи при атопическом дерматите
Л. Т. БАЯЗИТОВА, Ю. А. ТЮРИН, Е. О. СУКМАНСКАЯ, С. Н. КУЛИКОВ,
ФГУН Казанский НИИЭМ Роспотребнадзора.
Атопический дерматит (АтД) — хроническое воспалительное
заболевание кожи, часто осложняется инфекционным поражением бактериальной, грибковой и вирусной этиологии (ВПГ, контагиозного молюска) [1]. В настоящее время АтД остается важной
медико-социальной проблемой в силу его высокой распространенности, увеличения частоты перехода заболевания в тяжелые
и хронические формы, что приводит к резкому снижению качества жизни больного и его семьи, способствует формированию
психосоматических нарушений [2, 3].
Более чем у 30% пациентов, страдающих АтД, выявляют бактериальное и вирусное поражение кожи, по сравнению с 7-10%,
среди больных псориазом [1].
Механизмы, лежащие в основе высокой распространенности
экзематозных поражений кожи, вызванной S. aureus, раскрыты
не полностью. Результаты проведенных иследований показывают, что высокая подверженность кожи пациентов с АтД инфицированию может быть связана с дефектом в системе местного
врожденного иммунитета кожи [4, 5], что проявляется в низкой
концентрации в дерме больных АтД антимикробных факторов
защиты пептидной природы, образуемых непосредственно кератиноцитами, а также гранулоцитами и клетками потовых желез
кожи [6]. Угнетению образования этих факторов в коже пациентов с АтД способствуют подавляющие эффекты дисбалансовых
концентраций ИЛ-4, ИЛ-13 и высокие концентрации IgE у большинства пациентов [7].
Получены убедительные доказательства, что при дефиците
в дерме пациентов с АтД антибактериальных пептидов, в частности, кателицидина LL-37, β-дефензинов и дермицидина, возникает выраженная склонность к инфицированию и длительной
персистенции в коже S. aureus [6, 8].
Золотистый стафилококк, инфицирующий кожу пациентов
с АтД в 80-100% случаев, способен к образованию таких факторов вирулентности как протеиназы, разрушающие эти антимикробные пептиды; токсины (TSST-1), суперантигены (SE A-D),
которые вызывают и поддерживают воспалительную реакцию
в дерме [9, 10]. В тоже время, у здоровых лиц кожа также колонизируется представителями кокковой микрофлоры, в частности
у 15-20% лиц золотистым стафилококком, при этом сам стафилококк у здоровых лиц не вызывает воспалительного поражения
дермы [11].
В связи с этим, комплексное изучение факторов патогенности
у представителей микрофлоры кожи в частности, золотистого
стафилококка, при АтД является актуальным.
Цель работы: изучение фенотипических и биохимических характеристик изолятов стафилококков, инфицирующих кожу пациентов с АтД и здоровых лиц.
Учитывая важную роль протеиназ стафилококков, обеспечивающих его распространение в тканях и вызывающих разрушение эндогенных пептидных защитных факторов в дерме, нами
было предпринято изучение активности этих ферментов у кокковой микрофлоры кожи, и в частности, у коагулазотрицательного
(КОС) и золотистого стафилококка.
Материалы и методы
Обследованно 48 пациентов с атопическим дерматитом (АтД)
в возрасте от 1 месяца до 16 лет; мальчиков — 24 и девочек — 24.
Степень тяжести АтД определяли с использованием международного стандарта — индекса SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis), который наиболее полно отражает комплекс объективных
и субъективных симптомов заболевания [12]. Контрольную группу составили практически здоровые дети (n=25) в возрасте от
1 года до 16 лет.
Культивирование микроорганизмов
Бактериологическое исследование микробиоценоза кожи
проводили методом мазков-отпечатков по Н. Н. Клемпарской
с дополнительным использованием среды Сабуро. Кожные изоляты пересевали на чашки Петри (90 мм) с кровянным агаром
и на плотную среду, содержащую пептон и сыворотку. Культивирование изолятов осуществляли в аэробных условиях на поверхности стерильной диализной мембраны (пропускная способность
не более 3,5 кДа, Spectra/Por-3) (одна чашка Петри со средой на
один клинический изолят).
Получение супернатанта, содержащего секретируемые факторы, имеющие отношения к вирулентному потенциалу. Выросшую
биомассу стафилококка на поверхности диализной мембраны на
плотной среде смывали стерильным 0,05 М трис-HCl буфером
pH 7,85, клетки отделяли центрифугированием при 4 °С в течение
15 минут при 10000g, а супернатант, содержащий секретируемые
бактериальной культурой факторы патогенности, использовали
для определения протеазной активности.
Таблица 1. Характеристика изолятов коагулазо-отрицательных
стафилококков (КОС) по уровню активности протеиназ
Активность
бактериальных
ферментов
Контрольная
группа
Пациенты с АтД
SCORAD (40,2±5,4)
P
1
2
1-2
Ig-протеиназная
0,26±0,07
1,1±0,05
<0,05
Колагеноллитическая
0,03±0,01
0,09±0,02
<0,05
Лизоцимолитическая
0,03±0,01
0,08±0,01
<0,05
Определение протеазной активности изолятов стафилококка
1. Определение иммуноглобулин-расщепляющей активности стафилококков проводили модифицированным нами количественным методом, в среде ПЭГ (полиэтиленгликоль), 0,05М
трис-HCl буфер, рН 7,8 [13]. В качестве субстрата использовали
фармакопейный препарат «Иммуноглобулин человека нормальный» («Микроген»). В среде ПЭГ иммуноглобулины спонтанно
образовывали агрегаты. При действии бактериальных Ig-протеаз
на образуемые агрергаты, иммуноглобулины расщеплялись на
фрагменты (Fab и Fc), активность протеаз регистрировали спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности реакционной смеси (при длине 330 нм, кювета 10 мм). Активность
выражали в количестве расщепленного белка (иммуноглобулина) в пересчете на 1 млрд. микробных клеток за 1 час при 37 °С
(мг/1 млрд. клеток за 1 час при 37 °С).
2. Коллагенолитическую и лизоцимолитическую активность
определяли полуколичественным методом [14]. В качестве субстратов использовали коммерческий препарат частично денатурированного коллагена (желатин), и лизоцим («РЕАХИМ»).
Агаровую основу разливали на чашки Петри (100 мм). В застывшем субстрат-агаровом слое продавливали лунки диаметром
5,2 мм. Исследуемые на коллагенолитическую и лизоцимолитическую активность пробы, содержащие взвесь бактерий в объеме
12 мкл, вносили в лунки, и инкубировали при 37 °С 12 часов. После инкубации зоны протеолиза проявляли 20% раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Удельную активность протеиназ,
42
Тема номера: ПУЛЬМОНОЛОГИЯ. АЛЛЕРГОЛОГИЯ
‘4 (23) октябрь 2007 г.
Таблица 2. Характеристика изолятов S. aureus по уровню активности протеиназ
Пациенты с АтД
Активность бактериальных
ферментов
Контрольная группа
SCORAD
(29,4±1,3)
SCORAD
(44,1±1,6)
P
SCORAD
(91,9±5,8)
1-2
1-3
1-4
1
2
3
4
Ig-протеиназная
0,36±0,08
1,1±0,06
1,08±0,09
2,06±0,07
<0,05
<0,05
<0,05
Колагеноллитическая
0,03±0,01
0,1±0,02
0,2±0,02
0,2±0,03
<0,05
<0,05
<0,05
Лизоцимолитическая
0,03±0,01
0,1±0,008
0,1±0,01
0,08±0,01
<0,05
<0,05
<0,05
выделенных в среду агара, оценивали по площади кольца протеолиза и выражали в см2 на 1 млрд клеток.
ДНКазную активность определяли на среде ДНК-агар («Hi
Media»). Подозрительную колонию инокулировали на поверхность среды и инкубировали при 37 °С 24 часа, затем орошали
поверхность среды раствором нормальной соляной кислоты.
Отбор штаммов для изучения распространенности резистентности к метициллину осуществляли по результатам тестирования
антибиотикочувствительности дискодиффузионным методом на
среде Мюллера-Хотингера, принадлежность к метицилленрезистентным штаммам подтверждалась на среде MRSA-селект («BIORAD»).
Статистическую обработку проводили с использованием пакета статистических программ Microsoft Excel 2000 и Statistica v.
5.5. Данные представлены в виде М±m, где М — среднеарифметическое, m — ошибка среднего. Для оценки различия средних
в выборках применяли t-тест (критерий Стьюдента). Уровень достоверности соответствовал 95%, при значении р<0,05 различия
между группами рассматривались как статистически значимые.
Результаты и обсуждение
У 23 (48%) из обследуемых пациентов выявлена наследственная предрасположенность к аллергическим заболеваниям (аллергический ринит, поллиноз, бронхиальная астма, атопический
дерматит у родственников первой степени родства). У 24 (50%)
пациентов отмечены сезонные колебания в течение АтД с обострениями холодное время года.
Клинической картина АтД у обследованных нами больных характеризовалась наличием сложного клинико-морфологического синдрома, включающего истинный полиморфизм элементов,
множество вторичных элементов, фоновые патологические изменения кожи, а также характерную локализацию кожных проявлений и зуд.
Рис. 1. ДНКазная активность
здоровых лиц и пациентов с АтД.
(%
изолятов)
стафилококковкожи
При анализе результатов исследования микробиоценоза кожи
с очагов поражения у 36 больных АтД (75%) был выделен золотистый стафилококк (S. aureus) в концентрации log10 5,2±1,2 КОЕ/
см2, у 12 больных АтД (25%) — коагулазоотрицательный стафилококк (КОС) в log10 3,7±1,7 КОЕ/см2. При этом у 7 детей с тяжелым
течением АтД (SCORAD — 91,9±5,8) выделялся только золотистый стафилококк в титрах log10 5,7±0,8 КОЕ/см2.
При изучении ДНК-азной активности, выделенных с кожи
больных АтД, были получены следующие данные (рис. 1).
ДНК-расщепляющая активность среди стафилококков, высеянных с кожи больных АтД, встречалась на 56,3% чаще, чем среди
стафилококков с кожи здоровых пациентов. Причем, при тяжелом течении АтД (SCORAD — 91,9±5,8) ДНК-расщепляющая
активность выявлена у 100% высеянного золотистого стафилококка, тогда как при легком течении (SCORAD — 27,6±1,3) —
в 75%. У КОС, колонизирующего кожу пациентов с АтД, ДНКазная активность выявлялась в 41,6%.
Аналогичная картина выявляется при изучении устойчивости
изолятов золотистого стафилококка к антибиотикам. Оказалось,
что резистентность к метициллину среди изолятов золотистого
стафилококка (MRSA) с кожи пациентов с АтД встречалась на
58,9% чаще, чем у стафилококков с кожи здоровых лиц.
Анализ протеолитической активности in vitro показал, что
данной активностью обладали 90% изолятов стафилококка у здоровых лиц и 95,8% у больных АтД.
Таким образом, большинство изолятов стафилококка, выделяемых с кожи как пациентов с АтД, так и здоровых лиц, были
способны в тестах in vitro расщеплять такие белки как иммуноглобулины, коллаген и лизоцим.
Результаты исследования активности отдельных протеиназ,
выделяемых изолятами стафилококка кожи пациентов с АтД
и здоровых лиц приведены в таблицах 1, 2. Полученные результаты продемонстрирвовали, что изоляты золотистого стафилококка
и КОС выделенные у пациентов с АтД, с различной степенью тяжести заболевания, оцениваемого по индексу SCORAD, проявляли в несколько раз более высокую активность по расщеплению
в тестах in vitro таких значимых защитных белков как иммуноглобулины, лизоцим, структурного белка соединительной ткани — коллагена.
Таким образом, фенотипические особенности стафилоккоков
выделенных у здоровых лиц и пациентов с АтД, характеризуются
способностью продуцировать протеиназы с широкой субстратной специфичностью, что подтверждая данные о том, что данная
группа бактериальных ферментов, участвуя в процессе модуляции
и модификации собственных белков, образуемых стафилококками (фибриноген-связывающий белок, поверхностный белок А,
поверхностный фактор адгезии — ClfB) [15, 16, 17] способствует выживанию этих микроорганизмов в определенных биотопах
организма человека. Кроме того, экзопротеиназы, расщепляя образуемые стафилококками токсины, снижают вирулентный потенциал этих бактерий, что приводит к длительной колонизации
этими бактериями таких эпитопов организма человека как кожа
[18].
Более высокая активность протеиназ стафилококка, выделенного от больных АтД (таблица 1 и 2) косвенно характеризует
вирулентный потенциал этих штаммов. Необходимо учесть, что,
обладая более высоким протеиназным потенциалом стафилококки, колонизирующие кожу пациентов с АтД, способны вызвать
развитие тяжелой патологической деградации соединительной
ткани кожи, в отличие от штаммов, колонизирующих кожу здоровых лиц. Кроме этого, протеиназы золотистого стафилококка
оказывают иммуномодулирующий эффект, активируя T- и Bлимфоциты, а также ингибируют продукцию иммуноглобулинов
и активно расщепляют тяжелые цепи этих молекул [19]. Недавние
работы по изучению протеиназ стафилококка показали, что эти
ферменты играют важную роль в переходе к инвазивным (более
агрессивным) фенотипическим вариантам у штаммов S. aureus,
которые способны к распространению в организме с развитием
системной инфекции [20].
‘4 (23) октябрь 2007 г.
Тема номера: ПУЛЬМОНОЛОГИЯ. АЛЛЕРГОЛОГИЯ
Вирулентность S. aureus является результатом скоординированной деятельности нескольких выделяемых им токсинов
и ферментов, а также большого количества белков на бактериальной поверхности, которые связывают внеклеточные матричные
и плазменные белки организма человека.
Таким образом, полученные нами результаты показали, что
кожа больных АтД чаще заселеляется фенотипически более агрессивными штаммами стафилококка, что необходимо учитывать
при выборе оптимальной тактики антибактериальной терапии.
Литература
1. Leung D. Y. M., Tharp M., Boguniewicz M. Atopic dermatitis (atopic eczema). In: Freedberg I. M., Eisen A. Z., Wolff K., et al., eds. Fitzpatrick’s dermatology in general medicine. 5th ed. New York: McGraw-Hill, 1998, v. 1, p.
1464-1480.
2. Гомберг М. А., Соловьев А. М., Аковбян М. А. Атопический дерматит.
Рус. Mед. Журн., 1998, т. 6, с. 1328-1335.
3. Торопова Н. П., Синявская О. А., Градинаров А. М. Тяжелые (инвалидизирующие) формы атопического дерматита у детей. Методы медико-социальной реабилитации. Рус. Мед. Журн., 1997, т. 5, с. 713-720.
4. Nizet V., Ohtake T., Lauth X., et al. Innate antimicrobial peptide protects
the skin from invasive bacterial infection. — Nature, 2001, v. 414, p. 454-457.
5. Panyutich A., Shi J., Boutz P. L. et al. Porcine polymorphonuclear leukocytes generate extracellular microbicidal activity by elastase-mediated activation
of secreted proprotegrins. Infect. Immunol., 1997, v. 65, p. 978-985.
6. Morishita Y., Tada J., Sato A. et al. Possible influences of Staphylococcus
aureus on atopic dermatitis — the colonizing features and the effects of staphylococcal enterotoxins. Clin. Exp. Allergy, 1999, v. 29, p. 1110-1117.
7. Ong P. Y., Ohtake T., Brandt C. et al. Endogenous antimicrobial peptides
and skin infections in atopic dermatitis. N. Engl. J. Med., 2002, v. 347, p. 11511160.
8. Sieprawska-Lupa M., Mydel P., Krawczyk K. et al. Degradation of human
antimicrobial peptide LL-37 by Staphylococcus aureus-derived proteinases. Antimicrob. Agents Chemother., 2004, v. 48, p. 4673-4679.
43
9. Hauser C., Wüthrich B., Matter L. et al. Staphylococcus aureus skin colonization in atopic dermatitis. Dermatologica, 1985, v. 170, p. 35-39.
10.Breuer K., Kapp A., Werfel T. Bacterial infections and atopic dermatitis.
Allergy, 2001, v. 56, p. 1034-1041.
11. Monti G., Tonetto P., Mostert M., Oggero R. Staphylococcus aureus
skin colonization in infants with atopic dermatitis. Dermatology, 1996, v. 93.
p. 83-87.
12. Severity scoring of atopic dermatitis: the SCORAD Index (Consensus
Report of the European Task Force on atopic dermatitis). Dermatology., 1993,
v. 186, p. 23-31.
13. Bleeg H. S., Reinholdt J., Kilian M. Bacterial immunoglobulin a proteases
monitored by continuous spectrophotometry. FEBS., 1985, v. 188., p. 357-362.
14. Astrup T., Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic
activity. Arch. Biochem. Biophysics., 1952, v. 40, p. 346-357.
15. Sun Q., Smith G. M., Zahradka C., McGavin M. J. Identification of D
motif epitopes in Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein for the production of antibody inhibitors of fibronectin binding. Infect. Immun., 1997, v. 65,
p. 537-543.
16. Karlsson A., Saravia-Otten P., Tegmark K. et al. Decreased amounts of
cell wall-associated protein A and fibronectin-binding proteins in Staphylococcus aureus sarA mutants due to up-regulation of extracellular proteases. Infect.
Immun., 2001, v. 69, p. 4742-4748.
17. McAleese F. M., Walsh E. J., Sieprawska.M. et al. Loss of clumping factor B fibrinogen binding activity by Staphylococcus aureus involves cessation of
transcription, shedding and cleavage by metalloprotease. J. Biol. Chem., 2001,
v. 276, p. 29969-29978.
18. Lindsay J. A., Foster S. J. Interactive regulatory pathways control virulence determinant production and stability in response to environmental conditions
in Staphylococcus aureus. Mol.Gen. Genet., 1999, v. 262, p. 323-331.
19. Prokesova L., Potuznikova B., Potempa J. et al. Cleavage of human
immunoglobulins by serine proteinase from Staphylococcus aureus. Immunol.
Lett., 1992, v. 31, p. 259-265.
20. Cheung, A. L., Eberhardt K., Heinrichs J. H. Regulation of protein A synthesis by the sar and agr loci of Staphylococcus aureus. Infect. Immun., 1997,
v. 65, p. 2243-2249.
Активированный цинк пиритион (Скин-Кап)
в лечении атопического дерматита у детей
(результаты Российского многоцентрового
исследования)
Р. С. ФАССАХОВ, Е. О. СУКМАНСКАЯ, И. Д. РЕШЕТНИКОВА, Д. И. ВЛАДИМИРОВА,
Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора.
А. Н. ПАМПУРА, М. О. СМИРНОВА, А. А. ЧУСЛЯЕВА,
МОСКОВСКИЙ НИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава.
Д. С. КОРОСТОВЦЕВ, С. Г. ЛАЗАРЕВА, Р. Н. АРАКЕЛЯН, Т. И. АНТОНОВА,
Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия
Введение
Атопический дерматит является одним из наиболее распространенных заболеваний детского возраста. Согласно Международным и Национальным согласительным документам, успех
лечения обеспечивается мероприятиями, направленными на
элиминацию причинно-значимых аллергенов, а также оптимальный подбор средств системной и местной терапии [1-3].
Арсенал средств местной терапии включает в себя наряду со
средствами ухода за кожей топические кортикостероиды, нестероидные ингибиторы воспалительных цитокинов и противомикробные препараты [1, 2, 4].
В последнее десятилетие появились сообщения об эффективном использовании в качестве средства местной терапии атопического дерматита активированного цинк-пиритона (Скин-Кап),
противовоспалительного препарата с противогрибковым и антибактериальным действием. Было показано, что применение
препарата Скин-Кап приводит к значительному снижению выраженности воспаления, уменьшению площади поражения кожи
и интенсивности симптомов заболевания, позволяет достигать
стойкой клинической ремиссии [5-7]. Однако эти исследования
выполнены на ограниченном контингенте больных, и в боль-