Грузинский государственный аграрный университет Грузинский

ANNALS OF AGRARIAN SCIENCE, vol. 8, no. 3, 2010
ИЗВЕСТИЯ АГРАРНОЙ НАУКИ, Том 8, Ном. 3, 2010
---------------------------------------------------------------------------------------------VETERINARY AND ANIMAL HUSBANDRY ВЕТЕРИНАРИЯ И ЗООТЕХНИЯ
АНТАГОНИЗМ МЕЖДУ ЭШЕРИХИАМИ И КЛОСТРИДИЯМИ
Д.В. Начкебия,
Начкебия, К.Д. Начкебия,
Начкебия, Е.Д. Начкебия,
Начкебия, М.Р. Ониани
Грузинский государственный аграрный университет
Аллея Давида Агvашенебели, 13 км, Тбилиси, 0131, Грузия;
magatooniani@yahoo.com
Поступила в редакцию: 12.01.10; одобрена к печати: 22.05.10
Установлено, что при ассоциированном культивировании штаммов
токсигенных клостридий и эшерихий, клостридий и стафилококков
происходила постепенная элиминация клеток анаэробов из жидкой
питательной среды, что вызвано антагонистическим действием эшерихий и
стафилококков на клетки анаэробных микроорганизмов. То же самое
происходит и в твердой питательной среде – рост анаэробов отстоял на
значительное расстояние от зоны роста эшерихий и стафилококков.
ВВЕДЕНИЕ
Антагонистическое действие микроорганизмов связано с выработкой ими антибиотикоподобных веществ – бактериоцинов. Известны бактериоцины, продуцируемые
кишечной палочкой – колицины, Cl. perfringens – велхицины, возбудители чумы –
пестицины и др.
Бактериоцины как в жидкой, так и в твердой питательной среде проявляют
антагонистическое действие [1]. Такое влияние in vivo, в частности, в желудочно-кишечном
тракте, подавляет рост и развитие возбудителя сибирской язвы, токсигенных анаэробов и
других энтеропатогенных микроорганизмов. Благодаря антагонистическому действию
некоторых кишечных бактерий – молочно-кислых, эшерихий, стафилококков и др.,
возбудитель сибирской язвы не способен размножаться и вызвать кишечную форму
сибирской язвы, и только при угнетении этих бактерий возможно проявление кишечной
формы сибирской язвы.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Использовали культуры эшерихий и клостридий. Антагонистом к клостридиям
являлись эшерихии. Были взяты следующие штаммы клостридий – Сl. perfringens A28, B216,
D213; Cl. septicum A2, A103, A59; Cl. chauvoеi B1 и B16; в качестве антагонистов
использованы штаммы E.coli, выделенные из фэцес [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1
Для изучения этого вопроса были использованы культуры E. coli и анаэробов,
выделенные из фэцес стельных и отеливающихся коров.
Материал весом 100 мг суспензировали в 10 мл стерильного МПБ, тщательно
эмульгировали и 0,1 мл переносили в свежий МПБ (10 мл). Суспензии готовили в парных
пробирках. Одну часть пробирок, с содержимым, прогревали в водяной бане при 80°С 20
мин, другую часть оставляли без термического воздействия. Затем пробы инкубировали при
37°С в течение 24 ч. По истечении указанного времени производили высевы с гретых и
негретых проб в чашки Петри с глюкозно-кровяным агаром по Цейслеру. Посевы
культивировали в аэробных и анаэробных условиях в течение 48 часов. Рост на
пластинчатых средах был отмечен в обеих сериях проб. На чашках, где высевалась гретая
суспензия, культивируемая в условиях анаэробиоза, выросли колонии неоднородной формы
с зоной гемолиза. При изучении основных биологических свойств они были отнесены к Cl.
perfringens, Cl. septicum, Cl. oеdematiens. Выделенные штаммы клостридий были патогенны
для белых мышей; при подкожном заражении в дозе 0,5 мл (2·109 м.т./мл) они убивали
подопытных животных в течение 16-36ч. Штаммы Cl. perfringens относились к типу А – по
результатам реакции нейтрализации [2].
В чашках с посевами негретой суспензии выросли колонии однородной формы;
некоторые из них имели зону гемолиза и были вирулентны для белых мышей. При
микроскопии мазков из колоний с гемолизом и без гемолиза обнаруживали граммотрицательные, короткие, довольно толстые палочки, расположенные одиночно и попарно.
На среде Эндо они образовывали колонии красного цвета с металлическим блеском. Эти и
другие свойства позволили отнести их к виду E. coli.
В гретой суспензии выжили спорогенные формы, а эшерихии и другая
неспорообразующая
микрофлора
погибли.
Поэтому
на
пластинчатой
среде
(глюкозокровяной агар) выросли колонии разных видов клостридий. Там, где суспензии не
подвергались термическому воздействию, E. coli подавили рост спорогенных анаэробов.
В чашки Петри с глюкозокровяным агаром по диаметру газона узкой полосой
(штрихом) сеяли по одному штамму E. coli, 18ч роста на МПБ (всего 10 штаммов),
инкубировали при температуре 37°С 24ч в аэробных условиях. По истечении указанного
времени по линии роста культуры, перпендикулярно к ней, с обеих сторон, на расстоянии 2
мм, штрихом наносили культуры указанных анаэробных микроорганизмов, чашки с
посевами помещали в анаэростат и инкубировали при температуре 37°С в течение 24-48ч. По
истечении указанного времени наблюдали следующее. Около линии роста E. coli
отсутствовал рост штаммов анаэробных микроорганизмов; так, например, у Сl. perfringens
типа А28 зона задержки роста составила 15 мм, В216 – 17мм, Д213 – 13мм; у Cl. chauvoеi B1 –
22мм; у Cl. septicum A103 – 16мм, А59 – на 18мм, А2 – на 11 мм.
Далее проверили наличие антагонизма при одновременном посеве анаэробов и
эшерихий на глюкозокровяной агар. Для этого по диаметру газона питательной среды
полосой наносили смыв с МПА клеток E. coli и перпендикулярно к нему, отходя на 2 мм,
штаммы указанных анаэробов; делали параллельные посевы; одни чашки инкубировали в
аэробных условиях, другие – в анаэробных, на протяжении 24-48ч. В аэробных условиях
росли только эшерихии; в анаэробных – наблюдали рост всех посеянных культур, причем
зону задержки роста штаммов клостридий не наблюдали.
Таким образом, при одновременном высеве клостридий и эшерихий на пластинчатой
среде подавления роста анаэробов со стороны E. coli не отмечено.
2
Проверили также влияние анаэробов на рост эшерихий. Для этого в чашки Петри с
глюкозокровяным агаром радиальными линиями сеяли штаммы вышеуказанных анаэробов.
В середине, по диаметру, оставляли свободное место шириной 6 мм. Посевы помещали в
анаэростат при температуре 37°С 36ч (это время достаточно для роста анаэробов на
пластинчатой среде). По истечении указанного времени штаммы анаэробов росли нормально
по радиальным линиям посева. Затем в оставленном по диаметру пространстве сеяли
штрихом (перпендикулярно к радиальным линиям анаэробов) штаммы E. coli.
Инкубировали посевы в аэробных и анаэробных условиях. По истечении 24ч, 48 и 72ч
подавления роста штаммов E. coli со стороны клостридий не наблюдали [1,2].
Таким образом, на пластинчатой среде E. coli подавляет рост анаэробов в том случае,
если они будут высеяны на определенное время раньше, достаточное для роста эшерихий и
выделения ими в среду антагонистического фактора (колицинов), который, диффундируя в
питательный агар, подавляет рост анаэробов. Подобное наблюдается и в жидкой
питательной среде. Если в свежий МППБ одновременно внести инокуляты суточных
культур анаэробов и эшерихий, в первые три часа оба представителя размножаются
(эшерихии интенсивнее) удовлетворительно, но по прошествии 6-12-18-24-36 ч рост
анаэробов полностью подавляется, и они постепенно элиминируются из смешанной
культуральной среды. Если к активно растущей на МППБ культуре E. coli добавить
инокулят анаэробов (также с МППБ) в логарифмической фазе роста, то размножение
клостридий полностью подавляется, а затем и постепенно элиминируются [1,3].
Антагонизм особенно ярко выражен у содержащихся в желудочно-кишечном тракте
человека и животных микроорганизмов, из которых одни принадлежат к нормальной
микрофлоре (бифидобактерии, лактобактерии), вторые – к условно- или облигатным
патогенам. К нормальной микрофлоре относятся также эшерихии, хотя среди них
обнаруживаются
энтеропатогенные
расы,
которые
интенсивно
продуцируют
термолабильные токсины, они синтезируются в бактериальной клетке плазмидной ДНК.
Плазмидная ДНК поступает в клетки эшерихий из клеток токсигенных анаэробов, при
непосредственном контакте с ними – конъюгацией [2]. В этом случае бактерии антагонисты
не только проявляют бактериальное действие, но также нейтрализуют активность
термолабильного токсина. Заслуживает внимания и то, что эшерихии проявляют антагонизм
не только против анаэробов, но и против сальмонелл, шигель, сибирской язвы,
стафилококков.
Исходя из сказанного, сочли интересным проверить эффективность колицины,
продуцируемой штаммом E. coli M17 на стафилококки; для этого использовали штамм St.
aureus N209 и изоляты белых стафилококков (St. epidirmidis), выделенные из воздуха
методом седиментации – 13 культур. Изучили их основные биологические свойства –
культуральные, биохимические, гемолитические, вирулентность, резистентность к
антибиотикам. Выраженными патогенными свойствами и гемолитической активностью
характеризовался штамм St. aureus N209; стафилококки, выделенные из воздуха (четыре
культуры) вызывали гемолиз эритроцитов, две из них при заражении большими дозами
(2·109мт/мл) белых мышей, подкожно в области спины, на 5-7 день вызывали некроз кожи,
затем наступала гибель белых мышей [4].
Для культивирования эшерихий и стафилококков использовали изготовленную на
растительном субстрате питательную среду – жидкую и твердую [4]. Для изготовления
твердой питательной среды из растительного субстрата в экстракт добавляли агар – 2% и
хлорид натрия – 0,5%.
3
Для опыта инокулят E. coli М-17 24-часового роста в бульоне переносили в чашки
Петри с МПА, cеяли штрихом, диаметральной полосой, с последующим инкубированием
при 37°С на протяжении 24-х часов. Обильный рост прямой полосой выделялся на газон
агара; перпендикулярно этой полосе, отходя на 2мм, сеяли стафилококки с обеих сторон по
7 культур. Культивирование посевов проводили при 37°С в течение 24 часов. В результате с
зоны роста E. coli М-17 на расстоянии 20-30 мм отмечалась стерильная зона – каждая
культура стафилококков на разном расстоянии росла от центральной полосы роста E. coli M17 [5].
При одновременном высеве штамма E. coli М-17 и стафилококков, угнетение роста
стафилококков не наблюдали, т.к. до начала диффундирования колицина в среду,
стафилококки успели сформировать колонии. И в жидкой среде при одновременном
внесении E. coli M-17 и стафилококков, рост последних не угнетался, только с тем условием,
что оба вида бактерий внесены были в бульон со скошенного агара, смывом
физиологическим раствором NaCl. Это и понятно, поскольку смыв E. coli M-17 не содержал
колицинов. Они содержатся только в жидкой среде, или же, после определенного времени
инкубирования, диффундируют в агар, но при смыве экстрагирование не происходит.
В отличие от действия эшерихий на культуры клостридий, если в логарифмической
фазе роста внести 24-ч часовую культуру стафилококков, то рост и размножение клостридий
подавляется, но полной элиминации не происходит [5].
Было замечено, что стафилококки, как и эшерихии, затрудняют выделение клостридий
из любого субстрата, особенно из внутреннего органа животных [3,6], угнетая их рост,
постепенно элиминируют из питательной среды – жидкой и твердой. Стафилококки,
повторяя те же опыты эшерихий с клостридиями, проявляли антагонизм против
токсигенных анаэробов, полностью элиминируя их из жидкой питательной среды (МППБ с
высоким столбиком) [5].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Если обобщить результаты опытов, можно прийти к выводу, что в желудочнокишечном тракте человека и животных постоянно присутствуют токсигенные анаэробы,
однако их рост и размножение угнетается антагонистами – бифидобактериями,
лактобактериями, эшерихиями, стафилококками. Благодаря антагонизму развитие анаэробов
угнетается, и выделяемый ими токсин не накапливается в таком количестве, чтобы нанести
организму заметный вред за короткое время, хотя с годами он ускоряет старение и поскольку
это так, то следует довести до минимума их количество путем дачи проверенных штаммов,
эшерихий и других антагонистов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Начкебия Д.В. Антагонистическое действие E. coli на культуры клостридий // Респ.
конфер. “Современные проблемы микробиологии”, тезисы докладов, Тбилиси, 1990, c. 6667.1 . Nachkebia J. V. Antagonistic Effect of E. coli on Clostridia // Rep. Conf. “ Current Problems
of Microbiology”,Ttheses of Reports, Tbilisi,, 1990, pp. 66-67..
2. Начкебия Д.В. Влияние токсигенных анаэробов на биологические свойства эшерихий и
стафилококков // Автореферат .. . . дисс. степени доктора ветерин. наук, Тбилиси, 1992. 53 c.
.Nachkebia J. V. The Influence of Toxigenic Anaerobia on Biological Properties of Escherichia
and Staphylococci // Autorefer. . . . .doct. vet. dissert., Tbilisi, 1992. 53 pp.
4
3. Начкебия Д.В., Парцвания Б.В. Паготенные клостридии в паренхиматозных органах
клинически здоровых убойных животных // Тр. Груз. СХИ, т. 103, в. 41, 1978. c. 23-30.
Nachkebia J. V. , Partsvania B. V. Pathogenic Clostridia in Parenchymatous Organs of Clinically
Healthy Animals for Slaughter // Proc. of GAU, vol. 103, i. 41, 1978. pp. 23-30.
4. Начкебия Д.В., Капанадзе М.Г. Антагонистическое действие на клостридии штамма E.
coli M-17 // Сб. тр. Груз. зовет. ин-та, т. LXI, Тбилиси, 2003. c. 225-227..Nachkebia J. V. ,
Kapanadze M. G. Antagonistic Activity on the Clostridia Strains of E. coli M-17 // Procc. of
Georgian Institute of Veterinary, vol. LXI, Tbilisi, 2003, pp. 225-227.
5. Начкебия Д.В., Капанадзе М.Г. Антагонистическое действие на стафилококки штамма E.
coli M-17 // Сб. тр. Груз. зоовет. ин-та, т. LXI, Тбилиси, 2003, c.228-229. Nachkebia J. V.
,Kapanadze M. G. Antagonistic Activity on Staphylococci of Strains of E. coli M-17 // Procc. of
Georgian Institute of Veterinary, vol. LXI, Tbilisi, 2003, pp. 228-229.
6. Начкебия Д.В. Обсемененность внутренних органов с-х животных штаммами E. coli и
Cl. perfringens // Мат. I Респ. конф. молодых ученых и специал., ГЗВУИИ, Тбилиси, 1979, c.
104-106. Nachkebia J. V. Mincening of Inner Organs of Farm Animals by Strains of E. Coli and Cl.
Perfringens // Mat. of I Rep. Conf. of Young Scien. and Spec., GZVSIs, Tbilisi,1979, pp. 104-106.
ANTAGONISM BETWEEN ESCHERICHIA AND CLOSTRIDIA
J. V.Nachkebia, K. J.Nachkebia, E.J. Nachkebia, M. R. Oniani
During associated cultivation of strains of toxic Clostridia and Escherichia, Clostridia and
Staphylococci gradual elimination of Clostridia cells from liquid nutrient medium takes place,
which is caused by antagonistic action of Escherichia and Staphylococci on the cells of anaerobic
microorganisms. The same process occurs in solid nutrient medium – growth of toxigenic
anaerobia was at a significant distance from the zone of growth of Escherichia and Staphylococci.
By generalizing the results of the experiment, it is possible to come to the conclusion that
toxigenic anaerobia are permanently presented in human and animal gastrointestinal tract, but
their growth and generation are oppressed by antagonists, Escherichia and Staphylococci. Thanks
to antagonism, Clostridia’s development is oppressed and toxin secreted by them does not
accumulate in the amount that will cause remarkable harm in a short time, while it accelerates
ageing in the course of time, and because of this fact it is necessary to reduce their amount to a
minimum by means of giving checked strains of Escherichia (E. coli M-17) and other antagonists.
5