Биокинетика. Учебное пособие
реклама
Биокинетика (краткий конспект лекций) составил к.ф.-м.н. А. В. Чернышев. (http://cyto.kinetics.nsc.ru/biomed/staff.html) Глава 1. Введение в биокинетику 1.1. Предмет изучения биокинетики Развитие биологической кинетики (биокинетики) связано с постановкой следующих вопросов. - Что определяет протекание биологических процессов во времени? - Каковы пути и возможности ускорения биохимических реакций? - Какая стадия определяет скорость того или иного биологического явления? - Какие события на молекулярном уровне задают динамику развития в целом? - … Исследование количественных закономерностей развития биологических процессов во времени на молекулярном уровне составляет предмет биокинетики. Биокинетика – наука, изучающая на молекулярном уровне закономерности развития биологических процессов в системах in vitro, живых органах и тканях, клеточных популяциях. 1.2. Химическая кинетика как основа биокинетики В биокинетике количественное описание биологических процесов на молекулярном уровне основано на базовых законах химической кинетики. 1.2.1. Современные представления о механизме химической реакции Чтобы произошла химическая реакция, необходимо, чтобы энергия взаимодействующих молекул была больше энергии активации E a (Аррениус, 1889). На рис. 1.1 приведены различные типы химических реакций. Химические реакции Сложные Простые мономолекулярные обратимые каскадные бимолекулярные параллельные последовательные тримолекулярные циклические смешанные Рис. 1.1. Типы химических реакций. 1 Некоторые простые (элементарные) химические реакции: A B C D (бимолекулярная) AB (мономолекулярная, изомеризация) A BC (мономолекулярная, диссоциация) 1.2.2. Скорость химической реакции Для элементарной (простой) химической реакции, которая представлена стехиометрическим уравнением A B ... C A B ... C (1.1) определяется скорость реакции: W 1 dA 1 dB 1 dC 1 dA 1 dB 1 dC ... ... dt dt dt dt dt dt (1.2) и выполняется закон действующих масс: W k A B ... C (1.3) где k – константа скорости химической реакции. Универсальный метод определения порядка и константы скорости химической реакции в эксперименте: ln W ln k ln A ln B ... ln C (1.4) Для расчета кинетики сложной реакции, механизм которой составлен из простых реакций, используется принцип независимости элементарных стадий: k1 A B k2 B C (1.5) dA dt k1 A dB k1 A k 2 B dt dC dt k 2 B (1.6) 1.2.3. Константа равновесия В принципе, любая элементарная реакция обратима: k1 A B 1 B k A (1.7) В равновесии 0 dA k1 A k 1 B dt (1.8) A k 1 K B k1 (1.9) где K называется константой равновесия. 2 1.2.4. Выражения для константы скорости элементарной химической реакции Зависимость константы скорости от температуры (Аррениус): E k A exp a k bT где (1.10) k b - константа Больцмана. В общем случае, предэкспонент в (1.10) зависит от температуры: A AT Теория активированного (переходного) комплекса позволяет рассчитать k G k bT exp k T h b k bT exp S k h b exp H k T b где: - трансмиссионный множитель (обычно 1 ); k: (1.11) h - постоянная Планка; G , S , H - изменение энергии Гиббса, энтропии и энтальпии (соответственно) при переходе от реагентов к активированному (переходному) комплексу. 1.2.5. Влияние pH на скорость химической реакции Возможные схемы: A H AH A B (1.12a) A H AH AH B (1.12b) A H AH AH H AH 2 AH B (1.12c) При фиксированном значении pH скорость реакций (1.12a-c) можно описывать через эффективную константу скорости k эфф : W k эфф A0 Типичные зависимости kэфф(pH) для схем (1.12a-c) представлены на рис. 1.2. 3 kэфф b c a pH Рис. 1.2. Наиболее типичные pH-зависимости эффективной константы скорости реакции. 1.2.6. Кинетический эксперимент Для того чтобы определить механизм любой химической реакции, проводят кинетический эксперимент, который заключается в измерении концентрации исследуемого вещества в зависимости от времени и ряда изучаемых параметров. Исследуемым веществом может быть: исходное вещество, промежуточное вещество, продукт реакции. Параметрами могут быть: начальная концентрация исходных веществ, условия эксперимента (температура, давление, пр.). Для проведения адекватного кинетического эксперимента: один параметр измеряется, один параметр меняется, остальные параметры фиксируются. В реальном эксперименте при оцифровке сигнала происходит регистрация изучаемого параметра лишь в определенные (дискретные) промежутки времени. В результате кинетическая кривая носит дискретный характер. Теорема Найквиста утверждает, что для корректной дискретной регистрации непрерывного сигнала необходимо, чтобы частота цифрования (дискретизации) максимальную частоту f цифр превышала более чем в два раза f макс в Фурье-спектре исследуемого сигнала: f цифр 2 f макс (1.13) Основные источники ошибок в кинетическом эксперименте приведены на Рис.1.3. 4 Планирование эксперимента неадекватные условия неадекватный метод неадекватный диапазон параметров недостаточная чувствительнось метода неадекватный диапазон времени избыточная чувствительнось метода Проведение эксперимента Интерпретация результатов недостаточная точность регистрации параметров арифметическая ошибка приборная ошибка учет не всех параметров неадекватная модель случайная ошибка выбор слишком простой модели ошибка метода выбор слишком сложной модели непригодность метода модель не отвечает условиям или данным эксперимента Рис. 1.3. Основные ошибки кинетического эксперимента Глава 2. Ферментативный катализ 2.1. Кинетические схемы и механизм ферментативной реакции 2.1.1. Схема Михаэлиса-Ментен Считается, что механизмы ферментативных реакций выглядят следующим образом: субстрат S образует комплекс с активным центром фермента E, в комплексе X происходят фермент-субстратные изменения, образуются продукты реакции P, которые уходят из активного центра, освобождая его для взаимодействия с новой молекулой субстрата. Схема Михаэлиса-Ментен (Michaelis, Menten, 1913): k1 E S X k 1 k2 X E P (2.1) кинетической схеме (2.1) соответствует следующее дифференциальное уравнение: dX k1 E S (k 1 k 2 ) X dt W (2.2) dP k2 X dt (2.3) E0 E X (2.4) 5 Если пренебречь изменением концентрации субстрата (при его избытке или на небольших временах процесса), и при начальных условиях X t 0 0 , решение дифференциального уравнения (2.2): X (t ) E0 S 1 exp k1S k 1 k 2 t Km S (2.5) P(t ) k 2 E0 S k 2 E0 S exp k1 S K m t 1 t K m S 0 k1S k 1 k 2 Km S (2.6) Km k 1 k 2 k1 (2.7) где (константа Михаэлиса) В условиях стационарности по промежуточному соединению X ( dX / dt 0 ) уравнение стационарной скорости: W Где Wm S Km S (уравнение Михаэлиса) (2.8) Wm - максимальная скорость ( S ): Wm Wmax k 2 E0 (2.9) Как правило, реальные механизмы включают большое число промежуточных соединений фермента с субстратом. Однако, уравнение Михаэлиса (2.8) феменологически описывает практически все ферментативные реакции. В этом заключается фундаментальность этого уравнения. Несмотря на кажущуюся сложность ферментативной реакции, вне зависимости от числа и природы интермедиантов, стационарная кинетика процесса описывается уравнением Михаэлиса (2.8). Для характеристики ферментативных реакций обычно определяют оба параметра: максимальную скорость Wm и константу Михаэлиса K m . В качестве иллюстрации в табл.2.1. приведены примеры других кинетических схем, приводящих к уравнению Михаэлиса. Табл.2.1. Некоторые кинетические схемы, приводящие к уравнению Михаэлиса Схема Wm Km k1 X E S1 k2 X S 2 E P k1S1 E0 k1 S1 k2 k 2 k3 E0 k 2 k3 k 1k3 k1k 2 k1k3 E0 k 1 k 1 k2 k3 E S X 1 X 2 EP k 1 k 1 k2 kn 1 E S X 1 ... X n E P k n 1 1 k i 2 i 1 6 n 1 1 i 2 k i k1k 2 2.1.2. Определение параметров Wm и Km из экспериментальных данных Из данных по стационарной кинетике величины Wm и Km определяются на основе линеаризации уравнения Михаэлиса: 1) Метод двойных обратных координат K 1 1 1 m W Wm Wm S (2.10) 2) Метод Скэтчарда (Иди-Хофсти) W 1 1 Wm W S0 K m Km (2.11) 2.1.3. Метод графов при анализе кинетических схем Граф – совокупность точек (вершин) и соединяющих их линий (дуг, ветвей, ребер). Кинетический граф строят следующим образом. Каждую часть модели изображают точкой (вершиной графа). Те части, между которыми происходит обмен веществ, соединяют линией (дугой графа); стрелки показывают направление транспорта вещества. Перенос химического вещества или соответствующего фрагмента X из “источника” i в “сток” j, изображенный на графе стрелкой ij, характеризуется определенной скоростью vij(X) (количество вещества X, переходящим из i в j за единицу времени): vij X dni X dt (2.12) Часто скорость переноса вещества можно представить в виде формулы: vij X aij ni X (2.13) где aij - коэффициент переноса, не зависящий от ni X . Это число характеризует вес (величину) ветви. Общее изменение количества вещества X в произвольной части i можно представить в виде суммы прихода и ухода вещества: dni X vij v ji aij ni X a ji n j X dt i j i j (2.14) Система линейных дифференциальных уравнений (2.14) для данного графа может быть записана в матричном виде и решена методами линейной алгебры (через нахождение собственных значений и собственных векторов соответствующей матрицы). 2.1.4. Определение концентрации активных центров Максимальная скорость реакции определяется произведением каталитической константы и абсолютной концентрации активных центров: Wm k кат E0 (2.15) Для определения концентрации активных центров известно несколько подходов, например: 1) определение по содержанию белка, если известно, что молекула фермента содержит только один активный центр и в растворе присутствует только один фермент: 7 E0 P m (2.16) где P – концентрация белка, m – молярная масса белка; 2) путем необратимого ингибирования: W k ( E0 I 0 ) (2.17) 2.1.5. Лимитирующие стадии Большинство экспериментальных кинетических исследований ферментов выполнено в режиме стационарной кинетики. Максимальная скорость ферментативной реакции характеризует самый медленный кинетический процесс, протекающий в активном центре катализатора. Поэтому изучение лимитирующих процессов представляют наибольший интерес. Существует несколько подходов для идентификация лимитирующих стадий реакции, некоторые из них представлены ниже: 1. Использование субстратов с различной структурой и различной реакционной способностью. Если заметно различающиеся субстраты характеризуются одним и тем же значением kкат – вероятно реакция идет через образование промежуточного соединения, структура которого является общей для всех исследуемых субстратов, и превращение этого интермедианта лимитирует скорость каталитического процесса. 2. Нестационарная кинетика. Этот подход является общим для идентификации механизма реакции. 2.2. Типичные зависимости начальной стационарной скорости реакции от концентрации субстрата На рис. 2.1 показаны известные зависимости начальной стационарной скорости от концентрации субстрата: “классическая” кривая Михаэлиса (a) и кривая с экстремумом (b) или с ускорением (c) на начальном этапе. Механизмы, приводящие к “немихаэлисовским” зависимостям скорости реакции, связаны с взаимодействием фермента с несколькими молекулами субстрата. Отклонения могут быть вызваны ингибированием или активацией реакции избытком субстрата, а также аллостерическими эффектами. a W0 c b S0 Рис. 1.2. Известные зависимости начальной стационарной скорости от концентрации субстрата. 8 2.2.1. Ингибирование и активация избытком субстрата Кинетическая схема: Km kкат ES E P E S KS k ES 2 кат ES P ES S (2.18) Для скорости образования продукта: W dP kкат[ ES ] kкат[ ES2 ] dt (2.19) Учитывая равновесие по фермент-субстратным комплексам: [ ES ] ES Km [ ES 2 ] (2.20) [ ES ]S KS ES 2 (2.21) KmKS и сохранение количества фермента: E [ ES ] [ ES 2 ] E0 (2.22) получаем выражения для E, [ES] и [ES2]: E E0 (2.23) S S2 1 Km KmKS [ ES ] SE0 S S2 K m 1 K KmKS m [ ES 2 ] (2.24) S 2 E0 S S2 K m K S 1 K KmKS m (2.25) и для стационарной скорости: W k кат K S k кат S SE0 S S2 K m K S 1 K KmKS m (2.26) Если > 1, уравнение (2.26) объясняет эффект активации субстратом, если < 1 – эффект ингибирования субстратом. 2.2.2. Аллостерические эффекты Простейшая кинетическая схема, приводящая к сигмодальной зависимости, имеет вид: 9 KL E E K1 k1 E S ES EP K1 k1 E S E P E S K2 k2 ES 2 ES P ES S K 2 k2 E S 2 E S P E S S (2.27) Для простоты предположим, что реакционной способностью обладает лишь форма E’S2 и эффективность связывания субстрата формами E и E’ одинаковы (K1=K’1, K2=K’2). Тогда W k 2 E0 K L S 2 S S 2 K1 K 2 1 K L 1 K K1 K 2 1 (2.28) Схему (2.27) можно обобщить и для случая произвольного числа n взаимодействующих центров. В условиях справедливости вышеизложенных предположений (реакционноспособная частица ESn, константы равновесия K1=K’1,…, Kn=K’n): W k 2 E0 K L S n S Sn K1 ...K n 1 K L 1 ... K K1...K n 1 (2.29) Соответственно, число связывающих центров можно определить из анализа скорости реакции при низкой концентрации субстрата, когда справедливо уравнение lg W lg Wm lg( K1...K 2 ) n lg S (2.30) 2.3. Многосубстратные реакции Как правило, ферменты катализируют реакции с участием двух или нескольких субстратов. Односубстратные реакции являются частным случаем многосубстратных реакций, протекающих в режиме избытка одного из компонента реакции. При этом возможны два принципиально различных механизма: 1) реакция через тройной комплекс и 2) “пинг-понг” механизм. 2.3.1. Механизм тройного комплекса K1 E S1 ES1 K2 ES1 S 2 ES1 S 2 k E P ES1 S 2 (2.31) равновесные концентрации комплексов [ ES1 ] ES1 K1 [ ES1S 2 ] (2.32) [ ES1 ]S 2 ES1S 2 K2 K1 K 2 (2.33) тогда 10 E0 E [ ES1 ] [ ES1S 2 ] E ES1 ES1S 2 K1 K1 K 2 E0 E (2.34) (2.35) S SS 1 1 1 2 K1 K1 K 2 и выражение для стационарной скорости W kS1S 2 E0 ES S dP k[ ES1S 2 ] k 1 2 dt K1 K 2 S SS K1 K 2 1 1 1 2 K1 K1 K 2 (2.36) 2.3.2. “Пинг-понг” механизм K1 k1 ES1 X E S1 K2 k2 XS 2 EP X S 2 (2.37) равновесные концентрации комплексов [ ES1 ] [ XS 2 ] ES1 K1 (2.38) XS 2 (2.39) K2 условие на стационарность концентрации X 0 ES XS 2 dX k1[ ES1 ] k 2 [ XS 2 ] k1 1 k 2 dt K1 K2 X k1 K 2 S1 E k 2 K1S 2 (2.40) (2.41) сохранение количества фермента E0 E [ ES1 ] X [ XS 2 ] E E ES1 k1 K 2 S1 E S 1 2 K1 k 2 K1S 2 K 2 E0 S k K S 1 1 1 2 1 K1 k 2 K1 S 2 (2.42) (2.43) S 1 2 K2 тогда выражение для стационарной скорости W k XS kS E dP k 2 [ XS 2 ] 2 2 1 1 dt K2 K1 k1 E0 K k K 1 1 1 1 2 S1 k 2 S2 (2.44) 2.4. Нестационарная кинетика ферментативных реакций В настоящее время для анализа механизмов ферментативных реакций широко используются экспериментальные и теоретические методы нестационарной кинетики. 11 2.4.1. Предстационарная кинетика многостадийной реакции Прежде чем выйти в стационарный режим, реакция протекает в переходной (предстационарной) фазе. Как правило, предстационарная кинетика позволяет достаточно детально проанализировать стадийность процесса. Рассмотрим наиболее общий случай – реакция превращения субстрата в продукт с участием произвольного числа n промежуточных соединений: k k 1 2 kn 1 ES X1 ... X n E P k k 1 (2.45) 2 Пренебрежем изменением со временем концентрации субстрата. В этом случае кинетику процесса описывает система линейных дифференциальных уравнений dX 1 k SE k X k k X 1 2 2 1 2 1 dt ... dX i k i X i 1 k i 1 X i 1 k i k i 1 X i dt ... dX n k n X n1 k n k n1 X n dt n E0 E X i i 1 dP k X n 1 n dt (2.46) В матричной записи система (2.46) выглядит так n d X j Bij X i C j dt i 1 (2.47) Общим решением этого уравнения является сумма экспотенциальных членов n X j (t ) A ji e it A0 (2.47) i 1 где i - собственные значения матрицы Bij, а Aij и A0 – константы. Тогда n P(t ) k n1 i 1 Ani it e 1 k n1 A0 t i (2.48) 2.4.2. Релаксационная кинетика Релаксационные методы основаны на том принципе, что при быстром внешнем воздействии на систему (изменение температуры, давления, пр.) время, которое нужно системе для достижения нового равновесия (или стационарного состояния), зависит от скорости химической реакции (и иногда от скорости диффузии реагентов. Рассмотрим простейшую реакцию комплексообразования активного центра фермента с лигандом 12 k 1 EA EA k (2.49) 1 В начале система находится в равновесии, которое характеризуется константой равновесия K0=K(T0) и соответственно равновесными концентрациями E , A , E A . Предположим, что в системе резко меняется температура T -> T0 + T. Это приводит к изменению константы равновесия K -> K0 + K , которое определяется отношением K H ln K T K0 RT 2 (2.50) где H – стандартное изменение энтальпии. После этого система переходит в новое равновесное состояние: d [ EA] k1 EA k 1[ EA] dt (2.51) [ EA] [ E A ] [ EA](t ) E E E (t ) (2.52) A A A(t ) Уравнение (2.51) нелинейно. Предположим, что отклонение от равновесия невелико и тогда k1 E E A A k1 E A k1 E A k1 A E (2.53) и уравнение (2.51) преобразуется в линейное дифференциальное уравнение: d[ EA] k1 E A k 1[ E A ] k1 E k1 A k 1 [ EA] dt (2.54) Решение этого дифференциального уравнения: [ EA] k1 E A k 1[ E A ] 1 exp k1E k1 A k 1 t k1 E k1 A k 1 (2.53) Величина k1 E k1 A k 1 1 (2.54) называется временем релаксации. 2.5. Влияние температуры и pH на скорость ферментативных реакций Влияние этих факторов на скорость элементарной химической реакции было рассмотрено в Гл.1. Особенность состоит в том, что ферментативные реакции являются сложными многостадийными реакциями (состоящие из многих элементарных реакций). Кроме того, состояние молекул фермента в растворе характеризуется набором конформеров, обратимо переходящих друг в друга. Конформационные переходы молекулы определяются в значительной степени температурой и pH раствора. 2.6. Ингибирование ферментативных реакций Вещества, подавляющие каталитическую активность ферментов, называются ингибиторами. Различают два основных класса ингибиторов – обратимые k EI EI (2.55) (пестициды, зарин, зоман, аспирин и др.) 13 и необратимые (инактиваторы) k 1 EI EI k (2.55) 1 (окись углерода, цианид-ион, анальгин и др.) 2.7. Инактивация ферментов Биополимерные молекулы (ферменты) являются термодинамически неустойчивыми и, как правило, с течением времени изменяют свою структуру и свойства. В большинстве случаев процесс инактивации может быть описан как переход между двуми состояниями фермента активного Ea и неактивного Ei: k 1 Ea Ei k (2.56) Кинетика 1 процесса описывается соответствующим дифференциальным уравнением dE a k1 E a k 1 Ei dt E 0 E a Ei (2.57) и характеризуется постоянной времени k1 k1 1 (2.58) Процесс инактивации фермента может иметь различную физико-химическую природу. Наиболее общим является тепловая денатурация, представляющая собой существенную перестройку макромолекулы, изменение третичной и частично вторичной структуры. Для целей инактивации могут быть использованы кавитационный ультразвук, радиоактивное излучение и пр. Изменение pH также может привести к денатурации фермента. При каждом значении pH белок характеризуется соответствующим распределением зарядов (ионогенные группы). При очень низких или очень высоких pH распределение зарядов может существенно поляризовать молекулу, приводить к появлению изомеров и необратимо конформировать ее с разрушением структуры активного центра. Например: K1 K2 EH 2 EH E k0 E Ei k1 Ei EH k2 EH 2 Ei Денатурацию фермента вызывают и денатурирующие агенты, разрушающие вторичную структуру белка (например, мочевина), а также окислительные процессы с участием кислорода. При изучении таких процессов важная информация получена релаксационными методами. Как правило, конформационные изменения сопровождаются изменением окружения ароматических аминокислот – тирозина и триптофана (полоса поглощения излучения на 290 нм). Это проявляется в изменении спектров поглощения и флуоресценции. 14 Обратимые конформационные изменения обычно идут со временем 0.1-100 мс, а необратимые – 1-1000 мин. Пример 1. Простейшая кинетическая схема инактивации с равновесием конформеров: K k E1 E2 Ei (2.59) Кинетика процесса описывается одним характеристическим временем 1 K k (2.60) Пример 2. Инактивации подвержены оба конформера: K E1 E2 k1 E1i E1 k2 E 2 E 2i (2.61) 1 K k1 k 2 K (2.62) Пример 3. Более общий случай для системы с участием n конформеров: K K K k 1 1 E1 E2 2 E3 ... n En Ei 1 K n11 K n2 1 ... K 2 1 K1 k (2.63) (2.64) Часто ферменты в растворе образуют димеры, и в димерной форме оказываются стабильнее. Тогда наблюдается диссоциативный механизм инактивации: K k in E2 2 E 2 Ei (2.65) Следующая схема отражает возможные механизмы инактивации в процессе реакции (мономолекулярная инактивация свободной формы фермента, мономолекулярная инактивация фермен-субстратного комплекса, бимолекулярная инактивация фермента субстратом, бимолекулярная инактивация фермента продуктом): K k E S ES E P k1 E Ei k2 ES i ES k3 E S Ei k4 E P Ei (2.66) Дискриминация механизмов инактивации и определение кинетических характеристик реакции обычно проводится несколькими методами: 1) анализируя зависимость выхода продукта от концентрации фермента; 2) устанавливая связь степени конверсии субстрата со степенью инактивированности фермента; 3) проведение реакции при низких степенях конверсии субстрата и низких концентрациях фермента; 15 4) проведение реакции при больших концентрациях фермента; 5) предынкубация фермента с компонентами реакции; 6) использование интегральных уравнений реакции. 2.8. Полиферментные системы. Сопряженные ферментные реакции Реакции в полиферментных системах можно рассматривать как последовательные процессы, в которых каждая стадия катализируется своим ферментом, например: E E 1 2 S1 S 2 P (2.67) При этом считается, что скорости ферментативных реакций на первой и второй стадии реакции описываются уравнением Михаэлиса. Предполагая, что в системе гомогенно распределены субстраты и ферменты (т.е. нет образования специфических комплексов между ферментами) и градиенты субстратов и продукта по всему объему равны нулю, для схемы (2.67) можно записать следующие дифференциальные уравнения: V1m S1 V2 m S 2 dS 2 dt K S K S 1m 1 2m 2 dP V2m S 2 dt K 2m S 2 (2.68) Пренебрегая изменением S1 со временем (при избытке S1), в уравнении (2.68) можно разделить переменные и проинтегрировать: S2 0 dS 2 V1m S1 V2 m S 2 K1m S1 K 2 m S 2 t S2 V2 m K 2 m S ln 1 2 V2 m W1 K 2m W1 V1m S1 K1m S1 V2 m 1 W1 (2.69) W1 V2 m t (2.70) где (2.71) Уравнение (2.70) имеет смысл при условии 1 S2 K 2m V2m 1 0 W1 (2.72) что приводит к неравенству S2 K 2m (2.73) V2 m 1 W1 Рассмотрим наиболее важный частный случай, когда максимальная скорость второй стадии существенно превышает скорость первой (V2m>>W1). Тогда выражение (2.70) сводится к следующему S2 S V V ln 1 2 2m 2m t K 2m K 2m W1 K 2m (2.74) При V2m>>W1, S2/K2m<<1, и в этих условиях справедливо неравенство 16 S V S ln 1 2 2m 2 K 2m K 2m W1 (2.75) С учетом этого неравенства уравнение (2.74) приводит к следующей зависимости K 2m S 2 (t ) W1 1 e V2 m V2 m t K2m (2.76) Соответственно, концентрация продукта V2 m K 2m K 2 m t P(t ) W1t W1 e 1 V2 m (2.76) Кривая продукт-время имеет период индукции K 2m V2m (2.77) и асимптотически приближается к прямой с тангенсом угла наклона, равным стационарной скорости процесса. Рассмотрим общий случай E E E 1 2 n S1 S 2 ... S n P (2.78) в условиях бимолекулярного режима (Si << Kim) и малой степени конверсии субстрата в конечный продукт (P << S1+S2+…+Sn). Этой схеме соответствует следующая система дифференциальных уравнений: dS1 dt W1 0 dS 2 W W 1 2 dt ... 0 dS n W W n 1 n dt dP Wn dt S S ... S P S 2 n 0 1 (2.79) где Wi Vim S i K im S i (2.80) В стационарном состоянии: Vim S i V S Wi Wn im i K im S i K im S i (2.81) и в условиях бимолекулярного режима (Si << Kim): Vim S i V S Wi Wn nm n K im K nm (2.82) 17 Si Vnm K im Sn K nmVim (2.83) Тогда при малой степени конверсии субстрата в конечный продукт (P << S1+S2+…+Sn): n S0 i 1 V S i S n nm K nm n KV i 1 im (2.84) im K nm S 0 Sn (2.85) n Vnm KV im im i 1 dP Vnm S n dt K nm S0 KV i 1 Выражение (2.86) (2.86) n дает im im теоретический критерий определения лимитирующей стадии: наибольшее (лимитирующее) влияние на общую скорость процесса оказывают ферменты, имеющие наименьший параметр Vim/Kim. 2.9. Кинетика действия ферментов в открытых системах Под открытыми системами понимают системы, в которых происходит обмен компонента с окружающей средой. В принципе, такими системами являются все живые организмы. Кроме того, открытые системы часто используются в технологических процессах в промышленности. Некоторые типы открытых систем: 1) открытая по субстрату и продуктам; 2) открытая по ферменту. Некоторые типы реакторов: 1) проточный реактор идеального перемешивания; 2) проточный реактор идеального вытеснения; 3) мембранный реактор. 2.9.1. Основные принципы описания кинетики каталитических реакцих в открытых по субстрату системах Рассмотрим некоторый элементарный объем, в котором протекает реакция. Скорость изменения концентрации субстрата описывается дифференциальным уравнением: dS dS dS dt dt реакция dt обмен (2.87) Реакционная часть описывается уравнением Михаэлиса: k E S dS WE кат 0 Km S dt реакция (2.88) Обменная часть описывается в общем случае уравнением непрерывности потока компонента: 18 dS div J dt обмен (2.89) Поток J равен J S v D S (2.90) где D – коэффициент диффузии, а v – скорость ламинарного потока. 2.9.2. Реактор идеального вытеснения Рассмотрим одномерный реактор (длинную трубу) идеального вытеснения в пренебрежении диффузией. В стационаре: V S dS dS m v 0 dt Km S dx (2.91) тогда v V S dS m dx K m S (2.91) Решение уравнения (2.91): V S ( x) S 0 exp m x K mv 2.9.3. Реактор идеального перемешивания Для реактора идеального перемешивания диффузией также можно пренебречь. В стационаре: Vm S dS Q dt V S 0 S K S m dP Vm S Q P dt K m S V (2.92) где V – объем реактора, Q – объемный поток в реактор (равный объемному потоку из реактора). Глава 3. Молекулярная рецепция 3.1. Основные понятия Рецепторы – особые химические соединения на поверхности или внутри клеток, посредством которых происходит клеточное распознавание веществ (лигандов) и формирование клеточного ответа. Характеристики рецепторов: локализация (на мембране или внутриклеточно), специфичность взаимодействия, трансдукция сигнала (формирование клеточного ответа). Лиганды – химические вещества, способные реагировать с рецепторами. Взаимодействие лигандов с рецепторами в простейшем случае представляется следующей схемой: k 1 LR LR k (3.1) 1 19 Изменение концентрации лиганд-рецепторных комплексов, согласно схеме (3.1) описывается дифференциальным уравнением: d [ LR] k1 LR k 1[ LR] dt (3.2) Если L >> R: [ LR] L0 R0 1 exp k1 L0 k 1 t k 1 L0 k1 (3.3) Выражение (3.3) называется уравнением сорбции или уравнением (изотермой) Ленгмюра. Используя (3.3), можно определить концентрацию рецепторов по их аффинности (в равновесии), линеаризуя это уравнение в подходящих координатах: K L R0 [ LR] k 1 LR k1 [ LR] [ LR] 1 1 [ LR] R0 [ LR] K K L (3.4) (уравнение Скэтчарда) (3.5) Однако, далеко не все зависимости клеточного ответа от концентрации добавленного лиганда удовлетворительно описываются изотермой ленгмюра. Многочисленные исследования в этой области привели к формированию представлений о механизмах внутриклеточного проведения и усиления рецепторного сигнала. 3.1.1. Химическое строение рецепторов и лигандов Рецепторы – белки, различающиеся разными участками или третичной структурой. Большинство рецепторов – трансмембранные белки. Практически все рецепторы образуют четвертичную структуру с углеводами, гликопротеидами, фосфолипидами мембран. В процессе функционирования рецептора его третичная и четвертичная структуры могут изменяться (изменяться может конформация рецептора, структура и состав молекул, связанных с рецепторами, сами рецепторы, молекулы могут фосфорилировать, дефосфорилировать и т.д.). В зависимости от изменения структуры рецептора изменяется его сродство к лигандам (биологически активным веществам). На рецепторах существуют центры связывания лигандов: COOH-группы дикарбоновых кислот, NH2-группы диаминовых кослот, OH-группы гидроксиаминокислот, SHгруппы цистеина, гидрофобные участки аминокислот и др. Точно так же, как при образовании ферментсубстратного комплекса, в образовании лиганд-рецепторного комплекса участвует несколько активных участков связывающего центра. Однако, рецепторы отличаются большей степенью сродства к лигандам, чем ферменты к субстратам. Лиганды имеют различное химическое строение (белковые, пептидные и др.) 3.1.2. Агонисты и антагонисты Агонисты – лиганды, которые связываясь с рецепторами, активно вызывают биологический ответ клетки (стимулируют клеточные функции). Антагонисты – лиганды, которые не вызывают активного клеточного ответа. Антагонисты препятствуют связыванию агонистов с рецепторами, угнетая клеточные функции. 20 3.1.3. Принцип структурной комплиментарности Чем с меньшим числом различных лигандов может связаться рецептор данного типа, тем выше его специфичность, и наоборот (принцип “ключ-замок”). 3.2. Молекулярные механизмы проведения и усиления рецепторного сигнала Три основных факта: 1) максимальный биологический ответ клетки наблюдался даже тогда, когда лишь незначительная часть рецепторов связана с лигандами; 2) кривая зависимости биологического ответа клетки от концентрации добавленного лиганда во многих случаях имеет сложный колоколообразный вид; 3) различие механизма действия агонистов и антагонистов рецепторов одного типа. 3.2.1. Открытие вторичных мессенджеров Вторичные мессенджеры – внутриклеточные молекулы, осуществляющие сопряжение рецепторов с внутриклеточными эфферентными системами (ферментами, ионными каналами, геномом и т.д.). Первичными мессенджерами раньше называли лиганды, так как многие из лигандов осуществляют сопряжение эндокринных желез с эфферентными клетками. 3.2.2. Классификация рецепторов по их сопряжению со вторичными мессенджерами По сопряжению со вторичными мессенджерами все рецепторы делятсяна: 1) рецепторы-ионные каналы (несколько глобул интегральных белков на мембране, в неактивном состоянии рецептора ионный канал закрыт); 2) рецепторы, сопряженные с ферментами (одна из глобул белка-рецептора обладает каталитической активностью, образование лиганд-рецепторного комплекса приводит к изменению каталитической активности); 3) рецепторы сопряженные с G-белками (рецепторная молекула сопряжена в с внутриклеточной стороны с особым ГТФ-связывающим белком, - G-белком, - через G-белок рецепторы могут менять активность внутриклеточных ферментативных систем и вызывать открытие ионных каналов). 3.2.3. Строение и функционирование G-белок сопряженных рецепторов Все G-сопряженные рецепторы имеют однотипное строение. Они представляют собой белковую молекулу, которая семь раз пронизывает цитоплазматическую мембрану, при этом NH2-конец располагается внеклеточно. Рецептор образует три внутриклеточных и три внеклеточных “петли”. Чаще всего лиганды связывает вторая внеклеточная петля. Оканчивается рецептор гидрофильным COOH-концом (внутри клетки).Третья внутриклеточная петля и COOH-конец осуществляют сопряжение рецептора с G-белком. G-белок состоит из двух субъединиц: и , -субъединица связывает ГТФ, - субъединица осуществляет крепление G-белка к цитоплазматической мембране. -субъединица связывается с COOH концом и третьей петлей рецептора, а - субъединица связывается только с COOH-концом. G-белки представляют собой гетерогенную популяцию белков, отличающихся за счет -субъединицы: 1) Gs-белки (содержат s-субъединицу, стимулируют превращение АТФ в цАМФ, ингибирует Ca2+ каналы); 21 2) Gi-белки (ингибируют превращение АТФ в цАМФ); 3) Go-белки (угнетение потенциал-зависимых Ca2+ каналов, стимуляция калиевых каналов); 4) и др. Схема функционирования G-сопряженного рецептора: Ri L [ RL ]i [ RL ]i [ RL ] a [ RL ] a G [ RL ] a G [ RL ] a G ГТФ [ RL ] a G ГТФ [ RL ] a G ГТФ [ RL ] a G ГТФ G G ГТФ E G ГТФ E аденилатциклаза [G ГТФE ] АТФ цАМФ G ГДФ E P G ГТФ E G ГДФ E G ГДФ E G ГДФ G ГДФ G G ГДФ G ГДФ (3.6) Вначале свободный рецептор не связан с G-белком. После связывания агониста с рецептором происходит активация рецетора. Активированный рецепторможет взаимодействовать с G-белком, лишенным ГТФ. Присоединение ГТФ к связанному G-белку приводит к диссоциации G-белка на и -субъединицы. субъединица, связанная с ГТФ, взаимодействует с аденилатциклазой, которая катализирует превращение АТФ в цАМФ. Данный катализ продолжается до тех пор, пока ГТФ, связанная с -субъединицей, не перейдет в ГДФ за счет собственной ГТФ-азной активности -субъединицы. -субъединица, связанная с ГДФ, диссоциирует из связи с аденилатциклазой. Аденилатциклаза теряет каталитическую активность, а -субъединица взаимодействует с -субъединицей, образуя G-белок. Этот механиз обеспечивает проведение и усиление внутриклеточного сигнала. Один рецептор, находясь в активной фазе, может взаимодействовать с 10-100 G-белками. Одна активная аденилатциклаза способна катализовать образование 10-100 молекул цАМФ. Тем самым рецепторный сигнал усиливается в 100-10000 раз. Так как цАМФ не является конечной мишенью действия (ц-АМФ - вторичный мессенджер, стимулирует гликолиз, ингибирует фосфорилирование белков) рецепторного сигнала, то в процессе передачи его на внутриклеточный рецептор коэффициент усиления будет 10 4-108. 22 Рис. 3.1. Схема основных механизмов молекулярного проведения и усиления сигнала от G-сопряженного рецептора. 3.2.4. Механизмы внутриклеточного проведения и усиления рецепторного сигнала Механизмы внутриклеточного проведения и усиления рецепторного сигнала представляют собой совокупность каскадных реакций: L R E E S P E1 E1 P1 E 2 S1 E2 E3 S 2 P2 ... (3.7) Показано, что существующие в клетке ферментативные системы усиления сигнала теоретически позволяют достигать величин усиления 1012-1040. Однако внутри одной клетки запасы субстратов ограничены, поэтому реальная концентрация вторичных мессенджеровне превышает 10 -2M. Если учесть, что концентрация лигандрецепторных комплексовобычно составляет 10-12-10-9 М, то внутри клеток рецепторный сигнал увеличивается в среднем в 107-1010 раз. 23 3.2.5. Инактивация рецепторного сигнала Инактивация клеточного ответа на рецепторный сигнал обеспечивает его высокую специфичность и позволяет адаптировать клетку к изменяющимся внешним воздействиям. Классификация кинетических механизмов инактивации клеточного ответа: I. Механизмы, приводящие к уменьшению концентрации лиганд-рецепторных комплексов. а) Диссоциация лиганд-рецепторных комплексов (например за счет уменьшения концентрации лигандов в растворе вследствии разрушения лиганда ферментами). б) Повышение константы скорости диссоциации лиганд-рецепторного комплекса (активация рецептора). в) Изменение концентрации свободных или связанных рецепторов на мембране (эндоцитоз и экзоцитоз). II. Механизмы инактивации сопряжения лиган-рецепторного комплеска с ферментами. а) Самоинактивация -субъединицы G-белка (ГТФ-азная активность -субъединицы). б) Десенситизация ферментной системы (процессы фосфорилирования-дефосфорилирования, метилирования-деметилирования рецептора, G-белков, ферментов и т.д.). III. Инактивация фермента, синтезирующего ключевые регуляторы клеточного ответа. Например, инактивация вторичным мессенджером – арахидоновой кислотой – ферментов синтеза эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, липоксинов и т.д.) IV. Взаимодействие лиганда с различными типами рецепторов: L R1 стимулирование клеточного ответа, L R2 ингибирование клеточного ответа, L R3 не влияет на клеточный ответ. 3.3. Дискриминация моделей и определение параметров рецепторного связывания 1) Использование ингибиторов рецепторов (конкурентные антагонисты). 2) Ингибирование мембранного транспорта (разрушение клеток). 3) Уменьшение мембранного транспорта пептидных фрагментов. 4) Уменьшение эндоцитоза (мембранные стабилизаторы). 5) Увеличение проницаемости мембран (пермиолизаторы). 6) Использование димеров лигандов (димеры труднее диффундируют). 7) Использование ингибиторов макроэргов (уменьшение скорости энергозависимых процессов транспорта и деградации ферментов). 8) Ингибирование ферментов (уменьшение скорости деградации лигандов). 9) Добавление ионов металлов (меняют аффинность рецепторов). 10) Изменение pH, ионной силы, температуры (влияет на транспорт, деградацию, связывание и пр.). 3.3.1. Диффузия рецепторов Внутриклеточные рецепторы – трехмерная диффузия. Поверхностные рецепторы – двухмерная диффузия (по поверхности мембраны). 24 3.3.2. Связываение нескольких молекул лиганда с одним рецептором Если сродство меняется – кооперативное связывание: R L RL RL L RL 2 (3.8) ... Если сродство возрастает положительная - кооперативность, если убывает - отрицательная кооперативность. При сильно выраженной положительной кооперативности лиганд рецепторное взаимодействие описывается схемой K nL R Ln R (3.9) При условии избытка концентрации лиганда схему (3.9) описывает следующее дифференциальное уравнение: d [ Ln R] k1 Ln R0 [ Ln R] k 1[ Ln R] dt (3.10) Решение данного уравнения: [ Ln R ] 1 exp k L K Ln R0 n L n 1 k 1 t (3.11) Анализ кинетических кривых проводят в соответствующих координатах: 1) Координаты Хилла. log Ln R n log L log K R0 Ln R (3.12) Ln R log ; log L R0 Ln R Тангенс угла наклона () связан со степенью коопретивности: > 1 положительная кооперативность, < 1 отрицательная коперативность, = 1 отсутствие кооперативности. 2) Координаты Бьеррума. log L log K log 1 y y (3.13) y ; log L log y ; log L где y – степень насыщения: y [ LR ] L R0 KL (3.14) Число перегибов равно числу типов мест связывания. Абцисса точки перегиба равна логарифму константы диссоциации. 25 3.4. Взаимодействие нескольких лигандов с одним рецептором L1 R L1 R (3.15) L2 R L2 R Различают следующие виды взаимодействия: 1) Конкуренция за места связывания. а) неконкурентное (разные места связывания); б) конкурентное (одно место связывания); в) бесконкурентное (лиганд L2 связывается с L1R комплексом). 2) Изменение аффинности рецепторов. а) без изменения аффинности (L1R и R имеют одинаковую аффинность к L2); б) с изменением аффинности. 3) Наличие взаимодействия между лигандами. а) без взаимодействия L1 и L2; б) с взаимодействием. 3.5. Учет функции распределения клеток по количеству рецепторов на мембране Эксперименты по исследованию лиганд-рецепторных взаимодействий обычно проводят на большом количестве клеток (на ансамбле). При этом даже для однородной популяции клеток существует распределение их параметров по ансамблю. Например, разные клетки имеют разное количество рецепторов и т.д. Распределение клеток по количеству рецепторов проявляется в динамике изменения со временем функции распределения клеток по количеству образовавшихся лиганд-рецепторных комплексов (которые и регистрируются в эксперименте). Кинетику данного процесса при некоторых предположениях можно описать следующим образом. Если A – молекула лиганда, а C(x,y) – клетка, имеющая x свободных рецепторов (свободных посадочных мест) и y лиганд-рецепторных комплексов (занятых посадочных мест), причем N – полное количество рецепторов на клетке (N = x + y), то реакционная схема для данной клетки включает N последовательных стадий: ,y 1 x A C x,y k C x 1,y 1 k 2 x 1, y 1 k1 x 1, y 1 A C x 1,y 1 C x 2 ,y 2 k 2 x 2, y 2 ... k1 1, N 1 A C 1,N 1 C 0 ,N k 2 0 , N (3.16) Система дифференциальных уравнений, описывающая изменение концентрации клеток C(x,y,t) со временем в соответствии со схемой (3.16) выглядит так: 26 dС ( x, y, t ) k1 ( x 1, y 1) A(t )С ( x 1, y 1, t ) k1 ( x, y ) A(t )С ( x, y, t ) dt k 2 ( x, y )С ( x, y, t ) k 2 ( x 1, y 1)С ( x 1, y 1, t ) ... dA(t ) k1 ( x, y) A(t ) k 2 ( x, y) С ( x, y, t ) dt x y (3.17) Здесь предполагается, что нет процессов поглощения и обновления рецепторов на поверхности клетки (полное число рецепторов на клетке остается неизменным). Число уравнений в (3.17) равно числу рецепторов на клетке, и это число может быть достаточно большим (10 3 - 106). Поэтому удобно воспользоваться приближением – считать, что функция распределения клеток по количеству рецепторов C(x,y,t) – непрерывная функция от своих непрерывных переменных x и y, и написать дифференциальное уравнение для этой функции, заменив конечные разности в (3.17) дифференцированием, а суммы – интегрированием. Тогда система многих уравнений (3.17) перейдет в систему только двух уравнений: C ( x, y, t ) A(t ) k1 ( x, y )C ( x, y, t ) k 2 ( x, y )C ( x, y, t ) t x y x y dA(t ) dt k ( x, y) A(t) k ( x, y) C( x, y, t)dxdy 1 2 (3.18) (3.19) x y Предположим, что константа скорости прямой реакции пропорциональна количеству свободных рецепторов k1 ( x, y ) xk f (3.20) а константа обратной реакции пропорциональна количеству лиганд-рецепторных комплексов на клетке: k 2 ( x, y) ykb (3.21) Тогда решение системы уравнений (3.18) и (3.19): A A k t A1 A2 e 2 1 f A(t ) A A1 A2 A1 k f t 1 0 e A0 A2 (3.22) C ( x, y, t ) C ( x (t ), y (t ),0) (3.23) где t x (t ) xf (t ) ( x y )k b f (s)ds (3.24) f ( s)ds xf (t ) (3.25) 0 y (t ) ( x y )1 k b t 0 27 t f (t ) exp k f A( s) k b ds 0 (3.26) A1 и A2 – корни уравнения (A1>A2): kb kb A 2 A I 0 A0 A 0 k f k f 0 (3.27) A0 – начальная концентрация молекул лиганда, I0 – полное количество свободных рецепторов на всех клетках в единице объема в начале реакции (при t = 0): I0 xC( x, y,0)dxdy (3.28) 0 0 В эксперименте обычно измеряется функция распределения клеток по занятым рецепторам (лиганд- ~ рецепторным комплексам) C ( y , t ) : ~ C ( y, t ) C ( x, y, t)dx (3.29) 0 Если в начальный момент времени все рецепторы на клетках были свободны: 0, если y 0 C ( x, y,0) C0 ( x), если y 0 (3.30) то y (t ) ~ C ( y, t ) C0 ( y (t )) y (3.31) где y (t ) y z (t ) 1 f (t ) (3.32) t z (t ) 1 k f f (s)ds (3.33) 0 Выражение (3.31) описывает динамику изменения функции распределения клеток по лиганд-рецепторным комплексам. Интересно отметить, что эта функция хотя и изменяется со временем, но остается самоподобной. 3.6. Феномен колебаний рецепторного связывания Феномен колебаний рецепторного связывания – принципиально новое явление, описанное в 1991 г., заключающийся в том, что концентрация лиганд-рецепторных комплексов с течением времени на выходит на плато, а подвергается незатухающим или слабо затухающим колебаниям. Описаны: периодические колебания (период порядка 10 минут) и апериодические колебания. Для описания колебаний была предложена следующая модель: 28 K1 RL R L KX RX R X (3.34) Где изменение концентрации модулятора X представляется так: X B X 0 sin wt (3.35) Открытым остается вопрос о природе модулятора. Согласно одному из предположений, возможным источником колебаний может быть соотношение ГТФ.ГДФ, возникающее при гликолитических колебаниях. Глава 4. Клеточный рост 4.1. Клеточный цикл М - фаза (митоз) деление клетки G1 - фаза S - фаза синтез и удвоение ДНК G2 - фаза Длительность цикла: ~1 час (эмбриональные и микробные клетки), ~10 лет (гепатоциты, нейроны). Культивирование клеток -> изучение клеточного цикла in vitro (культуры, линии клеток). Фазы роста: 1) индукционный (лаг-фаза) – адаптация клеток к среде, перестройка их метаболизма; 2) экспоненциальный рост (много митозов); 3) линейный рост (мало митозов); 4) замедление роста; 5) стационарная фаза; 6) отмирание культуры. Причины замедления роста – истощение субстрата, накопление токсических продуктов и др. 4.2. Экспоненциальная фаза роста dN N dt (4.1) Предположим, что скорость роста клеточной культуры лимитируется одним субстратом S: KS NS N S m NS 2 N P (4.2) 29 где KS – константа сродства субстрата к клеткам. Будем считать, что равновесие по комплексам [NS] устанавливается намного быстрее, чем идет митоз (m). Тогда квазистационарная концентрация клеток Nс равна N c [ NS ] N NS N KS (4.3) и концентрация комплексов [NS]: [ NS ] Nc S NS KS KS S (4.4) Следовательно, рост клеточной культуры: dN с N S m [ NS ] m c dt KS S (4.5) Удельная скорость роста mS KS S (уравнение Моно) (4.6) Типичные значения: m ~ 10-2 ÷ 10-5 c-1, KS ~ 10-2 ÷ 10-8 M. Решение уравнения (4.5): N с N с0 e t (4.7) 4.2.1. Многосубстратные процессы Пример (M. thermoautotrophicum): 4H 2 CO2 CH 4 2H 2O (два субстрата) (4.8) Два возможных механизма: 1) тройной комплекс K1 S1 N S1 N K2 S1 S 2 N S1 N S 2 митоз 2 N P S1 S 2 N (4.9) m (4.10) K K K 1 2 1 2 S2 S1S 2 2) пинг-понг K1 S1 N S1 N S1 N X P K2 S2 X S 2 X митоз S 2 X 2 N P (4.11) m K K 1 1 2 S1 S 2 (4.12) 30 4.2.2. Ингибирование и активация клеточного роста Классификация ингибирования и активации: 1) По “мишени”: а) ингибиторы, действующие на ДНК (налидиксоновая кислота), б) ингибиторы, действующие на РНК (актиномицин), в) ингибиторы синтеза белка (хлорамфеникол, эритромицин, тетрациклин), г) ингибиторы синтеза клеточной стенки (пенициллин), д) мембраноактивные вещества (толуол, хлороформ), е) ингибиторы энергетических процессов (2,4 - динитрофенол), ж) ингибиторы лимитирующего фермента. 2) По кинетике действия: а) необратимые, б) обратимые. Следует отметить, что для кинетики роста клеток также характерно ингибирование избытком субстрата и продуктом. По аналогии с ферментативной кинетикой, общую схему действий эффектора R на процесс роста биомассы с лимитирующим субстратом можно записать следующим образом: KS N S NS m NS 2N P KR N R NR K S RNS NR S K R RNS NS R m 2 RN P RNS (4.9) Из (4.9) следует, что NRS [ NR]S [ NS ]R NSR [ NRS ] K S K R K S K R K R K S (4.10) и, следовательно, (4.11) Квазистационарная концентрация клеток Nс равна: N c N [ NS ] [ NR] [ NRS ] N NS NR N RS NS NR [ NR]S N KS KR K S KS K R K S K R (4.12) откуда N Nc S R RS 1 K S K R K S K R (4.13) Рост клеточной культуры: dN c N RS NS m [ NS ] m [ RNS ] m m dt KS K S K R Подставляя (4.13) в (4.14), получаем: 31 (4.14) R S N c m 1 K R dN c R RS dt KS S K R K R (4.15) и для удельной скорости роста: R S m 1 K R R RS KS S K R K R (4.16) 4.2.3. Влияние pH Многие клеточные культуры растут в достаточно узком диапазоне pH. Влияние pH: 1) на субстрат (напр, аминокислоты); 2) на ферменты клетки. Кинетика переноса ионов водорода через мембрану клетки: dH in H ex H in dt (4.17) В условиях равновесия: H ex H in (4.18) 4.3. Замедление скорости роста 4.3.1. Лимитирование по субстрату YS dS dN N dt dt S S0 (линейная связь) N N0 YS (4.19) (4.20) Тогда dN dt m N KS 1 N N0 S0 YS (4.21) Решение: YS K S N YS K S Y S N0 N 1 ln ln S 0 mt YS S 0 YS S 0 N 0 N 0 YS S 0 N 0 (4.22) Уравнение (4.22) называют интегральным уравнением Моно. Предел роста: N t YS S 0 N m (4.23) 32 4.3.2. Ингибирование избытком субстрата KS S N X Ki XS X S m X 2 N N c N X XS N N (4.24) SN XS SN SNS N K S Ki K S Ki K S (4.25) Nc (4.26) S S2 1 KS Ki K S dN c SN m X m dt KS m SN c (4.27) S2 KS S Ki 4.3.3. Ингибирование субстратом в условиях истощения по субстрату m SN dN dt S2 KS S Ki N N0 S S 0 YS (4.27) Решение: K S S0 N K S N N 0 1 1 ln N N 0 m t ln 1 S0 Ki N S0 N m K i YS 4.3.4. Ингибирование продуктами KS S N X m 2N P X Ki N P NP N c N X [ NP] N YP (4.28) SN NP K S Ki (4.29) dP dN c dt dt (4.30) YP P P0 N c N c0 (4.31) 33 dN c SN m X m dt KS m SN c K N N c0 K S S S P0 c Ki YP (4.32) Уравнение (4.32) преобразуется к виду YP K i K S S YP K S P0 K S N c0 KS dN c m dt Y K SN Y K S P i c P i (4.33) Решение: YP P0 N c0 K S 1 YP K i K S S Nc KS S ln N c N c 0 m t KS S N c0 YP K i K S S (4.34) 4.3.5. Период индукции 1) Трансформация предсубстрата в субстрат. k 0 S S (4.35) dS k0 S dt (4.36) S S0 1 e k0t (4.37) Решение: ln t 1 a N a m m ln N0 a k0 a a 1 (4.38) где a 1 KS S0 (4.39) m a (4.40) Период индукции: s KS S ln 1 0 S0 k0 K S (4.41) 2) Адаптация. k 0 N N 2 N (4.42) M NN (4.43) dN dt k 0 N dN k N N 0 dt (4.44) 34 N N 0 e k0t M (4.45) k 0 N 0 t N 0 k0t e e k0 k0 (4.46) Период индукции: a 1 m ln 1 m k0 (4.47) 3) Расход ингибитора роста. k 0 I N NI (4.48) dI k 0 I dt (4.49) I I 0 e k0t (4.50) Дифференциальное уравнение для скорости роста культуры: I dN N 1 0 e k0t dt Ki (4.51) Период индукции: i I0 K i k0 (4.52) 4.4. Старение клеток и апоптоз Апоптоз – совокупность процессов “программируемого” старения и гибели клеток. Некроз – гибель клеток за счет случайных событий или под действием внешних токсинов. 1961 г., Л. Хейфлик: предел клеточного деления для фибробластов человека (50 делений). Бактериальные клетки и клетки одноклеточных организмов могут делиться бесконечно; клетки многоклеточных организмов имеют предел деления (существует максимальное количество делений). Концепция “программируемого” старения: ДНК полимераза не способна реплицировать “хвосты” 3’ конца матрицы ДНК (несколько нуклеотидов на 3’ конце). Для предотвращения укорачивания ДНК фермент теломераза синтезирует на концах ядерной ДНК многократно повторяемый гексануклеотид TTAGGG (теломера). Таким образом, для преодоления укорачивания генома и старения клетка должна активировать теромеразный ген и экспрессировать большое количество теломеразы. 4.4.1. Выражение для удельной скорости клеточного роста в экспоненциальной фазе E R ДНК S S S P (4.53) Предположения: - скорость синтеза ДНК пропорциональна концентрации S’ и характеризуется константой скорости R; - скорость биосинтеза лимитирующего фермента и белков репликационного комплекса намного выше скорости синтеза ДНК, так что можно считать E=const. 35 Тогда: d dt ДНК R S dS k ES кат R S dt KS S (4.54) В квазистационаре: dS 0 dt (4.55) следовательно 1 k кат ES R KS S S (4.56) Квазистационарная концентрация синтезируемой ДНК: [ ДНК ](t ) R k кат ES t R KS S (4.57) Репликационный процесс заканчивается, когда количество синтезируемой ДНК равно базовому количеству ДНК: B R k кат ES R R KS S (4.58) Отсюда находим время репликации: R R K S S B (4.59) R kкат ES И удельная скорость роста клеточной культуры в экспоненциальной фазе: ln 2 R (4.60) 4.4.2. Многостадийность клеточного цикла Время удвоения равно R a (4.61) где R – время репликации, a – время нахождения в других фазах клеточного цикла. Тогда R K S S B R k кат ES a (4.62) Выражение (4.62) соответствует уравнению Моно m S (4.63) K S набл S где: m k кат E ln 2 (4.64) 1 B a k кат E R 36 K S набл KS k E 1 a кат R R B (4.65) Для микробов: a R B R k кат E R (4.66) Для многоклеточных организмов: a R (4.67) ln 2 a (4.68) m K S набл K S B R a k кат E R (4.69) 4.4.3. Старение клетки в процессе роста Старение – инактивация ключевых ферментативных систем: - репликационного комплекса, - лимитирующего фермента. E R ( ER ) S S ДНК Ei E E Ri E R (4.70) d dt [ ДНК ] R (t ) S dS kкат E (t ) S (t ) S R dt KS S R (t ) R (0)e t E (t ) E0e t (4.71) В квазистационаре (dS’/dt = 0): S k кат E (t ) S K S S R (t ) (4.72) d k E S [ ДНК ] кат 0 et K S S dt v0 kкат E0 S KS S [ ДНК ](t ) B (4.73) v0 (4.74) (1 e t ) (4.75) v0 (1 e R ) (4.76) 37 1 B R ln 1 v0 (4.77) ln 2 ln 2 R B ln 1 v0 (4.78) При старении клеток в процессе роста существует пороговая минимальная концентрация субстрата, ниже которой клеточный рост невозможен: S кр KS k кат E 1 B (4.79) 4.4.4. Кинетические модели апоптоза Появление в популяции клеток, потерявших способность к размножению. Две модели: 1) Прогрессирующая некомпетентность. dN a dt a (t ) N a N a dN i N a dt (4.80) где Na – способные к делению клетки. N N a Ni (4.81) dN a N a dt (4.82) Возможна ситуация: dN a 0 dt (максимальное количество некомпетентных клеток) (4.83) Если a дается уравнением Моно, то N (tm ) N 0 m S0 YS N (tm ) N 0 K S S0 YS (4.84) где tm – время достижения максимума по Na. K S N (t m ) N 0 YS S 0 m S (t m ) (4.85) K S m (4.86) а) Начальный период: a m,a (4.87) 38 N a N a 0 exp m,a t (4.88) N a 0 exp m,a t m,a Ni N m ,a N a 0 m,a (4.88) (4.89) exp m,a t б) Режим истощения субстрата (на больших временах): N a N a ,m exp t (4.90) 1) Запрограммируемый отказ. В ряде случаев остановка роста связана с потерей чувствительности клеток к ростовым факторам среды (т.е. уменьшением числа рецепторов на клетке). Кинетика изменения числа рецепторов R на клеточной мембране можно описать уравнением R(t ) A e t e t (4.91) Предположим, что скорость деления клеток пропорциональна числу рецепторов на мембране: 0 R (4.92) Тогда: dN a 0 R(t ) N a dt Na (4.93) t N a 0 exp 0 R(t )dt 0 (4.94) Если >>: N a N a 0 exp A 0 1 exp t (4.95) 4.5. Модель “хищник-жертва” dN1 dt aN1 N1 N 2 dN 2 N N N 1 2 2 dt (4.96) где N1 – популяция жертвы, N2 – популяция хищника. 1) Существует стационарное состояние: dN1 dt 0 , dN 2 0 dt N ст1 a N ст 2 (4.97) 39 2) Фазовый портрет (связь между N1 и N2). n1 N1 N2 , n2 N ст1 N ст 2 (4.98) dn1 dt a1 n2 n1 dn2 1 n n 1 2 dt (4.99) dn2 1 n1 n2 dn1 a1 n2 n1 (4.100) 1 n2 1 n1 dn2 dn1 n2 an1 (4.101) a n1 n2 n n const C e 1 e 2 (4.102) Такой фазовый портрет соответствует колебательной траектории. 3) Средняя численность популяции равна стационарной численности. T dn1 a1 n2 dt n1 (4.103) 0 T 0 ln n1 (t ) 0 aT aT n2 (4.104) n2 1 (4.105) аналогично: n1 1 (4.106) 4.6. Ассоциации микроорганизмов Типы взаимодействий – от симбиоза до антагонизма. Пример: ассоциация двух микроорганизмов M1 и M2. M M 1 2 S1 S 2 P (4.107) dM 1 1 S1 M 1 dt K1 S1 dM 2 2 S 2 M 2 dt K2 S2 1 dM 1 dS1 YS1 dt dt dS 1 dM 2 1 dM 1 2 YS2 dt YP1 dt dt dP 1 dM 2 dt YP dt 2 (4.108) 40 Глава 5. Мембранный транспорт Мембраны: клеточные, внутриклеточные (ядро, митохондрии, лизосомы). Мембранные поры: диаметр 8÷14 А, длина (толщина мембраны) ~160 А. Строение мембраны: липиды и белки, билипидный слой (гидрофобная часть внутри мембраны). У мембраны есть разность электрических потенциалов внутренней и внешней поверхности (сказывается на транспорте ионов). Виды мембранного транспорта: - пассивная диффузия (по градиенту химического или электрохимического потенциала), - облегченная диффузия (обратимое взаимодействие с переносчиком), - активный транспорт (против градиента), - транслокация групп (изменение вещества при транспорте, переносчик-фермент). 5.1. Пассивный транспорт Общие уравнения: Сi divJ i 0 t Fz J i Di Ci i Di Ci RT (5.1) (5.2) где F – число Фарадея, zi – заряд (целое число, в единицах электронов) i-го иона, - потенциал электрического поля в мембране: F z C i (5.3) i i В одномерном случае для заряженной молекулы в мембране: J D dC Fz d DC dx RT dx (5.4) В простейшем приближении электрическое поле внутри мембраны линейно: d dx x (5.5) тогда J D dC Fz DC dx RT x (5.6) Интегрируя это уравнение методом разделения переменных, получаем: x x 0 Ce dx Ci D dC Fz J DC RT x (5.7) и выражение для плотности потока J: 41 zF FzD C e Ci e RT J zF RT x 1 e RT (5.8) Коэффициент проницаемости мембраны p: p D uRT x x (5.9) где u – подвижность молекулы внутри мембраны. Если молекулы не заряжена (z = 0), то плотность потока пропорциональна разности концентраций этих молекул снаружи (Ce) и внутри (Ci) клетки (как и следовало ожидать): J pCe Ci (5.10) В случае равновесия (J = 0) из уравнения (5.8) следует уравнение Нерста: C e Ci e zF RT (5.11) Если в среде присутствуют положительные (например, H+) и отрицательные (например, Cl-) ионы, по которым установилось равновесие в результате пассивного транспорта (и для которых скорость пассивного транспорта намного выше скорости других видов транспорта), то из уравнения Нерста (5.11) следует следующее выражение (Доннаново равновесие): H i H e Cle (5.12) Cli 5.2. Активный ионный транспорт В качестве примера активного ионного транспорта рассмотрим модель K+-Na+ насоса. Согласно этой модели, белок E, который обеспечивает перенос этих ионов через мембрану, имеет два типа центров связывания, которые способны присоединять и обменивать K+ и Na+. Учитывая кооперативный эффект (несколько мест связывания работают одновременно) и наличие пассивной диффузии, эта модель приводит к следующей реакционной схеме: 42 k1 Nai Ei K АТФ Ei Na Ф АДФ K i (на внутр. пов. мембр.) k1 k2 K e Ee Na Ф E K Ф Nae (на внешн. пов. мембр.) e k 2 k3 E K (переворот молекулы белка ) Ei K e k3 k3 Ee Na Ф (переворот молекулы белка ) Ei Na Ф k3 J Na Nae (пассивный транспорт Na) Nai JK K e (пассивный транспорт K ) K i (5.13) Реакционной схеме (5.13) соответствует система дифференциальных уравнений, решение которых достаточно хорошо согласуется с экспериментальными данными по K+-Na+ насосу. Нужно отметить, что, несмотря на высокую селективность ионных каналов к определенному типу ионов, эта селективность не абсолютна. Например, отношение проницаемостей натриевого канала к разным ионам: p Li p Na 0.93 , p NH 4 p Na 0.16 , pK p Na 0.09 , а для калиевого канала: pTl pK 2.3 , p NH 4 pK 0.13 , p Na pK 0.01 . Глава 6. Эндоцитоз Модельную схему можно представить в следующем виде (рис. 6.1): 43 Рис. 6.1. Схема эндоцитоза. 1) Реакционная схема пиноцитоза, соответствующая рис. 6.1 выглядит так: Ae Ai Ai L1 L2 L3 L2 Le L3 L1 АГ (5.14) где Ae – молекулы пиноцитируемого вещества во внешней среде, Ai - молекулы пиноцитируемого вещества внутри пиноцитозной вакуоли внутри клетки, L1 – первичная лизосома, L2 – вторичная лизосома, L3 – остаточное тельце внутри клетки, Le – выброшенное из клетки остаточное тельце посредством экзоцитоза, АГ – аппарат Гольджи 2) Реакционная схема фагоцитоза отличается от пиноцитоза на начальном участке (реакция лигандрецептор на поверхности клетки): Ae R AR e AR e AR i AR i L1 L2 L2 L3 Le L3 L1 АГ (5.15) 44