УДК 612.62.014:577.336 Н.Н.Чуб, ст.н.с., канд. биол. наук. И.В.Коваленко, ст.н.с., канд. биол. наук. Т.С.Дюбко, ст.н.с., канд. биол. наук. В.И.Пиняев, ст.н.с., канд. мед. наук. И.В.Добрунова, аспирант. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины ул. Переяславская, 23. г.Харьков, Украина 61015 E-mail:natatchoob-2@yandex.ru ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК ГРАНУЛЕЗЫ И КУМУЛЮСА ЯИЧНИКА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ В последнее время все более широкое применение находят функциональные тесты жизнеспособности, в основе которых лежит изменение флуоресценции некоторых соединений, которое, как правило, пропорционально метаболической активности клеток. Применение флуоресцентных зондов (ФЗ) для тестирования биообъектов позволяет оценивать состояние клеточных мембран, липопротеидов и других органелл клетки [1], а также функциональную активность криоконсервированных клеток [2]. В связи с этим в данной работе представлялось целесообразным провести исследование жизнеспособности и стероидогенной активности криоконсервированных клеток гранулезы и кумулюса (КГК), полученных из преовуляторных фолликулов яичника человека. КГК из преовуляторных фолликулов получали у 10 женщин, проходивших программу экстракорпорального оплодотворения. Криоконсервирование КГК проводили по 3-х этапной программе с двухкомпонентной средой (0.7М ДМСО + 0.3М ПЭО-400). В работе были использованы ФЗ: нильский красный (НК) – селективный флуоресцентный краситель, применяемый для окрашивания внутриклеточных липидных капель [3], Рropidium iodide (РI) (Sigma,США). Для проведения анализа среду с КГК (1х1мм2) иммобилизировали на предметном стекле, наносили небольшую каплю ФЗ и накрывали покровным стеклом. Наблюдение осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSМ-510 META (Сarl Zeiss,Германия) Известно, что PI локализуется только в тех клетках, где повреждена цитоплазматическая мембрана. Проникая в ядро, он связывается с ДНК и флуоресцирует красным цветом в диапазоне 580 – 640 нм [1]. При изучении жизнеспособности КГК до и после криоконсервирования с помощью PI было установлено, что после криоконсервирования увеличивается количество КГК флуоресцирующих красным цветом, т.е. увеличивается число поврежденных клеток, которое составляет около 29% по сравнению с контролем (Рис.1,б). Известно, что в цитоплазме КГК в норме содержится значительное количество липидных гранул – депо холестерина, который является субстратом для синтеза стероидных гормонов. а б Рис.1. Флуоресценция КГК: а) интактные образцы; б) после криоконсервирования, окраска PI. При возбуждении лазером с длиной волны 543 нм стероидогенные клетки, окрашенные НК, флуоресцируют красным цветом с максимумом эмиссии зонда 628 нм (Рис.2,а). После действия криопротекторной смеси и криоконсервирования КГК незначительно изменили качество окрашивания НК и интенсивность флуоресценции по отношению к нативным образцам (Рис.2,б). а б Рис. 2. а – флуоресценция нативных КГК, б - после криоконсервирования, нильский красный, х630 Нужно отметить, что интенсивность свечения в индивидуальных клетках может быть различной, что, по-видимому, зависит от степени их гормональной активности фолликулярных клеток. Результаты окрашивания ФЗ на выявление липидных включений подтверждают данные, полученные ранее [4] о том, что КГК сохраняют способность к продукции стероидных гормонов после криоконсервирования. Таким образом, результаты данного исследования позволили установить, что криоконсервирование снижает жизнеспособность КГК и уменьшает интенсивность свечения НК в клетках. ФЗ могут быть использованы в качестве теста для характеристики функционального состояния различных клеток и их органелл. 1. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеидов // Г.Е.Добрецов. – М.: Наука, 1989. – 277 с. 2. Гончарук Е.И., Онищенко Е.В., Тимон В.В., Петренко Т.Ф., Боровой И.А., Малюкин Ю.В., Грищенко В.И. Применение карбоцианиновых флуоресцентных зондов для оценки функционального состояния культивированных клеток после криоконсервации // Биополимеры и клетка. −2008. −Т.24,№3. − С. 225-231. 3. Greenspan P., Fowler S.D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe by nile red // J.Lipid. Res. – 1985. – Vol.26,№7. – P.781-789. 4. Чуб Н.Н., Демина Л.Г., Добрунова И.В. Эстрогенная активность ткани яичника человека в культуре до и после низкотемпературного консервирования // В зб. тр. Фундаментальна та клiнична ендокрiнологiя: проблеми, здобутки, перспективи. – Харьков,2009. – С.133-134.