ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФОСФАТОВ

Вестник БГУ. Сер. 1. 2012. № 3
УДК 533.9.082.5; 621.373.826; 621.793.79
ЧИНЬ НГОК ХОАНГ (ВЬЕТНАМ), М. П. ПАТАПОВИЧ, ФАМ УИЕН ТХИ (ВЬЕТНАМ),
И. Д. ПАШКОВСКАЯ, Ж. И. БУЛОЙЧИК, А. П. ЗАЖОГИН
ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ФОСФАТОВ KАЛИЯ НА РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КАТИОНОВ Ca, Mg и Al
В ВЫСОХШИХ КАПЛЯХ АЛЬБУМИНА МЕТОДОМ ЛОКАЛЬНОЙ
ЛАЗЕРНОЙ АТОМНО-ЭМИССИОННОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Using multichannel laser atomic-emission spectrometry, the authors have studied the effect of potassium phosphates on the spatial distribution of calcium, magnesium, and aluminum on drying of drops of the egg-albumin aqueous solution on the surface of
a porous body (paper filter). It has been shown that preliminary application of albumin and potassium phosphate results in a considerable decrease of the drop size and in lowering of the rate of cationic motion to the periphery. It has been established that the correlation dependence between the drop diameter, type of potassium phosphate, solution application procedure and solubility of the
calcium phosphates formed is linear.
Поиск новых, более информативных показателей для оценки состояния организма в норме и при
заболеваниях – актуальная задача медико-биологической науки. Такой поиск ведется различными
методами, включая и биофизические. В частности, в последние годы внимание исследователей привлекают изменения конформации и других физико-химических свойств белков, связанные с развитием
патологических процессов в организме [1, 2].
Одним из белков, легко подвергающихся модификациям, является альбумин – белок, составляющий около половины массы белков плазмы крови и присутствующий во всех жидкостях организма.
В составе межклеточной жидкости альбумин взаимодействует почти со всеми клетками и в процессе
циркуляции изменяется в зависимости от состояния органов и тканей.
Изменения альбуминовых центров были обнаружены при самых разных заболеваниях [1]. При
этом степень такого изменения отражает состояние больных, а молекула альбумина выступает участником и/или индикатором этого процесса [2]. Усовершенствование методов контроля изменения
структуры и свойств молекулы альбумина при патологических процессах в организме могло бы быть
полезным при лечении больных.
Нами были исследованы процессы, протекающие при высыхании капли биологической жидкости
на твердой смачиваемой подложке при комнатных условиях. Такие процессы привлекают пристальное внимание уже несколько десятков лет. Интерес к этим объектам обусловлен прежде всего тем,
что в последние годы в медицинской диагностике применяется метод клиновидной дегидратации [3, 4].
Данный метод позволяет на основании анализа структур, образовавшихся при высыхании капли
биологической жидкости (плазма крови, спинномозговая жидкость, слюна и т. д.), выявлять широкий
набор различных заболеваний человека на доклинической стадии. Правда, физико-химические причины возникновения этих структур на сегодняшний день еще не выяснены, проблема требует изучения, хотя выявленные эмпирические закономерности уже позволяют дать оценку состояния организма
и активно используются в медицинской практике.
При высыхании капли биологической жидкости протекает множество разнообразных процессов
различной природы от нано- до макроуровня. Однако до сих пор нет полной ясности относительно
химического состава периферической и центральной части высушенных капель. Так, согласно [4–9]
считается, что при высыхании происходит перераспределение компонентов: белок накапливается
преимущественно по краям капли, в то время как соль распределяется по диаметру капли более или
менее равномерно.
Нами предприняты попытки исследовать изменения альбуминовых центров при изучении распределения макроэлементов в среде альбумина. Возможно, в дальнейшем это поможет проводить диагностику, особенно на начальных стадиях развития болезни, когда обычные лабораторные показатели
чаще всего остаются в пределах нормы.
В настоящей работе методом локальной лазерной атомно-эмиссионной спектрометрии изучено
радиальное распределение кальция, магния и алюминия при высыхании капли водного раствора
яичного альбумина на поверхности пористого тела (бумажный фильтр). Названные макроэлементы
выбраны как основные, входящие в состав белков. Катионы вводили в виде хлоридов соответствующих металлов, поскольку они хорошо растворимы в воде.
12
Физика
Методика исследований и пробоподготовки
Для проведения исследований использовался лазерный многоканальный атомно-эмиссионный
спектрометр LSS-1. Динамику развития процессов абляции и приповерхностного образования плазмы исследовали при воздействии сдвоенных лазерных импульсов на анализируемую поверхность
образцов высушенных капель водного раствора альбумина с катионами кальция, магния и алюминия.
Энергия первого и второго импульсов излучения составляла 58 и 42 мДж соответственно, временной
интервал между сдвоенными импульсами – 8 мкс.
Для изучения влияния диаметра образцов на интенсивность линий катионов были использованы
образцы диаметром 6 мм по диаметру высохшей капли белка на плоской поверхности подложки
и 20 мм согласно размеру растекания водного раствора белка на поверхности фильтра [10].
Образцы готовили по следующей методике. Каплю раствора хлорида металла определенной
концентрации (0,01; 0,05; 0,1; 0,2 и 0,5 % по металлу) наносили на поверхность бумажного фильтра (черная лента) диаметром 6 мм с помощью микропипетки. Объем капли составлял 10 мкл.
Время сушки при температуре 50 °С и относительной влажности воздуха 30÷35 % примерно
5 мин. Затем на высушенную поверхность соли наносили водные растворы 0,5 % альбумина.
Образцы высушивали при тех же условиях.
На рис. 1 представлена зависимость интенсивности I линий кальция и алюминия от их концентрации в спектрах высушенных капель альбумина при добавке соответствующих хлоридов. Анализ по
диаметру капли 6 мм в анализируемых образцах проводили в 8 точках. Аналогичные зависимости
получены для хлорида магния.
а
б
Рис. 1. Зависимость интенсивности линий кальция Ca II (393,239 нм) (а) и алюминия Al I (396,153 нм) (б) от концентрации катиона
Из приведенных графиков видно явное увеличение концентрации по краям капли. Вероятно, это
обусловлено миграцией солей по капиллярам фильтра при высыхании водного раствора. По краям
интенсивность высыхания больше, и, следовательно, раствор постепенно, по мере высыхания, передвигается на край капли, увеличивая здесь концентрацию катионов.
Для более детального исследования миграции макроэлементов в высохших каплях растворов
белка изучено влияние размера фильтра на распределение макроэлементов. Использовали фильтр
диаметром 20 мм. Анализ по диаметру пробы проводили в 30 точках (рис. 2).
Рис. 2. Интенсивности ионной линии Ca II (393,239 нм) в спектрах образцов на фильтре диаметром 20 мм (Ca 0,1 %)
В этом случае явного накопления катионов по краям не наблюдается, раствор высыхает практически
равномерно по всей поверхности образца.
13
Вестник БГУ. Сер. 1. 2012. № 3
Для дальнейшей разработки методики полуколичественного и количественного определения элементов нами использован метод осадочной бумажной хроматографии, позволяющий оценить особенности поверхностного распределения макроэлементов, в том числе размер зоны их осаждения.
В качестве осадителей для хлоридов кальция, магния и алюминия использовали дигидро-, гидрои фосфат калия, поскольку фосфаты калия обладают ограниченной растворимостью и вполне удовлетворяют требованиям осадочной хроматографии [11]. Растворимость S фосфатов в воде резко
падает с увеличением числа замещенных металлом атомов водорода, например, для солей кальция:
Ca(H2PO4)2 – 1,5 г/100 г Н2О; CaHPO4 – 0,02 г/100 г Н2О и Ca3(PO4)2 – 8·10–4 г/100 г Н2О. Трехзамещенные фосфаты практически не растворяются [11, 12].
Для изучения особенностей влияния фосфатов в процессе осаждения солей на размер капли
образцы готовили по трем вариантам. Первый вариант: каплю водного раствора того или иного фосфата калия объемом 10 мкл наносили микропипеткой на поверхность беззольного бумажного фильтра
(черная лента) диаметром 20 мм. Сушили при температуре 40 °С и относительной влажности воздуха
30÷35 % в течение примерно 5 мин. Затем поверх высушенной соли последовательно наносили смесь
водных растворов хлоридов алюминия, кальция и магния и затем 0,5 % альбумина. После каждого
нанесения очередного раствора образцы высушивали при указанных ранее условиях (рис. 3 а, 4 а).
Во втором варианте последовательность нанесения: фосфат калия, смесь солей, альбумин (рис. 3 б и 4 б).
В третьем варианте: альбумин, фосфат калия, смесь хлоридов (рис. 3 в и 4 в).
а
б
в
Рис. 3. Зависимость интенсивности линий кальция Ca II (393,239 нм) от варианта нанесения слоев:
а – первый, б – второй, в – третий (Ca 0,1 %)
Согласно приведенным графикам наблюдается определенная закономерность пространственного
распределения макроэлементов в зависимости от порядка нанесения растворов. Без использования
осадителей соли распределяются практически по всей площади образца (см. рис. 2). При введении
фосфатов концентрация макроэлементов в центральной части начинает заметно увеличиваться, особенно это характерно для образца, где в первую очередь наносили раствор альбумина (см. рис. 3 в и 4 в).
Анализ позволяет сделать предположение, что именно белок несет ответственность и имеет принципиальное значение для формирования альбуминового центра, и, таким образом, распределение макроэлементов может служить индикатором отклонений от их стандартного распределения при наличии патологии.
а
б
в
Рис. 4. Зависимость интенсивности линий алюминия Al I (396,153 нм) от варианта нанесения слоев:
а – первый, б – второй, в – третий (Al 0,1 %)
14
Физика
На рис. 5 приведены графики зависимости диаметра капли от растворимости образующихся фосфатов кальция для различных вариантов нанесения растворов (соответственно рис. 3).
Рис. 5. Зависимости диаметра капли D от растворимости S фосфатов кальция для различных порядков нанесения растворов
Как видно из приведенных графиков, наблюдается очень хорошая корреляционная зависимость
между диаметром капли, типом фосфата калия, порядком нанесения растворов на фильтр и растворимостью образующихся фосфатов кальция. Диаметр пятна тем больше, чем больше растворимость
соответствующего фосфата. Пятно имеет наименьший диаметр в третьем варианте последовательности нанесения слоев.
Аналогичные зависимости можно ожидать для алюминия и магния, основываясь на данных по
растворимости ортофосфатов алюминия (8,06·10–9 г/100 г Н2О) и магния (6,4·10–4 г/100 г Н2О). Их
растворимость близка и даже меньше, чем для соответствующего фосфата кальция.
***
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Разработана
методика изучения пространственного распределения элементов в высушенных на смачиваемых
поверхностях каплях альбумина. Варьируя состав фосфатов и порядок нанесения растворов, можно
получать необходимый диаметр капли. Поскольку большая часть биологических жидкостей (плазма
крови, спинномозговая жидкость, слюна и т. д.) также представляет собой растворы различных белков,
указанный метод анализа биологических объектов в сухом виде может дать дополнительные возможности прикладного использования лазерной спектрометрии. Обнаружение нарушений в пространственном распределении макро- и микроэлементов в сравнении со стандартом свидетельствует о перспективности данных исследований для разработки методики полуколичественного и затем количественного анализа содержания элементов в высохших каплях биологических жидкостей, что может
способствовать диагностике различных заболеваний.
1. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине: в 2 кн. / Под ред. Ю. А. Грызунова, Г. Е. Добрецова. М., 1998. Кн. 2.
2. Л о п у х и н Ю . М . , Д о б р е ц о в Г . Е . , Г р ы з у н о в Ю . А . // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2000. № 7. С. 4.
3. Ш а б а л и н В . Н . , Ш а т о х и н а С . Н . Морфология биологических жидкостей человека. М., 2001.
4. Т а р а с е в и ч Ю . Ю . , А ю п о в а А . К . // ЖТФ. 2003. Т. 73. Вып. 5. С. 13.
5. Т а р а с е в и ч Ю . Ю . , И с а к о в а О . Л . , К о н д у х о в В . В . , С а в и ц к а я А . В . // Там же. 2010. Т. 89. Вып. 5. С. 45.
6. М а к с и м о в С . А . // Бюл. сиб. медицины. 2007. № 4. C. 80.
7. Я х н о Т . А . , Я х н о В . Г . // ЖТФ. 2009. Т. 79. Вып. 8. С. 133.
8. Т а р а с е в и ч Ю . Ю . // УФН. 2004. Т. 174. № 7. С. 779.
9. Т а р а с е в и ч Ю . Ю . , П р а в о с л а в н о в а Д . М . // ЖТФ. 2007. Т. 77. Вып. 2. С. 17.
10. Ч и н ь Н г о к Х о а н г ( В ь е т н а м ) , П а т а п о в и ч М . П . , П а ш к о в с к а я И . Д . и др. // Вестн. БГУ. Сер. 1.
2012. № 1. С. 31.
11. А л е к с е е в В . Н . Количественный анализ. М., 1972. С. 65.
12. Г о р о н о в с к и й И . Т . , Н а з а р е н к о Ю . П . , Н е к р я ч Е . Ф . Краткий справочник по химии. Киев, 1987. С. 649.
Поступила в редакцию 25.06.12.
Чинь Нгок Хоанг − аспирант кафедры лазерной физики и спектроскопии. Научный руководитель – А. П. Зажогин.
Мария Петровна Патапович – аспирант кафедры лазерной физики и спектроскопии. Научный руководитель – А. П. Зажогин.
Фам Уиен Тхи – студентка 3-го курса кафедры лазерной физики и спектроскопии.
Ирина Дмитриевна Пашковская – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник РНПЦ неврологии
и нейрохирургии.
Жанна Игнатьевна Булойчик – кандидат химических наук, старший научный сотрудник кафедры физической оптики.
Анатолий Павлович Зажогин – доктор физико-математических наук, профессор кафедры лазерной физики и спектроскопии.
15