ПОЛИФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ПОЛИСАХАРИДОВ

УДК 577.151.45
З.Ю. Алексеева1, А.Х. Еникеев2, В.А. Галынкин3,
А.В. Гарабаджиу4, Г.В. Козлов5
ПОЛИФЕРМЕНТАТИВНЫЙ
ГИДРОЛИЗ ПОЛИСАХАРИДОВ
ВОДОРОСЛЕЙ LAMINARIA
SACCHARINA
Санкт-Петербургский государственный
технологический институт (технический университет),
190013, Санкт-Петербург, Московский пр., д. 26
Биомасса водорослей – гидролизуется комплексом ферментов, содержащим
целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы. При этом клеточная структура биомассы начинает разрушаться с освобождением полисахаридов. Такое разрушение может происходить и при предварительном механическом разрушении. Так как ферменты имеют различные оптимумы рH и температуры то оптимизацию процесса можно проводить, изменяя эти физико-химические параметры. Разрушение биомассы проводили в термостойком сосуде с перемешиванием и термостатированием. Нами опробованы некоторые предварительные методы разрушения клеток, что ускоряет процесс ферментативного
гидролиза, а затем использованы различные гидролитические ферментные
препараты для гидролиза полисахаридов и декстринов. Моноуглеводы водорослей могут быть использованы для культивирования микроорганизмов.
Ключевые
слова:
биоэтанол,
полиферментативный гидролиз.
Биоконверсия растительного сырья в топливо рассматривается, в настоящее время, как одна из ключевых отраслей
биотехнологии, что связано с необходимостью строить свою
энергетику в значительной степени на основе собственного
возобновляемого сырья. Наземные и водные растения в результате процессов фотосинтеза образуют до 400 млрд. тонн
в год сухой биомассы (эффективно используется не более
5%), что позволяет говорить о растительной биомассе как о
важнейшем возобновляемом сырьевом ресурсе биосферы.
Производство топливного этанола из продуктов растениеводства требует выделения под энергетические культуры
сельскохозяйственных земель и затраты энергоносителей на
обработку пашни. Использование для производства этанола
биомассы наземных растений (отходы сельского хозяйства и
переработки древесины) даже при самом высоком развитии
технологий будет сопряжено с образованием большого количества отходов лигнина, поскольку последний входит в состав
почти всех наземных растений и по распространенности среди природных полимеров уступает только полисахаридам.
Содержание лигнина в древесине хвойных и лиственных пород составляет соответственно 23-38 и 14-25% по массе [1].
Использование для энергетических целей генетически модифицированной древесины не решает проблемы отходов, поскольку минимальное содержание лигнина ограничено требованиям к механической устойчивости растений.
Альтернативным сырьем в прибрежных регионах России
(Арктика и Дальний Восток) может быть биомасса водорослей, которые обладают большей продуктивностью, чем наземные растения, поскольку у наземных растений фотосинтез
происходит только в листве (хвое), а у водорослей в фотосинтезе принимает участие вся поверхность. Содержание углеводородов у ламинариевых и фукусовых достигает 73-74%
[2], в т.ч. целлюлозы до 20% [3]. Продуктивность ламинарии
по сухой массе составляет 24,1 кг/м2 в год, таким образом,
плантации этих водорослей в Баренцевом море ориентировочно могут давать 18 млн. литров биотоплива [4].
В настоящее время широко используют химический и
ферментативный способ гидролиза полисахаридов расти1
2
3
полисахариды
водорослей,
тельного сырья. Кислотный гидролиз имеет ряд недостатков,
связанных с большими энергетическим затратами, расходом
кислоты, потребностью в кислотоупорной аппаратуре, образованием токсичных и канцерогенных продуктов гидролиза, что значительно загрязняет окружающую среду, отрицательно отражается на здоровье обслуживающего персонала и
населения. Все это приводит к загрязнению окружающей среды, попаданию формальдегида, метанола, фурфурола и меланинов в продукты микробного синтеза и значительному
снижению их качества. Поэтому перспективным представляется замена кислотного гидролиза ферментативным. В
основе биологической утилизации целлюлозосодержащих
материалов лежит ее ферментативное расщепление до глюкозы.
В состав клеточной стенки водорослей входят: целлюлоза, гемицеллюлоза, пектины, протеины (рисунок 1) [5], поэтому наиболее глубокая деструкция целлюлозы и других полисахаридов растительной биомассы может происходить под
действием комплексных полиферментных систем.
Рис. 1. Строение клеточной стенки бурых водорослей
В этой связи целью исследования была отработка полиферментативного гидролиза штормовых выбросов водо-
Алексеева Зинаида Юрьевна, соискатель, каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: adydyka@rambler.ru
Еникеев Айрат Хасанович, канд. хим. наук, ген. дир. ООО «НИИ РОСБИО», Санкт-Петербург, ул.Мельничная, 12А, e-mail: rosbio@inbox.ru
Галынкин Валерий Абрамович, д-р техн. наук, зав. лабораторией микробиологии, ОАО «Гипрорыбфлот», СПб, ул. Малая Морская, д. 18-20, email: 7731254@mail.ru
4
Гарабаджиу Александр Васильевич, д-р хим. наук, проф. зав. каф. технологии микробиологического синтеза декан фак. тонкого органического и
микробиологического синтеза, e-mail: gar-54@mail.ru
5
Козлов Григорий Владимирович, канд.биол. наук. ст. преподаватель, каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: kozlov_gv@mail.ru
Дата поступления – 30 октября 2009 года
рослей Баренцева моря. Данная работа посвящена исследованию закономерностей ферментативного гидролиза полисахаридов ламинариевых водорослей в присутствии одного, двух и трех ферментных препаратов.
Материалы и методы
В работе использовалась сухая биомасса водорослей
ламинарии сахаристой, полученная из штормовых выбросов на побережье Баренцева моря. Влажность субстрата 10%, зольность - 28%. Содержание липидов - 0,9% от сухой массы [6]. Углеводный состав (см. раздел «Результаты
и обсуждение»).
Для ферментативного гидролиза водорослевого сырья
необходимо было использовать комплексные ферментные
препараты, содержащие целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы, протеиназы и т.д. Поиск ферментов, гидролизующих полисахариды морских организмов, начался еще в
первой половине ХХ века. Такие ферменты были изолированы преимущественно из морских организмов, моллюсков
и бактерий, использующих водоросли в качестве питательных веществ [5]. Однако, поскольку ферментов, предназначенных конкретно для гидролиза водорослевого сырья,
не выпускается, работы велись с препаратами, используемыми в других отраслях промышленности (таблица 1).
Таблица 1.
Использованные в работе ферментные препараты
Название пре- Активности
парата
Оптимальные
условия
Фирма/
страна
Область
применения
Эрбслё/
Германия
Пивоварение
Дистицим БА
а-амилаза
Оптимальная температура 50°С
Рабочая температура 30-70°С
Оптимальный рH
4,7.
Рабочий рH 3,0-7,0
Церемикс
6ХМГ
α-амилаза,
β-глюканаза, протеаза
Оптимальная температура 50°С
Рабочая температура 45-60°С
Оптимальный рH
5,7. Рабочий рH
5,7-6,0
Новозайм/
Дания
Спиртовая
промышленность
Ультрафло Л
Оптимальная температура 50°С
β-глюкана- Рабочая температура 55-75°С
за
Оптимальный рH
5,7. Рабочий рH
5,0-7,0
Новозайм/
Дания
Пивоварение
Вискофло MG
(Viscoflow
MG)
β-глюканаза - ксиланаза, арабино-ксиланаза,
пентозаназа, целлюлаза, арабиназа,
пектиназы,
гемицеллюлаза, αамилаза
Рабочая температура 55-70°С
Оптимальный рH
5,7. Рабочий рH
5,0-7,0
Целлюлаза, β-глюканаза,
ксиланаза,
глюкоамилаза
Оптимальная температура 60°С
Рабочая температура 50-70°С
Оптимальный рH
4,7
Рабочий рH 4,5-7,0
СибБиоФарм/ Россия
эндо-1,3(4)
-b-глюканаза,
целлюлаОллзайм за, амилаБГ
за, протеаза, пентозаназа
целлобиаза
Оптимальная температура 40°С
Рабочая температура 37-60°С
Оптимальный рH
4,7.
Рабочий рH 4,5-7,0
Оллтек/
Россия
Целлолюкс-А
Состав углеводов субстрата определяли последовательной экстракцией. Свободные углеводы экстрагировались следующим образом - 2,5 г измельченного образца кипятят с 10 мл 75% этанола с
обратным холодильником на водяной бане. Извлечение легко- и трудногидролизуемых углеводов
проводят, соответственно, после 3 часов кипячения
с обратным холодильником с 2% соляной кислотой
и после 3 часов выдерживания при комнатной температуре с 80%-ной серной кислотой с последующим кипячением в течение 5 часов под обратным
холодильником с 5% серной кислотой.
Определение моносахаров проводилось методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Все полученные экстракты и гидролизаты отделяют
фильтрацией и разбавляют в 10 раз подвижной фазой, подаваемой на колонку. Полученные пробы
анализируют на стеклянной колонке 0,6×55 см с
ионообменной смолой Hitachi 2614 в H + -форме при
55°С. Подвижная фаза: 90 мМ хлорная кислота; 1,4
мл/мин. Детектор: спектрофотометр, 214 нм. Объем
вводимой пробы: 10 мкл. Для оценки содержания
углеводов в образцах на хроматограммах выбраны
характерные пики со временем выхода: 15 мин –
глюкоза; 16 мин – сорбит; 17мин – фукоза.
Ферментативный гидролиз проводили в аппарате «Биостат» (США).
Степень гидролиза оценивали по выходу сухих
(СВ) и редуцирующих (РВ) веществ.
Определение редуцирующих сахаров проводили
колориметрически. Метод основан на способности
глюкозы и других редуцирующих сахаров восстанавливать бесцветный 2,3,5-трифенилтетразолий
хлористый до окрашенного трифенилформазана. К
0,4 мл пробы добавляют 0,2 мл водного раствора
1Н NaOH и 0,2 мл 0,3% водного раствора 2,3,5трифенилтетразолия хлористого. Смесь выдерживают 3 мин на кипящей водяной бане, охлаждают под
струей воды. Затем добавляют 0,2 мл. 2H уксусной
кислоты и 5 мл 95% раствора этанола. Измеряют
оптическую плотность на КФК при 490 нм (кювета
5мм) против контроля. Контроль готовят аналогично, только вместо пробы используют дистиллированную воду. Содержание редуцирующих сахаров
определяют по калибровочному графику.
Результаты и обсуждение
При изучении содержания редуцирующих веществ
в субстрате были получены следующие данные (таблица 2), которые служат ориентиром по выходу продукта
для процесса ферментативного гидролиза.
Таблица 2. Содержание и состав углеводов ламинарии
сахаристой из штормовых выбросов Баренцева моря
Новозайм/
Дания
Пивоварение
Кормовые
препараты
Кормовые
препараты
Фракция
Состав
мг/г ±15%
Глюкоза
Сорбит
Фукоза
Всего
Свободные углеводы
4,14
1,61
3,91
9,66
Легко гидролизуемые
110,17
50,6
27,37
188,14
Трудно
гидролизуемые
254,15
0,46
26,22
280,83
Всего
368,46
52,67
57,5
478,63
Нами был испытан ряд моно- и полиферментных
препаратов (см. таблицу 1). Гидролиз проводили
при +50°С (это наиболее оптимальная для действия большинства ферментов температура).
Гидролиз проходил в течение четырех часов,
при паспортных оптимальных условиях действия
ферментных препаратов. Каждый час отбирались
пробы и проводился их анализ на сухие и редуцирующие вещества. На рисунках 2 и 3 представлены
результаты анализов.
Рис. 2. Сравнение гидролитической активности
различных ферментных препаратов при использовании
в качестве субстрата ламинарии сахаристой
(по выходу редуцирующих веществ)
Рис. 4. Действие фермента (Церемикс) на исходное
и измельченное сырье. Примечание: Изм. – измельченное
сырье; рН 4,5 – опыт проводился при значении рН 4,5
На рисунке 4 приведены данные по экспериментам с
различным исходным значением рН, что имеет практическое значение в случае использования Церемикса, так как
большинство ферментов наиболее активны при кислых
или слабокислых значениях рН, а рассматриваемый препарат имеет оптимум действия при нейтральных значениях.
Известно, что Церемикс гидролизует полисахариды и при
рН ниже оптимума. Вероятно, его можно использовать в
комбинации с другими ферментами, так как при гидролизе
получаются высокие показатели и по РВ, и по СВ.
Так как ферменты имеют различный механизм действия, нами были проведены опыты на совместное действие трех самых эффективных ферментных препаратов
(рисунок 5).
Рис. 3. Сравнение гидролитической активности
различных ферментных препаратов при использовании
в качестве субстрата ламинарии сахаристой
(по выходу сухих веществ)
Кривая ферментативного гидролиза выходит на
плато на четвертый час проведения гидролиза. Ферменты Дистицим и Целлолюкс гидролизуют водоросли с высоким выходом моносахаридов (оценивали по
количеству редуцирующих веществ), ферменты Вискофло и Церемикс – с высоким выходом полисахаридов (оценивали по количеству сухих веществ) что
позволяет предположить различный механизм действия ферментов. Таким образом, комбинация этих
препаратов может в дальнейшем дать высокий выход редуцирующих веществ.
Поскольку кинетика действия ферментов лежит в
диффузионной области, что можно объяснить труднодоступностью субстрата (большие размеры – куски субстрата могут достигать 6-10 мм, отсутствие
перемешивания), мы проводили эксперименты с измельченным сырьем. Для этого высушенные водоросли измельчали до частиц размером около 2 мм.
Прирост выхода редуцирующих веществ составил
20%. Однако, если частицы сырья имели размер менее 1 мм, выход падал, и при 0,1 мм ни один фермент не показал результат, отличный от контроля.
Результаты, представленные на рисунке 4, подтверждают, что измельчение способствует увеличению выхода как редуцирующих, так и сухих веществ.
Рис. 5. Сравнение действия одного фермента
и комплекса ферментов на водорослевое сырье
Преимущества полиферментативного гидролиза очевидно – количество редуцирующих веществ в этом случае
в 2 раза выше, чем при гидролизе ламинарии монопрепаратами. Так же был проведен гидролиз субстрата двумя
ферментными препаратами (Целлолюкс и Вискофло).
Условия гидролиза полностью соответствуют условиям
опыта по гидролизу тремя ферментными препаратами. Результаты анализов представлены на рисунке 6.
Рис. 6. Содержание редуцирующих веществ
в гидролизатах в случае использования двух
и трех ферментных препаратов
Выходы по редуцирующим веществам в случае использования двух ферментных препаратов (Целлолюкс
и Вискофло) близки к выходам по редуцирующим веществам в случае использования трех ферментных
препаратов (Целлолюкс, Вискофло и Дистицим), поэтому совместное использование Целлолюкса и Дистицима нецелесообразно.
Заключение
Таким образом, совместное использование наиболее эффективных ферментов при оптимальных условиях действия привели к конечному максимальному результату содержания РВ 2,5 г/л, что составляет 10% от
исходной концентрации и почти 70% от максимального
количества РВ сырья.
В дальнейшем увеличения концентрации РВ можно
достичь предварительным измельчением сырья, проведением процесса при постоянном перемешивании, увеличении времени гидролиза, подбором оптимальных
сочетаний ферментных препаратов. Увеличение концентрации исходного сырья также может привести к
улучшению результата. Поскольку некоторые ферментные препараты являются термостабильными, возможно использовать их при температуре 70-80°С.
Литература
1. Фенгел Д. Вегенер Г. Древесина (химия,
ультраструктура, реакции): пер. с англ. под ред. А.А.
Леоновича. М: Лесная промышленность, 1988. 512 с.
2. Mucci, A. Davis T. A., Volesky B. A review of the
biochemistry of heavy metal biosorption by brown algae //
Water Research. 2003. V. 37 P. 4311–4330.
3. Воскобойников Г.М., Зубова Е.Ю. Биохимический
состав промысловых бурых водорослй // Промысловые
и перспективные для использования водоросли и беспозвоночные Баренцева и Белого морей. Апатиты: Изд.
КНЦ РАН, 1998. С. 306-322.
4. Петров М.С. Бурые водоросли в биотехнолии.
СПб: Химия, 2002. 20с.
5. Kloareg B., Quatrano, R.S. Structure of the cell walls
of marine algae and ecophysiological functions of the matrix polysaccharides // Oceanogr. Mar. Biol. Annual Rev.
1988. V. 26. P. 259-315.
6. Справочник по химическому составу и технологическим свойствам водорослей, беспозвоночных и морских млекопитающих / под ред. В.П. Быкова, М.: ВНИРО, 1999. 450 с.