XII МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ 892 «ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК»

XII МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ
892
«ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК»
ШИРОКОГЕНОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЛЕЛЬНОГО ИМБАЛАНСА В ОПУХОЛИ
МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ НЕОАДЪЮВАНТНОЙ ХИМИТЕРАПИИ
М.М. Цыганов1,2, М.К. Ибрагимова1, И.В. Дерюшева1
Научный руководитель: д.б.н. Н.В. Литвяков
Томский НИИ онкологии, Россия, г. Томск, пер. Кооперативный 5, 634050
1
Национальный исследовательский Томский государственный университет, Россия, г. Томск,
2
пр. Ленина, 36, 634050
E-mail: TsyganovMM@yandex.ru
GENOMIC APPROACH IN THE RESEARCH OF ALLELIC IMBALANCE IN BREAST TUMORS
DURING THE COURSE OF NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY
M.M. Tsyganov1,2, M.K. Ibragimova1, I.V. Deryusheva1
Scientific Supervisor: Doctor of Sc., N.V. Litviakov
1
Tomsk Cancer Research Institute, Russia, Tomsk, Kooperativny Street, 5, 634050
2
Tomsk State University, Russia, Tomsk, Lenina av., 36, 634050
E-mail: TsyganovMM@yandex.ru
Annotation. Normal genetic variability due to single nucleotide polymorphism (SNP) is one of the factors
determining the level of the individual variability of the tumor. Characteristic feature of SNP is a so-called
phenomenon of allelic imbalance (AI) and a special case of it - loss of heterozygosity (LOH), where the loss of
one allele of a heterozygous genotype and decrease heterozygous genotype frequencies in comparison with
genomic DNA are detected. Majority of the studies devoted to allelic imbalance in breast tumors focused on
study of one or a few genes. In our study microarray CytoScanTM HD Array genotypes were used to compare
all SNPs in tumor tissue prior to treatment and after neoadjuvant chemotherapy (NCT) in 26 patients. It was
found that frequency of genotype inversions significantly associated to NCT. There was a tendency towards
correlation in frequency of genotype inversions and 5-years metastasis-free survival in breast cancer patients.
Для однонуклеотидного полиморфизма – SNP (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) характерно
явление аллельного имбаланса (АИ). Его частный случай - потеря гетерозиготности (Loss of heterozygote
– LOH), при которой происходит утрата (структурная или функциональная) одного из аллелей
гетерозиготного генотипа, и в результате чего наблюдается уменьшение детектируемых частот
гетерозиготных генотипов в опухолевой ткани по сравнению с геномной ДНК в строме. Аллельный
имбаланс может быть результатом аллельных делеций (потери одной из копий данного локуса), или
амплификации одного из аллелей [1]. Согласно двухударной модели канцерогенеза A. Knudson для
инактивации генов-супрессоров необходимо два последовательных мутационных события – утрата
одного аллеля в результате LOH и соматические мутации либо метилирование в другом аллеле [2]. АИ и
LOH могут приводить к активации онкогенов и инактивации опухолевых генов-супрессоров, что может
провоцировать неконтролируемый рост клеток и метастазирование [3]. В настоящее время, АИ и LOH
изучены и показаны для многих генов при различных опухолях [4, 5]. В крупном исследовании греческие
и немецкие авторы показали наличие АИ для таких генов как: EGFR, TERT, TP53, CASP8, PARP2, GATA3
Россия, Томск, 21– 24 Апреля 2015 г.
БИОЛОГИЯ И МЕДИ
XII МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ
893
«ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК»
и BRCA1 [6]. Таким образом, большинство авторов явление аллельного имбаланса в опухоли молочной
железы в рамках одного или нескольких генов, и, как правило, связывали его с процессом канцерогенеза
в исследованиях по типу случай-контроль. Явление АИ в процессе химиотерапии (ХТ) и тем более в
широкогеномном формате никогда ранее не изучалось. Целью настоящей работы было широкогеномное
исследование аллельного имбаланса в опухоли молочной железы при проведении неоадъювантной
химиотерапии (НХТ).
В исследование было включено 26 больных РМЖ со стадией IIA – IIIC, получавших в 2006-2010
годах лечение в клинике Томского НИИ онкологии. Больные в неоадъювантном режиме получали 2-4
курса ХТ по схемам FAC или CAX. Затем проводилась операция и 2 курса адъювантной химиотерапии
по схеме FAC, лучевая терапия и/или гормональное лечение назначались по показаниям. ДНК из 26
парных образцов до лечения и операционных образцов выделяли с помощью набора QIAampDNA
miniKit (Qiagen, Germany). Микроматричный анализ проводили на ДНК-чипах высокой плотности
фирмы Affymetrix (USA) CytoScanTM HD Array, которые содержат более 750 тыс. SNP. После
микроматричного анализа проводили сравнение генотипов по SNP ДНК опухолевой ткани до лечения и
после НХТ у каждого пациента и регистрировали аллельный имбаланс как изменение генотипов
опухолевой ткани (АА→АВ, АВ→АА, ВВ→АВ, АВ→ВВ) в процессе терапии. Для анализа
безметастатической выживаемости использовался метод Каплана-Майера. Сравнение частот по
качественным признакам проводили при помощи двухстороннего критерия Фишера.
Частота АИ в опухоли молочной железы при проведении НХТ сильно варьировала в пределах
0,9%-66,5% от всех изученных SNP (6850 – 497979 SNP). Для каждого пациента была рассчитана частота
смены генотипов (гомозиготного генотипа в гетерозиготный и, наоборот) в процентах от всех смены.
Изменения дикого или мутантного генотипов в гетерозиготный (АА или ВВ→АВ) объединяли в одну
группу; вторую группу составила сумма смены гетерозиготного генотипа в гомозиготный дикий генотип
или мутантный (АВ→АА или ВВ). В среднем, для первой группы частота аллельного имбаланса
составила 44,9±6,4%, для второй – 55,1±6,4% от всех изменений генотипов SNP в процессе НХТ. Нами
было установлено, что с направлением АИ статистически значимо ассоциирован эффект НХТ. В группе
пациентов с частичной регрессией чаще происходит АИ в направлении смены гомозиготного генотипа в
гетерозиготный (АА или ВВ→АВ) (9/14, 64% случаев). Предполагается, что это происходит из-за
повышения стромально-паренхиматозного соотношения в опухоли и увеличения представленности
стромы, которая является носителем нормального гетерозиготного генотипа. Тогда как для пациентов с
отсутствием ответа на НХТ (со стабилизацией или прогрессированием), наблюдается обратная картина.
У всех этих пациентов (12/12 случаев) происходит АИ в направлении смены гетерозиготного генотипа в
гомозиготный (АВ→АА или ВВ) (p=0,00071), т.е. наблюдается снижение стромально-паренхиматозного
соотношения и представленность опухолевой паренхимы, с мутантным генотипом, возрастает. АИ в
процессе химиотерапии на уровне выраженной тенденции (Log-rank test, p=0,062) связан с 5-ти летней
безметастатической выживаемостью (Рисунок 1). У пациентов с АИ в направлении смены
гетерозиготных генотипов в гомозиготные наблюдается низкая безметастатическая выживаемость, в то
время как у больных с инверсией гомозиготных генотипов в гетерозиготные отмечена 100%
выживаемость (p=0,062), и такой тип аллельного имбаланса является благоприятным прогностическим
признаком.
Россия, Томск, 21– 24 Апреля 2015 г.
БИОЛОГИЯ И МЕДИ
XII МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ
894
«ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК»
Рис. 1. Безметастатическая выживаемость больных РМЖ при различном направлении АИ
Аллельный имбаланс в опухоли молочной железы в процессе НХТ является массовым явлением и может
затрагивать до 67% SNP. АИ может происходить в направлении смены гомозиготных генотипов на
гетерозиготные, что ассоциировано с хорошим ответом на лечение и 100% безметастатической
выживаемостью. По-видимому, это можно объяснить тем, что смена гомозиготных генотипов на
гетерозиготные
обусловлена
частичным
уничтожением
опухолевых
клеток
под
действием
химиопрепаратов, в результате чего, происходит увеличение представленности стромы. Таким образом,
на фоне мутантной опухолевой ДНК начинает преимущественно детектироваться нормальная геномная
ДНК стромы, вероятно, имеющая более высокую частоту гетерозиготных генотипов. АИ в направлении
смены гетерозиготных генотипов на гомозиготные в процессе НХТ, напротив, сопряжен с отсутствием
ответа на химиотерапию, метастазированием и обусловлен появлением новых мутантных опухолевых
клонов, имеющих высокую представленность в опухоли. В этом случае, преимущественно,
детектируется мутантная опухолевая ДНК на фоне нормальной ДНК стромы.
СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ
1.
Tamura G. Alterations of tumor suppressor and tumor-related genes in the development and progression of
gastric cancer // World journal of gastroenterology: WJG. – 2006. – Vol. 12 (2). – p. 192-198.
2.
Knudson A.G. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // Proceedings of the National
Academy of Sciences. – 1971. – Vol. 68 (4). – p. 820-823.
3.
Chen Y. and Chen C. DNA copy number variation and loss of heterozygosity in relation to recurrence of
and survival from head and neck squamous cell carcinoma: a review // Head & neck. – 2008. – Vol. 30 (10).
– p. 1361-1383.
4.
Okudela K. et al. Allelic Imbalance in the miR-31 Host Gene Locus in Lung Cancer-Its Potential Role in
Carcinogenesis // PloS one. – 2014. – Vol. 9 (6).
5.
Fleming J.L. et al. Allele-specific imbalance mapping identifies HDAC9 as a candidate gene for cutaneous
squamous cell carcinoma// International Journal of Cancer. – 2014. – Vol. 134 (1). – p. 244-248.
6.
Kotoula V. et al. Investigating the clinical relevance of genomic characteristics in luminal and b breast
cancer (BC) // Annals of Oncology. – 2014. – Vol. 25 (suppl 4) – p. iv87-iv87
Россия, Томск, 21– 24 Апреля 2015 г.
БИОЛОГИЯ И МЕДИ