Определение активности ферментов наиболее
реклама
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ, МОЛОДЕЖИ И СПОРТА УКРАИНЫ Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ для выполнения экспериментальных исследований по большому специальному практикуму часть 2 «ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ОКСИДОРЕДУКТАЗ» для студентов биологического факультета Одесса 2012 Печатается по решению Ученого Совета биологического факультета ОНУ им. И.И. Мечникова (протокол № от 2011 г.) Практикум позволяет студентам овладеть и приобрести навыки самостоятельной работы с литературой и методами выделения, определения активности верментов в биологическом материале в норме, при экспериментальных патологиях, а также коррекции биологически активными соединениями (витаминами, витаминными смесями, гормонами и т.д.), которые могут быть использованы для выполнения курсовых и дипломных работ, а также для работы по избранной специальности. В учебное пособие введены контрольные вопросы и задания по программе «Большого специального практикума» для национальных университетов, что позволяет студентам глубоко усвоить теоретический материал. Пособие может быть использовано студентами других обучающих учреждений, которые готовят специалистов по биологии, а также студентами медицинских вузов Украины. Методические указания составлены доц. Федорко Н.Л., доц. Захариевой З.Е., доц. Вовчук И.Л., доц. Будняком А.К., доц. Чернадчук С.С., проф. Петровым С.А., доц. Запорожченко А.В., доц. Сорокиным А.В., ст. преп. Кокошкиной О.О. на основании учебного плана специальности, обобщая учебную и научную литературу. Утверждено на заседании кафедры биохимии (протокол № от 2011г.) Зав. кафедрой доц. Запорожченко А.В. Ученый секретарь доц. Федорко Н.Л. Рецензенты: доктор биологических наук, профессор Карпов Л.М. доктор биологических наук, профессор Стойловский В.П. 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 5 КРАТКАЯ ИНСТРУКЦИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ 7 Раздел 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ КЛАССА ОКСИДОРЕДУКТАЗ И НЕКОТОРЫХ ЕГО ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ 8 1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 9 И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ Лабораторная работа № 1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 1.2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ И МЕХАНИЗМЫ 12 РЕГУЛЯЦИИ Лабораторная работа № 2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ 1.3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И МЕХАНИЗМЫ 13 14 РЕГУЛЯЦИИ 15 Лабораторная работа № 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 16 Раздел 2. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ МУЛЬТИЭНЗИМНЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ 2ОКСОКИСЛОТ 18 Лабораторная работа № 4 ПОЛУЧЕНИЕ ТКАНЕВЫХ ГОМОГЕНАТОВ ОРГАНОВ ИНТАКТНЫХ КРЫС 25 Лабораторная работа № 5 ВЫДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ФРАКЦИИ МИТОХОНДРИЙ 25 Лабораторная работа № 6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ОКИСЛЕНИЯ ПИРУВАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА И 2-ОКСОГЛУТАРАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА В ГОМОГЕНАТАХ И МИТОХОНДРИЯХ ТКАНЕЙ ОРГАНОВ КРЫС ФЕРРИЦИАНИДНЫМ МЕТОДОМ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В ГОМОГЕНАТАХ И МИТОХОНДРИЯХ 26 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА МУЛЬТИЭНЗИМНЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ 2-ОКСОКИСЛОТ (по РОШЕ И КЕЙТ) 27 Лабораторная работа № 7 ВЫДЕЛЕНИЕ И ПОЭТАПНАЯ КОМПЛЕКСОВ: ПДК И 2-ОГДК 27 ОЧИСТКА 3 МУЛЬТИЭНЗИМНЫХ Лабораторная работа № 8 РАЗДЕЛЕНИЕ ДЕГИДРОГЕНАЗ 2-ОКСОКИСЛОТ И ИХ ОЧИСТКА 29 Лабораторная работа № 9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕНЫХ И ОЧИЩЕННЫХ МУЛЬТИЭНЗИМНЫХ КОМПЛЕКСОВ: ПДК И 2-ОГДК. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ПО ЛОУРИ, РАСЧЕТ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ 30 Лабораторная работа № 10 КОФЕРМЕНТНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ in vitro 31 ОЧИЩЕННЫХ КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 32 ЛИТЕРАТУРА 34 ПРИЛОЖЕНИЕ 36 4 ВВЕДЕНИЕ Живой организм и его функционирование находятся в постоянной зависимости от окружающей среды. Интенсивность обмена с внешней средой и скорость внутриклеточных процессов обмена веществ поддерживают постоянство внутренней среды и целостность организма. Обмен веществ в организме человека протекает не хаотично, а интегрирован и тонко настроен. Все превращения органических веществ, процессы анаболизма и катаболизма тесно связаны друг с другом. В частности, процессы синтеза и распада взаимосвязаны, координированы и регулируются нейрогормональными механизмами, придающими химическим процессам нужное направление. В организме человека, как и в живой природе вообще, не существует самостоятельного обмена белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Все превращения объединены в целостный процесс метаболизма, подчиняющийся диалектическим закономерностям взаимозависимости и взаимообусловленности, допускающий также взаимопревращения между отдельными классами органических веществ. Подобные взаимопревращения диктуются физиологическими потребностями организма, а также целесообразностью замены одних классов органических веществ другими в условиях блокирования какого-либо процесса при патологии. Еще Кребс и Корнберг отмечали, что, несмотря на огромное разнообразие пищевых веществ (белки, жиры, углеводы), число химических реакций, обеспечивающих их превращения (распад) и образование энергии, «удивительно мало». Эти закономерности свойственны как организму животных и человека, так и микроорганизмам и растениям. В настоящее время экспериментально обосновано существование четырех главных этапов распада молекул углеводов, белков и жиров, которые интегрируют образование энергии из основных пищевых источников. На I этапе полисахариды расщепляются до моносахаридов (обычно гексоз); жиры распадаются на глицерин и высшие жирные кислоты, а белки – на составляющие их свободные аминокислоты. Следует подчеркнуть, что указанные процессы в основном являются гидролитическими, поэтому освобождающаяся в небольшом количестве энергия почти целиком используется организмами в качестве тепла. На II этапе мономерные молекулы (гексозы, глицерин, жирные кислоты и аминокислоты) подвергаются дальнейшему распаду, в процессе которого образуются богатые энергией фосфатные соединения и ацетил-КоА. В частности, при гликолизе гексозы расщепляются до пировиноградной кислоты и далее до ацетил-КоА. Этот процесс сопровождается образованием ограниченного числа богатых энергией фосфатных связей путем субстратного фосфорилирования. На этом этапе высшие жирные кислоты аналогично распадаются до ацетил-КоА, в то время как глицерин окисляется по гликолитическому пути до пировиноградной кислоты и далее до ацетил-КоА. Для аминокислот ситуация на II этапе несколько отлична. При преимущественном использовании аминокислот в качестве источника энергии (при дефиците углеводов или при сахарном диабете) некоторые из них непосредственно превращаются в метаболиты лимоннокислого цикла (глутамат, аспартат), другие - опосредованно через глутамат (пролин, гистидин. аргинин), третьи - в пируват и далее в ацетил-КоА (аланин, серии, глицин, цистеин). Наконец, ряд аминокислот, в частности лейцин, изолейцин, расщепляется до ацетил-КоА, а из фенилаланина и тирозина, помимо ацетил-КоА, образуется оксалоацетат через фумаровую кислоту. Как видно, II этап можно назвать этапом образования ацетил-КоА, являющегося по существу единым (общим) промежуточным продуктом катаболизма основных пищевых веществ в клетках. На III этапе ацетил-К0А (и некоторые другие метаболиты, например αкетоглутарат, оксалоацетат) подвергаются окислению («сгоранию») в цикле ди- и 5 трикарбоновых кислот Кребса. Окисление сопровождается образованием + восстановленных форм НАДН + Н и ФАДН2. На IV этапе осуществляется перенос электронов от восстановленных нуклеотидов на кислород (через дыхательную цепь). Он сопровождается образованием конечного продукта - молекулы воды. Этот транспорт электронов сопряжен с синтезом АТФ в процессе окислительного фосфорилирования. В последние годы накоплено немало экспериментальных данных, свидетельствующих о существовании в живых организмах множества регулирующих механизмов, осуществляющих метаболический контроль и обеспечивающих как взаимопревращения белков, липидов и углеводов, так и интеграцию энергии. Не отрицая значение других типов регуляции метаболизма, следует подчеркнуть, что движущей силой во взаимопревращениях веществ и интенсивности метаболизма, вероятнее всего, является энергетическое состояние клетки, в частности уровень АТФ (точнее, отношение АМФ/АТФ). Так, при низких концентрациях АМФ и высоких концентрациях АТФ (состояние, которое принято обозначать «энергонасыщенностью») в клетках происходит резкое снижение гликолитического распада глюкозы, обусловленное действием этих нуклеотидов на ключевой фермент гликолиза - фосфофруктокиназу и на фосфатазу фруктозо-6-фосфата. В результате в клетках накапливается не только фруктозо-6-фосфат, но и его предшественник - глюкозо-6-фосфат. Последний, являясь положительным модулятором фермента гликогенсинтазы, стимулирует синтез полисахарида — гликогена. При низких концентрациях АТФ (соответственно при высоком уровне АМФ) в клетках отмечаются стимулирование гликолиза и окисление пирувата в лимоннокислом цикле, что способствует обеспечению клеток энергией. Однако при низких концентрациях АМФ имеет место снижение скорости цикла трикарбоновых кислот, обусловленное торможением активности изоцитратдегидрогеназы, соответственно наблюдается снижение скорости синтеза АТФ и накопление изолимонной кислоты. Последняя, как известно, повышает активность другого фермента — ацетил-КоА-карбоксилазы, которая в свою очередь катализирует I стадию превращения ацетил-КоА в жирную кислоту. Благодаря этим обстоятельствам клетка переводит образовавшуюся при гликолизе молекулу ацетил-КоА с энергетического пути на путь синтеза липидов и их отложения в депо. В то же время при восстановлении скорости утилизации АТФ, что обычно наблюдается при синтезе жирных кислот, соответствующее повышение уровня АМФ способствует снижению концентрации лимонной кислоты и соответственно торможению синтеза липидов. Перечисленными примерами абсолютно не исчерпывается все многообразие взаимопревращений органических веществ, которые постоянно совершаются в живых организмах. Приведены лишь главные, магистральные каналы и пути превращения общих классов веществ и указаны ключевые субстраты и ферментные системы, обеспечивающие постоянство химических компонентов и тканей и динамичность живых структур. Таким образом, скорость распада одних питательных веществ и биосинтеза других прежде всего определяется физиологическим состоянием и потребностями организма в энергии и метаболитах. Благодаря динамичности и координации метаболической активности обеспечивается макро- и микроскопическое постоянство всех форм живого. Выяснение фундаментальных проблем структуры и функций отдельных биомолекул может служить основой для раскрытия как молекулярных механизмов химических процессов, лежащих в основе состава и функций отдельных клеток и целостного организма, - так и процессов, обеспечивающих биологическую индивидуальность живых организмов. Цель настоящего пособия – помочь студентам в теоретической подготовке и практическом проведении исследований по разделу: «Ензимология» общего курса биохимии, что позволяет получить: 6 знания: о структуре, функционировании и регуляции активности ферментов; умения: работать с биологическим материалом, проводить выделение, очистку ферментов, овладеть основными приемами регуляции активности ферментов; навыки: самостоятельно планировать и проводить эксперимент, анализировать полученные данные, делать логичные выводы. Настоящее учебное руководство включает классические биохимические методы и новые методики. В процессе проведения лабораторных работ студенты должны так же усвоить большой объем теоретического материала, который обобщается и оформляется в виде реферата. Студенты не всегда знакомы с правилами техники безопасности в химической лаборатории, что может привести к случаям травматизма. В связи с этим мы приводим краткую инструкцию по технике безопасности, которую должны строго соблюдать студенты. Ознакомившись с ней, студенты обязаны расписаться в специальном журнале инструктажа по технике безопасности. Каждое задание, формулы, и расчеты к нему оформляются в виде протокола в специальной тетради. Задание считается выполненным только после проверки и подписи преподавателя. КРАТКАЯ ИНСТРУКЦИЯ по технике безопасности при работе в биохимической лаборатории Химические вещества при неумелом и неправильном использовании могут стать причиной отравления лиц, которые работают, вызывать пожар, взрыв или химический ожог. С целью исключения случаев травматизма при работах в химических лабораториях необходимо выполнять следующие требования: 1. Каждый студент к началу опыта должен хорошо ознакомиться со свойствами веществ, с которыми будет работать и необходимыми условиями безопасного проведения работы с учетом возможных побочных реакций. 2. При работе в вытяжном шкафу, с целью более эффективного действия вентиляции, следует поднять дверцы вытяжного шкафа на 1\3 - 1\4 ее подъема. По окончанию работы необходимо плотно прикрыть дверцы шкафа. 3. В случае перерыва действия вентиляции все работы в вытяжных шкафах, которые связаны с выделением вредных газов, паров, нужно немедленно прекратить. 4. Не хранить вещества в посуде без этикеток. Не делать никаких опытов в нечистой посуде. Посуду мыть сразу же после опыта. 5. Не оставлять включенными нагревательные приборы, электроплиты, сушильные шкафы, термостаты, горящие горелки, открытые газовые и водопроводные краны. При работе с едкими веществами необходимо соблюдать следующие правила: 1. При смешивании концентрированных серной и азотной кислот пользоваться только тонкостенной химической или фарфоровой посудой. 2. Во избежание разбрызгивания при разведении концентрированной серной кислоты - добавлять кислоту в воду, а не наоборот. 3. При попадании кислот или щелочей на поверхность кожи их необходимо немедленно смыть сильной струей воды. 4. Едкие щелочи дают ожоги всех степеней. Поэтому при работе с едкими щелочами необходимо применять меры против разбрызгивания и использовать защитную спецодежду и предохранительные очки. 7 5. Наполнение пипеток концентрированными кислотами, щелочами путем всасывания ртом категорически запрещается, для этого нужно пользоваться сифонами или специальными пипетками с резиновой грушей. При работе с горючими и легковоспламеняющимися жидкостями (сероуглерод, эфир, спирт, бензол и т.д.) необходимо соблюдать правила: 1. Не пользоваться открытым пламенем для нагревания; 2. Не держать эти соединения на столах в больших количествах; 3. Переливать вдали от огня, а при переливании больших количеств все нагреватели (газовые и другие горелки) в помещении потушить; 4. Не выливать эти вещества в раковину; 5. Не нагревать на открытом огне, а только на водяной бане. 6. При работе с масляными банями пользоваться термометром и не превышать температуру воспламенения горючих веществ. 7. Не наклоняться над сосудом, в котором кипит раствор или в который наливают какую-либо жидкость (особенно едкую), потому что брызги могут попасть в глаза. 8. Пробирку, в которой нагревается жидкость, держать отверстием в сторону, а не к себе или к рядом работающему, потому что жидкость в результате нагревания нередко выбрасывается из пробирки. 9. В случае воспламенения горючих жидкостей: а) немедленно погасить все горелки, отключить электронагревательные приборы; б) отставить сосуды с огнеопасными веществами от очага воспламенения; в) прикрыть пламя мокрым одеялом, а по необходимости засыпать песком; г) отключить вентиляционные установки; д) при необходимости использовать углекислотный огнетушитель; е) срочно сообщить в отделение МЧС (тел. 01) и руководству факультета. Пра работе с электрическими приборами необходимо соблюдать следующие правила: 1. Перед включением электроприборы должны быть заземлены. 2. Работать с электронагревательными приборами, которые имеют открытую спираль, в химической лаборатории категорически запрещено. 3. Перед включением прибора необходимо проверить исправность розетки и целостность шнуров, особенно от электроплит. 4. При работе с приборами, которые генерируют высокое напряжение, необходимо тщательным образом проверить их заземление, а также не касаться электронесущих узлов. 5. При работе с центрифугами центрифужные пробирки попарно уравновешивать на центрифужных весах и помещать в гнезда ротора одну напротив другой. При разливе проб гнезда тщательным образом очистить и высушить. 6. По окончанию работы необходимо выключить все использованные в работе электроприборы. Внимание! После изучения данной инструкции в специальном журнале делается соответствующая отметка, где каждый студент ставит свою подпись. РАЗДЕЛ 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ КЛАССА ОКСИДОРЕДУКТАЗ И НЕКОТОРЫХ ЕГО ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе 8 биологического окисления. Систематические названия их составляют го форме «донор: акцептор оксидоредуктаза». Например, лактат: НАД+ оксидоредуктаза для лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов) непосредственно на кислород; анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород; цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относят также гемсодержащие ферменты каталазу и пероксидазу, катализирующие реакции с участием перекиси водорода. Фермент Сукцинатдегидрогеназа Тип окисления ─С═С─ │ │ - образование Алкогольдегидрогеназа Спирт- в альдегид Альдегиддегидрогеназа Альдегид- в кислоту Цитохромоксидаза Основная реакция Ферроферринопорфирин NADH Дигидропиридин(или NADPH) пиридин дегидрогеназы СН2СООН │ СН2СООН → СНСООН │ СНСООН + 2Н О // СН3СН2ОН → СН3С + 2Н \ Н О ОН ОН // / / СН3С + Н2О → СН3С−О−Н → СН3С + 2Н \ \ \\ Н Н О в R − FeII → R − FeIII + e в 1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) [КФ 1.3.99.1] - сукцинат: (акцептор)оксидоредуктаза, сукцинат - убихинон редуктаза, фермент класса оксидоредуктаз , катализирующий окисление дианиона янтарной к-ты (сукцината) до дианиона фумаровой к-ты (фумарата) в трикарбоновых кислот цикле ; природные акцепторы электронов в этой реакции - убихиноны, нафтохиноны, неприродные - гексацианоферрат и некоторые др. Сукцинатдегидрогеназа высших организмов катализирует и обратную реакцию (фумаратредуктазную) - восстановление фумарата до сукцината; доноры электронов 9 убихинолы, флавинмононуклеотид и др. У ряда микроорганизмов фумаратредуктазная реакция катализируется специальным ферментом (фумаратредуктазой), очень близким по структуре к сукцинатдегидрогеназе. У некоторых организмов в клетках одновременно присутствуют сукцинатдегидрогеназа и фумаратредуктаза. Фермент состоит из 4 субъединиц с молекулярными массами около 70, 30, 14 и 12 тысяч Да и содержит в качестве окислительно-восстановительных групп флавинадениндинуклеотид (ковалентно связанный с самой тяжелой субъединицей) и 3 FeS-кластера (ассоциированных с субъединицей с молекулярной массой 30 тысяч Да). Одна из малых субъединиц сукцинатдегидрогеназы высших организмов и фумаратредуктазы микроорганизмов содержит гем. Активный центр, связывающий сукцинат, локализован на самой тяжелой субъединице, а центр, связывающий убихинон, в субъединице с молекулярной массой 12 тысяч Да. В специфичном связывании сукцината участвуют остатки аргинина, гистидина и цистеина. Сукцинатдегидрогеназа проявляет оптимальную каталитическую активность при рН 7,5 – 8,0. Установлены первичные структуры субъединиц с молекулярной массой 70 и 30 тысяч Да. Специфичные ингибиторы сукцинатдегидрогеназы - ртутьорганические соединения, N-алкиламиды малеиновой кислоты, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, некоторые эфиры карбоновых кислот и др. Растворимая сукцинатдегидрогеназа восстанавливает феназинметасульфат, но не способна взаимодействовать с природным акцептором электронов - убихиноном. Сукцинатдегидрогеназа входит в состав II комплекса дыхательной цепи. Молекулярная масса сукцинатдегидрогеназы - 100 кДа, она состоит из двух субъединиц в 70 и 27 кДа. FAD ковалентно связан с большой субъединицей через 8 альфа-группу изоаллоксазинового кольца, с остатком гистидина. Субъединица в 27 кДа является Fe-S белком, однако и субъединица в 70 кДа содержит Fe-S кластер. Всего в сукцинатдегидрогеназе содержится 8 атомов FeII и эквивалентное количество лабильного сульфида (S лаб.). Сукцинатдегидрогеназа дрожжевых и животных митохондрий содержит три Fe-S центра, различающихся по ЭПР-спектроскопии и редокспотенциалом. В активном центре сукцинатдегидрогеназы присутствует реактивная SH-группа, ответственная за торможение активности сукцинатдегидрогеназы сульфгидрильными ингибиторами, а также одна или две молекулы аргинина. Методом генной инженерии получен мутант S. cerevisiae с разрушенным геном Fe-S субъединицы сукцинатдегидрогеназы. Мутант синтезировал флавопротеиновую субъединицу сукцинатдегидрогеназы и импортировал ее в митохондрии, но на значительно более низком уровне, чем у дрожжей дикого типа. Первичная структура всего II комплекса известна для Е. coli и В. subtilis в результате клонирования и секвенирования Sah оперона. Для Е. coli известна нуклеотидная последовательность и frd оперона, кодирующего фумаратредуктазу, имеющую высокую степень гомологии с сукцинатдегидрогеназой. Определена полная аминокислотная последовательность для малой субъединицы сукцинатдегидрогеназы митохондрий сердца быка и митохондрий печени человека - в последнем случае на основании анализа нуклеотидной последовательности ДНК. Обнаружена гомология (50,8%) с продуктом Sah В гена Е. coli и удивительный консерватизм среди трех кластеров аминокислот, обогащенных цистеином, предполагающий локализацию Fe-S центров. Информация об аминокислотной последовательности малой субъединицы сукцинатдегидрогеназы митохондрий животных была использована для клонирования части общей геномной ДНК из большого числа видов, включая дрожжи S. cerevisiae и S. pombe. Подтверждена гомология с другими FeS-содержащими белками. Полипептид из S. cerevisiae имел значительную (60%) степень гомологии с полипептидом S. pombe, митохондрий человека, крысы, быка. Клоны, дефектные по малой субъединице сукцинатдегидрогеназы, продолжали синтезировать большую субъединицу, хотя и в меньшей степени. 10 ЖСЦ сукцинатдегидрогеназы Методом ЭПР-спектроскопии в составе сукцинатдегидрогеназного комплекса митохондрий дрожжей выявлены три железо - сернистые центры (ЖСЦ): ЖСЦ S-l , ЖСЦ S-2 и ЖСЦ S-3 с величинами g-факторов (для S-1 и S-2 gz = 2,03; gy = l,93; gx = 1,91; для S-3 g = 2,01) и величинами потенциалов полувосстановления (Em для S-l = 0 + 15 мВ; Еm для S-2 = -245 + 15 мВ), близкими соответствующим характеристикам ЖСЦ животных митохондрий. ЖСЦ S-1 и S-2 парамагнитны в восстановленном состоянии (ЖСЦ S-1 может быть восстановлен сукцинатом и NAPH, S-2 - только дитионитом), ЖСЦ S-3 парамагнитен в окисленном состоянии. По содержанию ионов железа и серы их относят: S-l к кластеру 2Fe-2S, S-2 к кластеру 4Fe-4S и S-3 к кластеру 3Fe-4S, т.е. сукцинатубихинон-редуктаза является уникальным ферментом, содержащим все три типа кластеров Fe-S. Растворимые препараты сукцинатдегидрогеназы сохраняют ЖСЦ S-l и S2, но теряют ЖСЦ S-3, фермент при этом теряет и способность взаимодействовать с естественным акцептором электронов - убихиноном, а также феррициани-дредуктазную активность. Тот факт, что ЖСЦ S-3 обнаруживается лишь в препаратах, способных к реконструкции, указывает на важную роль его в качестве терминального переносчика электронов к убихинону. Локализация ЖСЦ все еще остается неопределенной. До недавнего времени полагали, что ЖСЦ S-1 (кластер 2Fe-2S) и ЖСЦ S2 (кластер 4Fe-4S) локализованы на большей субъединице сукцинатдегидрогеназы, a ЖСЦ S-3 (кластер 3Fe-4S) - на меньшей (ЖСЦ S-3 должен быть защищен от воды и локализован вблизи липидного бислоя). Однако, иная локализация указанных ЖСЦ на изолированных субъединицах фумаратредуктазы из Е. coli и Vibrio succinogenes (фермента, сходного по субъединичному составу и первичной структуре с сукцинатдегидрогеназой эукариот), требует уточнения этих данных. Согласно некоторым данным, 2Fe-2S и 3Fe-4S кластеры должны были локализованы на малой субъединице, a 4Fe-4S кластер - либо на большой субъединице, либо между каталитическими доменами. Однако ранее локализация 4Fe-4S кластера на малой (27 кДа) субъединице была постулирована на основании данных по аминокислотной последовательности. Фермент обнаруживает удивительное сходство у всех аэробных организмов. Связь его с внутренней мембраной митохондрий осуществляется с помощью ионных и гидрофобных взаимодействий (точный механизм связи неизвестен); фермент может быть обратимо удален из субмитохондриальных частиц щелочной обработкой в анаэробных условиях или обработкой хаотропными агентами. FAD ковалентно связан через 8метилгруппу изоаллоксазинового кольца с N- 3 атомом имидазольной группы гистидина большой субъединицы (70 кДа). Большая субъединица сукцинатдегидрогеназы помимо FAD содержит и центр связывания сукцината. Существенную роль в присоединении субстрата играет SH-группа с рК 7,0, к которой сукцинат, как полагают, присоединяется полутиоацетальной связью. Механизм функционирования сукцинатдегидрогеназы Сукцинатдегидрогеназа высших организмов кроме сукцината способна катализировать окисление (со значительно меньшими скоростями) его галогензамещенных и дианиона яблочной кислоты. Как следует из названия, комплекс катализирует перенос восстановительных эквивалентов от сукцината к убихинону. В его составе выявлено, по данным разных авторов, от трех до пяти полипептидов с молекулярной массой от 12,5 до 73 кДа, FAD, негемовое железо, лабильный сульфид и цитохром Ь. Весь FAD, Fe (негемовое) и S (лабильный) связаны с двумя наибольшими полипептидами (73 и 27 - 30 кДа), составляющими сукцинатдегидрогеназу растворимую. Растворимая сукцинатдегидрогеназа не обладает убихинон-редуктазной активностью. Для ее взаимодействия с убихиноном необходимо подключение дополнительных белков, остающихся в мембране после экстракции 11 сукцинатдегидрогеназы. Это небольшие полипептиды с молекулярной массой 7,5 - 15 кДа, весьма гидрофобные и локализованные, судя по их взаимодействию с арилазидофосфолипидами, вблизи липидного бислоя. Аминокислотная последовательность определена лишь для цитохрома b 558, входящего в состав фумаратредуктазы В. subtilis (на основании анализа нуклеотидной последовательности соответствующей открытой рамки считывания ДНК). Согласно данным, лишь один из дополнительных полипептидов с молекулярной массой ~ 15 кДа, названный авторами QPs, участвует в специфическом связывании убихинона (возможно, убисемихинона). Обратимые конкурентные (по отношению к сукцинату) ингибиторы - дианионы малоновой и щавелевоуксусной кислот. Сукцинатдегидрогеназы всех изученных организмов прочно связаны с внутренней мембраной митохондрий (высшие животные, дрожжи) или плазматической мембраной (бактерии и сине-зеленые водоросли), являясь компонентами электронотранспортной дыхательной цепи. Активность сукцинатдегидрогеназы часто используют для идентификации внутренних мембран митохондрий при фракционировании клеток и клеточных органелл. Неопределенности, существующие до сих пор относительно стехиометрии первичной структуры QPs-белков, выделяемых в разных лабораториях, отсутствие достоверно установленной стабилизации семихинона изолированными препаратами пептида(ов), активного в реконструкции, не позволяют принять безоговорочно эту точку зрения. Согласно современной модели, возникновение центра связывания убихинона в сукцинат-убихинон-редуктазном комплексе обеспечивается белок-белковыми взаимодействиями между меньшей субъединицей сукцинатдегидрогеназы и малыми пептидами, стабилизирующими растворимую сукцинатдегидрогеназу в составе комплекса. Непонятна до конца и роль низкопотенциального (Em = -144 мВ) цитохрома Ь, обнаруживаемого в составе сукцинат-дегидрогеназного комплекса. Способность восстанавливаться дитионитом, но не сукцинатом, отсутствие редокс-изменений в ходе каталитического акта, присутствие в субстехиометрических количествах по отношению к флавину - все это порождало сомнение относительно необходимости и важности этого компонента в переносе электронов от сукцината к убихинону. Однако были представлены доказательства его возможной функциональной связи с сукцинатдегидрогеназой: взаимодействие цитохрома b в составе двухсубъединичного QPS с сукцинатдегидрогеназой сопровождалось изменением его спектральных свойств, спектра ЭПР, снижением редокс-потенциала, уменьшением способности взаимодействовать с СО. Его присутствие в QPe, по данным авторов, увеличивало реконструкционную активность препаратов, хотя это утверждение не согласуется с наблюдениями других авторов. Перенос электронов в II комплексе ингибируется аналогами сукцината (малонат, ЩУК), SH-реагентами, действующими на центр связывания субстрата, теноилтрифторацетоном (Km = 2-5 мкМ) и карбоксанилидами (Km = 4 мкМ), действующими на стадии выхода электрона из фермента и блокирующими взаимодействие ЖСЦ S-3 с убихиноном. Лабораторная работа № 1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Принцип метода заключается в восстановлении феррицианида калия (К3[Fe(CN)6]), раствор которого имеет желтую окраску, до бесцветного феррицианида калия (К4[Fe(CN)6]) сукцинатом под действием СДГ. Активность фермента пропорциональна количеству восстановленного феррицианида. 12 Ход определения В центрифужные пробирки наливали по 1 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,8) и по 0,1 мл растворов янтарной кислоты (0,1М, рН 7,8), ЭДТА (25 мМ, рН 7,8), азида натрия (150 мМ) и дистиллированной воды. К пробам добавляли по 0,5 мл гомогената ткани, разведенного в соотношении 1:10 на 0,9% NaCl, пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут для ингибирования цитохромоксидазы азидом натрия. Реакцию начинали добавлением к пробам 0,1мл 25мМ раствора феррицианида калия. Пробы инкубировали 15 минут при температуре 30оС. После инкубации реакцию останавливали погружением проб в лед и добавлением к пробам по 2 мл 20% ТХУ. В контрольные пробы, содержащие все компоненты инкубационной смеси, ТХУ добавляли перед внесением гомогената. Таким образом, СДГ в контрольных пробах с начала инкубации полностью денатурирована, и специфического восстановления феррицианида сукцинатом не происходит. После остановки реакции и охлаждения пробы центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 минут для осаждения денатурированного белка. Надосадочнуюю жидкость фотометрировали на спектрофотометре при 420 нм. Оптическим контролем служила смесь 20% ТХУ и 0,1М фосфатного буфера. Активность фермента (А) в нмоль/г/мин вычесляют по формуле: А=1000 х 3,25 х ΔЕ / m / t , где: ΔЕ= Ек - Ео - разность экстинций контрольных и опытных проб; t - время инкубации; m -навеска ткани; 3,25 - коэффициент, учитывающий соответствие между количеством феррицианида и разностью оптических плотностей контрольных и опытных проб, на линейном участке калибровочной кривой, определенный нами эксперементально. 1.2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ Алкогольдегидрогеназа (Алкоголь: НАД+-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.1), М.м. субъединицы 40 кДа – фермент класса дегидрогеназ, катализирующий окисление спиртов и ацеталей до альдегидов и кетонов в присутствии никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Алкогольдегидрогеназы являются димерами, состоящими из субъединиц с молекулярным весом около 40000 и содержащими ион цинка Zn2+. алкогольдегидрогеназа СН3СНО + НАДН + Н СН3СН2ОН + НАД+ + Фермент относится к классу оксидоредуктаз. Обнаружен во многих тканях животных и растений, а также у микроорганизмов. Субъединицы, образующие энзим, могут кодироваться идентичными или разными генами. Так, АДГ I человека представлена многочисленными изозимами, которые являются парными комбинациями трех основных субъединиц – α, β и γ, делящихся, в свою очередь, на варианты α, β1, β2, β3, γ1 и γ2 (аллели – АДГ1, АДГ12, АДГ22, АДГ32, АДГ13, АДГ23). В результате кинетическиехарактеристики и ряд особенностей действия 13 изозимов класса I значительно различаются. АДГ классов II, III и IV состоят из пар идентичных субъединиц – π, χ и σ, соответственно. Субстратная специфичность АДГ различных классов имеет существенные различия. Прежде всего, необходима оценка их способности к окислению этанола. В широком диапазоне концентраций – это функция именно АДГ I и АДГ IV. Важно подчеркнуть, что катализируемая этими энзимами реакция этанол + НАД+ ацетальдегид + НАДН + H+ характеризуется положением равновесия, когда при концентрациях, близких к физиологическим, оно смещено влево. Это отражает детоксицирующее действие АДГ I и АДГ IV по отношению к ацетальдегиду, постоянно образующемуся при многих метаболических процессах. Известно его негативное действие на широкий круг белков и структур. Очень ограниченное участие в окислении этанола принимает АДГ II. Особо следует отметить относительно невысокую способность АДГ I и IV окислять метанол. АДГ II и III вовсе не обладают такой активностью. Значение АДГ классов II и III в реакциях детоксикации спиртов (или, напротив, образования токсических альдегидов) связано преимущественно с превращениями длинноцепочечных алкоголей. Важной специальной функцией АДГ III является окисление формальдегида в реакции с участием глютатиона. Эта функция сопряжена с рядом процессов метаболизма одноуглеродных радикалов в организме. Алкогольдегидрогеназа пекарских дрожжей энергично окисляет первичные спирты с неразветвленной цепью и со значительно меньшей скоростью спирты с разветвленной цепью, вторичные спирты, некоторые оксикислоты, аминоспирты и полиспирты. Молекула фермента (М.м. 150 кДа) состоит из четырех субъединиц, имеет четыре активных центра, содержит четыре атома прочно связанного цинка. Алкогольдегидрогеназа является сульфгидрильным ферментом. В трис- и пирофосфатном буферах оптимум рН равен 8,6. Цианиды, йодоацетат тормозят действие энзима. Кm для НАД и НАДН равны соответственно 1,7 х 10 -4 М и 2,3 х 10-5 М, для этилового спирта – 1,6 х 10-2 М, для уксусного альдегида – 3 х 10-4 М. А 1 %/1 см при 280 нм равна 12,6. Лабораторная работа № 2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ Принцип метода. Окисление этилового спирта под действием алкогольдегидрогеназы сопровождается восстановлением НАД (моль на моль), что регистрируют спектрофотометрически по увеличению оптической плотности при 340 нм. Реактивы: 1. Натрий-пирофосфатный буфер – 60 мМ раствор, рН 8,5. 2. Этанол – 3 М раствор. 3. НАД – 15 мМ раствор, рН 6,0. Может несколько дней храниться на холоде. 4. Калий-фосфатный буфер – 10 мМ раствор, рН 7,5. 5. Бычий сывороточный альбумин, 0,1%-ный раствор, приготовленный на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5. 6. Алкогольдегидрогеназа – 1 Е/мл, свежеприготовленный раствор на 0,1% -ном растворе бычьего сывороточного альбумина в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5. 14 Биологический материал: гомогенаты тканей животных на 0,9 % NaCl, сыворотка крови. Ход работы. В спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь, содержащую (указаны конечные концентрации) 6 мМ буфер, 100 мМ этанол и 0,5 мМ НАД. Реакцию начинают добавлением 0,05 мл раствора алкогольдегидрогеназы. Общий объем пробы – 3 мл. Перемешивают и измеряют увеличение оптической плотности при 340 нм в течение 45 с. Состав контрольной кюветы тот же, только отсутствует субстрат. Расчет. Активность АДГ (в мкмолях НАДН/мин на 1 мг белка) рассчитывают по формуле X = ΔEV∙ 1000/6,22a, где ΔE – среднее изменение оптической плотности пробы за 1 мин; V – конечный объем пробы в кювете (3,0 мл); 1000 – коэффициент перевода мкмолей в нмоли. 6,22 – коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиннуклеотидов при длине волны 340 нм; а - количество белка в пробе, определенное параллельно в том же тканевом препарате методом Лоури, мг. Полученные данные занести в таблицу: АДГ, нмоль НАДН/мин на 1 мг белка Группы животных печень почки сердечная мышца мозг кровь Интактные С экспериментальной патологией С коррекцией экспериментальной патологии Сделать выводы: 1.3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Лактатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.27, L-лактат:НAД-оксидоредуктаза) – фермент, обратимо катализирующий превращение лактата в пируват с образованием НAДH+ и пирувата в лактат с образованием НАД. Коэнзимом фермента служит никотинамидадениндинуклеотид. Лактатдегидрогеназа была открыта Мейергофом в 1909 г, получена в кристаллическом виде Штраубом в 1940 г. Лактатдегидрогеназа имеет молекулярную массу 144 000 Да и широко распространена в организме человека и животных: почках, сердце, скелетных мышцах, 15 поджелудочной железе, селезенке, печени, легких, сыворотке крови. Существуют несколько изоферментов лактатдегидрогеназы, что обусловлено наличием 2 генетических локусов, которые кодируют синтез 2 олигомеров – субъединицы М и субъединицы Н. В плазме (сыворотке) крови выявлено пять изоферментов лактатдегидрогеназы – ЛДГ1, ЛДГ2 ,ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5, отличающихся между собой по электрофоретической подвижности и тканевому происхождению. Так, изофермент ЛДГ1 происходит из ткани сердца, а ЛДГ5 - из печени. Каждый из изоферментов представляет собой тетрамер, образованный субъединицами Н и М. Каждая субъединица представлена одной полипептидной цепью, состоящей из 334 аминокислот и имеющей молекулярную массу 36 000 Да. В молекуле-тетрамере лактатдегидрогеназы каждый из четырех активных центров содержит SH-группу, блокирование которой приводит к ингибированию фермента. Активность ЛДГ ингибируется: оксалатами (используемыми в качестве антикоагулянтов), мочевиной, щавелевой и щавелево-уксусной кислотой, солями тяжелых металлов, тиоловыми ядами. Активность ЛДГ в сыворотке крови возрастает при анемиях, обширном карциноматозе, опухолях, лейкозе, лимфоме, гепатитах, обтурационном циррозе печени, заболеваниях почек, нарушениях функции опорно-двигательного аппарата, инфаркте миокарда. Снижения активности ЛДГ в сыворотке крови обусловлено наличием эндогенного ингибитора в сыворотке (плазме) крови или генетическими нарушениями. Лабораторная работа № 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Принцип метода в прямой реакции основан на спектрофотометрическом определении содержания НАДН, а в обратной реакции – на спектрофотометрическом определении содержания НАД с максимумом поглощения при λ=340 нм. В прямой реакции: L-лактат + НАД пируват + НАДН лактатдегидрогеназа В обратной реакции пируват под действием лактатдегидрогеназы в присутствии НAДН окисляется в лактат: Пируват + НАДН L-лактат + НАД+ лактатдегидрогеназа Реактивы: Реактив 1. 0,1 М фосфатный буфер рН 7,4; 2. Реактив 2. 0,165 мМ раствор НАДН на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4; 3. Реактив 3. 1,03 мМ раствор натрия пировинограднокислого на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4;. 4. Субстратно-буферная смесь. Смешивают равные объемы реактива 2 и реактива 3. Раствор стабилен в течение суток при хранении в холодильнике. 16 Примечание: Оптическая плотность раствора при λ=340 нм должна быть не менее 1,2. 5. 0,9 % раствор натрия хлорид. Биологический материал: гомогенаты тканей животных на 0,9 % NaCl, сыворотка крови (не гемолизированная и без оксалатов). Ход работы. В пробирку вносят 3,5 мл субстратно-буферного раствора, добавляют 0,1 мл источника фермента, перемешивают, измеряют оптическую плотность при λ=340 нм против дистиллированной воды в кювете с толщиной слоя 10 мм и помещают в водяной термостат при 37 °С. Через 30, 60, 90 с инкубации измеряют оптическую плотность при λ=340 нм против дистиллированной воды в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчет. Активность ЛДГ выражают в нмолях НАДН/мин на 1 мг белка. Вычисление проводят по формуле: A = ΔEV∙ 1000/6,22a, где ΔE – среднее изменение оптической плотности пробы за 1 мин; V – конечный объем пробы в кювете; 1000 – коэффициент перевода мкмолей в нмоли. 6,22 – коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиннуклеотидов при длине волны 340 нм; а - количество белка в пробе, определенное параллельно в том же тканевом препарате методом Лоури, мг. Если величина ΔE уменьшается более, чем на 0,0027 в секунду, то сыворотку разводят 0,9% раствором хлорида натрия в отношении 1:9. Повторяют измерение, а результаты умножают на 10. В пробе с сывороткой с высокой активностью ЛДГ может быть измерена очень низкая начальная величина оптической плотности, так как концентрация NАДН в таком случае уже снижается до проведения первого измерения оптической плотности. Такую сыворотку разводят 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1: 19, а результаты умножают на 20. Полученные данные занести в таблицу: Группы животных Активность ЛДГ в мМ НАДН (для прямой реакции) или в мМ НАД (для обратной реакции) на г (мл) в час печень почки Интактные С экспериментальной патологией С коррекцией экспериментальной патологии Сделать выводы: 17 сердечная мышца мозг кровь РАЗДЕЛ 2 ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ МУЛЬТИЭНЗИМНЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ 2-ОКСОКИСЛОТ Все процессы, протекающие в организме, направляются и регулируются системой ферментов. Особую группу составляют надмолекулярные комплексы, в состав которых входят ферменты, катализирующие последовательные ступени превращения какого-либо субстрата. Отличительной особенностью таких комплексов, помимо прочности ассоциаций, является определенная последовательность прохождения промежуточных стадий: то есть продукт, полученный при участии первого фермента, оказывается в роли субстрата для следующего фермента и т.д. Типичным примером подобных комплексов являются мультиферментные комплексы дегидрогеназ 2-оксокислот, катализирующие реакции окислительного декарбоксилирования 2-оксокислот (пирувата, 2-оксоглутарата и оксокислот с разветвленной цепью – продуктов катаболизма валина, лейцина, изолейцина и др.) с образованием соответствующих ацил-КоА. Все они обладают большой молекулярной массой2-8,5 млн. дальтон. Исследование надмолекулярной структуры комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот показало, что все они состоят их множественных копий четырех типов субъединиц, базирующихся на липоат-ацетилтрансферазе (Е2), которая является ядром комплекса и состоит из 60 субъединиц, каждая из которых подразделяется на два домена: связывающий и липоильный. Пируватдегидрогеназную реакцию можно назвать центральной амфиболической точкой организма, связывающей обмен углеводов, жиров и белков. Функционирование пируватдегидрогеназного мультиферментного комплекса (ПДК) обеспечивает связь гликолиза с циклом Кребса, поставку ацетил-КоА для синтеза жирных кислот и стероидных молекул, а также интеграцию восстановительных эквивалентов в форме НАДН для биоэнергетических целей. Сложный процесс окислительного декарбоксилирования пирувата включает в себя ряд последовательных стадий, катализируемых тремя индивидуальными ферментами, объединенными в комплекс, который имеет упорядоченную, строго организованную структуру и действует по многоцентровому пинг-понг механизму. Пируватдегидрогеназный комплекс (ПДК, КФ - 1.2.4.1) Методами ионообменной хроматографии, гельфильтрации, электрофореза в полиакриламидном геле ПДК разделен на три компонента: Е1 – пируватдегидрогеназу, Е2 – дигидролипомидацетилтрансферазу и Е3 – липоатдегидрогеназу [13, 14]. ПДК имеет диаметр 30-35 нм, ее ядром служит компонент Е2. При электронной микроскопии Е2 выглядит в форме пентагонального додекаэдра с диаметром 21-24 нм. Компонент Е1 состоит из четырех субъединиц двух типов – и , с молекулярной формулой 22, являясь, таким образом, функциональным димером, имеющим два каталитически идентичных активных центра, расположенных на соседних субъединицах. Расшифрована последовательность с N-концевой области субъединицы из сердца быка. Молекулярные массы субъединиц несколько варьируют в зависимости от источника выделения. Компонент Е2 – липоацетилтрансфераза имеет молекулярную массу от 38 до 80 кДа и является ядром ПДК, как и всех дегидрогеназ 2-оксокислот. Е2, выделенный из Е. coli и млекопитающих, имеет различное количество доменов: первый состоит из трех отдельных липидных доменов, а второй – из одного домена, которые составляют концевую половину полипептидной цепочки. При изучении Е2 субъединицы из Arabidopsis и гороха установлены участки субъединичного связывания и каталитические домены, определены 18 последовательности, участвующие в сборке Е2 кода пируватдегидрогеназного комплекса. Методами генной инженерии доказана локализация на С-концевой половине каталитической и комплексообразующей функции компонента Е2. Полученные трипсиновые фрагменты Е2: фрагмент А с молекулярной массой 26 кДа и фрагмент В с молекулярной массой 22 кДа – не способны связываться с компонентом Е1. Компонент Е2 образован 60 субъединицами липоацетилтрансферазы и его активность совершенно не зависит от декарбоксилазнго компонента. Е3 – липоамиддегидрогеназа имеет молекулярную массу 112 кДа и представлена двумя идентичными мономерами, содержащими по одной молекуле ФАД. (В работах Hadgson, Matuda и Rahmatullah) установлено наличие четвертого компонента Х в составе ПДК, молекулярная масса которого колеблется от 46 кДа до 52 кДа. Компонент Х содержит липоильный остаток, который подвергается восстановлению и ацетилированию, и гомологичен с липоацетилтрансферазой. Полагают, что компонент Х является связующим звеном между Е2 и другими каталитическими единицами ПДК. При дальнейшем изучении ПДК из различных источников были выделены компонент Е3–А и компонент ВР. N-концевая область Е3-А состоит из остатков 1-112 и отличается от всех известных Е 3. Она напоминает N-конец дигидролипоамидацетилтрансфераз и содержит один липоильный домен, отделенный шарнирной областью от С-концевой области Е3–А, которая высокогомологична классической Е3 . При изучении дигидролипоилтрансацетилазного – липоамиддегидрогеназного субкомплекса (Е2-Е3-ВР) обнаружен компонент ВР - Е3связывающий белок. Обработка Е2-Е3-ВР гуанидинхлоридом или KSCN приводит к быстрому снижению трансацетилазной активности. Параллельно инактивации происходит нарушение четвертичной структуры субкомплекса. Подобранные условия реассоциации позволяют получить олигомеры Е2, свободные от Е2-ВР. Такие олигомеры не восстанавливают общую активность пируватдегидрогеназного комплекса при инкубации с пируватдегидрогеназой (Е1) и Е3. В этом случае возможно комплексообразование с Е1, но связывание Е2 и Е3 не происходит. Можно предположить, что компоненты Е3–А и ВР гомологичны и являются четвертым компонентом (компонентом Х) ПДК, представляющим собой белок, связывающий Е2 и Е3 субъединицы между собой. Сопряжение активных центров в ПДК обеспечивается сегментом, обогащенным аланином и пролином, осуществляющим подвижность липоильных доменов. ПДК катализирует окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты, действуя по многоцентровому «пинг-понг» механизму: 1) CH3-CO-COOH + [ТПФ]-ПДГ [CH3-CH-OH- ТПФ]-ПДГ + CO2 2) [CH3-CH-OH-ТПФ]-ПДГ + [ЛКS2]-ЛАТ [CH3-CO~SЛК·SH]-ЛАТ + [ТПФ]-ПДГ 3) [CH3-CO~SЛК·SH]-ЛАТ + KoA-SH CH3-CO~SKoA + [ЛК·(SH)2]-ЛАТ 4) [ЛК·(SH)2]-ЛАТ + [ФАД]-ЛДГ [ЛК·S2]-ЛАТ + [ФАД·H2]-ЛДГ 5) [ФАД·H2]-ЛДГ + НАД [ФАД]-ЛДГ + НАД·H + H+, или суммарно: CH3-CO-COOH + KoA-SH + НАД+ CH3-CO~SKoA + СО2 + НАД-H + H+ 19 Реакция необратима: G1 = 39,5 кДж/моль, константа равновесия составляет 8,4106 при рН 7,0. В каскаде реакций принимают участие три фермента: пируватдегидрогеназа (ПДГ, КФ 1.2.4.1.) - компонент Е1, коферментом которого является тиаминпирофосфат (ТПФ); липоацетилтрансфераза (ЛАТ, КФ 2.3.1.12) - компонент Е2, содержащий липоевую кислоту (ЛК) в качестве кофермента; липоамиддегидрогеназа (ЛДГ, КФ 1.6.4.3) компонент Е3, связан с коферментом ФАД. Непосредственное участие принимают в реакции еще два кофермента – КоА и НАД. Ферменты, входящие в ПДК, связаны нековалентными связями, причем пируватдегидрогеназа и липоилдегидрогеназа не взаимодействуют между собой, но оба связываются липоилтрансферазой. Липоилтрансфераза (Е2) обеспечивает также перенос ацетильного остатка с липоевой кислоты на ацетил-КоА (реакция 3), то есть этот фермент выполняет структурную и каталитическую функция. Пируватдегидрогеназа, как изолированная, так и в составе комплекса, способна осуществлять окислительное декарбоксилирование пирувата при добавлении в инкубационную среду искусственных акцепторов электронов, например, феррицианида, метиленового синего и др. При этом происходит образование СО2 и уксусной кислоты; функцию акцептора ацетила в данном случае выполняет вода. ПДК активизирует не только окислительное декарбоксилирование пирувата, но и 2-оксоглутарата, хотя и с меньшей скоростью, а также, возможно, 2-оксоизокапроната и 2оксокапроната. Значение ПДК определяется в основном широким участием субстратов и продуктов реакции в энергетическом метаболизме митохондрий. Дегидрогеназы 2-оксокислот частично способны осуществлять реакции переаминирования с образованием соответствующих аминокислот, что определяет связь между обменом углеводов и белков. Конечный продукт аэробного окисления глюкозы – ацетил-КоА, образующийся в результате пируватдегидрогеназной реакции, окисляется в цикле Кребса или используется на построение кетоновых тел, стеринов, жирных кислот, фосфолипидов и других соединений. Фактически, на уровне пируватдегидрогеназной реакции осуществляется регуляция распределения потока углеводов от гликолиза к липолизу, кетогенезу и циклу трикарбоновых кислот (ЦТК). 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (2-ОГДК, КФ - 1.2.4.2) На важном участке цикла трикарбоновых кислот расположен 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс. Продуктами реакции являются сукцинил-КоА и СО2: и 2-КГ + НАД+ + КоА-SН сукцинил-S-КоА + СО2 + НАДН + Н+. Процесс протекает в несколько стадий и аналогичен окислительному декарбоксилированию пирувата. 2-ОГДК, катализирующий реакцию окисления 2-оксоглутарата в сукцинил-КоА, выделен из различных тканей животных и человека, растительных тканей, а также из микроорганизмов. Процесс протекает в несколько стадий, и продуктами реакции являются сукцинил-КоА и СО2: 2КГ + НАД+ + КоА-SН сукцинил-S-КоА + СО2 + НАДН + Н+. 2-ОГДК из сердца свиньи имеет молекулярную массу 2,7 млн. Да /80/. 2-ОГДК расположен на важном этапе цикла трикарбоновых кислот. 2-ОГДК по сравнению с ПДК является менее изученным ферментом. 20 В состав 2-ОГДК входят три индивидуальных фермента: Е1 – 2-оксоглутаратдегидрогеназа Е2 – дигидролипоамидсукцинилтрансфераза Е3 – липоамиддегидрогеназа. Связи, существующие между ферментами в комплексе, не являются ковалентными. Показано, что [Е2] и [Е1] компоненты способны диссоциировать из комплекса уже в процессе их выделения. При образовании структуры комплекса, ферменты связываются между собой не хаотически, а в строго определенной последовательности. [Е1] и [Е3] компоненты никогда не связываются между собой, однако, легко образуют субкомплексы с липоилтрансацетилазным компонентом. На поверхности этого компонента – ядре комплекса, по всей вероятности, имеются специфические места для присоединения молекул [Е1] и [Е3]. Количественное соотношение ферментов в 2-ОГДК животного и бактериального происхождения одинаково: к одной молекуле липоамиддегидрогеназы присоединяется по 6 молекул димерных дегидрогеназного и дигидролипоамидсукцинилтрансферазного компонентов. Принцип их взаимного расположения по периферии комплекса остается пока не выясненным. Из всего сказанного выше ясно, что структура 2-ОГДК строга, упорядочена и компактна. Все химические превращения субстратов происходят в пределах фиксированной структуры комплекса, в которой многочисленные полипептидные цепочки белков плотно и определенным образом закреплены, а продукты промежуточных каталитических превращений не выделяются в среду. Было показано, что в состав 2-ОГДК входят 6 молекул связанного тиаминдифосфата, 6 молекул связанного липоата и 9 молекул связанного флавинадениндинуклеотида окисленного. Выявлены множественные сходные черты в структуре 2-ОГДК и ПДК, особенно в компоненте Е2, который выполняет как структурную, так и каталитическую функцию. Флавопротеиновые компоненты обоих комплексов взаимозаменяемы: липоилдегидрогеназа, выделенная из ПДК, может при реконструкции включаться в 2-ОГДК (и наоборот) без нарушения его каталитических свойств. Пируват является плохим субстратом для 2-ОГДК, но он полностью восстанавливает связанный с 2-ОГДК ФАД. Высказано предположение, что 2ОГДК может в качестве компонента Е1 содержать пируватдегидрогеназу (10 %) и 2-оксоглутаратдегидрогеназу (90 %). 2-ОГДК располагается на внутренней мембране митохондрий с помощью двух центров связывания, расположенных на его противоположных сторонах. Молекулярная масса комплекса 8 МДа. Предполагается, что комплекс ферментов цикла трикарбоновых кислот, названный Любаревым и Курчановим метаболоном, взаимодействует с другими мультиферментными комплексами цепи переноса электронов. Исследования последних лет показали, что комплексы дегидрогеназ 2-оксокислот включены в состав митохондриальных белков и являются интегральной частью белковых ансамблей митохондрий. Регуляция активности дегидрогеназ 2-оксокислот Все комплексы дегидрогеназ 2-оксокислот являются амфиболическими полиферментными системами, подверженными многостороннему метаболическому контролю, который базируется в основном на трех различных механизмах: ингибировании ферментных комплексов конечными продуктами реакций окислительного декарбоксилирования 2-оксокислот на уровне активных центров; цикличном фосфорилировании – дефосфорилировании; аллостерическом действии эффекторов. Относительная значимость каждого из названных механизмов различна в регуляции дегидрогеназ 2-осокислот и зависит от общего метаболического уровня и периода физиологического развития организма. Активность двух из трех мультиферментных комплексов семейства дегидрогеназ 221 осокислот – пируватдегидрогеназного комплекса (ПДК) (КФ 1.2.4.1/2.3.1.12/1.8.1.4) эукариот (млекопитающих, птиц, растений, круглых червей нематод Ascaris suum, грибов Neurospora crassa и Saccharomyces cerevisiae) и комплекса дегидрогеназ разветвленных αкетокислот (КДРК) (КФ 1.2.4.4/2.3.1.12/1.8.1.4) млекопитающих – регулируется фосфорилированием (инактивация) и дефосфорилированием (активация) α-субъединиц тетрамерного (α2β2) компонента Е1 этих комплексов. У прокариот регуляция активности комплексов дегидрогеназ 2-осокислот фосфорилированием – дефосфорилированием не обнаружена. Реакция фосфорилирования трех центров α-субъединиц компонента Е1 (α2β2) ПДК млекопитающих в условиях in vivo осуществляется находящейся в составе комплекса киназой пируватдегидрогеназы (КПД) (КФ 2.7.1.99). Дефосфорилирование компонента Е1 осуществляет фосфатаза пируватдегидрогеназы (ФПД) (КФ 3.1.3.43), для которой в настоящее время достоверно не установлен не только детальный механизм гидролиза фосфатных групп Е1, но и механизм взаимодействия с ПДК. Киназа пируватдегидрогеназы прочно присоединена к ПДГ, а фосфатаза – связана с мультиферментным комплексом слабо и требует Са++. Многочисленными работами установлены центры фосфорилирования, выявлена роль отдельных центров фосфорилирования, определена аминокислотная последовательность вокруг них. Активность киназы пируватдегидрогеназы (КПД) определяется активностью семейства белков (КПД 1 – 4). КПД2 и КПД4 выделяются из большинства тканей и органов тела, локализация КПД1 ограничена сердцем и панкреатическими островками, а КПД3 – почками, мозгом и яичками. Активность КПД4 избирательно повышается в течение продолжительного времени в большинстве тканей в ответ на голодание и нарушения гормонального баланса, такие как диабет и гипертиреоидизм. Увеличение экспресии КПД2 и КПД4 связано с тканями, в которых происходит глюконеогенез, почками и печенью, в которых метаболизируется пируват. В число факторов, регулирующих экспрессию КПД4, входят окисление жирных кислот и соответствующее действие инсулина. КПД4 является также прямой и непрямой мишенью пероксисомного пролифератор-активируемого рецептора альфа, недостаток которого в печени и почках ограничивает повышение активности КПД4, связанное с голоданием, а роль его в сердце и скелетных мышцах более сложна. Фармакологическая модуляция активности КПД необходима для управления глюкозным, липидным и лактатным гомеостазом всего организма в состоянии болезни и указывает на то, что терапевтическое вмешательство должно быть направлено на отдельные ткани для того, чтобы не нарушить гомеостаз всего организма. Изоферменты киназы пируватдегидрогеназы различаются по способности + + + реагировать на НАДН и НAДН +ацетил-КоА. НАДН только стимулирует деятельность КПД1 и КПД2 на 20 и 30 % соответственно, но НАДН++ацетил-КоА активирует их на 200 и 300 %. КПД3 практически была неотзывчива на НАДН+ и НАДН++ацетил-КоА. КПД4 активизируется незначительно и практически в равной степени НАДН+ и НАДН++ацетилКоА. Это указывает на уникальное тканевое распределение и кинетические характеристики изоферментов киназы пируватдегидрогеназы. Межбелковые взаимодействия играют также важную роль в регуляции ферментативной активности киназы пируватдегидрогеназы. Взаимодействие между отдельными изоферментами киназы пируватдегидрогеназы и доменом L2 изоэнзим-специфично и может быть одним из важнейших факторов, определяющих активность киназ отдельных изоферментов в отношении пируватдегидрогеназного комплекса. Дефосфорилирование компонента Е1 осуществляет фосфатаза пируватдегидрогеназы (ФПД) (КФ 3.1.3.43), для которой в настоящее время достоверно не установлен детальный механизм гидролиза фосфатных групп Е1 и механизм взаимодействия с ПДК. 22 ФПД из различных тканей, принадлежащим разным организмам, является гетеродимером (αβ), состоящим из каталитической и регуляторной субъединиц. Регуляторная субъединица имеет в составе ФАД, функция которого пока не установлена. ФПД имеет некоторые различия в структуре и регуляции своей активности в различных тканях, а также молекулярную массу димера, каталитической и регуляторной субъединиц. Основными регуляторами активности ФПД млекопитающих, которые непосредственно взаимодействуют с молекулой ФПД, являются ионы Ca2+, Mg2+, полиамины (спермин, спермидин, путресцин) и НАДH/НАД+. Без наличия в среде Mg2+ ФПД млекопитающих неактивна. Пируватдегидрогеназный комплекс инактивируется во многих тканях во время голодания и при диабете для сберегания трикарбоновых соединений для глюконеогенеза, что достигается при помощи увеличения активности киназы ПДГ в связи с экспрессией фосфатазы пируватдегидрогеназы. То есть взаимно противоположные изменения экспрессии специфичных изоформ киназы прируватдегидрогеназы и фосфатазы прируватдегидрогеназы вносят вклад в фосфорилирование, а следовательно, инактивацию пируватдегидрогеназного комплекса в сердце и почках при голодании и диабете. Таким образом инактивация комплекса играет решающую роль для сохранения субстратов при их недостатке, в то время как достаточная активность ферментного комплекса необходима для синтеза АТФ и жирных кислот из глюкозы. Следующим механизмом регуляции активности ПДК является ее ингибирование конечными продуктами реакции окислительного декарбоксилирования субстратов на уровне активных центров: ацетил-КоА и НАДH. Ингибирование полиферментного пируватдегидрогеназного комплекса различными ацил-КоА: ацетил-КоА, пропионил-КоА и изовалероил-КоА показало, что все они ингибируют ПДК конкурентно по отношению к КоА, а пропионил-КоА и изовалероил-КоА – неконкурентно по отношению к НАД. Важное значение имеет регуляция ПДК различными гормонами и ингибирование жирными кислотами. Увеличение активности ПДК отмечено про действии ряда гормонов на клетки и выражается в увеличении доли ПДКа (нефосфорилированной) в матриксе, то есть осуществляется через стимуляцию ФПД. В случае действия Са2+ мобилизующих гормонов (вазопрессин, ангиотензин II), катехоламинов и глюкагона стимуляция ФПД опосредуется через увеличение внутримитохондриальной концентрации ионов кальция, а в случае действия на клетки инсулина эта стимуляция опосредуется через другой, не установленный окончательно посредник, предположительно через полиамины. Считается, что действие гормонов сводится к увеличению отношения ПДКанефосфор. : ПДКвфосфор. в матриксе. Скорость фосфорилирования в значительной степени модулируется соотношениями концентраций АТФ : АДФ, НАДН : НАД+, ацетил-КоА : КоА и концентрацией пирувата. Пируватдегидрогеназный комплекс в растительной клетке испытывает несколько взаимодействующих уровней регуляции. Первый уровень – субклеточная компартментация: клетка обладает двумя различными пространственно размещенными формами ПДК: митохондриальной и пластидной. Митохондриальный пируватдегидрогеназный комплекс – место включения углерода в ЦТК, в то время как пластидный пируватдегидрогеназный комплекс поставляет ацетил-КоА и НАДН для синтеза жирных кислот de novo. Второй уровень регуляции активности ПДК – контроль экспрессии генов. Экспрессия генов, кодирующих субъединицы митохондриального и пластидного ПДК, подчиняется программе развития и дополнительно зависит от физиологических условий и факторов среды. В-третьих, как митохондриальный, так и пластидный ПДК чувствительны к ингибированию продуктом и, возможно, к метаболитным эффекторам. Наконец, две 23 разные формы комплекса регулируются различными органеллоспецифическими механизмами. Активность митохондриального ПДК регулируется обратимым фосфорилированием, катализируемым внутренними киназными и фосфатазными компонентами. Дополнительный уровень чувствительности обеспечивается метаболитным контролем активности киназ. Пластидный ПДК не регулируется обратимым фосфорилированием. Его активность в значительной мере контролируется физическими условиями среды пластидной стромы. Таким образом, регуляция ПДК животного и растительного происхождения уникальна, поскольку определяет переключение метаболических потоков, а специализация клеток определяет особенности регуляции комплекса в клетках каждого типа. Витаминная и коферментная регуляция активности дегидрогеназ. В составе комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот имеются коферменты: ТПФ, КоА, НАД+, ФАД и липоевая кислота, изменение содержания которых в органах и тканях влечет за собой изменение активности комплексов. Главную роль в процессах регуляции на уровне коферментов многие исследователи отдают ТПФ ввиду его участия в лимитирующей реакции окислительного декарбоксилирования 2-оксокислот в составе компонентов Е1 комплексов дегидрогеназ 2оксокислот. Помимо коферментной, ТПФ играет и регуляторную роль в функционировании комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот. При введении тиамина отмечено повышение активности ПДК в тканях экспериментальных животных. Однако, отмечено и отрицательное влияние тиамина на активность ПДК для животных, получивших после голодания высокоуглеводный рацион. Введение тиамина в этом случае приводит к изменению соотношения активности регуляторных ферментов ПДК, так как активация фермента в присутствии Mg2+ и АДФ почти полностью снимала отрицательный эффект тиамина. Возможно также, что связывание ТПФ, Mg2+ и АМФ индуцируют конформационные изменения, приводящие фермент в активное состояние. Для 2-оксоглутаратдекарбоксилазы отмечена стабилизация ТПФ совместно с Са2+ и Mg2+ при повышении температуры. Другие коферменты дегидрогеназ 2-оксокислот выполняют свои функции на уровне компонентов, которые не ограничивают скорость суммарной реакции и поэтому гораздо меньше подходят для регуляторных целей. Однако, значимость их приобретает все больший эффект в последнее время, особенно для 2-ОГДК, для которого отсутствует механизм регуляции активности путем фосфорилирования – дефосфорилирования. Установлена гиперболическая зависимость начальной скорости реакции, катализируемой ПДК из надпочечников быка, от концентрации пирувата, КоА и НАД и отмечен также аналогичный эффект для начальной скорости реакции, катализируемой ОГДК, которая зависела от концентрации 2-оксоглутарата, КоА и НАД в присутствии Фн. Сукцинил-КоА ингибирует ОГДК по конкурентному типу в отношении КоА, а НАДН – по смешанному типу в отношении 2-оксоглутарата и НАД+, что объясняется его влиянием не только на первый компонент комплекса. Отмечена видоспецифичность в функционировании оксоглутараного комплекса из сердечной мышцы взрослого человека и крысы. Подавление активности липоатдегидрогеназы ОГДК связано с изменением структуры активного центра, так как изменяется связь между ФАД и белком. Аналогичные данные получены и для ПДК. Активизирующим действием на дегидрогеназы 2-оксокислот обладает липоевая кислота. В ряде работ установлено, что при введении моновитаминов животным в терапевтических дозах наибольшим активирующим эффектом для ПДК и 2-ОГДК 24 обладали липоат, пантотенат и тиамин, а рибофлавин и никотинат – в наименьшей степени. Причем, действие пантотената было двухстадийным, что согласуется с закономерностями динамики биосинтеза КоА в печени крыс после инъекции им этого витамина, установленным в нашей лаборатории. Двухфазная динамика действия на активность дегидрогеназ 2-оксокислот отмечена и для витамина В1, причем она отражает процесс обновления тиамина в исследуемых органах крыс. Коферментные формы каждого из рассматриваемых витаминов (особенно никотиновой и пантотеновой кислот) участвуют в катализе огромного числа реакций. И во многих из них могут выявляться, или уже выявлены, те или иные виды взаимодействия с другими коферментами. Однако наиболее ярко и полно взаимодействие этих витаминов проявляется в их совместном участии в построении и функционировании мультиэнзимных комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот: пируватдегидрогеназы и 2оксоглутаратдегидрогеназы. Особое место в проблеме регуляции активности дегидрогеназ 2-оксокислот занимает вопрос о взаимодействии их коферментов и апоферментов. Наличие определенных их соотношений приводит к реконструкции мультиэнзимных комплексов. Необходимо подчеркнуть, что эта зависимость не существует в «чистом виде», а всегда неизбежны диетические, гормональные, возрастные и другие наслоения. Лабораторная работа № 4 ПОЛУЧЕНИЕ ТКАНЕВЫХ ГОМОГЕНАТОВ ОРГАНОВ ИНТАКТНЫХ КРЫС Необходимые реактивы: 1) Сахароза – 0,25 М 2) Калий-натрий фосфатный буфер (KH2PO4; Na2HPO4∙2H2O) рН 7,4 – 1/15 М 3) NaOH – 1н Ход работы: Извлекаем исследуемые органы (печень, мозг, почки и др.) и помещаем их в стоящие на льду стаканчики с охлажденной 0,25 М сахарозой. Органы промываем, просушиваем фильтровальной бумагой от избытка сахарозы и отвешиваем один грамм ткани. Навеску измельчаем ножницами и помещаем в стеклянный гомогенизатор (PotterElveheim) с тефлоновым пестиком, добавляем 9 мл охлажденной 0,25 М сахарозы. Гомогенизатор помещаем в резиновый мешочек со льдом. Ткань разрушаем вращением пестика со скоростью 2000 об/мин при одновременном движении стеклянного корпуса вверх и вниз в течение 60-70 сек. Такая обработка обеспечивает получение гомогената, почти не содержащего неразрушенных клеток и поврежденных митохондрий. Лабораторная работа № 5 ВЫДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ФРАКЦИИ МИТОХОНДРИЙ Из гомогенатов тканей, полученых в ходе лаб. р. № 1 выделяем митохондрии по методу Джонсона и Ларди, осаждая при 12000 об/мин в течении 20 мин, осаждая при этом общую фракцию митохондрий. Осадок митохондрий промываем и вновь осаждаем при 25 тех же условиях. Общую фракцию митохондрий подвергаем трехкратному замораживанию-оттаиванию для того, чтобы разрушить мембраны митохондрий и обеспечить максимальную доступность субстрата и кофакторов к ферменту (либо можно митохондрии поместить в дистилированою воду из расчета 1 : 4 для осмотического шока). Во всех гомогенатах и митохондриях определяем белок методом Лоури или биуретовым методом. В гомогенатах и митохондриальной фракции определяем скорость окисления пирувата и 2-оксоглутарата, сукцината. Лабораторная работа № 6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ОКИСЛЕНИЯ ПИРУВАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА И 2-ОКСОГЛУТАРАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА В ГОМОГЕНАТАХ И МИТОХОНДРИЯХ ТКАНЕЙ ОРГАНОВ КРЫС ФЕРРИЦИАНИДНЫМ МЕТОДОМ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В ГОМОГЕНАТАХ И МИТОХОНДРИЯХ ФЕРРИЦИАНИДНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ОКИСЛЕНИЯ ПИРУВАТА И 2-ОКСОГЛУТАРАТА Необходимые реактивы: 1) Калий-натрий фосфатный буфер (KH2PO4; Na2HPO4∙2H2O) рН 7,4 2) Сахароза – 0,25 М 3) MgSO4 (сернокислый магний) – 20 мкМ 4) ЭДТА – 2 мкМ 5) α-КГ (ПВ–Na, сукцинат) – 20 мкМ 6) АТФ – 6 мкМ 7) феррицианид калия (K3[Fe(CN)6]) – 4,66 мкМ 8) ТХУ – 50 % Метод основан на измерении экстинции (при 417 нм) феррицианида, добавленного в инкубационную среду, содержащую гомогенат (или митохондрии), 2-оксоглутарат (или пируват, сукцинат) и все необходимые для его окисления компоненты после осаждения белков трихлоруксусной кислотой. Стандартную инкубационную среду на одну пробу готовим в следующем порядке и соотношениях: − калий-натрий фосфатный буфер рН 7,4 – 7,5 мкМ – 0,5 мл − сахароза – 425 мкМ – 1,7 мл − сернокислый магний (MgSO4) – 20 мкМ – 0,1 мл − ЭДТА – 2 мкМ – 0,1 мл − α-КГ (или пируват, сукцинат) – 20 мкМ – 0,1 мл − АТФ – 6 мкМ – 0,1 мл − феррицианид калия (K3[Fe(CN)6]) – 4,66 мкМ – 0,7 мл Реакцию начинаем добавлением 0,4 мл суспензии тканевого гомогената (или митохондрий). Таким образом, объем инкубата составляет 3,7 мл. Контрольные пробы содержат все перечисленные ингредиенты, за исключением субстрата, вместо которого вносим 0,1 мл физраствора. После добавления гомогената (митохондрий) пробирки ставим в термостатируемую водяную баню при температуре 37 ºС. По истечении 30 мин пробы 26 вынимаем, останавливаем реакцию добавлением 0,3 мл трихлоруксусной кислоты (ТХУ), которая вызывает полное осаждение находящихся в пробе белков. Осадок удаляем центрифугированием при 600 g в течении 10 мин. Надосадочную жидкость спектрофотометрируем на спектрофотометре СФ-4А при 417 нм в увиолиевых кюветах с толщиной слоя 10 мм. Определение ферментной активности проводим в пересчете на мг белка гомогената ткани или митохондрий по формуле: K 3 FeCN 6 (C K CO ) 4,05 1000 , m где СК – содержание феррицианида в мкМ в контрольном опыте, то есть в пробе, содержащей все ингредиенты стандартной смеси и гомогенат (митохондрии), за исключением субстрата; СО – содержание феррицианида в мкМ в исследуемой пробе после инкубации гомогената (митохондрий) с субстратом в тех же условиях; m – содержание белка в пробе мг, определенное методом Лоури. При пересчете ферментативной активности на мг белка в формулу вводили коэффициент 1000, поскольку активность выражали не в мкМ, а в нМ. Определение ферментативной активности в пересчете на 1 г ткани производим по формуле: K 3 FeCN 6 C K CO 25 , где коэффициент 25, учитывающий разведение гомогената. Таким образом, скорость окисления 2-оксоглутарата или пирувата выражаем в нМ восстановленного феррицианида на мг белка за 30 мин. инкубации или в мкМ восстановленного феррицианида на 1 г ткани за 30 мин. инкубации. 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА МУЛЬТИЭНЗИМНЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ 2-ОКСОКИСЛОТ (по Роше и Кейт) Лабораторная работа № 7 ВЫДЕЛЕНИЕ И ПОЭТАПНАЯ ОЧИСТКА МУЛЬТИЭНЗИМНЫХ КОМПЛЕКСОВ: ПДК И 2-ОГДК Необходимые реактивы: 1) Сахароза – 0,25 М 2) Калий-натрий фосфатный буфер (KH2PO4; Na2HPO4∙2H2O) рН 7,4 – 1 мМ 3) Сахарозофосфатный буфер: 0,25 М сахароза (970 мл) + 1 мМ калий-натрий фосфатный буфер рН 7,4 (30 мл) 4) ЭДТА – 0,1 мМ 5) Калий-натрий фосфатный буфер (KH2PO4; Na2HPO4∙2H2O) рН 7,4 – 5 мМ 6) Калий-натрий фосфатный буфер (KH2PO4; Na2HPO4∙2H2O) рН 6,5 – 0,1 мМ 7) NaCl – 5 М 27 8) Сиворотка кролика 9) MgCl2 – 1 М 10) ПЕГ (полиетиленгликоль) – 25 % 11) Дитиотреотол – 0,2 мМ 12) ЭДТА – 0,2 мМ 13) Сахароза – 12,5 % 14) HEPES-буфер рН 7,2 – 0,05 М 15) EGTA – 0,5 М Одноразово брали печень 50 крыс (~500 г печени) гомогенизируем в сахарозофосфатном буфере (pH 7,4) в отношении 1:9 при температуре 4ºС. Затем гомогенат центрифугируем при 600 g 10 мин. для удаления ядер. Супернатанты объединяем и центрифугируем при 18000 g 25 мин. Таким образом, в осадке получаем общую фракцию митохондрий. Митохондриальный осадок был последовательно промыт посредством ресуспендирования и последующего центрифугирования в четырех средах. Реактивы: I промывка: сахарозо-фосфатная среда, состоящая из: 0,25 М сахароза; 0,1 мМ ЭДТА; 1 мМ калий-натрий фосфатный буфер, рН 7,2; II промывка: сахарозо-фосфатная среда, состоящая из: 0,25 М сахароза; 5 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,2; III промывка: сахарозо-фосфатная среда, разведенная в 5 раз дейонизированной водой, содержащей 0,1 мМ ЭДТА; VI промывка: 0,02 калий-фосфатный буфер, рН 6,5; 0,1 мМ ЭДТА Первая промывка осуществляется сахарозофосфатной средой в отношении 1:4. Второй средой промываем в отношении 1:4. Третьей средой промываем в отношении 1:1. Четвертая промывка проводится в четырехкратном объеме 0,02 М калий-фосфатного буфера с добавлением ЭДТА. Полученные после последней промывки митохондриальные осадки ресуспендируем в минимальном объеме 0,02 М калий-фосфатного буфера рН 6,5 с 0,1 мМ ЭДТА, переносим в пластмассовые пробирки и замораживаем в жидком азоте при температуре – 196 ˚С, или в камере глубокой заморозки. Замороженные митохондриальные препараты, храним в жидком азоте, или в камере глубокой заморозки. Размораживаем препарат порциями сначала при комнатной температуре 20 мин., затем под током водопроводной воды до полного оттаивания. Размороженный препарат разбавляем 0,02 М калий-фосфатным буфером рН 6,5 из расчета 250 г митохондрий до 1000 мл, до концентрации белка 10 мг/мл, затем добавляем 5 мл 5 М NaCl и 10 мл сыворотки крови кролика. Суспензию центрифугировали при 18000 g 15 мин., в полученном экстракте определяем белок. Экстракт разбавляем 0,02 М калийфосфатным буфером рН 6,5, добавляем сыворотку кролика из расчета 2 % на конечный объем для стабилизации дегидрогеназ 2-оксокислот. Сыворотку крови кролика готовим заранее: 2 часа отстаиваем кровь с последующим центрифугированием крови 30 мин при 3000 об/мин. 28 Лабораторная работа № 8 РАЗДЕЛЕНИЕ ДЕГИДРОГЕНАЗ 2-ОКСОКИСЛОТ И ИХ ОЧИСТКА Доводим рН митохондриального экстракта до 6,5 и для активации фермента добавляем 1 мл 1 М MgCl2 на 100 мл экстракта. Инкубируем в течение 20 мин при 20ºС. После окончания инкубации проводим первое осаждение 2-ОГДК и ПДК полиэтиленгликолем. Все процедуры, связанные с фракционированием ферментов, включая центрифугирование, проводим при комнатной температуре. К экстракту по каплям добавляем 25 % раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации его в растворе 7 % и перемешиваем 10 мин., используя магнитную мешалку. Затем центрифугируем при 18000 g 15 мин. В осадок переходят пируватдегидрогеназный и 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплексы. Полученный осадок гомогенизируем в 30-50 мл 0,02 М калийфосфатного буфера (рН 7,2), содержащем 0,2 мМ ЭДТА и 0,5 мл дитиотреитола. Суспензию оставляем на 1,5 часа (или на ночь в холодильнике на магнитной мешалке). Основная порция осадка не растворяется в буфере и его удаляем центрифугированием при 15000 g 15 мин. В полученном супернатанте определяем содержание белка. В случае необходимости белок разбавляем 0,02 М калий-фосфатным буфером рН 6,5 до концентрации 8-10 мг на 1 мл. СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ 2-ОГДК, ПДК Выделение митохондрий I промывка II промывка Замораживание митохондрий в жидком азоте Оттаивание Осаждение балластных белков III промывка IV промывка Активация фермента Mg2+ В осадке α-КГДК Осаждение ПДК 2-ОГДК ПЭГ 7 % насыщения Осаждение ПДК из супернатанта 7 % насыщением Отделение 2-ОГДК от ПДК 3,5 % насыщением ПЭГ Ультрацентрифугирован ие ферментов 29 Для того, чтобы отделить ПДК от 2-ОГДК, добавляем полиэтиленгликоль до конечной концентрации его в растворе 3,5 %. Осадок 2-ОГДК отделяем центрифугированием при 18000 g 15 мин, а из полученного супернатанта осаждаем ПДК доведением полиэтиленгликоля в растворе до конечной концентрации 7 %. Осадок ПДК собираем центрифугированием при 8 000 g в течение 15 мин. Супернатант, содержащий фосфатазу ПДК в дальнейшем не используем. Осадки 2-ОГДК и ПДК суспендируем в 30-50 мл HEPES-буфера с добавками. Суспензии оставляем на 1 час на холоду. Далее супернатанты наслаиваем на 12,5 % сахарозу, приготовленную на HEPESбуфере, содержащем 0,5 М EGTA. Затем проводим ультрацентрифугирование при 140 000 g 6 часов на малом бакетроторе. Осадки суспендируем в минимальном объеме 0,05 М HEPES-буфера рН 7,2 и определяем содержание белка. С этими препаратами проводим дальнейшие опыты. Лабораторная работа № 9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕНЫХ И ОЧИЩЕННЫХ МУЛЬТИЭНЗИМНЫХ КОМПЛЕКСОВ: ПДК И 2-ОГДК. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ПО ЛОУРИ, РАСЧЕТ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ Необходимые реактивы: 1) Буфер трис-НСl рН 7,4 – 7,6 – 140 мкМ 2) α-КГ – 5 мкМ 3) пируват - Na – 5 мкМ 4) MgCl2 – 20 мкМ 5) Тиаминпирофосфат (ТПФ) – 2 мкМ 6) НАД – 2 мкМ 7) Меркаптоэтанол – 5 мкМ 8) ЭДТА – 1 мкМ 9) КоА – 0,1 % 10) Буфер трис-НСl рН 8,0 – 70 мМ Активность ферментного комплекса спектрофотометрическим методом основано на регистрации восстановления НАД. 2-ОГДК (ПДК) осуществляет окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата (пирувата) с одновременным восстановлением НАД по схеме: -КГ (ПВ) + КоА-SH + НАД 2-ОГДК (ПДК) сукцинил-КоА + СО2 + НАДН +Н+ Скорость накопления в инкубационной среде восстановленной формы НАД, измеряем спектрофотометрически при длине волны 340 нм, что отражает скорость окисления субстрата и служит мерой активности ферментативного комплекса. Инкубационная среда для проведения ферментативной реакции содержит следующие компоненты в мкмолях (в расчете на одну пробу объемом 1,8 мл): − Буфер трис-НСl − 2-Оксоглутарат (пируват) – 140 –5 30 − MgCl2 − Тиаминпирофосфат (ТПФ) − НАД − Меркаптоэтанол − ЭДТА – 20 –2 –2 –5 –1 Инкубационную среду готовили непосредственно перед использованием. 0,1 % раствор КоА готовим на буфере трис-НСl (70 мМ, pH 8,0) перед спектрофотометрированием. Для определения ферментативной реакции в кювету спектрофотометра шириной 1 см вносим 1,8 мл инкубационной среды, добавляем 0,1 мл митохондриального препарата и устанавливаем щель прибора. Реакцию начинаем внесением в кювету 0,1 мл раствора коэнзима А. Изменение оптической плотности пробы, вызванное образованием восстановленной формы НАД, регистрируем при длине волн 340 нм через каждые 15 сек в течение 2 мин. Активность 2-оксоглутаратдегидрогеназы или пируватдегидрогеназного комплекса (в нмолях НАДН/мин на 1 мг белка) вычисляем по формуле: X = EV/6,22a, где E – изменение оптической плотности пробы за 1 мин; V – конечный объем пробы в кювете (2,0 мл); 6,22 – коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов при длине волны 340 нм; a – количество белка в пробе, определенное методом Лоури параллельно с проведением ферментативного анализа в той же суспензии митохондрий, мг. Лабораторная работа № 10 КОФЕРМЕНТНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ОЧИЩЕННЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ in vitro Регуляция активности дегидрогеназ 2-оксокислот коферментами in vitro Приготовление растворов Коферменты Молекулярная масса, кДа Раствор № 1 Раствор № 2 Раствор № 3 1,0 мМ 0,1 мМ 0,01 мМ 4,12 мг в 20 мл 2 мл р-ра № 1 2 мл р-ра № 2 буфера + 18 мл буфера + 18 мл буфера 8,72 мг в 20 мл 2 мл р-ра № 1 2 мл р-ра № 2 ТРР 436 буфера + 18 мл буфера + 18 мл буфера 15,50 мг в 20 мл 2 мл р-ра № 1 2 мл р-ра № 2 КоА 467,5 буфера + 18 мл буфера + 18 мл буфера 13,26 мг в 20 мл 2 мл р-ра № 1 2 мл р-ра № 2 НАД 663,5 буфера + 18 мл буфера + 18 мл буфера Примечание: все растворы коферментов готовили на 0,1 М калий – фосфатном буфере рН 8,0. ЛК 206,3 31 КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Где и когда были приняты современная класификация и номенклатура ферментов? 2. Какой критерий положен в основу классификации ферментов? 3. Как делятся ферменты по действию классификацией и номенклатурой? 4. Как построена современная рациональная (системная) номенклатура ферментов? 5. На сколько классов делятся ферменты? 6. Израсходуются ли ферменты в процессе катализа? 7. Что такое положительный катализ? 8. Что такое отрицательный катализ? 9. Какие связи принимают участие в образовании фермент-субстратного комплекса? 10. Какими методами можно получить информацию о природе связей между субстратом и контактною областью активного центра фермента? 11. Какие основные механизмы действия ферментов? 12. Дайте определение ферментативной кинетики химических реакций? 13. Дайте определение константы равновесия ферментативной химической реакции? 14. Дайте определение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса? v [s] v max ? K s [s] 15. Что описывает уравнение Михаэлиcа-Ментен: 16. Что характеризует константа Михаэлиcа (Кm)? 17. Какие основные функции апофермента? 18. Что представ лет структура активного центра фермента? 19. Какая часть фермента определяет его специфичность? 20. Охарактеризуйте каталитическую область активного центра? 21. Что представляет собой контактная (якорная) область активного центра? 22. В каких единицах выражается скорость ферментативной реакции? 23. Дайте определение удельной активности фермента? 24. Как обеспечивается стабилизация высших структур белковой молекулы? 25. Какие АК берут участие в образовании ион-ионных связей? 26. Какие группы берут участие в образовании водородных связей между пептидными цепями? 27. Вторичная и надвторичная структура ферментов. 28. Силы, стабилизирующие третичную структуру ферментов. 29. Функции четвертичной структуры ферментов. 30. Механизмы формирования пространственной структуры белка, роль рибосом. 31. Стадии сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию и формирование элементов вторичной и третичной структуры. 32. Внутриклеточная регуляция формирования пространственной структуры белка. 33. Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания белка. 34. Шапероны и шаперонины, роль в поддержании нативной конформации белка. 35. Роль белок-белковых взаимодействий в формировании пространственной структуры. 36. α-спираль и β-структура полипептидных цепей ферментов. 37. Формирование активного центра ферментов. 38. Строение активного центра фермента. 39. Гетерогенность микросреды поверхностного шара активного центра. 40. Фермент-субстратный комплекс. Механизмы сорбции. 41. Причины ускорения реакций ферментами. 42. Полифункциональный характер химических механизмов ферментативного катализа. 43. Теория индуцированного соответствия Кошланда. 44. Теория переходного состояния Холдейна и Полинга. 45. Теория напряжения Ламри, Эйринга, Дженкса. 32 46. Кинетика и термодинамика ферментативного катализа. 47. Аллостерические многоцентровые ферменты, коэфициент А. Хила. 48. Биологическое значение Кm. 49. Лианеризация уравнения Михаэлиса-Ментен, его значение. 50. Конкурентное и неконкурентное ингибирование, графическая интерпретация. 51. Аллостерический механизм регуляции активности ферментов. 52. Диссоциативная регуляция активности ферментов. 53. Адсорбционная регуляция активности ферментов. 54. Регуляция активности ферментов ковалентным связыванием. 55. Регуляция ограниченным протеолизом активности ферментов. 56. Адсорбционный механизм регуляции активности ферментов. 57. Физиологические последствия адсорбции ферментов. Компартментализация метаболитов. 58. Сборка мультиферментных комплексов на субклеточных структурах. 59. Регуляция активности ферментов путем постсинтетической модификации. 60. Регуляция количества ферментов. 61. Регуляторная роль изоферментов. 62. Кислотно-щелочной катализ и процесс образования и превращения ферментсубстратного комплекса. 63. Дайте определение сукцинатдегидрогеназы. 64. Какие реакции катализирует СДГ у прокариот и эукариот? 65. Опишите строение СДГ. 66. Охарактеризуйте железо-сернистые центры фермента. 67. Опишите механизм функционирования сукцинатдегидрогеназы. 68. Какую роль в каталитической активности играет кофермент витамина В2? 69. Какие ингибиторы активности СДГ вы знаете? 70. Какова роль QPs белков в обеспечении активности фермента СДГ? 71. Какой принцип метода определения активности СДГ? 72. Как расчитывают активность СДГ по представленной методике? 73. Дайте определение алкогольдегидрогеназы. 74. Какие реакции катализирует алкогольдегидрогеназа у прокариот и эукариот? 75. Структура и функции алкогольдегидрогеназы. 76. Механизм катализа алкогольдегидрогеназы. 77. Роль кофермента в каталитической активности алкогольдегидрогеназы. 78. Механизмы регуляции активности алкогольдегидрогеназы.? 79. Принцип метода определения активности алкогольдегидрогеназы. 80. Дайте определение лактатдегидрогеназы. 81. Какие реакции катализирует лактатдегидрогеназа у прокариот и эукариот? 82. Роль кофермента в каталитической активности лактатдегидрогеназы. 83. Структура и функции лактатдегидрогеназы. 84. Механизм катализа лактатдегидрогеназы. 85. Механизмы регуляции активности лактатдегидрогеназы. 86. Принцип метода определения активности лактатдегидрогеназы. 87. Биохимическая роль дегидрогеназ 2-оксокислот (ПДК, 2-ОГДК, СДГ, дегидрогеназы разветленных оксокислот). 88. Структура ПДК. 89. Структура 2-ОГДК. 90. Строение компонентов мультиэнзимных ПДК и 2-ОГДК. 91. Взаимозаменяемость компонентов в структуре комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот. 92. Механизмы действия ПДК. 93. Механизмы действия 2-ОГДК. 94. Коферменты дегидрогеназ 2-оксокислот и участие их в механизме катализа. 33 95. Механизмы регуляции активности ПДК. 96. Механизмы регуляции активности 2-ОГДК. 97. Витаминно-коферментная регуляция активности дегидрогеназ 2-оксокислот. ЛИТЕРАТУРА 1. Ашмарин И.П. Алкогольдегидрогеназа млекопитающих – объект молекулярной медицины // Успехи биологической химии. – т. 43. – 2003. – с. 3-18. 2. Биохимия / Под ред. Е.С. Северина. – 2-е изд. – М: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 784 с. 3. Горячковский А.М. Клиническая биохимия в лабораторной диагностике. – Одесса: Экология. – 2005. – 608 с. 4. Ермаков Г.Л., Гольдштейн Б.Н. Модель пространственного расположениея фосфатазы приуватдегидрогеназы в пируватдегидрогеназном комплексе млекопитающих // Биохимия. – 1999. – Т. 64, вып. 3. – С. 390-399. 5. Камышников В.С. Клинические лабораторные тесты от А до Я и их диагностические профили / Спр. пособие. – М: МЕДпресс-информ, 2007. – 3-е издание. – 320 с. 6. Карпов Л.М. Реализация специфической активности функционально связанных витаминов группы В, их производных и комплексов при различных состояниях организма: дисс. ... докт. биол. наук.- Одесса, 1994.- 505 с. 7. Карпов Л.М., Полеся Т.Л. Действие функционально связанных витаминов и их коферментных форм на активность дегидрогеназ 2-оксокислот в органах мышей // Укр. биохим. журн. – 1989. – Т. 61, № 4. – С. 82-87. 8. Коденцова В.М., Вржесинская О.А., Алексеева И.А. и др. Обмен рибофлавина и функционально связанных с ним ферментов// Вопр. мед. хим.- 1993.- 39, № 5.- С.33-37. 9. Кучеренко Н.Е., Германюк Я.Л., Васильев А.Н. Молекулярные механизмы гормональной регуляции обмена веществ.- К.: Вища школа, 1986.- 248 с. 10. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Надмолекулярная организация ферментов цикла трикарбоновых кислот //Молек. биол.- 1987.- № 49.- Вып.5.-С. 1286-1296. 11. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / Под ред. М. И. Прохоровой. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. - 272 с. 12. Островцова С.А. Свойства оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из сердца человека. Автореф. дис. ... канд. биол. наук.- Минск, 1990. 16 с. 13. Петров С.А. Особенности взаимодействия функционально-связанных витаминов в организме мидий, кефали и крыс. Автореф. дис. ... канд. биол. наук.- Минск, 1979. 23 с. 14. Петров С. А. Регуляция тиамином и его метаболитами процесса образования и обмена аминокислот и кетокислот в организме. Автореф. … докт. биол. наук. Минск. 1992. 48 с. 15. Практикум по биохимии / под. ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А. – 2-е изд. – М: издво МГУ, 1989. – 509 с. 16. Розанов А. Я. Механизмы регуляции биокатализа: Учебн. пособие. – К.: Вища школа, 1989. – 240 с. 17. Сабаляускене В.Л. Выделение, очистка и некоторые свойства пируватдегидрогеназы из мозга. Автореф. дис. ... канд.биол.наук. - Вильнюс, 1980. 18. Сенкевич С.В. Очистка и изучение свойств пируватдегидрогеназного комплекса из митохондрий коры надпочечников быка. Автореф. дис. … канд. биол. наук. Вильнюс, 1992. 19 с. 19. Струмило С.А. Регуляция активности полиферментного пируватдегидрогеназного комплекса тканей млекопитающих //Успехи совр. биол.-1988.- Т. 106.- Вып. I (4).С.54-68. 20. Струмило С. А., Островцова С. А. , Киселевский Ю.В. , Островский Ю. М. , Борисов В. Н., Кинетическая характеристика пируват- и оксоглутаратдегидрогеназного комплексов из сердца человека. М. , 1990. – 10 с. – Деп. В ВИНИТИ 17.01.90, № 341 – 34 В. 21. Струмило С. А., Таранда Н. И., Виноградов В. В. Кинетическое изучение липоамиддегидрогеназы оксоглутаратдегидрогеназного комплекса надпочечников // Известия АН БССР. – 1984. – №4. – С. 111 – 112. 22. Струмило С. А., Таранда Н. И., Виноградов В. В. Кооперативный характер взаимодействия аденозиндифосфата с оксоглутаратдегидрогеназным комплексом коры надпочечников // Докл. Ан БССР. – 1983. – Т. 27, № 3. – С. 128 – 129. 23. Струмило С. А., Таранда Н. И., Виноградов В. В. О роли АТФ в регуляции оксоглутаратдегидрогеназного комплекса коры надпочечников // Вопр. Мед. Химии. – 1982. – Т. 28, № 4. – С. 59-61. 24. Таранда Н.И. Очистка, характеристика, расщепление оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из надпочечников быка и свойства его периферических ферментов. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Минск, 1984. 41 с. 25. Фан Ван Тьи. Липоевая кислота и ее метаболиты как модификаторы активности компонентов мультиэнзимных комплексов – метаболонов, метаболонов, митохондрий, печени, мозга крыс. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Киев, 1990. 17 с. 26. Хайлова Л.С., Корочкина Л.Г., Северин С.Е. Идентификация каталитических центров декарбоксилирующего компонента мышечной пируватдегидрогеназы //Докл. АН СССР.- 1987.- 195.- № 4.- С. 1020-1023. 27. A mitochondrial pyruvate dehydrogenase bypass in the yeast Saccharomyces cerevisiae / Boubekeur S., Bunoust O., Camougrand N. et al. // J. Biol. Chem. – 1999/ – V. 274, № 30. – P. 21044-21048. 28. Activation of the promoters of Arabidopsis genes for the branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase complex in transgenic tobacco BY-2 cells under sugar starvation. / Fujiki Y., Ito M., Itoh T. et al. // Plant Cell. Physiol. – 2002. – V. 43, № 3. – P. 275-280. 29. Adamson S.R., Holmes C.F.B., Stevenson K.J. Acetilable lipoic acid residues interact directly with lipoamid dehydrogenase in the pyruvate dehydrogenase multiensyme complex of Escherichia coli// Biochem.and Cell Biol- 1986.- V. 64, № 3.- P.250-255. 30. Bcl-2-dependent oxidation of pyruvate dehydrogenase-E2, a primary biliary cirrhosis autoantigen, during apoptosis. / Odin J. A., Huebert R. C., Casciola-Rosen L. et al. // J. Clin. Invest. – 2001. – V. 108, № 2. – P. 223-232. 31. Boulatnikov I., Popov K. M. Formation of functional heterodimers by isozymes 1 and 2 of pyruvate dehydrogenase kinase // Biochim. Biophys. Acta. – 2003. – V. 1645, № 2. – P. 183-192. 32. Breidbach T., Ngazoa E., Steverding D. Trypanosoma brucei: in vitro slender-to-stumpy differentiation of culture-adapted, monomorphic bloodstream forms // Exp. Parasitol. – 2002. – V. 101, № 4. – P. 223-230. 33. Bulatnikov I., Popov K.M. Formation of functional heterodimers by izozymes 1 and 2 of pyruvate dehydrogenase kinase // Biochim. Biophys. Acta. – 2003. – V. 1645, № 2. – Р. 183192. 34. Denton R.U., Mc Cormack J.G., Edgell N.J. Role of calcuim ions in the regulation of intramitochondrial metabolism. Effect of Na+ Mg++ and ruthenium red on the Ca++ stimulated oxidation of oxoglutarate and on pyrivate dehydrogenase activity in intact rat heart mitochondria //Biochem. J.-1989.- № 1.-P.107-117. 35. Differential expression of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase in hypothalamic areas of obese Zucker rats. / Kim M.J., Kim Y., Choe B.K. et al. // Neurosci. Lett. – 2000. – V.292, № 1. – P. 60-62. 36. Evidence for existence of tissue-specific regulation of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex / Bowker-Kinley M.M., Davis W.I., Wu P. et al. // Biochem. J. – 1998. – V. 329, Pt. 1. – P. 191-196. 37. Expression and regulation of pyruvate dehydrogenase kinase isoforms in the developing rat heart and in adulthood: role of thyroid hormone status and lipid supply / M.C. Sugden, 35 M.L.Langdown, R.A.Harris, M.J.Holness // D. Biochem. J. – 2000. – V. 352, Pt. 3. – P. 731738. 38. Expression of pyruvate dehydrogenase isoforms during the aerobic/anaerobic transition in the development of the parasitic nematode Ascaris suum: altered stoichiometry of phosphorylation/inactivation / Huang Y.J., Walker D., Chen W. et al. // Arch. Biochem. Biophys. – 1998. – V. 352, № 2. – P. 263-270. 39. Hengeveld A.F., de Kok A. Structural basis of the dysfunctioning of human 2-oxo acid dehydrogenase complexes // Med. Chem. – 2002. – V. 9(4). – P. 499-520. 40. Hoffmann F., Weber J., Rinas U. Metabolic adaptation of Escherichia coli during temperature-induced recombinant protein production: 1. Readjustment of metabolic enzyme synthesis // Biotechnol. Bioeng. – 2002. – V. 80, № 3. – P. 313-319. 41. Hohmann S., Meacock P. A. Thiamin metabolism and thiamin diphosphate-dependent enzymes in the yeast Saccharomyces cerevisiae: genetic regulation // Biochim. Biophys. Acta. – 1998. – V. 1385, № 2. – P. 201-219. ПРИЛОЖЕНИЕ БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ Таблица 1 Исходные растворы Раствор № 1 – соляная кислота, 0,1 н (готовится из фиксанала, либо 8,26 мл HCl с концентрацией 37,3 % и ρ = 1,185 в 1 л воды) Раствор № 2 – цитрат натрия, о,1 М (21,014 г Н3С6Н5О7 · Н2О + 200 мл 1 н раствора NaОН в 1 л воды) Раствор № 3 – уксусная кислота, 1 н (57, 1 мл ледяной уксусной кислоты с концентрацией 99,9 % и ρ = 1,050 в 1 л воды ) Раствор № 4 – NaОН, 1 н ( 40,0 г NaОН в 1 л воды) Раствор № 5 – КН2РО4, 0,06 м ( 9,073 г КН2РО4 в 1 л воды) Раствор № 6 - Na2НРО4, 0,06 м ( 11,866 г Na2НРО4 в 1 л воды) Раствор № 7 – трис – (оксиметил) – аминометан (24,2 г в 500 мл воды) Раствор № 8 - соляная кислота, 1 н (готовится из фиксанала, либо 82,6 мл HCl с концентрацией 37,3 % и ρ = 1,185 в 1 л воды) Цитратный буфер рН = 1,1 – 4,9. Каждый из указанных ниже объемов раствора № 2 доводят до 100 мл раствором № 1 (табл. 1). рН 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 р-р № 2 4,8 11,1 15,9 19,3 22,2 24,6 26,5 28,2 29,5 30,6 рН 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3,0 р-р № 2 31,7 32,6 33,6 34,5 35,4 36,4 37,3 38,3 39,3 40,3 рН 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0 36 р-р № 2 41,5 42,7 44,0 45,4 46,8 48,4 50,1 51,9 53,8 56,0 рН 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9 р-р № 2 58,5 61,1 64,3 67,9 71,9 76,9 82,2 88,0 95,6 Ацетатный буфер рН = 3,8 – 6,3. К указанному объему раствора № 3 прибавляют 50 мл раствора № 4 (табл. 1) и разбавляют дистиллированной водой до 500 мл. рН 3,8 3,9 4,0 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 р-р № 3 421,5 345,1 284,4 236,2 197,9 167,4 143,3 124,1 108,9 рН 4,7 4,8 4,9 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4 5,5 р-р № 3 96,8 87,2 79,5 73,4 68,6 64,8 61,7 59,3 57,4 рН 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 р-р № 3 55,9 54,7 53,7 53,0 52,3 51,9 51,5 51,2 Фосфатный буфер рН = 4,8 – 8,0. Каждый из указанных ниже объемов раствора № 6 доводят до 100 мл раствором № 5 (табл. 1). рН 4,8 4,9 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4 5,5 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 р-р № 6 0,35 0,60 0,95 1,35 1,80 2,30 3,00 3,90 4,90 6,20 7,90 9,8 12,1 рН 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6 6,7 6,8 6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 р-р № 6 15,0 18,4 22,1 26,4 31,3 37,1 43,0 49,2 55,2 61,2 67,0 72,6 77,7 рН 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8,0 р-р № 6 81,8 85,2 88,5 91,2 93,6 95,5 96,9 Буферный раствор трис–(оксиметил)–аминометана (трис-буфер) рН = 7,1 – 9,2. К 500 мл раствора № 7 (табл. 1) прибавляют указанные ниже объемы раствора № 8 и разбавляют дистиллированной водой до 1000мл. рН 7,1 7,2 7,4 р-р № 8 189 183 170 рН 7,8 8,1 8,3 р-р № 8 150 90 70 37 рН 8,5 8,7 9,2 р-р № 8 50 16,5 5,75 Таблица 2 Плотности и концентрации некоторых продажных реактивов Реактив Аммиака раствор конц. Азотная кислота «крепкая» Азотная кислота «слабая» Бромистоводородная кислота Йодистоводородная кислота Серная кислота Соляная кислота Уксусная кислота ледяная х.ч. Уксусная кислота ч.д.а. и чист. Фосфорная кислота ч.д.а. Фосфорная кислота чист. Фтористоводородная кислота ч.д.а. Фтористоводородная кислота чист. Хлорная кислота Плотность при 20 °С, г/см3 0,901-0,907 1,372-1,405 1,337-1,367 1,486 1,50-1,55 1,83-1,835 1,147-1,185 ≤ 1,0503 ≤ 1,0549 ≥ 1,719 ≥1,713 ≥1,128 ≥1,116 1,206-1,220 Концентрация % (масс.) моль/л 25,0-27,0 60,7-68,0 54,0-60,0 46,85 45,3-45,8 93,56-95,60 35,0-38,0 ≥ 99,8 ≥98 ≥88 ≥87,5 ≥40 ≥35 30,0-31,61 13,32-14,28 13,28-15,16 11,41-13,02 8,60 5,31-5,55 17,46-17,88 11,27-12,38 ≥17,45 ≥17,21 ≥15,43 ≥15,29 ≥22,55 ≥19,52 3,60-3,84 Таблица 3 Количество исходных веществ для приготовления процентных растворов кислот и аммиака (в мл на 1 л процентного раствора) ОтносиУдельный тельная Весовой Исходное вес моле% 25 % 20 % 10 % 5 % вещество исходного кулярная исходного вещества масса, вещества 1 г-м HCl 1,19 36,47 37,23 634,8 496,8 236,4 115,2 H2SO4 1,84 98,0 95,6 167,7 129,9 60,6 29,3 HNO3 1,40 63,02 65,6 313,0 243,6 115,0 56,0 CH3COOH 1,05 60,05 99,5 247,8 196,7 97,1 48,2 NH4OH 0,91 35,04 25,0 1000,0 814,0 422,0 215,4 38 2% 1% 45,5 11,5 22,0 19,2 87,2 22,6 5,6 10,8 9,0 43,7 Составители: доц. Федорко Н.Л., доц. Захариева З.Е., доц. Вовчук И.Л., доц. Будняк О.К., доц. Чернадчук С.С., проф. Петров С.А., доц. Запорожченко О.В., доц. Сорокин А.В., ст. преп. Кокошкина О.О. 39