Прижизненное изображение CTL (цитотоксических Т лимфоцитов), разрушающих β клетки островка поджелудочной железы, у мышей, страдающих диабетом. Причиной сахарного диабета 1 типа (СД1) является аутоиммунная деструкция инсулинпродуцирующих β-клеток островков поджелудочной железы, по существу являющихся мини-органами, встроенными в экзокринную ткань. Считается, что CTL играют главную роль в аутоиммунной деструкции, которая лежит в основе СД1. Визуализация СTL-опосредованного разрушения клеток должна облегчить понимание патогенеза СД1, однако, является технически сложной в выполнении. Здесь мы описываем прижизненное двухфотонное изображение динамичного поведения увеличенной диабетогенной популяции CTL в поджелудочной железе мыши в стадии разрушения клеток. После сосудистого торможения и кровоизлияния, CTL начинают хаотично перемещаться по всей экзокринной ткани и беспрепятственно мигрируют между анатомически близкими островками. При столкновении с антигеном внутри островка, движение замедляется, что позволяет CTL проверить поверхность клетки-мишени. Впоследствии меньшая часть CTL останавливает движение, образуя соединения с β-клеткой мишенью, которое сохраняется около нескольких часов. Медленное поражение возникает при длительном присутствии существенного числа эффекторных клеток. Все эти данные изображают передвижение CTL от одной клетки-мишени к другой, как стохастический процесс на суборганном уровне, и противоречат мнению об основном влиянии градиентов хемотаксиса. Дополнительная информация к видео Доп. Видео 1 – внутренняя ткань, 3D визуализация сосудистой сети нормального островка in vivo Вращение 3D изображения нормального островка поджелудочной железы (отмечено зеленым) в различных плоскостях у животного RIP-LCMV. GP/MIP-GFP после инъекции сосудистого красителя 70kDa Dextran-TxRed (красный). Обратите внимание на плотную, извилистую сеть капилляров, протекающих в островок, и стекающих в более широкие сопредельные венулы. Соответсвует изображению 2С, D. Параметры изображения ш/в=1.52/d=5/z=32 Доп. Видео 2 – Внутрисосудистое торможение CTL (цитотоксических Т лимфоцитов) изначально возникает в более широких панкреатических венулах. Серия изображений, состоящая из проекционных изображений с максимальной интенсивностью (параметры изображения ш/в=0.56, d=4/z=25/t=30s). На вкладке изображен участок, снятый с высокой частотой смены кадров (5 к/сек.) на фоне единого плана по оси Z (ш/в=0.51). Красными стрелками показаны неподвижные круглые клетки, контактирующие со стенкой сосуда (коричневатые, 70kDa Dextran-TxRed). Флюоресцирующее вещество, в виде быстро передвигающихся белых точек на вкладке, показывает направление кровотока. Соответствует изображению 2E, F. Доп. Видео 3 – Внутрисосудистое торможение CTL изначально возникает в более широких панкреатических венулах. Серия изображений, состоящая из проекционных изображений с максимальной интенсивностью (параметры изображения ш/в=1.52, d=5/z=21/t=30s). На вкладке изображен участок, снятый с высокой частотой смены кадров (5 к/сек.) на фоне единого плана по оси Z (ш/в=0.51). Зелеными стрелками показаны неподвижные круглые клетки, контактирующие со стенкой сосуда (красные, 70kDa Dextran-TxRed). Голубыми стрелками показаны CTL, движущиеся по сосудистой стенке. Желтыми стрелками отмечены свободно циркулирующие СTL. Белыми стрелками показаны неотмеченные клетки, прочно контактирующие с сосудистой стенкой. Красные стрелки указывают на протечку сосудистого контрастного вещества. Соответствует изображению 2G. Доп. Видео 4 – фенотип протекающей венулы в предиабетической поджелудочной железе RIP-LCMV.GP. Изоповерхностное изображение сосудистого просачивания в предиабетической поджелудочной железе. Сосудистый краситель Dextran-TxRed введен при Т=0. Соответствует изображению 3А, В, сложный изоповерхностный объем был использован для создания изображения 3E. Параметры изображения: ш/в=1.52/d=5/z=26/t=60s 46 Доп. Видео 5 – Целостные сосудистые сети в здоровой поджелудочной железе RIP-LCMV.GP. Изоповерхностное изображение целостных сосудистых сетей (красный цвет) и структуры островков (зеленый) в здоровой поджелудочной железе. Сосудистый краситель Dextran-TxRed введен при Т=0. Соответствует изображению 3С, D сложный изоповерхностный объем был использован для создания изображения 3E . Параметры изображения: ш/в=1.52/d=5/z=33/t=60s Доп. Видео 6 – 3D путь движения индуцирующих диабет CTL внутри ацинуса. Беспорядочное движение CTL внутри ацинарной ткани, премыкающей к островку поджелудочной железы. Пурпурные точки – это единичные отслеживаемые движущиеся CTL, связанные с цветным шлейфом, повторяющим последние 5 позиций клеток. Соответствует изображению 4 С. Параметры изображения: ш/в=0.52/d=6/z=17/t=30s Доп. Видео 7 – Беспорядочное движение CTL в экзокринной поджелудочной железе в высоком разрешении. Серия четких изображений CTL, отмеченных зеленым, и изоповерхностной сосудистой сети (красный цвет). Обратите внимание, что все CTL находятся в ткани, а не внутри сосудистой сети. Соответствует изображению 4Е. Параметры изображения: ш/в=0.27/d=5/z=24/t=30s Доп. Видео 8 – Беспорядочное движение совместно с пептидом/адъювантактиватором CTL. Экспериментальная установка, идентичная Видео 6 и 7, но вместо неинфицированных CTL клетки, инфицированные LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита). Обратите внимание на образование континуума воспалительных CTL между соседними островками на изображении. Соответствует изображению 5B. Параметры изображения: ш/в=0.69/d=6/z=14/t=30s Доп. Видео 9 - Континуум пораженных CTL среди анатомически соседних островков. Как видно CTL (подвижные клетки зеленого цвета) формируют континуум между соседними островками (зеленое скопление слева и справа). Соответствует изображению 5В. Параметры изображения: ш/в=0.70/d=6/z=22/t=30s Доп. Видео 10 – Беспорядочное движение CTL среди анатомически соседних островков. Пример поведения CTL и отслеживание их движения в 3D проостранстве между анатомически близкими островками (большое скопление зеленого цвета). Пурпурные точки обозначают единичные CTL, окрашенный «шлейф» отображает пять последних позиций клетки. Соответствует изображению 5D. Параметры изображения: ш/в=1.11/d=6/z=16/t=30s 47 Доп. Видео 11 – Сдерживание подвижности CTL и их торможение в веществе островка. CTL (пурпурный флуоресцентный белок) и бета-клетки (зеленый флуоресцентный белок) отображают рассасывание клеток. Соответствует изображению 6A. Параметры изображения: ш/в=0.79/d=5/z=22/t=60s Доп. Видео 12 – Торможение CTL и изучение их поведения в островках пожделудочной железы. Усиленное 3D пространство, соответствующее изображению 6А, показывает контакт CTL с бета-клетками в изображении сплошного времени (под красной стрелкой) во время миграции в зоне видимости множества подвижных CTL. Параметры изображения и временное разрешение: смотри Доп. Видео 11. Доп. Видео 13 – Торможение CTL и изучение их поведения в островках пожделудочной железы. Увеличенное 3D пространство, соответствующее изображению 6В, показывает стабильные контакты CTL с бета-клетками в режиме сплошного (под красной стрелкой) и прерывистого (под синей стрелкой) времени во время миграции в зоне видимости множества подвижных CTL. Параметры изображения и оригинальная последовательность: ш/в=0.88/d=5/z=20/t=60s Доп. Видео 14 – Обнаружение смерти бета-клеток in vivo. Красной стрелкой отмечена потеря GPF (флуоресцентный белок) сигнала, что связано со смертью клетки. Соответствует изображению 7А. Параметры изображения: ш/в=0.58/d=6/z=21/t=30s Доп. Видео 15 – Объединение смерти бета-клеток (зеленый; под красной стрелкой) с торможением CTL (пурпурный; под белой стрелкой). Соответствует изображению7Е. Параметры изображения : ш/в=0.86/d=5/z=22/t=60s Доп. Видео 16 – Детали Доп. Видео 15. Параметры изображения : ш/в=0.06/d=5/z=22/t=60 Доп. Видео 17 – Недостаток ограничения движения и торможения CTL в клетках пожделудочной железы, при развившимся сахарном диабете. Единичные бета-клетки (большие, неподвижные, зеленого цвета) можно наблюдать в центре поля, среди CTL красного цвета. Маленькие подвижные зеленые клетки – это, возможно, фагоциты, фагоцитирующие бета-клетки с GFP (феномен уже описали Tang, Q., Adams, J.Y., Tooley, A.J., Bi, M., Fife, B.T., Serra, P., Santamaria, P., Locksley, R.M., Krummel, M.F., and Bluestone, J.A. в 2006 году. Визуализация контроля аутоиммунного ответа регулирующими Т-клетками на мышах, страдающих диабетом без ожирения: Nat Immunol 7:83-92) Изображение представляет собой увеличенный участок Изображения 7Е. Параметры изображения и оригинальная последовательность ш/в=1.52/d=5/z=20/t=60s Доп. Видео 18 – Быстрое исчезновение СTL при истощении антигена. Небольшая популяция медленно движущихся CTL (мелкие зеленые точки) вбизи оставшихся островков (большее по объему желтовато-зеленое скопление) у животного, тяжело болеющего сахарным диабетом. Кровеносное русло окрашено Dextran-TxRed. Соответствует изображению 7G после инъекции сосудистого красителя. Параметры изображения: ш/в=1.52/d=5/z=18/t=30s